Zimotrwalosc I Mrozoodpornosc

Fizjologia stresów

Zimotrwałość i mrozoodporność roślin

Omawiając to zagadnienie musimy posługiwać się trzema pojęciami, które są bardzo często przeciwstawnie interpretowane. Żeby się rozumieć

zdefiniujmy je i przyjmijmy tą interpretację za jedyną słuszną.

• Adaptacja – dostosowanie organizmu do funkcjonowania w środowisku wykształcone na drodze ewolucji, mające oczywiście swoje podłoże genetyczne. Cechy adaptacyjne mogą podlegać ekspresji konstytutywnej, mogą być też indukowane przez zmiany w środowisku (ale geny są obecne cały czas).

• Aklimacja (hartowanie) – (1) ekspresja indukowalnych cech adaptacyjnych pod wpływem określonych czynników środowiska lub (2) działanie tymi czynnikami w celu indukcji cech adaptacyjnych.

• Aklimatyzacja – (1) ekspozycja organizmu na określone czynniki środowiska powodująca zmiany w jego stanie fizjologicznym ale nie powodująca indukcji cech adaptacyjnych, np. zacienianie liści wyłączające aparat fotosyntetyczny, „powolne wyciąganie” pomidorów z inspektu do warunków polowych w celu zapobieżenia uszkodzeniom chłodowym – unikanie szoku lub (2) proces prowadzący do wykształcenia się lub uruchomienia adaptacji (wg. Klasycznej genetyki niemożliwe, ale biorąc pod uwagę epigenetyczne wyciszanie czy uruchamianie genów…) (3) w hodowli roślin – prace prowadzące do introdukcji nowego gatunku poprzez selekcję genotypów, które mogą lepiej funkcjonować w nowym środowisku (wykorzystywanie naturalnej zmienności) lub tworzenie zmienności na drodze mutacji, transgenezy, czy wymuszania zmian epigenetycznych (np. w wyciszaniu genów).

Zimotrwałość (Levitt 1980)

• Mrozoodporność• Odporność na suszę

– fizjologiczną– wysmalanie

• Odporność na stres świetlny• Odporność na uszkodzenia mechaniczne

– odporność na ruchy gleby (zamarzanie-rozmarzanie; system korzeniowy)

– odporność na ściskanie skorupą- lodową (część nadziemna)

• Odporność na warunki beztlenowe– odporność na długo zalegający śnieg– odporność na wymakanie

• Odporność na choroby i szkodniki

Mrozoodporność (Anderssson, Olsson 1961)

• mrozoodporność właściwa (po zahartowaniu)• mrozoodporność w stanie niezahartowanym• mrozoodporność związana z pokrojem roślin

W warunkach nietypowego przebiegu zimy

1. Odporność na suboptymalne warunki prehartowania

2. Zdolność do utrzymania zahamowania wzrostu nabytego podczas prehartowania

1. Wysokie wymagania wernalizacyjne2. Niska wczesność3. Niska wrażliwość na rozhartowywanie

Strategie przetrwania zimy• Unikanie

(przetrwanie w formie nasion, stratyfikacja)• Mechanizmy aklimacyjne

– Strategia indukowanego unikania stresów zimowych w tym zamarzania

– Strategia indukowanej tolerancji stresów zimowych, w tym zamarzania

Cechą charakterystyczną zimotrwałości jest to, iż zmienia się ona sezonowo: rośnie jesienią (hartowanie na mróz) a spada w okresie wiosennym (rozhartowywanie). Hartowanie roślin na mróz zwiększa STOPIEŃ MROZOODPORNOŚCI oraz odporność na: STRES ŚWIETLNY i STRESY DEHYDRATACYJNE

Morfologia i cechy anatomiczne roślin a zimotrwałość

W wielu pracach stwierdzano zależność zimotrwałości roślin od cech anatomicznych i morfologicznych roślin (długość i szerokość blaszki liściowej, wielkość komórek, ilość liści, zawartość wody w części nadziemnej, stopień rozwoju systemu korzeniowego). Istniejące tu zależności są podobne do tych omawianych w przypadku roli zahamowania wzrostu wydłużeniowego w procesie hartowania na mróz.

Wpływ czynników zewnętrznych na zimotrwałość roślin

• Temperatura (obniżanie się wywołuje hartowanie, wzrost-rozhartowywanie)

• Światło (długość dnia, PAR-sygnał dla ekspresji genów, PAR-źródło energii dla fotosyntezy i uszkodzeń w przypadku fotoinhibicji)

• Nawożenie (N-przyspiesza wzrost, działa indukcyjnie, hamuje proces hartowania na mróz, rośliny większe są bardziej podatne na mróz po nie chowają się pod śniegiem, K-sprzyja hartowaniu bo gromadzenie jonów K+ obniża potencjał osmotyczny)

Wpływ czynników zewnętrznych na zimotrwałość roślin

• Stężenie CO2 (wysokie oszukuje PSII, który jest współodpowiedzialny za wykrywanie zmian temperatury – roślina „myśli”, że jest cieplej i gorzej się hartuje, obfitość asymilatów przyspiesza wzrost co też osłabia hartowanie)

• Okrywa śniegowa (zapobiega gwałtownym spadkom temperatury w godzinach porannych, stanowi bufor cieplny, ogranicza suszę i stres świetlny, sprzyja anoksji i stresom biotycznym)

PRZYCZYNY USZKODZEN MROZOWYCH

• Przyczyną śmierci komórek w czasie zamarzania jest destrukcja membran cytoplazmatycznych, destrukcja ta może być destrukcją:– Mechaniczną– Biochemiczną bądź fizyczną

PRZYCZYNY USZKODZEN MROZOWYCH

• Mechaniczna: przez kryształy lodu rosnące w obrębie komórki• Biochemiczna bądź fizyczna

– Aktywacja bądź uwalnianie lipaz - deestryfikacja lipidów (Yoshida 1978, Willemot 1983)

– Utrata struktury lipidowej błon w czasie indukowanej mrozem desykacji cytoplazmy

– Wysalanie białek membranowych w czasie indukowanej mrozem desykacji cytoplazmy (Thebud, Santarius 1981)

– Przejście fazowe błon (Caffrey 1987)– Potencjał elektryczny powstający na skutek ekskluzji substancji

rozpuszczonych na granicy lód-roztwór (Steponkus 1985)– Obecność wolnych rodników przy jednoczesnej, ograniczonej

możliwości ich neutralizowania (Kendall, McKers:a 1989)

Metody oceny zimotrwałości roślin

• Polowa - ze względu na dużą zmienność przebiegu zim ocena taka wymaga wieloletnich (lub/i) wielopunktowych badań. Skala 9°.

• Poprzez ocenę mrozoodporności (odporność na mróz najczęściej decyduje o przeżyciu zimy i koreluje z zimotrwałością na poziomie 0,6-0,95 w zależności od dokładności oceny zimotrwałości i sposobu oceny mrozoodporności).

• Poprzez ocenę innych cech (wymagania wernalizacyjne, cechy anatomiczne...)

9° skala oceny przeżywalności polowej (przykłady)

1 7

Mrozoodporność – metody oceny

• Bezpośrednie (konieczne zahartowanie roślin i mrożenie)

• Pośrednie (określanie zmian biochemicznych lub fizycznych zachodzących podczas hartowania na mróz)

Bezpośrednia ocena mrozoodporności

• Hartowanie roślin w polu. Metoda tańsza, ale mniej dokładna, gdyż stopień mrozoodporności zmienia się w ciągu zimy. Dokonywana jednokrotnie koreluje z zimotrwałością zwykle na poziomie około 0,6. Dokonywana kilkukrotnie w czasie zimy daje korelacje rzędu 0,8-0,9.

• Hartowanie roślin w warunkach laboratoryjnych (najdokładniejsza, ale droga).

• Hartowanie in vitro kalusa, czy zawiesin komórkowych.

Podział ze względu na źródło materiałów do oceny

Bezpośrednia ocena mrozoodporności

• Ocena przeżycia roślin (jeśli materiał pochodzi z pola, to stosuje się tzw. skrzynkową metodę Kocha – rośliny wysiewane są w warunkach polowych do skrzynek i pobierane do mrożeń zwykle trzykrotnie w czasie zimy, mrożone są całe szkrzynki). % przeżycia.

• Wizualna bonitacja stopnia uszkodzeń lub odrostu roślin. Skala 9°.

Podział ze względu na sposób oceny uszkodzeń

Bezpośrednia ocena mrozoodporności

• Ocena wypływu elektrolitów (można mrozić fragmenty roślin).

• Ocena stopnia uszkodzeń aparatu fotosyntetycznego przy użyciu pomiarów fluorescencji chlorofilu (można mrozić fragmenty roślin)

• Test tetrazolinowy (głównie in vitro lub fragmenty roślin)

Podział ze względu na sposób oceny uszkodzeń

Skala odrostu traw (Larsen 1972)

Pośrednie kryteria mrozoodporności

• zawartość cukrów rozpuszczalnych - Levitt 1956 - pszenica, żyto, lucerna

• aktywność grup SH (test nitroprusydkowy) Bruckmann, Werthelm 1954 - pszenica, jęczmień

• zawartość związków redukujących (miareczkowanie askorblnlanu) Schmutz 1969 - zboża

• lepkość plazmy - Muller 1959• zawartość wody związanej - Levitt 1956

Pośrednie kryteria mrozoodporności

• przewodnictwo elektryczne soku komórkowego - Wllner 1960

• aktywność amonloliazy-L –fenyloalanlny - Parra 1990 – rzepak

• ocena przeżycia kalusa na pożywkach selekcjonujących (np. bogatych w hydroksyprolinę, Dörffling 1990)

Pośrednie kryteria mrozoodporności

Żadne z nich nie znalazło zastosowania w hodowli – są zbyt drogie i niepewne.

• Stopień aklimacji aparatu fotosyntetycznego do chłodu (u zbóż i rzepaku ozimego – aktywność fotosyntetyczna) – Öquist 1944 – akumulacja s.m. jesienią, Rapacz 2005 – fluorescencja chlorofilu jesienią (metoda tania i przez to perspektywiczna)

Markery molekularne• Klasyczne: duży problem – mrozoodporność ZMIENIA SIĘ

SEZONOWO więc nie zależy od obecności genów lecz stopnia ich ekspresji

• Ale z tego wynika, że można używać do selekcji negatywnej (jak genu nie ma to nie może podlegać ekspresji)

• Inny problem to poligeniczność: dużo QTLi• Jedyna możliwość: szukanie w regionach sterujących lub w

specyficznych wypadkach (przenosimy mrozoodporność na drodze krzyżowań jednocześnie wprowadzając geny markerujące o bliskich QTL lub jeżeli istnieją lub są przenoszone geny konstytutywne ułatwiające przebieg hartowania)

• Ekspresyjne: perspektywiczne, szczególnie jeśli weźmie się pod uwagę czynniki transkrypcyjne sterujące hartowaniem

Markery mrozoodporności u jęczmienia (Rapacz, Tyrka, Gut 2006). Polimorfizm DNA dla wybranych oznaczeń wysoko skorelowanych z reakcją tolerancji na mróz (ocena metodą

polowo-laboratoryjną w 2005 roku). Kolorem białym oznaczono markery skorelowane również z wynikami oceny fluorescencyjnej. Na żółto markery skorelowane ze stopniem

aklimacji aparatu fotosyntetycznego.

PO

A 4

044/

94/1

PO

A 4

027/

94

Car

ola

PO

A 4

584/

95

PO

A 3

941/

94

PO

A 4

751/

98

PO

A 3

455/

92

PO

A 4

006/

94/1

PO

A 4

746/

98/4

PO

A 4

784/

98

przeżywalność (%)

75,5

76,7

40,1

70,6

50,2

49,1

45,9

51,8

75,8

53,2

Oznaczenie 1 3 5 6 7 8 9 10 11 12

Korelacja

1_24 Psr115_R+L_1200 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0,529 1_38_ag Wg644_2_R+L_1200 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0,643 2_11_ag vrn_c_f_39+vrn_c_r_159_700 0 0 1 1 1 1 1 1 -0,631 2_12_H vrd11f_45+vrd11r_201_390 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0,594 2_22_H Mwg914_R+L_800 0 0 0 0 1 1 1 0 -0,632 2_25_B CBF1_R+L_380 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 -0,737 2_25_B CBF1_R+L_270 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 -0,551 3_1_pion barc151_R+L_f 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 -0,534 3_1_pion barc151_R+L_d 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0,534 3_14_pion wmc475_R+L_c 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 -0,513 3_17_pion wmc630_R+L_ 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0,531 3_18 gwm186 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 -0,594 3_21 wmc215_3 1 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0,725 3_25_pion wmc95_R+L_ 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0,545 3_25_pion wmc95_R+L_ 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 -0,643 3_25_pion wmc95_R+L_ 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0,643

Aby się zahartować na mróz rośliny muszą zahamować wzrost wydłużeniowy

• Jest to proces w sposób konkurencyjny dla hartowania zużywający energię

• Wzrost zwiększa zawartość wody w komórkach (co utrudnia hartowanie)

• Rośliny nie „chowają się pod śniegiem”• Ekspresja genów związana ze wzrostem organów

generatywnych hamuje ekspresję genów corPrzełączanie 2 strategii: wzrost i rozwój – przetrwanie

zimy

Jak hamowany jest wzrost?

• To zależy od przyjętej strategii: hamowanie jest albo całkowite (strategia supercooling – zachodzi równocześnie z hartowaniem) albo częściowe (strategia tolerancji – zachodzi w etapie prehartowania)

Strategie hartowania na mróz

• Strategia indukowanego unikania stresów – SUPERCOOLING (tkanki u tych roślin nigdy nie zamarzają)

• Strategia indukowanej tolerancji stresu – NON-SUPERCOOLING (lód powstaje w tkankach ale roślina umie to tolerować)

• Oczywiście w wielu przypadkach obydwie strategie występują u tych samych gatunków

Strategia indukowanego unikania stresów zimowych

• Jest ona ewolucyjnie starsza, nazywa się ją też strategią przechłodzenia a towarzyszące zwiększanie odporności na stres świetlny i stresy dehydratacyjne polega na typowej ucieczce poprzez pozbycie się aparatu fotosyntetycznego a co za tym idzie powierzchni transpiracyjnej poprzez zrzucanie liści. Strategie tą obserwujemy u drzew, krzewów i krzewinek klimatu umiarkowanego i zimnego.

Strategia indukowanego unikania stresów zimowych

• Jak to było? Ewolucja okrytonasiennych w klimacie w którym występują zimy początkowo „umieściła” rośliny o dużym udziale silnie zdrewniałych, a więc zawierających mało wody tkanek mechanicznych w łodygach i zrzucających liście. Rośliny zielne, zimujące, mogły pojawić się dopiero wraz z wykształceniem drugiego z wymienionych mechanizmów.

Strategia indukowanego unikania stresów zimowych

• Przebieg hartowaniaBodźcem dla rozpoczęcia hartowania jest skracający się dzień

(ale działa też chłód i przymrozki). Długość krytyczna zależy od geograficznego pochodzenia ekotypu i jest dłuższa u form północnych.

- Transgeniczna topola (hybrid aspen) z nadekspresją genu fitochromu A nie hartuje się: nie hamuje wzrostu, nie zrzuca liści, nie indukuje spoczynku pąków, chociaż ma obniżony poziom GA i auksyn to nie zmniejsza ilości GA na krótkim dniu. Działaniem inhibitora giberelin (paklobutrazolem) można zahamować (ale tylko częściowo) negatywne efekty u transgenu.

Strategia indukowanego unikania stresów zimowych

• Przebieg hartowania- Czyszczenie wody w ksylemie co umożliwia jej

przechłodzenie nawet do około -50°C.- Akumulacja asymilatów wyprowadzanych z liści we

floemie- Rozmieszczanie w tkankach przewodzących białek

przeciwzamarzaniowych- Indukowanie spoczynku pąków, ochrona ich przez

odwadnianie, akumulację asymilatów, białek przeciwzamarzaniowych i okrywanie tkankami martwymi co zabezpiecza przed gwałtownymi spadkami temperatury

- Zrzucanie liści (obrona przed stresami dehydratacyjnymi i stresem świetlnym)

Nabywanie i utrata odporności na mróz u Robinia pseudoaccacia (wg. Guy 1990)

Zmiany odporności jabłoni w ciągu zimy

Strategie pośrednie – drzewa i krzewy wieczniezielone

• Szpilkowe- Postępują jak zrzucające liście, ale:

- ich aparat fotosyntetyczny aklimuje się do stresu świetlnego- nie muszą zabezpieczać szpilek przed dehydratacją bo ich

kseromorfizm jest wystarczający, - wiązki przewodzące w szpilkach zabezpieczane są jak w pniach,

ponieważ nie ma przestworów międzykomórkowych to woda nie ma gdzie zamarzać, komórki miękiszu są napakowane asymilatami.

• Liściaste– Można u nich zaobserwować mechanizm supercoolingu

(łodygi) i mechanizm tolerancji (liście). Taka mieszanka nie jest jednak najszczęśliwszym rozwiązaniem i rośliny te nie mają wysokiej mrozoodporności.

Strategia indukowanej tolerancji

• Proces hartowania prowadzi w tym przypadku do przesunięcia miejsca zamarzania wody z wnętrza komórki do przestworów międzykomórkowych

Pozakomórkowe (2) i wewnątrzkomórkowe (1) zamarzanie wody (wg. Li i Palta 1978, w: Li, Sakai „Plant cold hardiness and freezing stress”)

• Zamarzanie wody we wnętrzu komórki zawsze prowadzi do jej śmierci

• Zamarzanie poza komórką nie musi (ale może) komórki zabić

• Wnętrze komórki można bezpiecznie dla jej życia zamrozić jedynie przy bardzo szybkim spadku temperatury (100 K/min). Dochodzi wtedy do zeszklenia protoplastu – nie tworzą się duże kryształy lodu (witryfikacja).

Przebieg hartowania w strategii indukowanej tolerancji

• Prehartowanie, temperatura <15°C w czasie dni słonecznych, <10°C w czasie dni pochmurnych, niekiedy wymagany krótki dzień

• Faza I: 0-8°C, wymagane światło• Faza Ib: okresowo działające temperatury ujemne (w

nocy) – wzmaga indukujące zaburzenia w gospodarce wodnej

• Faza II – temperatury ujemne (ciągle działające) – fizyczna dehydratacja protoplastu, światło niewymagane

Etapy hartowania i temperatury w okresie jesiennym, zaznaczono termin siewu i wschodów rzepaku ozimego

Prehartowanie

• Hamowanie wzrostu wydłużeniowego• Aklimacja aparatu fotosyntetycznego do niskiej

temperatury (mechanizm zależny generalnie od strategii gromadzenia asymilatów)

• Stopień mrozoodporności nie wzrasta zauważalnie, jednak prehartowanie umożliwia pełne zahartowanie roślin w kolejnych etapach

Prehartowanie - sygnał

• Wzrost stopnia redukcji PSII• Zapewne też fotoperiod

Prehartowanie rzepaku ozimego w warunkach wzrostu redukujących PSII

• Kompaktowa morfologia roślin – wzrost zawartości ABA i spadek ilości giberelin

20/12°C (dzień/noc) 12/20°C (dzień/noc)

Potencjalna możliwość uwalniana ABA w warunkach zredukowanego PSII

Rysunek przedstawia mechanizm pułapkowania ABA w chloroplastach, przy zbyt dużym, nierozładowywanym gradiencie protonów w poprzek tylakoidu ABA może być uwalniane z tej swoistej pułaki

Prehartowanie

• Geny hamowane przez gibereliny mogą zawierać elementy odpowiadające na ABA (Thomas i Sun 2004).

• Przy braku GA indukowana jest ekspresja ABA, a gdy się one pojawią jest ona hamowana, wynika to stąd, że białka DELLA biorące udział w przekazywaniu sygnału giberelin (pojawienie się giberelin indukuje ich proteolizę) stymulują gen XERICO aktywujący biosyntezę ABA. ABA z kolei hamuje aktywność niektórych genów zaangażowanych w biosyntezę GA (Zentella et al. Plant Cell.2007; 19: 3037-3057).

Właściwe hartowanie na mróz

W odróżnieniu od prehartowania stopień mrozoodporności zaczyna tu stopniowo wzrastać

Strategia tolerancji zamarzania –sezonowe zmiany stopnia aklimacji

• Zmiany odporności rzepaku ozimego (wg. Kacperska-Palacz, 1978)

Długość okresu hartowania

• Do pełnego zahartowania roślin wystarczają zwykle 3-4 tygodnie w temperaturze +2-5°C,

• Do dohartowania do maksymalnego poziomu roślin hartowanych w wyższych temperaturach wystarczy już około 5 dni w +2°C

Hartowanie na mróz - zależność od temperatury i podatność tkanek

Hartowanie na mróz - zależność od temperatury i podatność tkanek

• Na mróz nie są się w stanie hartować nie tylko główne wierzchołki wzrostu niektórych traw (Lolium), ale też korzenie (nie jest to im potrzebne)

• U traw hartują się boczne wierzchołki wzrostu (bo są „podłączone” do liści)

Podstawowe kierunki zmian metabolicznych

podczas hartowania na mróz – zmiany są

odpowiedzią na zagrożenia związane z działaniem niskiej

temperatury i zamarzaniem

Białka przeciwzamarzaniowe

Zwierzęce: AGFP, AFP typ.I., typ.II, typ.III, typ.IV (http://www.afprotein.com/table.htm). Izolowane gównie z ryb antarktycznych lub owadów.

Mechanizm hamowania wzrostu kryształów lodu przez białka AFP

A tak to wygląda pod mikroskopem - wpływ ekstraktów z apoplastu żyta w zależności od długości hartowania w 2C na kształt kryształów lodu in vitro.

Kryształy lodu tworzące się przy braku (z lewej) i w obecności białek AFP, typ III (z prawej)

Białka przeciwzamarzaniowe

Roślinne: wykazują niewielką aktywność w stosunku do obniżania temperatury krystalizacji (o około 1,5°C, gdy zwierzęce nawet o 6°C). Przypuszcza się, że pełnią one raczej rolę ochronną przed tworzeniem się lodu w specyficznych regionach komórki (w pobliżu białek i błon) lub/i zmieniają kształt i rozmiar kryształów lodu, tak, żeby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne.

Strukturalny model białka przeciwzamarzaniowego z Lolium perenne

Osmoprotektanty – gromadzone też w czasie suszy

Rozhartowywanie

• Jest szybsze od hartowania,• Nieodwracalne, jeśli rozpocznie się intensywny

wzrost wydłużeniowy (cofnie się spoczynek w strategii supercooling lub efekty prehartowania w strategii tolerancji)

• Czynniki: temperatura, stan redoks PSII, fotoperiod (ważniejszy dla strategii supercooling – przerywa spoczynek pąków i indukujący rozwój generatywny, np.. U rzepaku)

Hartowanie, rozhartowywanie i ponowne hartowanie rzepaku ozimego,

niezwernalizowanego (A) i jarego (B)