4. Kultivierung von MO pH-Wert –pH 7 = 10 -7 mol/l H + –pH 5 = 10 -5 mol/l H + –bei pH 5 die...

4. Kultivierung von MO

• pH-Wert– pH 7 = 10-7 mol/l H+

– pH 5 = 10-5 mol/l H+

– bei pH 5 die [H+] verdoppeln: -log (2*10-5) = pH 4,7

– pH Meter:• pH Elektrode• elektrochemische

Potentialmessung• hohe Genauigkeit

4. Kultivierung von MO

• pH-Wert– pH 7 = 10-7 mol/l H+

– pH 5 = 10-5 mol/l H+

– Indikatorfarbstoffe• rel. ungenau• auf Stäbchen

aufgebracht – Mischung verschiedener Farbstoffe

4. Kultivierung von MO

• pH-Wert– Puffer:

• wässrige Lsgen von Substanzen oder Substanzgemischen, die Wasserstoff bzw. Hydroxidionen abfangen oder nachliefern können, wodurch der pH-Wert in bestimmen Grenzen gehalten werden kann

• nach Puffertabellen (zB.: Geigy oder Küster, Thiel: Rechentafeln für die Chemische Analytik, De Gruyter) werden Puffergemische hergestellt (2 bis 4 verschiedene Lsgen)

– für verschiedene pH Werte unterschiedliche Pufferlösungen

• für Nährböden oft anorganische Phosphate• org. Pufferbestandteile können von MO abgebaut werden

(bspw. Citrat oder Acetat)

aus: Geigy: Wissenschaftliche Tabellen

4. Kultivierung von MO

• Gefäße – Laborglasware– Schottflaschen:

• Nährmedienherstellung mit Dispenser

• Aufbewahrung (Schraubverschluss)

• NICHT geeicht

– Erlenmeyerkolben• Nährmedienherstellung• Kulturgefäß: erleichtert

Gasaustausch (aerob)• „Allzweckglas“• NICHT geeicht

4. Kultivierung von MO

• Gefäße – Laborglasware– Schottflaschen:

• Nährmedienherstellung mit Dispenser

• Aufbewahrung (Schraubverschluss)

• NICHT geeicht

– Erlenmeyerkolben• Nährmedienherstellung• Kulturgefäß: erleichtert

Gasaustausch (aerob)• „Allzweckglas“• NICHT geeicht

4. Kultivierung von MO

• Gefäße – Laborglasware– Messzylinder

• auf „ex“ geeicht• Zugabe eines bestimmten

Volumens

– Messkolben• auf „in“ geeicht• zur Herstellung definierter

Lösungen (z.B. „molare Lsgen“ (1 M KH2PO4))

• einwiegen und bis zur Marke auffüllen

4. Kultivierung von MO

• Gefäße – Laborglasware– Pipetten:

• Glaspipetten (Skalierung), Messpipetten• Vollpipetten (ähnlich Messkolben mit einer

Marke)• Kolbenhubpipetten mit Plastikspitzen

4. Kultivierung von MO

• Gefäße – Laborglasware– Glasqualität:

• verschiedene Sorten/Qualitäten• Borosilicatglas am besten geeignet

– Markennamen: Pyrex, Duran, Solidex– hohe chemische Beständigkeit– sehr hitzebeständig (bis zu 200 °C bei dickwandigen

Gefäßen)

• Quarzglas:– Photometrie: UV-Durchlässigkeit bis 180 nm

4. Kultivierung von MO

• Gefäße – Kulturgefäße

4. Kultivierung von MO

• Herstellung von Agarplatten– Einwiegen der NM Bestandteile– Zugabe von Wasser– (ev. zum vollständigen Lösen erwärmen bzw. aufkochen)– Zugabe von Agar– Nährboden (Nährmedium mit Agar) wird autoklaviert– (ev. im Wasserbad/Wärmeschrank bei ca. 50°C warmhalten)– NB wird unter aseptischen Bedingungen in sterile

Petrischalen gefüllt („gegossen“) - LF– Agarplatte = eine Petrischale mit ca. 20 ml Nährboden– Platten abkühlen lassen damit der Agar fest wird– Petrischalen beschriften (Unterseite)– zur weiteren Bearbeitung fertig– Aufbewahrung im Kühlschrank (4 °C Raum)

4. Kultivierung von MO

• Herstellung von Schrägagarröhrchen– Einwiegen der NM Bestandteile– Zugabe von Wasser– (ev. zum vollständigen Lösen erwärmen bzw. aufkochen)– Zugabe von Agar– Nährboden (Nährmedium mit Agar) wird autoklaviert– (ev. im Wasserbad/Wärmeschrank bei ca. 50°C warmhalten)– NB wird unter aseptischen Bedingungen in sterile Röhrchen

gefüllt: ca. 5 bis 10 ml je Röhrchen– auf Ablage schräg ablegen (z. B. auf Pipette o.Ä.)– abkühlen lassen – beschriften – zur weiteren Bearbeitung fertig– Aufbewahrung im Kühlschrank (4 °C Raum)

4. Kultivierung von MO

• Abfüllen von NL– Herstellung des gewünschten Vol. an NL– Abfüllen in entsprechende Kulturgefäße (z.B.

Erlenmeyerkolben, Eprouvetten)– Kolben mit Wattestopfen verschließen, Eprouvetten

mit Überwurfkappe– Watte mit Alufolie abdecken– autoklavieren– abkühlen lassen (ev. im kalten Wasserbad)– Lagerung auf 4°C– (bei Platzmangel wird das gesamte Vol autoklaviert,

gelagert und erst bei Bedarf in separat sterilisierte Gefäße abgefüllt)

4. Kultivierung von MO

• Impftechniken– „beimpfen“ = Übertragung einer gewissen Menge an lebens-

und vermehrungsfähigen Materials (MO) in ein geeignetes Medium

– „Inokulum“ = vermehrungsfähige Mikroorganismen, susp.– als Inokulum kommen Reinkulturen auf Agarplatte oder NL,

aber auch Mischkulturen (meist in NL) in Frage– Größe des Inokulums kann variiert werden (Fragestellung)

• für Reinkulturgewinnung: wenig Inokulum auf Impföse auf eine Agarplatte überimpfen

• Anreicherung von MO: z.B. over-night Kultur als Versuchsvorkultur

• Zugabe einer definierten Menge mit definierter Zell- oder Keimzahl (z.B. aus Vorkultur)

4. Kultivierung von MO

• Impftechniken– Grundregeln:

• Arbeiten unter dem Laminar-Flow (aseptische Bedingungen, Personenschutz)

• Kulturgefäße (inkl. Inhalt) müssen steril sein • Arbeitsgerät muß steril sein (Impföse, Spartel,…)• Kulturgefäße werden vor dem Überimpfen mit Inhalt (NL),

Kulturname und eigenem Namen versehen (wasserfester Stift !!!)

• nach Lagerung im Kühlschrank sollte NL angewärmt werden (je nach Org.)

• niemals in Gefäße greifen, immer am unteren Rand anfassen

• beim Überimpfen ruhig und sicher arbeiten

4. Kultivierung von MO

• Impftechniken– Arbeitsgeräte

4. Kultivierung von MO

• Impftechniken– Arbeitsgeräte

4. Kultivierung von MO

• Impftechniken– Ausglühen der Impföse/ -nadel

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– statische (batch) Kultur

• wird einmal angesetzt und stellt damit ein geschlossenes System dar

• z.B.: in einen EK mit 100 ml NL wird E. coli überimpft und 10 Tage inkubiert

• relativ einfach und im normalen Laboralltag weit verbreitet• z.B. für Vorkulturen

– kontinuierliche Kultur• im Chemostaten• nach Maßgabe wird Medium nachgefüttert, der pH Wert korrigiert

o.Ä.• kein geschlossenes System• oftmals aufwändig, relativ lange Vorbereitungszeiten• im Normalfall aber recht gut reproduzierbar

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Temperatur

• jeder MO hat eine optimale Wachstumstemp. (jene Temp. mit der maximalen Wachstumsrate) (z.B. E. coli 37 °C, B. stearothermophilus 55 °C, B. psychrophilus 18 °C)

• ABER: Wachstumsbereich (z.B. E. coli zw. 30 und 37 °C)• van‘t Hoffsche Regel: eine Erhöhung der Temp. um 10°C

(unterhalb des Optimums!!!!) bewirkt eine (ca.) Verdopplung der Wachstumsrate bei den meisten Bakterien (Anhalt)

• Bebrütungstemp. hat nicht nur Auswirkung auf Wachstumsrate, sondern z.B. auch auf die chemische Zusammenseztung von Zellen (Bsp. Serratia marcescens: Einlagerung von rotem Pigment bei 30°C, weißliche Kultur bei 37°C)

Serratia marcescens bei 30 inkubiert Serratia marcescens bei 37 inkubiert

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Temperatur

• mesophil: max. Wachstumsrate bei 20 bis 42°C• thermotolerant: Wachstum bis 65°C• thermophil: Max. WR bei 42 bis 70°C• extem thermophil/hyperthermophil: Wachstum

bis zu 100°C• psychrophil/kryophil: Temp. Optimum unter 20°C

und Minimum bis zu -5°C

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Temperatur

• meist mesophile Organismen: 30 °C

• Meschen-/Tierpathogene: bei 35 – 37 °C

• Bodenmikrooganismen: bei 20 bis 25 °C

• Pilze (inkl. Hefen): 20 bis 25 °C

• Inkubation in Temperaturschränken (Heiz-/Kühlschrank), aber auch im Wasserbad

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Licht

• chemotrophe Org. brauchen kein Licht für ihr Wachstum (Energie kommt aus der Oxidation org/anorg. Substrate, sondern kann ev. schädigen (Photooxidation)

• chemotrophe Org. werden im Dunkel inkubiert• Phototrophe: Licht als (Haupt-)Energiequelle• Sporulation: für manche Pilze wird zur Induktion

der Sporulation Licht eingesetzt

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

• strikt aerob: atmen O2 (Elektronenakzeptor) wachsen bei O2 Konz. der Luft (21%) (z.B. Azotobacter, Pseudomonas):

• mikroaerophil: atmen O2, wachsen jedoch nur bei niedrigeren O2 Konz. <21% (z.B. Campylobacter)

• strikt anaerob: O2 kann zur Energiegewinnung nicht verwendet werden (toxisch) (z.B. Clostridium, Desulfovibrio)

• aerbotolerant: Wachstum mit und ohne O2, Energiegewinnung jedoch ausschließlich durch Gärung (z.B. Milchsäurebakterien)

• fakulativ anaerob: Wachstum mit und ohne O2, können zwischen Atmung und Gärung umschalten

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

• Oberflächenkultur:– auf Agar: ausreichende O2 Versorgung, Austrocknung

• Zweiphasenkultur:– Agarplatte mit Flüssigkeit überschichtet

• Deckenkultur:– Wachstum als Haut an der Oberfläche (v.a. Pilze,

schleimbildende MOs)– stehend inkubieren

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

• Submerskultur:– submers = „untergetaucht“

– MOs werden in Flüssigkeit subspendiert (und meist geschüttelt)

– je größer die Phasengrenzfläche, desto mehr O2 löst sich in der Flüssigphase

» Schütteln: Rundschüttler (kreisförmig), Längsschüttler (hin-her), Over-head Schüttler (kreisförmig über Deckel)

» Rühren

» Art des Gefäßes (Schikanen)

» Einleiten von Luft

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

• Submerskultur:– Löslichkeit von O2 in wässrigen Lsgen abhängig von:

» Temperatur» Salzkonzentration

– bei 30°C sind ca. 7 mg O2 gelöst (0,22 mmol) = für die Oxidation von ca. 6,5 mg Glk notwendig

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

• mikroaerobe Inkubation– bei O2 Gehalten zw. 1 und 15 % (v/v)

– Kultivierung auf halbfesten NB (ca. 4 g Agar)» „Stichagar“: durch die Schichtung im Agar entsteht

ein Gradient in der O2 Konz. und die Org. wachsen an jenen Stellen, die für sie die richtige O2-Konz. bereitstellen

– Kultivierung im Anaerobiertopf mit Gasphasengeneratoren auf herkömmlichen festen Agarplatten (ca. 20 g Agar)

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

• mikroaerobe Inkubation– fakultativ anaerobe MO

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

• mikroaerobe Inkubation– fakultativ anaerobe MO

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

• anaerobe Inkubation– Produkte des molekularen Sauerstoff toxisch (z.B.

H2O2)– große Unterschiede in der Sauerstoffempfindlichkeit

(Methanosarcina thermophilia > Clostridium tetani > Clostridium acetobutyricum)

– Redoxpotential (E`0 [mV]):» Standard NL: ca. +400 mV hpts. durch das

Redoxsystem ½ O2 + 2 e- → O2-

» Methanogene wachsen erst ab ca. -250 bis -300 mV

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

• anaerobe Inkubation– Redoxpotential:

» durch Aufkochen einer NL wird O2 aus dem Medium getrieben

» Restsauerstoff: Zugabe eines reduzierenden Stoffes: L-Cystein, Na-Thioglycolat, Na-Sulfid

» Redoxindikatoren: Methylenblau (E`0 = +11 mV), Resazurin (E`0 = -51 mV), Phenosafranin (E`0 = -252 mV)

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

• anaerobe Inkubation– Arbeiten mit Anaerobiern:

» NM autoklavieren und schnell abkühlen (ohne zu schütteln)

» Nährböden schnell verwenden und im Anaerobiertopf inkubieren

» flüssige NM für strikte Anaerobier mit Widdelkolben abfüllen

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

• anaerobe Inkubation– Anaerobiertopf:

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

• anaerobe Inkubation» Widdelkolben:

4. Kultivierung von MO

• Bebrütung – Inkubation– Einflussfaktor Sauerstoff

• anaerobe Inkubation– Arbeiten mit Anaerobiern:

» Wright-Burri Röhrchen

5. Anreicherung und Isolierung

• MO kommen in der Natur fast ausschließlich als Mischpopulationen vor

• viele unterschiedliche MO bzw. Stämme mit einer Vielzahl an physiologischen Voraussetzungen

• für eine aussagekräftige Beschreibung von MO ist in der Regel eine Reinkultur notwendig

• sind in einem Habitat nur geringe Abundanzen des Zielorganismus‘ zu finden, so muss eine Anreicherungskultur angelegt werden, die Bedingungen schafft, welche den Org. physiologisch bevorzugen

5. Anreicherung und Isolierung

• Anreicherungskultur:– setzt Kenntnis über Zielorganismus voraus– als geschlossenes System: batch-Ansatz– zumeinst in synthetischem Flüssigmedium –

erleichtert die Manipulation (z.B. Austausch eines Salzes oder einer C-/N-Quelle)

– Inokulation mit der Probe (Bodenextrakt, Schlamm etc.)

– Medium richtet sich nach den Rahmenbedingungen der Probe (Bodenprobe mit tiefem pH Wert – Medium mit niedrigem pH Wert etc)

5. Anreicherung und Isolierung

• Beispiel Anreicherungskultur:– Sulfatreduzierende Bakterien (SRB) – Desulfovibrio

• zu finden in Sedimenten, eutrophen Gewässern, Faulschlamm, Abwasserleitungen (!!)

• benötigt div. Endprodukte anaerober Abbauwege als Elektronendonatoren und C-Quellen

• Sulfat als Elektronenakzeptor

• es bildet sich H2S

• anaerobe Bedingungen

• niedriges Redoxpotential E`0 = < -100 mV

5. Anreicherung und Isolierung

• Beispiel Anreicherungskultur:– Sulfatreduzierende Bakterien (SRB) – Desulfovibrio

• Herstellen eines NB mit Salzen, Laktat, Hefeextrakt und FeSO4

• zum NB eine sterilen Eisennagel (ausglühen) zugeben (senkt das Redoxpotential)

• z.B. in Wright-Burri Röhrchen füllen• mit z.B. Sediment inokulieren• einige Tage bei 30°C inkubieren• Auswertung:

– Kulturen durch deutlich schwarz-Färbung erkennbar– sitzen oft auf Eisennagel (schwarzer Belag)– Mikroskop: kleine gekrümmte Stäbchen, g-

– Geruch nach Schwefelwasserstoff (!!!!)

5. Anreicherung und Isolierung

• Beispiel Anreicherungskultur:– Sulfatreduzierende Bakterien (SRB) –

Desulfovibrio

Wasserstoffver-brauch lässt Röhrchen (b) absinken, bzw. drückt NL in Flasche II (d)