1 2 3 PC ん 1 2 3 ぺ ん M Hinf I PCR-RFLP...PCR-RFLP...

新規なエビ種判別法の加工食品への

応用に関する検討

背景および目的

○西 純市1、岩崎直子1、阪地英男2、引間順一3、酒井正博3

1株式会社生活品質科学研究所、2国立研究開発法人 水産研究・教育機構、3宮崎大学 農学部

●2013年に発覚した外食産業のメニュー表示虚偽問題において、安価なウシエビ（ブラックタイガー）Penaeus monodonなどの種を高価なクルマエビMarsupenaeus japonicusなどと偽装した事例が多く確認された。

その原因として、エビ類は類似した種や加工調理された種の判別が困難であることが挙げられる。また、エビは種によって価格差が大きい。

●現在、解読した塩基配列をデータベースと照合して種を判別する方法は存在するが、多くの時間と労力を要することから日々の品質管理として用いることは難しい。

●これまで生の状態のエビにおける簡便な種判別法を報告したが、エビが加工食品の場合、本手法が有効であるかについての知見は無い。

遺伝子診断技術を用いたエビ種判別法が加工食品に対して有効であるかを調べることを目的とし検討を実施した。

材料および方法

結果① PCR-RFLP法による種判別

結果② PCR法による種判別

総括および考察

サンプル ・形態同定済みクルマエビ（Marsupenaeus japonicus） 10尾

・形態同定済みウシエビ（Penaeus monodon） 10尾

・はんぺん（※原材料：魚肉すり身、卵白、でん粉、砂糖、食塩、発酵調味料、やまいも、小麦たん白、加工でん粉、調味料（アミノ酸等）、増粘多糖類、pH調整剤、酵素）

・片栗粉

・塩

前処理

加工種別 加熱時間 加熱条件 調理器具

a 揚げる 3分 180℃ フライヤー

b 焼く 3分 中火 フライパン・ガスコンロ

c 茹でる 5分 100℃（沸騰水） 鍋・IH調理器

①：クルマエビ ダイス、②：クルマエビ ペースト③：ウシエビ ダイス、④ウシエビ ペースト

遺伝子診断技術による種判別

前処理および加工条件に関わらず、モデル加工食品に使用したクルマエビおよびウシエビを正しく判別できた。

前処理および加工条件に関わらず、モデル加工食品に使用したクルマエビを正しく判別できた。

クルマエビ ウシエビ

①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭

ユニバーサルプライマー

PC

⑮M

はんぺん

Alu I クルマエビ ウシエビ

① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ ⑪ ⑫ ⑬ ⑭

PC

⑮ M

はんぺん

Dra I クルマエビ ウシエビ

① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ ⑪ ⑫ ⑬ ⑭

PC

⑮ M

はんぺん

Dde I クルマエビ ウシエビ

① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ ⑪ ⑫ ⑬ ⑭

PC

⑮ M

はんぺん

Hinf I クルマエビ ウシエビ

① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ ⑪ ⑫ ⑬ ⑭

PC

⑮ M

はんぺん

ユニバーサルプライマーによる増幅結果

4種類の制限酵素による酵素処理結果

種名 前処理 加工方法 種名 前処理 加工方法

① 茹でる ⑦ 茹でる

② 焼く ⑧ 焼く

③ 揚げる ⑨ 揚げる

④ 茹でる ⑩ 茹でる

⑤ 焼く ⑪ 焼く

⑥ 揚げる ⑫ 揚げる

⑬ ⑭⑮ M サイズマーカー

ウシエビPC

はんぺんのみ

クルマエビPC

クルマエビ

ダイス

ウシエビ

ダイス

ペースト ペースト

Noサンプル

Noサンプル

約1cm角にカットしたもの（以下、ダイス）

ペースト状にしたもの （以下、ペースト）

クルマエビ ウシエビ

① ② ③ ④

②

a b c

③

a b c

④

a b c

①

a b c

そこで

電気泳動中のサンプル

混合・加工

前処理済みエビ（①～④） ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 40g

はんぺん ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 35g

片栗粉 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 4g

塩 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1g

DNA抽出 PCR・電気泳動 制限酵素処理・ 電気泳動

種判別

PCR-

RFLP法

PCR法

結果①

結果②

上記「12種類の

モデル加工食品」および「はんぺん」に対し、 Phenol /

Chloroform

Isoamyl alcohol

（PCI）を用いたDNA抽出

ユニバーサルプライマーを用いた

degenerate PCR

クルマエビを特異的に検出可能なクルマエビプライマーを用い

たPCR

増幅した産物の制限酵素処理

バンドパターンによる種判別

バンドの有無による種判別

種名 前処理 加工方法 種名 前処理 加工方法

① 茹でる ⑦ 茹でる

② 焼く ⑧ 焼く

③ 揚げる ⑨ 揚げる

④ 茹でる ⑩ 茹でる

⑤ 焼く ⑪ 焼く

⑥ 揚げる ⑫ 揚げる

⑬ ⑭⑮ M サイズマーカー

ウシエビPC

はんぺんのみ

クルマエビPC

クルマエビ

ダイス

ウシエビ

ダイス

ペースト ペースト

Noサンプル

Noサンプル

電気泳動中のサンプル

●PCR-RFLP法では、ユニバーサルプライマーがエビ以外の生物種にも反

応性を示すことを確認したが、いずれのモデル加工食品においても制限酵素の切断パターンによりエビを正しく種判別出来た。

●PCR-RFLP法は、エビ以外の原材料が含まれる加工食品に対しても種判別できる可能性が示唆された。

●PCR法では、他の原材料に対しても非特異な反応は確認されず、加工条件に関わらずクルマエビを正しく種判別出来た。

遺伝子診断技術を用いたエビ種判別法は、

加工食品にも有効かつ簡便にエビの種判別が可能

12種類のモデル加工食品を作製した。

バンドパターンによる種判別

サイズ：解読した塩基配列から推定した制限酵素処理産物のサイズ

＋ ：推定サイズにバンド検出

＋ ：推定サイズ以外のバンド検出

1 2

切断されない + + + + + + +

320 + + + + + + + +

310 +

244～248 + + + + + + + +

81 + + + + + + + +

67,68,69 + + + + + + + +

A+ A+ A+ A+ A+ A+ A+ A+ C C C C C C C X

430 +

切断されない + + + + + + +

250 + + + + + + + +

142,144 + + + + + + + +

A A A A A A A A B B B B B B B X

切断されない + + + + + + + + + + + + + + + +

321 +

290 +

73 +

A A A A A A A A A B A A A A A A A X

460 +

420 +

切断されない

348,349 + + + + + + + + + + + + + + +

46,47 + + + + + + + + + + + + + + +

A A A A A A A A A A A A A A A X

クルマエビ

クルマエビ

クルマエビ

クルマエビ

クルマエビ

クルマエビ

クルマエビ

クルマエビ

ウシエビ

ウシエビ

ウシエビ

ウシエビ

ウシエビ

ウシエビ

ウシエビ

判定不能

⑫サイズクルマエビ

⑬ウシエビ

⑥ ⑩⑦ ⑧ ⑨ ⑪ ⑭ ⑮

Alu I

区分け

Dra I

区分け

Dde I

② ③ ④ ⑤

種判定 ウシエビ

①

区分け

Hin f I

区分け

C

B

A

+

+

+

+