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Técnicas de
Inmunohistoquímicas
Introducción
¿Que es la Inmunohistoquímica?
• Topología
• Inmunología
• Bioquímica
Introducción
¿Cual es su historia y su relación con la
inmunofluorescencia?
• 1871 Baeyer. Demostración de la unión del Rin y el Danubio (Fluoresceina)
• 1941 Coons Inmunofluorescencia (isocianatos: -N=C=O)
• 1949 Struggers. Utilización del Naranja de acridina en Microscopía de
Fluorescencia
• 1958 Riggs. Inmunofluorescencia (isotiocianatos –N=C=S)
• 1966 Nakane, 1969 Avrameas. Marcado por Peroxidasa de Rábano picante.
Desventajas de la IF
Requiere de Microscopio de luz UV
Material fresco o especialmente procesado
Conservación corta de la muestra
Cito morfología poco definida
Decaimiento de la fluorescencia con el tiempo
Fundamentos de la IHQ
Para comprender mejor el potencial de los métodos de coloración de IHQ,
así como los problemas latentes que pueden estar asociados con los mismos
es necesario tener un conocimiento básico sobre:
Fundamentos de la IHQ
IgM y la inmunización
IgG y la Hiperinmunización
Vida media de las Ig
Fundamentos de la IHQ
Anticuerpos Policlonales
• Especies: conejo, cabra, cerdo, equino
• Facilidad del mantenimineto
• ATC humanos contra proteínas de conejo
son menos frecuentes que para otras
especies
• Los ATC de conejo precipitan mejor
proteínas humanas
• Pools de varios conejos no generan
variaciones en las partidas
• Vías y dósis de inoculación
• Purificación: antisueros o fracción de Ig
Fundamentos de la IHQ
Anticuerpos Monoclonales
• Características
• Producción de monoclonales
• Ventajas: homogeneidad, auscencia de
inespecificidad, ausencia de variabilidad
entre partidas, facilidad en la caracterización
• La especificidad: el epitope debe ser único en
el ATG
Fundamentos de la IHQ
Afinidad entre Anticuerpos
• Afinidad intrínseca: Fuerzas iónicas, de van der Waals, enlaces de H+
• Afinidad funcional: Concentraciones iónicas, T °C, agitación, tiempo
de incubación
Reactividad cruzada entre Anticuerpos
• Entre ATC y dos o mas ATGs
• Entre un ATg y varios ATCs diferentes
• Reactividad cruzada interespecifica y su aplicación científica
Fundamentos de la IHQ
Estabilidad de los Anticuerpos
• Métodos de Purificación: PH, concentraciones salinas,
ATC conjugados con glutaraldehido
• Métodos de Almacenaje.
Manejo de los Anticuerpos
• Envases adecuados
• Temperatura de almacenaje
Fundamentos de la IHQ
Título de los Anticuerpos
• El concepto de la dilución máxima
Dilución de los Anticuerpos
Estreptoavidina-
HRP
Diluciones del ATC Primario
1:50 1:50 1:100 1:200
1:100 1:50 1:100 1:200
1:200 1:50 1:100 1:200
• Tiempo de incubación
• Temperatura de incubación
Fundamentos de la IHQ
Enzimología: Concepto
E +S E.S P + E
Px + H2O2 Px.H2O2 + DAB (cromógeno)
Molécula coloreada + Px + H2O
Fundamentos de la IHQ
Peroxidasa (HRP)
• Tiene un grupo hematina
• Se inhibe por exceso de sustrato
• Cuando se combina con H2O2 libera O2 molecular
Fosfatasa alcalina (AP)
• Transfiere grupos fofato
• No es interferida por la actividad endógena de la perxidasa
• La actividad de fosfatasa alcalina endógena se bloquea con
Levamisol
Fundamentos de la IHQ
Sustratos de la Peroxidasa
• 3, 3´diaminobenzidina DAB)
•3-amino-9-etilcarbazol (AEC)
• 4-chloro-1-naftol (CN)
• P-fenilendiamina dihidroclorhidrico
Sustratos de la Fosfatasa alcalina
• naftol AS- fosfato
• la fuccina nueva
• AS-Bi fosfato
• 5 bromo-4-cloro 3-indoxil fosfato (BCIP)
• Fast red
• Nitro Blue
La Fijación
La fijación como modificación de la
estructura antigénica
• Coagulación de proteínas
• Formación de puentes metileno entre aminoácidos básicos
Tipos de fijadores
• Extendidos de sangre
• Extendidos citológicos
• Cortes de críos tato
• Cortes de Parafina
• Microondas
La Fijación
La Recuperación Antigénica
• El uso de enzimas digestivas
• El uso de soluciones de metales o de citrato alternando con calor
• El uso del calor y presión
• Usos combinados
• La AR en la hibridación in situ
Metodos de Coloración
El Método Directo
El Método Indirecto
Métodos de Coloración
Método indirecto de tres pasos
Técnicas de Complejos
Inmune Solubles de Enzima
Métodos de Coloración
Técnica de (Estrept) Avidina - Biotina
Técnica de LSAB
Métodos de Coloración
Técnica ABC utilizando la amplificación
catalizada de señal (ACS)
Métodos de Coloración
Tecnología de Polímeros Conjugados
Metodo EPOS
• Polímero de Dextrán
• 70 moléculas de Enzima
• 10 moléculas de ATC 1rio
Metodo EnVision
• ATC 2rio unido al polímero de Dextrán
• No usan (estrept)avidina biotina
• Se reduce el tiempo de incubación
• Mayores diluciones de ATC
Métodos de Coloración
Sistema EnVision para la marcación simultánea de varios ATG tisulares
Métodos de Coloración
Los Controles
Para determinar la especificidad de un policlonal es mejor reemplazarlo
con un antisuero preabsorbido o una fracción de Inmunoglobulina.
• Concentración de proteína de la fracción IgG
4.8 g/l, Dil. 1:200. Concentración final: 4.8/200= 0.024g/l
• Fracción de IgG no inmune de conejo
20g/l, Dil. 20 g/l / 0.024 = 833
• Dilución de control negativo de Reactivo:
1:833
Los controles de Reactivo
Métodos de Coloración
Los Controles de Tejido
• Controles de tejido Negativos
• Controles de tejido Positivos
• Controles de Tejido Internos
Los Controles de Técnica
• Controles negativo de ATC 1rio
• Controles negativo de ATC 2rio
El Fondo Interacciones Hidrofóbicas
El Fondo
La actividad de enzimas endógenas
Interacciones por difusión de ATG
El Fondo
• Difusión de Antígeno
• Difusión de proteínas de plasma
Interacciones Misceláneas
El Fondo
• Por fijación inadecuada • Células aplastadas
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