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SIBS – SOCIETA’ ITALIANA DI BIOLOGIA SPERIMENTALE
85° CONVEGNO SIBS
LA BIOLOGIA SPERIMENTALE:
DALLE MOLECOLE ALL’ORGANISMO
Aula Magna dell’Università di Parma
29 - 30 novembre 2012
2 |
Con il patrocinio di:
Università degli studi di Parma
Accademia ligure di scienze e lettere
Museo di storia naturale di Parma
Provincia di Parma
Comune di Parma
Si ringraziano:
Stardea S.r.l.
Physik Instrumente (PI) S.r.l.
| 3
PRESIDENTE NAZIONALE
Emma Rabino Massa –Università degli studi di Torino
VICE PRESIDENTE
Proto Pippia – Università degli studi di Sassari
SEGRETARIO NAZIONALE
Giovanni Pizzuti – Università degli studi di Napoli Federico II
COMITATO ORGANIZZATORE
M. G. Bridelli - Università degli studi di Parma
R. Antolini - Università degli studi di Trento
M. Cocchi - Università degli studi di Bologna
M. A. Dessì - Università degli studi di Cagliari
L. Pane - Università degli studi di Genova
P. Pippia - Università degli studi di Sassari
G. Pizzuti - Università degli studi di Napoli Federico II
E. Rabino Massa - Università degli studi di Torino
COMITATO SCIENTIFICO
M. G. Bridelli
S. De Iasio
M. Miragoli
E. Polverini
M. Zaniboni
| 4
Sommario
LETTURA MAGISTRALE “GAETANO QUAGLIARIELLO” ....................................... 7
Dal neurone al comportamento: il sistema mirror e la cognizione sociale ........................................ 7
COMUNICAZIONI ORALI .................................................................................................. 9
Sindrome metabolica .................................................................................................................... 11
Simmetrie e rotture di simmetrie tra biologia molecolare, disturbi dell’umore ed emergentismo
personalistico. ................................................................................................................................... 11
Sindrome metabolica e performance cognitiva nell’anziano ........................................................... 13
Sindrome metabolica ........................................................................................................................ 13
Metabolic syndrome and cardiovascular risk: contribution of ultrasonography.............................. 17
Fisiologia cardiaca ........................................................................................................................ 19
A protocol which combines current – and voltage-clamp provides a novel useful three-dimensional
representation of the cardiac action potential ................................................................................. 19
Spontaneous electrical activity of guinea pig sinoatrial cells under modulation of two different
pacemaker mechanisms ................................................................................................................... 20
Single low-intensity premature stimuli can induce ventricular arrhythmias in the normal heart .... 23
Antropologia ed evoluzione molecolare ........................................................................................ 25
Complementarietà di spettroscopia FT-IR ed analisi istologiche per lo studio del degrado della
pelle mummificata. ........................................................................................................................... 25
Stature estimation using mandibular morphometric parameters in Italian population: a
preliminary report............................................................................................................................. 26
Variabilità di marcatori uniparentali in popolazioni italiane a diverso grado di isolamento ............ 28
Ancient DNA studies: new perspectives on old samples .................................................................. 28
Mine, yours, ours? sharing data on human genetic variation .......................................................... 29
Metodologie e tecniche della biologia sperimentale...................................................................... 30
Light regulated enzyme activities ..................................................................................................... 30
Towards nano-physiology in mammalian cells: a multi-parametric analysis with scanning ion
conductance microscopy .................................................................................................................. 30
Biomolecular NMR, a versatile tool for the understanding of protein science; retinoid-binding
proteins as an example ..................................................................................................................... 32
Application of the multiuse encapsulator agent F-500 for environmental remediation .................. 33
A photochromic bacterial photoreceptor as a novel tool for super-resolution microscopy ............ 35
Study of the interaction of myelin basic protein with membranes by means of molecular dynamics
simulations ........................................................................................................................................ 36
Modulation of the photocycle of a flavin-based photoreceptor by site-directed mutagenesis ....... 37
Aspetti non-algoritmici della biologia quantistica ............................................................................ 37
Verso un modello generale della dinamica del citoscheletro ........................................................... 39
Nuove metodologie per antichi rimedi: il caso del fungo di malta ................................................... 41
| 5
POSTER .............................................................................................................................. 44
P01-Qualitative comparision of olive oil mediterranean ................................................................. 44
P02-The control of abstinence in the treatment of alcohol dependence: the use of acamprosate in
relapse prevention. .......................................................................................................................... 45 P03-Relationship between maximal fat oxidation and oxygen uptake: comparison between patients
with type 2 diabetes and healthy sedentary subjects. ....................................................................... 47 P04-The influence of hypocaloric diet, associated with moderate physical activity and CBT
(cognitive behavioral therapy), on self-esteem and self-efficacy and their modulator role on
emotional eating. .............................................................................................................................. 49
P05-Cellular drug delivery system based on vaterite particles ....................................................... 50
P06-Modelli biologici di stress ossidativo per lo studio delle proprietà antiossidanti del carciofo . 50 P07-Cardiac regeneration by pharmacologically active microcarriers releasing growth factors
and/or transporting adipose-derived stem cells ................................................................................ 52
P08-Micro-Raman mapping of bio-carbonates and polyenic pigments in corals and shells ........... 54
P09-La popolazione del vergante attraverso lo studio dei cognomi ................................................ 55
P10-Ricerche sulla popolazione di Giaglione (TO) in epoca preunitaria .......................................... 56
P11-Distribution and phylogeny/distance-trees of prokaryotic photoreactive domains ................ 58
P12-Biomarcatori per la diagnosi precoce del tumore al polmone ................................................. 58
P13-Comparative analysis of cytotoxic effects INDUCED BY N4-ethylmorpholine
citronellalthiosemicabazone complexes in different human cancer cell lines ................................ 60
P14-Effetti citotossici degli ossidi di cobalto e di titanio su cellule A549. ....................................... 62
P15-Enzimatic biomarkers in the gilthead seabream juveniles fed with graded concentrations of
alchylphenols ................................................................................................................................... 63
P16-Hepatic activities in Sparus Aurata L. juveniles fed with bisphenol A enriched diet. ............... 64
P17-K:D-Rib un inibitore della proliferazione delle cellule tumorali ed un promotore del folding di
DNAzima. ......................................................................................................................................... 65
P18-Contenuto e mappa di distribuzione del magnesio intracellulare in cellule farmaco-resistenti e
-sensibili ........................................................................................................................................... 66
P19-Modificazioni del contenuto intracellulare di magnesio durante l’apoptosi mitocondrio-
mediata: studi degli eventi precoci correlati al potenziale mitocondriale....................................... 68
P20-Valutazione dell’efflusso di magnesio indotto da cAMP in cellule HL60 mediante un nuovo
chemosensore fluorescente derivato dall’8-idrossichinolina .......................................................... 69
P21-Nuove prospettive nella determinazione del magnesio intracellulare ..................................... 70
P22-La carenza di magnesio inibisce la progressione del ciclo cellulare in cellule di osteosarcoma
umano .............................................................................................................................................. 71
P23-Behavior of classical and non-classical soluble HLA class I molecules in patients with chronic
hepatitis C virus infection before and after pegylated interferon and ribavirin treatment: potential
role as markers of immune activation and response to antiviral treatment. .................................. 72
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LETTURA MAGISTRALE “Gaetano Quagliariello”
Dal neurone al comportamento: il sistema mirror e la cognizione
sociale
Leonardo Fogassi
Dipartimento di Neuroscienze, Università di Parma
Nella concezione classica si considerava che le funzioni cognitive fossero il risultato di un livello
superiore di elaborazione sensoriale, lasciando alla corteccia motoria un ruolo prevalentemente
esecutivo. Gli studi neuroanatomici e neurofisiologici delle ultime due decadi hanno rivoluzionato
questo concetto, portando al riconoscimento che dal sistema motorio possano emergere numerose
capacità cognitive. Un ottimo esempio di tali capacità è il sistema dei neuroni mirror, originariamente
scoperti nella corteccia premotoria della scimmia. Questi neuroni si attivano sia quando una scimmia
esegue un atto motorio finalizzato (ad esempio afferrare un oggetto) sia quando osservano un altro
individuo svolgere lo stesso atto. Tale funzione è resa possibile dal fatto che la corteccia motoria
contiene le rappresentazioni degli atti motori contenuti nel repertorio della specie. Confrontando
quindi l’atto svolto da un altro individuo con la rappresentazione motoria dello stesso atto è possibile
comprendere automaticamente lo scopo del comportamento altrui. Se nella scimmia la comprensione
degli atti altrui è probabilmente la funzione preminente del sistema mirror, nell’uomo un sistema
omologo, dimostrato nella corteccia parieto-frontale, sottostà verosimilmente a svariate funzioni
sociali. Tra le funzioni proposte vi sono l’imitazione, la comprensione dell’intenzione altrui, la
comprensione del linguaggio e l’empatia. Numerosi studi ormai hanno dimostrato la presenza del
sistema mirror nell’uomo e il suo coinvolgimento nelle funzioni suddette. Per il futuro, tre nuovi
sviluppi della ricerca su tale sistema neuronale sembrano essere promettenti. Uno è l’investigazione di
come la funzione di “rispecchiamento” si sviluppi nel bambino e quale ne possa essere il ruolo. Studi
comportamentali, neurofisiologici e di neuroimmagine suggeriscono che il sistema mirror sia già
presente precocemente nell’ontogenesi e abbia un ruolo importante nello sviluppo della comprensione
dell’azione e, verosimilmente, nell’intersoggettività. Un secondo sviluppo riguarda lo studio delle
sindromi che possono coinvolgere il sistema mirror, quali, ad esempio, l’autismo. Negli ultimi anni
svariati lavori convergono nel proporre che un’anomalia nell’organizzazione del sistema mirror o del
sistema motorio ad esso soggiacente, possano spiegare alcuni degli aspetti sociali di tale sindrome. Il
terzo sviluppo rappresenta la possibilità di utilizzare le proprietà del sistema mirror per riabilitare
adulti e bambini con deficit motori, basandosi su terapie osservazionali. Alcuni studi di questi ultimi
anni sembrano suggerire un effetto positivo di queste terapie, in parallelo a modificazioni plastiche
delle aree contenenti il sistema mirror.
| 11
Sindrome metabolica
Simmetrie e rotture di simmetrie tra biologia molecolare, disturbi
dell’umore ed emergentismo personalistico. 1,2
M. Cocchi, 1F. Gabrielli
1Istituto “Paolo Sotgiu” per la ricerca in Psichiatria e Cardiologia Quantitativa e Quantistica
2Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie
Il ruolo della membrana cellulare (neurone e piastrina)
La membrana delle cellule del cervello sembra offrire una via promettente verso una migliore
comprensione della psicopatologia nei suoi differenti aspetti: Depressione Maggiore, Disturbo
Bipolare e le loro conseguenze sul deficit cognitivo. Diversi approcci hanno fornito elementi di prova
a proposito di quest’argomento. In particolare, un'ampia letteratura scientifica supporta il
suggerimento del gruppo di Rasenick, cioè, che le piastrine umane servano come marcatori biologici
per la depressione.
Altri autori, vale a dire Cocchi e Tonello (1, 2, 3) hanno studiato le membrane delle piastrine di
soggetti depressi, evidenziando i profili degli acidi grassi come possibile misura dello stato di
membrana.
In particolare, hanno confrontato il profilo delle piastrine degli acidi grassi di membrana di un gruppo
di soggetti clinicamente depressi contro un gruppo di soggetti sani. I risultati ottenuti con l’impiego di
una Rete Neurale Artificiale, nei due gruppi, hanno evidenziato la possibilità di classificare i Disordini
dell’Umore dalla cosiddetta normalità e, all’interno dei Disordini dell’Umore, di distinguere i soggetti
con Depressione Maggiore da quelli con Disordine Bipolare. I risultati, inoltre, degli esperimenti degli
autori sembrano molto coerenti con quelli ottenuti sulle proteine-G e sulle zattere lipidiche di
membrana delineati dal gruppo di Rasenick.
La membrana cellulare vive, dunque, in una costante condizione di mobilità e, quando le oscillazioni
degli acidi grassi varcano gli intervalli di tolleranza della membrana, possono essere espressi
fenomeni patologici.
“The mechanical factors of membrane lipids constitute lipid dependent factors that can dramatically
affect protein functions or protein-protein interactions (4). In realtà la costante condizione di mobilità
della membrana, sia per livelli fisiologici sia sconfinando in conseguenze patologiche, si traduce in
una deformazione della stessa a diversi livelli d’intensità con conseguenze che coinvolgono il raft
lipidico di membrana, la proteina Gsα e il citoscheletro (5).
Adhesion between membrane and cytoskeleton is influenced by a number of factors, including the
lipid composition, cytoskeleton density and distribution, membrane surface area–to-volume ratio, and
internal cellular pressure (6).
In letteratura sono state ampiamente descritte le risposte alle modificazioni indotte sul citoscheletro da
forze di tipo meccanico (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14) esercitate sulla membrana.
Tutte le conoscenze acquisite, lo studio delle ipotesi quantistiche della coscienza, l’opportunità del
dialogo che si è aperto all’interno del Quantum Paradigm Psychopathology Group (QPP), tutto questo
ha certamente contribuito alla costruzione di un nuovo tentativo d’ipotesi che parrebbe potere
conciliare quelle precedenti le quali, in realtà, sono solamente frutto di modi diversi di guardare allo
stesso fenomeno.
Lo stato di continuo rinnovo e scambio di acidi grassi da parte della membrana con conseguente
deformazione del bilayer lipidico, può essere pensato nei termini di una forza meccanica, sia in
condizioni fisiologiche sia patologiche, che si esercita sul citoscheletro con carattere di continuità
consentendo, quando sussistano condizioni fisiologiche per la membrana, periodi di decoerenza dei
microtubuli (500ms), che danno origine alla manifestazione cosciente che si tradurrà in coscienza
12 |
classica, neurocorrelata.
Il problema che si pone è di comprendere come, nelle diverse condizioni dei disordini dell’umore, la
decoerenza possa modificarsi allungando o accorciando il periodo (< o > di 500ms).
Avendo avuto la possibilità di comprendere che una maggiore mobilità della membrana caratterizza
la DM e una minore il DB, si è percepito che esistono condizioni patologiche di deformazione della
membrana che possono esercitare differenti forze meccaniche sul citoscheletro dall’interno della
stessa membrana e che potrebbero compromettere il fisiologico fenomeno di superposition dei
microtubuli e conseguentemente il periodo di oscillazione.
Nel caso del DB ci sarebbe un accorciamento del periodo di decoerenza mentre nel caso della DM un
allungamento.
A questa eventualità potrebbero corrispondere, in casi di estrema criticità dei tempi di decoerenza,
profonde e decisive modificazioni dello stato cosciente.
Avendo dimostrato che fra DM e DB esiste una rottura di simmetria, tenendo sempre presenti le
caratteristiche di mobilità della membrana, che esiste un”domain wall” governata da forze
elettromagnetiche che sono verosimilmente l’unica forma di comunicazione fra i due fenomeni (DM e
DB) e che l’unica cosa, pertanto, che può accumunare le due condizioni è il suicidio, sembra coerente
pensare che tal evento possa realizzarsi per condizioni critiche dell’allungamento o accorciamento
dei periodi di decoerenza, quindi della capacità di coscienza.
Questa forza, che nel caso del neurone potrebbe essere definita “neuromeccanica”,
rappresenterebbe, di fatto, l’elemento condizionante la cabina di regia dei microtubuli e
condizionante il loro rapporto di criticità con le sinapsi, la corteccia e la serotonina (15).
L’accostamento ai processi di coscienza, nelle loro dinamiche normali e patologiche, non puó,
tuttavia, fissarsi su elementi e piani isolati, osservabili da un osservatore privilegiato e distaccato,
bensì pensando, e agendo operativamente, per connessioni, relazioni, reti. Il tutto, sempre nella
convinzione che la scienza è narrazione di un mondo espressivo di stati emergenti - per questo mai
riducibile alla semplice somma dei suoi ingredienti elementari - e in cui le rotture di simmetria
garantiscono molteplicità, creatività, vitalità, nel segno dell’autorganizzazione naturale, dell’evolversi
dei sistemi, grazie alle rotture spontanee di simmetrie, verso stati vieppiú complessi e imprevedibili,
tra cui la persona come relazione emergente.
Bibliografia
1. Cocchi M, Tonello L (2010). Bio molecular considerations in Major Depression and Ischemic Cardiovascular Disease.
Central Nervous System Agents in Medicinal Chemistry.10: 2, 97-107.
2. Cocchi M, Tonello L, Rasenick Mark M (2010) Human depression: a new approach in quantitative psychiatry. Annals of
General Psychiatry. 9:25.
3. Tonello L, Cocchi M. (2010). The Cell Membrane: Is it a Bridge from Psychiatry to Quantum Consciousness?
NeuroQuantology. 8: 1, 54-60.
4. McIntosh TJ, Simon SA (2006) Roles of bilayer material properties in function and distribution of membrane proteins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36:177–98.
5. Cocchi M, Gabrielli F, Tonello L, Pregnolato M (2010) The Interactome Hypothesis of Depression. NeuroQuantology, 4:
603-613).
6. Sheetz MP, Sable JE and Döbereiner HG (2006) Continuous Membrane-Cytoskeleton Adhesion Requires Continuous
Accommodation to Lipid and Cytoskeleton Dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35:417–34.
7. Chifflet S and Hernandez JA (2011) The PlasmaMembrane Potential and the Organization of the Actin Cytoskeleton of Epithelial Cells, International Journal of Cell Biology Volume 2012 Article ID 121424, 13 pages, doi:10.1155/2012/121424.
8. Sun M, Northup N, Marga F, Huber T, Byfiel dFJ, Levitan I and Forgacs G (2007) The effect of cellular cholesterol on
membrane cytoskeleton adhesion, J Cell Sci 120: 2223-31. 9. Yap B, Kamm RD (2005) Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow
channels. J Appl Physiol 99: 2323–2330.
10. Hoover RL, Fujiwara K, Klausner RD, Bhalla DK, Tucker R, Karnovsky MJ (1981) Effects of Free Fatty Acids on the Organization of Cytoskeletal Elements in Lymphocytes, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY 10: 939-948.
11. Apodaca G (2002) Modulation of membrane traffic by mechanical stimuli. AJP-Renal Physiol 282: F179-F190.
12. Namikoshi M, Suzuki S, Meguro S, Kobayashi H, Mine Y and Kasuga I (2002) Inhibitors of Microtubule Assembly Produced by the Marine Fungus Strain TUF 98F139 Collected in Palau. Journal of Tokyo University of Fisheries 88: 1-6.
13. Janmey P. (1995) Cell Membranes and the Cytoskeleton, Chapter 17, Handbook of Biological Physics, Volume 1, edited
by R. Lipowsky and E. Sackmann, Elsevier Science B.V. 14. Janmey PA, and McCulloch CA (2007) Cell Mechanics: Integrating Cell Responses to Mechanical Stimuli, Annu. Rev.
Biomed. Eng 9:1–34.
| 13
15. Cocchi M, Tonello L, Gabrielli F, Pregnolato M. & Pessa E. (2011). Quantum Human & Animal Consciousness: A
Concept Embracing Philosophy, Quantitative Molecular Biology & Mathematics. Journal of Consciousness Exploration &
Research, 2: 547-574).
Corresponding Author: Massimo Cocchi e-mail massimo.cocchi@unibo.it
Sindrome metabolica e performance cognitiva nell’anziano
Marianna Rinaldi (1)
, Giuseppe Graffi (2)
, Salvatore Gallone (3)
, Emma Rabino Massa.(1)
(1) Laboratorio di Antropologia, Dipartimento di Biologia Animale e dell’Uomo, Università degli
Studi di Torino, Via Accademia Albertina 13, 10123 Torino, (2)
ASL TO3, Distretto di Susa, piazza
San Francesco 4, 10059, Susa (TO), (3)
Laboratorio di Neurogenetica, Dipartimento di Neuroscienze,
Via Cherasco 15, 10126 Torino.
La Sindrome Metabolica (MetS) è un insieme di alterazioni ognuna delle quali rappresenta di per sé
un fattore di rischio cardiovascolare (obesità di tipo centrale, iperglicemia, dislipidemia ed
ipertensione). In diversi studi recenti la MetS è stata correlata ad un accelerato declino cognitivo in età
senile. Il nostro studio si è proposto di analizzare la relazione tra MetS e performance cognitiva in un
gruppo di anziani appartenenti ad alcune comunità rurali della Val Cenischia (Piemonte).
È stato reclutato un campione di 199 persone (111 donne e 88 uomini) di età superiore ai 60 anni in
cui è stata valutata la presenza di MetS secondo i criteri diagnostici previsti dal NCEP ATP III
aggiornato (2004). Inoltre ad ogni paziente è stato somministrato il Mini Mental State Examination
(MMSE) per valutarne lo stato cognitivo.
La prevalenza della MetS nel campione esaminato è pari al 50,3% (donne: 49,5%; uomini: 51,3%). I
dati relativi al MMSE rivelano un declino cognitivo nel 10,1% del campione (MMSE 23,9). Il 6,6%
del campione presenta risultati borderline (MMSE tra 24,0 e 24,9), mentre l’83,3% ottiene un
punteggio normale (MMSE 25,0).
I risultati confermano il legame esistente tra sindrome metabolica e peggiori performance cognitive
nell’anziano in quanto dall’elaborazione dei dati emerge che esiste una associazione significativa tra
punteggi borderline al test MMSE e presenza di sindrome metabolica (OR=3,78; IC95%: 1,0-14,3).
La ricerca ha ricevuto l’approvazione del Comitato di Bioetica d’Ateneo dell’Università di Torino.
Corresponding Author: Marianna Rinaldi e-mail marianna.rinaldi@unito.it
Sindrome metabolica
Massimo Gualerzi (Fondazione Don Gnocchi – Parma)
Il termine “sindrome metabolica” descrive un insieme di fattori di rischio metabolici che aumentano la
possibilità di sviluppare malattie cardiache, ictus e diabete. La causa della sindrome metabolica risiede
principalmente nelle cattive abitudini di vitacee a loro volta conducono all’affermarsi di quelle
condizioni che determineranno la sindrome stessa come l’ipertensione la dislipidemia l’obesita e il
diabete. Tra i fattori acquisiti predisponesti quello di maggiore interesse è presenza di una eccessiva
quantità di grasso corporeo, specie a livello dell’addome, determinata dalle cattive abitudini alimentari
e dallo scarso esercizio fisico.
La sindrome metabolica viene diagnosticata quando sono presenti tre o più dei seguenti fattori di
rischio:
14 |
elevata quantità di tessuto adiposo addominale (valutata mediante la misurazione della
circonferenza della vita): sono considerati patologici valori superiori a 94 cm nell’ uomo e
superiori a 80 cm nella donna)
basso colesterolo HDL (il cosiddetto “colesterolo buono”): meno di 40 mg/dl nell’uomo e meno
di 50 mg/dL nella donna)
elevati livelli di trigliceridi: valori superiori a 150 mg/dL
elevati valori di pressione arteriosa: superiore a 135/85 mmHg o qualora sia già in corso una
terapia antipertensiva)
elevati livelli di glicemia: glicemia a digiuno superiore a 100 mg/dL.
La presenza di tre o più di questi fattori di rischio è un segno che l’organismo è resistente all’azione
dell’ insulina, un importante ormone prodotto dal pancreas. Quando è presente una condizione di
resistenza all’insulina è necessaria una quantità di insulina maggiore rispetto alla norma per mantenere
normali livelli di glicemia. Il riscontro di valori elevati di insulina nel sangue a fronte di valori normali
di glicemia rappresenta un indice indiretto di tale condizione.
Chi corre il rischio di sviluppare la sindrome metabolica?
La sindrome metabolica è molto frequente nella popolazione, e il rischio di sviluppare la sindrome
cresce con l’aumentare dell’età.
Una persona può considerarsi a rischio per lo sviluppo della sindrome metabolica se non svolge
attività fisica e se:
-è aumentato di peso, specie a livello della circonferenza della vita (questa semplice misurazione è un
indice di eccessiva espansione del tessuto adiposo viscerale, quello, cioè, che si trova all’interno
dell’addome e circonda i visceri)
-ha una storia di diabete
-ha elevati livelli di trigliceridi nel sangue
-ha elevati valori di pressione arteriosa
La maggior parte delle persone che ha la sindrome metabolica si sente bene e frequentemente non
presenta sintomi; tuttavia queste persone hanno un rischio maggiore di sviluppare in futuro malattie
gravi come diabete e patologie cardiovascolari, soprattutto in presenza di familiarità positiva e sono
chiamate quindi a modificare fortemente le proprie abitudini alimentari e iniziare un trattamento.
Come si cura la sindrome metabolica?
Il modo migliore per curare la sindrome metabolica è aumentare l’attività fisica e ridurre il peso
corporeo; è oggi inoltre possibile agire associando alla dieta nutraceutici, prodotti che, sfruttando
l’effetto, noto, di alcune componenti naturali, agiscono in modo deciso e sostanziale in associazione
alla modifica dello stile di vita nel ridurre il rischio e nel riequilibrare le alterazioni biochimiche
presenti. Stiamo parlando principalmente degli Omega 3 e del riso rosso fermentato Monascus
purpureus come elementi in grado di sfiammare, ridurre i trigliceridi il colesterolo e quindi di ridurre
notevolmente il rischio cardiometabolico.
Conclusioni
Ricordare che la perdita di peso e l’attività fisica sono le armi migliori per prevenire e trattare la
sindrome metabolica; è importante sapere se si è affetti o meno dalla sindrome metabolica per poter
mettere in atto cambiamenti nello stile e iniziare ad assumere adiuvanti nutraceutici prima che
compaiano severe complicazioni.
Corresponding Author: Massimo Gualerzi Specialista in Cardiologia, U.O. Prevenzione e Riabilitazione Cardiovascolare,
Fondazione Don Gnocchi – Parma
| 15
Synthesis and antimicrobial activity of new 1-R-3-(2-PIRiDYL)- 4-
nitroso- 5-carboxiethyl-1H-pyrazoles.
S. Aielloa , C. Massimo Maida
b, F. Venturella
b, D. Planeta,
cM. Giammanco
d, M.Milici
b
a Dipartimento di Scienze e Tecnologie Molecolari e Biomolecolari, Università degli Studi di Palermo
bDipartimento di Scienze per la Promozione della Salute
G. D’ Alessandro, Università degli Studi di
Palermo, cDipartimento dei Sistemi Agro-Abientali, Università degli Studi di Palermo,
dDipartimednto
di Studi Giuridici, Economici, Biomedici e Psicosociopedagogici delle Scienze Motorie e Sportive,
Università degli Studi di Palermo
In recent years, epidemiological studies confirm the significant impact on human health by infections
caused by pathogenic fungi. In fact, although the Candida genus is commensal and a constituent of the
normal gut flora, it is responsible for opportunistic infections and can become pathogenic secondary to
predisposing factors related to the host, like a comprimised immune system (AIDS, anti-cancer
therapy, transplants), excessive prophylaxis with antimicrobial agents, and use of invasive catheters.
Large-scale surveillance for fungal infections has demonstrated an increasing incidence of drug-
resistant fungal pathogens. As a matter of fact, a significant number of fungi species (especially
Candida glabrata and Candida krusei) exhibited primary resistance to Fluconazole or were less
susceptible to Amphotericin B.
Furthermore, as a consequence of the toxicity of the currently used polyene antifungal drugs, which
leads to interrupt the therapy, and the emergence of Candida species resistance to azole-based agents,
there is an urgent need for developing alternative drug therapies.
In our previous study we have disclosed the synthesis and antifungal activity of a series of 4-
nitrosopyrazoles that mainly displayed in vitro potent antifungal activity at no cytotoxic
concentrations and that some of these compounds were 4 times more potent than Amphotericine B
and Fluconazole respectively against Cryptococcus neoformans and Candida Krusei [1-4]
As part of our Structure Activity Relationships studies, we were interested in learning the influence of
the steric and electronic effects of the substituent in position 5 of the 4-nitrosopyrazoles which had
already showed powerful antimycotic activity.
Therefore, we synthetized title compounds and evaluated their antimycotic activity (fig1).
Fig 1. Synthetized compoundsN
NN
COOC2H5ON
R
R: a=H, b= CH3, c=C2H5
The 5-carboxiethylester group has made the antimycotic actity dramatically decay, confirming the
necessity, for a good antimicotic activity, of derivatives in which the position 5 is free or substituted
with little groups as a methyl shown the best antifungal activity.
Bibliography
[1] E. Aiello, S. Aiello, F. Mingoia, A. Bacchi, G. Pelizzi, C. Musiu, M. G. Setzu, A. Pani, P. La Colla and M. E. Marongiu.
Synthesis and Antimicrobial activity of New 3-(1-R -3-methyl-4-nitroso-1H-5-pyrazolyl)-5-methylisoxazole derivatives,
Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2000, 8, 2719-2728
[2] Stefania Aiello; Enrico Aiello, Marica Orioli, Marina Carini, 3-(1-R-3-methyl-4-nitroso-1H-5-pyrazolyl)-5-
methylisoxazoles: a new class of antifungal compounds. In vitro metabolism by rat liver:LC and LC-MS studies. Convegno
Nazionale, Sorrento 18-22 Settembre 2002.
[3] S. Aiello, E. Aiello and M. Milici: “Synthesis and Antifungal Activity of new 3(5)-methyl-5(3)-(2-thiophenyl) and -(2-
quinolyl)-1H-1-R-4-nitrosopyrazoles.Part V”. Polish-Austrian-German-Hungarian-Italian Joint Meeting on Medicinal
Chemistry, Krakow, October 15-18, 2003
[4] Stefania Aiello, Antonio Macchiarulo, Maria Milici and Enrico Aiello, Sintesi e studi QSAR di nuovi derivati 3(5)-(2-X)-
1R-1H-4-nitrosopirazoli: una classe di composti con potente attività antifungina in vitro. Parte VI XVII Convegno Nazionale
16 |
della Divisione di Chimica Farmaceutica della SCI, Pisa 6-10 settembre 2004.
Corresponding author: Stefania Aiello, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Molecolari e Biomolecolari, Università degli
Studi di Palermo, Via Archirafi 32, 90123 Palermo, Italy; tel:+39.091 23896802; email: stefania.aiello@unipa.it
From the role of intestine in metabolic syndrome to neurological
diseases. A think of the past .
P.Mainardi, M. Mainardi and P.Striano (DINOGMI Università di Genova)
Metabolic syndrome (MS) could be defined as a combination of symptoms that are increasing the risk
of cardiovascular pathologies and diabetes. Several metabolic aspects, as obesity, insulin resistance,
hypertension, dyslipidemia, are considered to make a diagnosis, they put in evidence an altered food
metabolism.
The incidence of MS is about 25% of total population and it is reported to increase with aging. Often
the diet is unable to treat symptoms and to reestablish a correct metabolic response. Intestinal flora is
reported to play a role in the pathogenic mechanisms of MS1, this is supported by the elevated
incidence of MS in patients with inflammatory bowel diseases or ulcerative colitis, moreover if they
have an insulin resistance, too.
Recently a decreasing in toll like receptors-5 (TLR-5) has been reported in MS, these receptors play a
control role of intestinal flora. The lacking of this control function allow to understand why the diets
are inefficacy. In fact, even if in standard diet, TLR-5 deficient mice increase adiposity, while
develop hallmark features of metabolic syndrome, including hyperlipidemia, hypertension, insulin
resistance, too2.
On the other hand, TLR-2 deficient mice exhibit sub-clinical inflammation, insulin resistance,
glucose intolerance and obesity3.
Other than TLR, peroxisomes are involved in glucose metabolism, insulin resistance and obesity,
too4,5
. Drugs modulating the peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) are able to decrease
insulin resistance and improve related sympotms .
It is interessant to note as TLRs are involved in neurodegeneration process6, as well as a decreasing in
peroxisomes can lead to severe neurological disorders7.
These common factors between MS and neurological disorders allow us to reevaluate the role of
intestine, that until ‘30s was considered to play a pivot role in the pathogenic mechanisms of
neurological disorders. In fact, in 20s epilepsy, depression and schizophrenia are included in
metabolic disorders, together with diabetes and gout.
Confirming the role of intestine, in neurological diseases is reported an elevated incidence of insulin
resistance, an elevated glucose response and often neurological patients report intestinal diseases,
too8, 9,10
.
Ketogenic diet (KD) is reported to be able to improve several neurological symptoms, this could be
linked to its intestinal prebiotic effect11
. Also Curcumin shows to be a neuroprotective agent, in fact, it
has been reported it freely cross from blood to brain, but Curcumin is not even absorbed from
intestine. Curcumin has an anti-inflammatory and anti-bacterial intestinal action12
. Furthermore,
curcumin inhibits gluconeogenesis, ROS production, and ameliorates mitochondrial functions13
.
It is well known that to induce intestinal inflammation decreases epileptogenic threshold14
and
produces anxiety, then intestinal anti-inflammation actions could be helpful to decrease anxiety and to
improve seizures control. Moreover, an altered intestinal flora, dysbiosis, could play a role in the
intestinal adsorption of essential amino acids, that are the only precursor of important
neurotransmitters. In fact, an intestinal dysbiosis is reported in epileptic patients, it is responsible of an
excessive tryptophan decarboxylation in indole and skatole. In this way dysbiosis decreases
tryptophan brain uptake and its brain transformation in serotonin. But intestinal tryptophan controls
| 17
brain neuropetide-Y (NPY) synthesis, too. Brain NPY controls epileptogenic threshold and pain
threshold, not only it controls the neurogenesis and synaptogenesis, that are the tools of
neuroplasticity.
Also the anticonvulsant results of alpha-lactalbumin (ALAC)15,16,17
, that we suggest as anticonvulsive
agent, could be linked to its intestinal actions to decrease intestinal permeability, inflammation and
dysbiosis. In fact, the main role of ALAC in human colostrums is to activate in newborn the intestinal
absorptive and protective process, in this way, by its specific prebiotic effects, it modulates the brain
development.
It is interessant to note that both KD and ALAC increase insulin response.
To treat intestine could be an ancient but also a revolutionary therapeutic strategy to improve
neurological disorders, that can be included again in metabolic syndromes.
References
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2):60-9.
Metabolic syndrome and cardiovascular risk: contribution of
ultrasonography
Santovito D., Graziano G.(*), Moschetta A., Minerva F., Sacco C., Pontrelli D., Palmieri V.O.,
Palasciano G.
Clinica Medica “A. Murri” – Dipartimento di Scienze Biomediche ed Oncologia Umana – Università
degli Studi di Bari, (*) Istituto Mario Negri Sud - Chieti
Background and aims: Metabolic syndrome (MetS) is a term used to explain the co-occurrence of
several conditions related to central obesity and insulin resistance that also includes impaired glucose
metabolism, dyslipidemia, and high blood pressure. The presence of MetS increases the
18 |
cardiovascular risk. The distribution of regional fat as well as the presence and the severity of steatosis
and the intima media thickness are believed to have a specific role as cardiovascular risk factors.
Ultrasonography may play a unique role in this context since it allows to evaluate in a single clinical
session most of these factors and therefore to give specific information on the prognosis of patients
affected by MetS and diabetes.
The aim of this work is therefore to evaluate the contribution of ultrasonograpghy to the study of
MetS and the cardiovascular risk.
Patients and methods: we enclosed in the study 404 patients (F 203, mean age 56,9; M 201, mean
age 53,6) admitted in our department for the evaluation of MetS. The diagnosis of MetS on the basis
of the NCEP ATP III criteria (2001) was confirmed in 309 patients (F 165, mean age 57,3, M 144,
mean age 53,8). All patients underwent a complete clinical and biochemical standard evaluation for
each component of MetS; abdominal ultrasonography was performed and the presence and severity of
steatosis as well as the thickness of subcutaneous, preperitoneal and visceral fat were recorded; the
cardiac ultrasonography revealed ventricular mass and interventricular septum thickness; intima media
thickness was finally evaluated. Data are expressed as M+SD. Comparison between means and
frequency and multivariate logistic analysis were ruled out for the statistical evaluation.
Results: Patients with and without MetS differed for ALT [53.71 (26.26)vs50.98 (29.33)], BMI
[32.93 (5.75)vs30.36 (6.70)], waist circumference [110.62 (11.71)vs102.78 (13.14)], HDL chol [40.61
(9.69)vs52.35 (11.10)], GGT [53.98 (50.60)vs42.89 (43.44)], glycemia [119.88 (41.68)vs95.22
(21.15)], steatosis grade [1.27 (0.69)vs0.92 (0.74)], US visceral fat (mm) [84.60 (85.07)vs64.71
(28.81)], HbA1C [6.56 (1.53)vs5.90 (1.33)], HOMA test [7.55 (6.42)vs3.43 (2.99)], insulin [26.87
(19.39)vs15.48 (14.14)], microalbuminuria [74.62 (277.64)vs24.94 (51.14)], systolic pressure [136.53
(15.65)vs130.18 (15.99)], cardiovascular risk (PROCAM) [16.47 (16.39)vs8.24 (7.66)], tryglicerides
[185.62 (163.61)vs101.92 (39.37)]. Patients with (n=368) and without (n=36) steatosis differed for
BMI [32.76 (5.98)vs27.86 (5.32)], waist circumference [109.88 (12.02)vs97.46 (11.73)], HDL chol
[42.64 (10.42)vs50.83 (15.56)], LDL chol [131.12 (35.10)vs110.06 (33.77)], GGT [52.97
(50.77)vs34.53 (21.00)], glycemia [115.90 (39.93)vs95.53 (25.68)], US preperitoneal fat [14.46
(13.24)vs12.01 (6.19)], US subcutaneous fat [17.17 (12.83)vs13.60 (4.73)], US visceral fat [82.85
(78.86)vs50.51 (26.24)], HOMA test [6.93 (6.13)vs1.86 (1.42)], n criteria MetS [3.30 (1.11)vs2.14
(1.17)], tryglicerides [171.51 (153.21)vs109.03 (67.05)].Patients with (n=107) or without (n=297)
microalbuminuria differed for ALT [54.58 (24.77)vs52.53 (27.77)], HDL chol [40.60 (10.00)vs44.34
(11.44)], Ejection fraction [56.73 (2.85)vs57.36 (3.03)], GGT [58.17 (40.42)vs48.96 (51.85)],
glycemia [129.43 (44.16)vs108.64 (35.91)], US steatosis grade [1.38 (0.72)vs1.11 (0.70)], US visceral
fat [81.07 (25.63)vs79.57 (87.48)], HOMA test [8.81 (7.25)vs5.80 (5.37)], n. criteria for MetS [3.50
(1.05)vs3.09 (1.19)], systolic pressure [138.50 (17.74)vs133.79 (15.08)], PROCAM risk [19.00
(16.87)vs12.95 (14.28)], tryglicerides [189.03 (198.88)vs157.62 (125.06)], visceral/subcutaneous ratio
[6.08 (3.30)vs5.05 (2.62)]. Multivariate logistic analysis (O.R., 95% OR CI) showed for: MetS a
correlation with systolic pressure (1.04, 1.01-1.06), PROCAM risk (1.06, 1.02-1.11), glycemia (1.04,
1.02-1.07), tryglicerides (1.01, 1.01-1.02), HDL chol (0.92, 0.88-0.95); steatosis a correlation with
HDL chol (0.96, 0.92-1.00), LDL chol (1.03, 1.01-1.05), US visceral fat (1.03, 1.01-1.06), insulin
levels (1.14, 1.04-1.24); microalbuminuria a correlation with RCV PROCAM (1.02, 1.00-1.03) and
the diagnosis of MetS (1); cardiovascular risk a correlation with HDL chol (0.91, 0.88-0.94), LDL
chol (1.02, 1.01-1.03), age (1.15, 1.10-1.19), smoking (1.06, 1.04-1.09), subcutaneous fat (0.91, 0.86-
0.96), diabetes (4.80, 2.52-9.14).
Conclusions: a complete evaluation of MetS and of the related cardiovascular risk seems to need the
execution of ultrasonography not only for the detection of well known conditions associated to the
MetS (e.g. biliary litiasis, steatosis, PCOS) but also in order to gain important information for the
prognosis of this syndrome. Our data show that US regional fat distribution study has a predictive
value for steatosis, microalbuminuria and cardiovascular risk higher than the waist circumference in
patients with MetS.
| 19
Fisiologia cardiaca
A protocol which combines current – and voltage-clamp provides a
novel useful three-dimensional representation of the cardiac action
potential
M. Zaniboni*#, F. Cacciani
*
* Department of Biosciences, University of Parma, Italy,
# Center of Excellence for Toxicological
Research, University of Parma, Italy
The cardiac cellular action potential (AP) describes the electrical
activity of heart cells by means of a function (membrane potential
Vm) of a single variable (time). Though invaluable for the study of
cardiac electrophysiology, this type of representation is
intrinsically limited by the fact that substantially different
membranes can display very similar or even identical APs (1,2),
endowed with quite different dynamical properties. A compact
representation of cardiac AP properties in terms of current source,
would be beneficial for cardiac electrophysiological research.
Based on previous patch
clamp (3) and modelling (1,4-
6) studies, we present here a
protocol which combines
current- and voltage-clamp in order to measure instantaneous
current-voltage relationships during AP repolarization, and
generates three-dimensional time-voltage-current surfaces, which
compactly describe several key dynamic features of the
corresponding membrane. A preliminary and incomplete version
of the procedure has been applied on real enzymatically isolated
guinea pig cardiac ventricular myocytes (Figure 1). During the
repolarization of an electrically elicited (current clamp) AP, and
at different time delays after AP overshoot (see arrows in Figure
1), the membrane was voltage clamped for 50 ms at the Vm
occupied by AP trajectory at that time (Vmt), and, in subsequent
runs, at Vmt -10 mV, and at Vmt +10 mV. The ion current (Iion)
flowing during each step was recorded (bottom panel of Figure 1) and allowed to draw instantaneous
current-voltage relations at each repolarization time. The “in silico” version of the protocol allows
higher time and voltage (and therefore current) – resolution, and is applied here on a human
ventricular AP model (7). Voltage clamp steps were applied every 1 ms during AP repolarization
(only 5 representative examples are reported in Figure 2A), and Vm clamped, at each time, every 1 mV
starting from - 120 mV up to + 40 mV. From the Iion density generated by the models equation system
during each step (Figure 2B), the Iion value (measured 1 ms after the onset of the step) was taken to
construct an instantaneous Iion-Vm curve at any given time of AP repolarization (Figure 2C).
Furthermore, the capacitive current (IC) density (-dV/dt), flowing at each time during AP
repolarization, was added to Iion for each Iion-Vm curve, leading to a collection of Im-Vm curves, where
Im is membrane current (Im = IC + Iion) density. The collection of Im-Vm plots (see representative
examples in panel D) generates a 3D surface (panel E) where x is time, y is Vm and z is Im. The AP
20 |
profile lies on the region where such surface intersects the Im = 0 plane. The model was recompiled in
its Matlab version by means of COR facility at “http://cor.physiol.ox.ac.uk”. The three-dimensional
AP representation allows to easily estimate membrane resistance (the inverse of the slope of Im-Vm
slices) during repolarization, which is a key factor involved in its electrotonic modulation. The 3D
surface also shows that, during late repolarization phase, membrane conductance becomes negative
(white arrow in figure 2E), which leads to the novel finding that, at this time, repolarization is auto-
regenerative, i.e. the ventricular membrane acts as a repolarizing source of current. An additional
number of relevant features concerning repolarization dynamics are compactly contained in the 3D
AP representation that we present here, and which we propose therefore as a new useful tool for both
in vivo and in silico cardiac cellular electrophysiological investigations.
Reference
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1206-23, 1998.
Corresponding Author: Dott. Massimiliano Zaniboni – Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi di Parma, Tel 0521
905623 , e-mail: massimiliano.zaniboni@unipr.it
Spontaneous electrical activity of guinea pig sinoatrial cells under
modulation of two different pacemaker mechanisms
M. Zaniboni*#, F. Cacciani
*
* Department of Biosciences, University of Parma, Italy,
# Center of Excellence for Toxicological
Research, University of Parma, Italy
Spontaneous electrical activity of cardiac pacemaker cells is caused by two main mechanisms (1): one
related to voltage-gated membrane channels, mainly the hyperpolarization-activated cationic current If
(2), the other linked to the intracellular calcium handling via the Na+/Ca
2+ exchanger, which, activated
by the release of calcium by sarcoplasmic reticulum, provides a cyclic source of inward current (3).
The relative contribution of these two mechanisms to cardiac pacemaking is still object of debate, and
their regulation is of great clinic and pharmacological interest. The aim of our study was to compare
the effect of 3µM Ivabradine (specific If blocker (4)) and of the same concentration of Ryanodine
(blocker of sarcoplamic calcium release channels (5)) on action potential (AP) parameters of single
cells isolated from guinea-pig sinoatrial node. Analogous studies have been performed previously on
different species (6).
Sinoatrial pacemaker cells, enzimatically isolated from guinea-pig hearts (male Dunkin Harley
weighing 300-400 gr) (2) were transferred in the cell chamber of an inverted microscope, and perfused
in physiological Normal Tyrode (NT) solution at 36°C. Only cells displaying spontaneous and regular
contractions were brought in patch-clamp whole cell configuration, and underwent membrane
potential recordings.
For each of these cells, a sequence of spontaneous APs was recorded for 2-3 minutes, until a steady-
state AP waveform was reached; perfusion solution was then rapidly switched, by means of an
| 21
electrovalve, to Ivabradine solution (IVA), and spontaneous APs recorded until a new steady-state
was gained (usually 3 to 5 minutes), then again to NT until recovery of the starting intrinsic
configuration. This protocol was applied on 20 cells; on seven of these, the whole cell patch clamp
configuration lasted enough time to allow testing of Ryanodine solution (RYA) as well.
Data analysis was performed by means of a dedicated software (Scaldyn), which we developed in
collaboration with the University of Utah (7). The software automatically calculates, for each beat, the
following parameters: maximum diastolic potential (MDP, mV), AP peak (Vpeak, mV), AP amplitude
(APA, mV) and duration (APD, ms), take-off potential (TOP, mV), and the diastolic depolarization
rate (DDR, V/s). Also, cycle length (the inverse of the pacing frequency, CL, ms) and its coefficient of
variability (CV, %) are calculated. Fig. 1 shows representative examples of the effect of IVA (top) and
RYA (bottom) on APs (left column) and on CL (right column). Though the time taken to reach the
new steady state is quite different in the examples shown, no stastical difference in this parameter was
found between IVA and RYA.
IVA significantly changed all parameters of AP (n = 20), increasing CL, CV and APD, depolarizing
MDP and TOP and decreasing Vpeak, APA and DDR. On the 7 cells treated with both IVA and RYA,
blockers displayed, with respect to NT, comparable effects on every AP parameter (as shown in the
hystogram in Fig. 2). In particular, both blockers increased CL (by 27 and 30% respectively), and
APD (by 31 e 26%), decreased DDR (by 34 and 42%), depolarized TOP (by 7 and 10%). The only
difference recorded was that IVA increased CV of CL much more than RYA (+59% and +16%
respectively). These results, though incomplete, suggest a possible interest in new pharmacological
modulators of cardiac sinus rhythm, which could be used in addition or as substitutes of the molecules
(e.g. Ivabradine, β-blockers) presently in use.
Fig. 1: Left column: representative examples of the effect of Ivabradine (top) and Ryanodine (bottom)
on steady state AP sequences of guinea-pig sinoatrial cells; controls in black, and blockers in red.
Right column: representative example of time-course of changes of CL secondary to blockers
application.
Fig.1 Fig.2
Fig. 2: Hystogram of the overall effects of blockers on action potential parameters. Data are
normalized to the mean value in NT.
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Corresponding Author: Dott.ssa Francesca Cacciani – Dip. Bioscienze, Università degli Studi di Parma Tel 0521 906119 e-
mail francesca.cacciani@unipr.it
22 |
Arrhythmia susceptibility in senescent rat hearts
S. Rossi1, S. Baruffi
1, D. Corradi
2,3, S. Callegari
4, E. Musso
1, A. Sgoifo
5, L. Carnevali
5, M. Miragoli
3
and E. Macchi1,3
1 Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi, Parma;
2 Dipartimento di Scienze Biomediche,
Biotecnologiche e Traslazionali, Università degli Studi, Parma; 3 Centro di Eccellenza di Ricerca
Tossicologica, Università degli Studi, Parma; 4 Reparto di Cardiologia, Ospedale di Vaio, Fidenza;
5 Dipartimento di Neuroscienze, Università degli Studi, Parma.
Background.
Cardiovascular disease increases with age. Significant alterations of cardiac electrophysiological
properties occur during the normal aging process as a result of structural remodeling of the
extracellular matrix, modifications of cell-to-cell connection between neighboring cardiac myocytes
(gap junctions) and changes in active membrane properties. Even if advanced age appears to be a risk
factor for increased susceptibility to ventricular arrhythmia, a detailed knowledge about changes in
cardiac electrophysiology relevant to arrhythmogenesis in the elderly is relatively lacking.
Objective.
Thus the aim of the study was to determine specific age-related changes in electrophysiological
properties and myocardial structure of the ventricles which can be related to a structural-functional
arrhythmogenic substrate.
Methods.
Multiple epicardial electrograms were recorded on the ventricular surface of in vivo control (10
months) and aged (24 months) rats during normal sinus rhythm and ventricular pacing. Arrhythmia
inducibility was tested by premature stimulation and burst pacing. Fiber architecture, connexin43
(Cx43), connexin40 (Cx40), interstitial fibrosis and tissue collagen content were determined by
(immune)histology, while proteins content was performed by Western blotting.
Fig.1 Different cycles of arrhythmia events in aged heart characterized either by slow propagating wavefronts circulating around a functionally refractory region or by multiple wavefronts (A). Subsequent cycles of the arrhythmia were characterized
by slow circus movement of reentrant activation sequences around the same region of functional block or by focal activation
spreading with slow anisotropic conduction velocity (B). Subsequently some of the cycles displayed the same focal origin as in previous arrhythmic episodes and interestingly the focal activation is localized in the same point of the BTP during sinus
rhythm (C). The arrhythmia terminated with a 5 Hz monomorphic sequence characterized by wavefronts circulating counter-
clockwise around an obstacle in the lower right area of the electrode array (D). Arrhythmia terminates with spontaneous ventricular activation characterized by low heart rate (E). During a II episode of VT few beats of focal activation spreading with
slow anisotropic conduction velocity were observed (F).
| 23
Results.
Spontaneous supraventricular and ventricular rhythm disturbances were frequently observed in aged
hearts1. Ectopic beats during premature stimulation and sustained ventricular arrhythmias during
burst pacing were frequently induced in aged hearts but not in control hearts (Fig.1).
Electrophysiological analysis in aged hearts revealed that PQ duration and total ventricular activation
time (QRS duration) were significantly delayed as compared to control hearts while anisotropic
conduction velocity did not change significantly2. Ventricular activation patterns displayed variable
number, location and time of appearance of epicardial breakthrough points1.
Morphological analysis in aged hearts revealed that heart weight and myocyte transverse diameter
increased significantly, scattered microfoci of interstitial fibrosis were mostly present in the
ventricular subendocardium and gap junction Cx43 and Cx40 expression decreased significantly in
ventricular myocardium, as compared to controls2.
Conclusion.
Delayed QRS duration, abnormal activation patterns and unchanged ventricular conduction velocity in
aged hearts suggest the occurrence of impaired impulse conduction through the Purkinje system
leading to uncoordinated myocardial excitation despite structural changes. Impaired interaction
between Purkinje system and ventricular myocardium might create a potential reentry substrate,
contributing to higher vulnerability to ventricular arrhythmias observed in aged hearts. This is
consistent with the occurrence of intermittent focal anisotropic activations, possibly originating from
Purkinje-ventricular junctions, among sequences of wide wavefront circus movements around a
functionally refractory region.
References 1 Rossi S, Baruffi S, Bertuzzi A, Mastorci F, Sgoifo A, Musso E, Corradi D, Maestri R, Brisinda D, Fenici R, Macchi E. Susceptibility to ventricular arrhythmias in aged hearts. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2007; 2007: 410-414. 2 Rossi S, Baruffi S, Bertuzzi A, Miragoli M, Corradi D, Maestri R, Alinovi R, Mutti A, Musso E, Sgoifo A, Brisinda D, Fenici
R, Macchi E. Ventricular activation is impaired in aged rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008; 295: H2336-2347. Corresponding Author: Stefano Rossi; Address: Dipartimento di Bioscienze, Parco Area delle Scienze 11/A, 43124, Parma; Tel
Number: 0521905621; e-mail: stefano.rossi@unipr.it
Single low-intensity premature stimuli can induce ventricular
arrhythmias in the normal heart
S. Rossi1, S. Baruffi
1, S. Callegari
2, L. Carnevali
3, D. Corradi
4,5, M. Miragoli
5, E. Musso
1, A. Sgoifo
3,
M. Trombini1, E. Macchi
1,5
1Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi, Parma,
2Reparto di Cardiologia, Ospedale di
Vaio, Fidenza, 3Dipartimento di Neuroscienze, Università degli Studi, Parma,
4Dipartimento di
Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali, Università degli Studi, Parma, 5Centro di
Eccellenza di Ricerca Tossicologica, INAIL, ex-ISPESL, Università degli Studi, Parma
Background
It is very unusual for single low-intensity premature stimuli to induce ventricular arrhythmias in
the normal heart, even when delivered in succession, whereas strong electrical stimuli, when properly
timed, usually do [1, 2, 3]. Still, we observed that a single low-intensity premature stimulus could
occasionally induce ectopic beats in normal rat hearts. Surprisingly, by repeating the premature
stimulation at the same ventricular location and with the same coupling interval, the ectopic beats
were consistently induced. Based on these observations, possible hypothesis for the arrhythmogenesis
is that the premature beat can encounter a zone of unidirectional conduction block to initiate reentry
[4]. However, enhanced dispersion of refractoriness, a necessary condition for initiation of reentry, is
unlikely to be present in normal myocardium [5, 6, 7]. Accordingly, the mechanisms underlying the
origin of the ectopic beats induced by single low-intensity premature stimuli are not definitely
manifest.
Objective
The main objective of the present study was to characterize pacing sites and critical premature
intervals which can induce ectopic beats in the normal heart and to identify their arrhytmogenic
substrate. Therefore we performed high spatial resolution potential mapping while pacing numerous
24 |
epicardial sites in normal rats with a view to identify temporal and spatial properties of possible
reentrant excitations. To evaluate whether spatial dispersion in recovery of excitability might be
important for the occurrence of unidirectional block, we also measured the effective refractory period
(ERP) at each pacing site. These measurements were then related with the spread of excitation during
the onset of the arrhythmia.
Methods
Unipolar electrograms (EGs) were recorded from the anterior ventricular surface of 20 in vivo
adult rats using a 8x8, 1 mm resolution, epicardial electrode array during sinus rhythm (SR) and
premature stimulation. At 18 evenly distributed array electrodes, regular trains of low-intensity stimuli
(two times diastolic threshold) were followed by a premature stimulus (eight times diastolic threshold)
at progressively shorter coupling intervals, until ERP was reached.
Results
Gradual increase in stimulus prematurity determined a corresponding increase in latency in
impulse initiation as well as decrease in anisotropic conduction velocity. Ectopic beats were induced
when pacing was performed at well-defined sites of right (RV) and left ventricle (LV) and the
premature intervals were almost equal to ERP values. Ectopic activation patterns were characterized
by the appearance on the paced ventricle of epicardial breakthrough points (BTPs) which gave rise to
wavefronts rapidly propagating in all directions. The location of BTPs was either coincident with SR
BTPs or new BTPs could appear. When the pacing sites were located on the epicardial projection of
the septum, BTPs appeared, in the proximity of the pacing sites, either on the RV or LV. Regions of
critical degree of conduction and reentry were not observed on the epicardial surface, consistent with
the measured uniform ERP spatial distribution.
Conclusion
The appearance of BTPs during the ectopic activation patterns is the epicardial manifestation of
wavefronts originating from underlying Purkinje fiber-ventricular muscle junctions (PVJs). Thus, our
findings suggest that a critically premature beat can encounter an appropriate substrate for
unidirectional block and reentrant excitation at underlying PVJs where intrinsically different action
potential durations are normally present at the two sides of the PVJ due to appreciably longer
repolarization time of Purkinje fibers [8, 9].
Exactly the same issue would face a local spontaneous excitation in normal myocardium, such as a
premature ventricular complex eventually caused by an early afterdepolarization, originating at a
critical time during the repolarization phase of a sinus beat. Although in the normal myocardium
ventricular arrhythmias rarely occur spontaneously, their incidence might be favored by the presence
of reentrant ectopic beats especially when dispersion of refractoriness is increased, such as during
enhanced activity of the sympathetic nervous system [10].
References
1) Winfree AT. Electrical instability in cardiac muscle: phase singularities and rotors. J Theor Biol. 1989; 138: 353-405.
2) Gotoh M, Uchida T, Mandel WJ, Fishbein MC, Chen PS, Karagueuzian HS. Cellular graded responses and ventricular vulnerability to reentry by a premature stimulus in isolated canine ventricle. Circulation. 1997; 95: 2141–2154.
3) Janse MJ. Vulnerability to ventricular fibrillation. Chaos. 1998; 8: 149-156.
4) Kléber AG, Rudy Y. Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated arrhythmias. Physiol Rev. 2004; 84: 431-88.
5) Allessie MA, Bonke FI, Schopman FJ. Circus movement in rabbit atrial muscle as a mechanism of tachycardia. II. The
role of nonuniform recovery of excitability in the occurrence of unidirectional block, as studied with multiple microelectrodes. Circ Res. 1976; 39: 168-177.
6) Burton FL, Cobbe SM. Dispersion of ventricular repolarization and refractory period. Cardiovasc Res. 2001; 50: 10-23.
7) Coronel R, Wilms-Schopman FJ, Opthof T, Janse MJ. Dispersion of repolarization and arrhythmogenesis. Heart Rhythm. 2009; 6: 537-43.
8) Myerburg RJ, Stewart JW, Hoffman BF. Electrophysiological properties of the canine peripheral A-V conducting system.
Circ Res. 1970; 26: 361-378. 9) Mendez C, Mueller WJ, Merideth J, Moe GK. Interaction of transmembrane potentials in canine Purkinje fibers and at
Purkinje fiber–muscle functions. Circ Res 1969;24:361-372.
10) Schwartz PJ, Stone HL. The role of the autonomic nervous system in sudden coronary death. Ann N Y Acad Sci. 1982;
382: 162-80.
Corresponding author: Emilio Macchi; address: Dipartimento di Bioscienze, Viale Parco Area delle Scienze 11/A, Università
degli Studi, Parma; telephone: 0521 906 116; e-mail: emilio.macchi@unipr.it
| 25
Antropologia ed evoluzione molecolare
Complementarietà di spettroscopia FT-IR ed analisi istologiche per
lo studio del degrado della pelle mummificata.
M. Stani1, A. Baraldi
1, R. Boano
2, R. Cinquetti
3, M. G. Bridelli
1
1Dipartimento di Fisica e Scienze della Terra, Università di Parma,
2Dipartimento di Biologia Animale
ed Umana, Università di Torino, 3Dipartimento di Bioscienze, Università di Parma.
La collezione di mummie egiziane del museo di Antropologia ed Etnografia Giovanni Marro
dell’Università degli Studi di Torino rappresenta un patrimonio di informazioni preziosissime per
poter comprendere quali fossero le antiche tecniche di mummificazione. La presenza sia di mummie
naturali (di epoca predinastica) che di mummie sottoposte a procedimenti di imbalsamazione (tipici
delle epoche dinastiche) permette, utilizzando specifiche tecniche diagnostiche, di stabilire quale sia
lo stato di conservazione di questi reperti sia in riferimento al diverso procedimento di
mummificazione subito, sia in relazione alle diverse condizioni di seppellimento a cui furono
sottoposte. E’ inoltre possibile monitorarne costantemente i processi di invecchiamento e di
deterioramento da parte di fattori endogeni ed esogeni al fine di stilare specifici protocolli di
conservazione. Le tecniche utilizzate in questo studio sono state la Spettroscopia Infrarossa a
Trasformata di Fourier (FT-IR) e una serie di analisi istologiche. Tutti i campioni antichi sono stati
messi a confronto con campioni di riferimento di pelle moderna analizzati con le medesime tecniche.
La pelle è costituita da una serie di strati che è possibile distinguere sommariamente in epidermide,
derma ed ipoderma. L’epidermide a sua volta è costituita da differenti strati di cellule che si
differenziano fra loro per un progressivo accumulo, dall’interno verso l’esterno, di cheratina. Il derma
è costituito invece prevalentemente da fasci di fibre collagene, intervallati da sottili fibre elastiche, il
tutto immerso insieme ad una serie di altri elementi come ghiandole e bulbi piliferi in una matrice di
glicosaminoglicani. Infine l’ipoderma è costituito prevalentemente da tessuto adiposo.
Dallo spettro infrarosso della pelle è possibile ottenere informazioni che riguardano tutte le classi di
composti che costituiscono questo tessuto ma in particolare le proteine. Nell’intervallo di frequenze
compreso tra 1650 cm-1
e 1550 cm-1
infatti si riscontrano gli assorbimenti della banda Amide I, dovuta
allo stretching del legame C=O, e della banda Amide II dovuta al bending del legame N-H ed allo
stretching del legame peptidico C-N (1). Attraverso un procedimento di curve fitting iterativo eseguito
sulla banda Amide I, si possono ottenere informazioni sulla struttura secondaria delle proteine. Il
risultato generale delle misure suggerisce una diminuzione del quantitativo di struttura ad alfa elica a
favore di un incremento della struttura beta (2, 3), con notevole variabilità da un campione all’altro, in
dipendenza dal trattamento di imbalsamazione subito. Questo dato è indicativo di una modificazione
conformazionale delle proteine presenti dovuta a fenomeni di degrado occorsi nel tempo. Le
informazioni ottenute dall’analisi degli spettri FTIR possono essere correlate alle diverse classi di
proteine della pelle quali cheratina, elastina e collagene, mediante studi istologici dei campioni.
L’analisi istologica ha permesso l’osservazione morfologica dei tessuti mummificati, l’identificazione
dei diversi strati costituenti la pelle e il loro stato di conservazione. È stato infatti possibile notare che,
oltre alla totale assenza dell’epidermide, sono presenti sostanziali differenze fra reperti sottoposti ai
due differenti processi di mummificazione, evidenziabili in particolare nel diverso aspetto
morfologico e livello di conservazione delle fibre collagene (4-5).
L’accostamento delle due tecniche di indagine, in conclusione, si è rivelato estremamente utile perché
è stato possibile confrontare i dati ottenuti separatamente mediante le due metodologie e constatare
che questi risultano complementari ed integrativi gli uni degli altri.
26 |
FIG. 1: a – Confronto spettri FT-IR delle pelle moderna e della pelle di mummia predinastica; b – Fitting della banda Amide I
della pelle moderna; c – Fitting della banda Amide I della pelle di mummia predinastica; Tabella: Confronto tra le percentuali
delle strutture secondarie.
FIG 2: a – Immagine al microscopio ottico della pelle di mummia predinastica; b – Immagine al microscopio ottico della pelle
di mummia imbalsamata.
Bibliografia:
1. Torii, H., Tasumi, M. (1996). Theoretical analyses of the Amide I infrared bands of globular proteins, in Infrared
Spectroscopy of Biomolecules. H. H. Mantsch and D. Chapman eds., J. Wiley & sons, inc. NY. Pp. 1-18.
2. Byler, D. M., and Susi, H. (1986). Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra.
Biopolymers, 25(3): 469 – 487.
3. Bridelli, M. G., Dell’Anna, A., Stani, C., Baraldi, A., Boano, R., De Iasio, S. FT-IR spectroscopy and microspectroscopy of
ancient Egyptian embalmed heads from the Museum of Anthropology and Ethnography of the University of Turin. 2nd
Bolzano Mummy Congress – Mummies from the ice (Bolzano, Italy, 20 – 22 October 2011). Proceedings pp. 51.
4. Byung Soo Chang, Chang Sub Uhm, Chang Hyun Park et al. (2006). Preserved skin structure of a recently found fifteenth-
century mummy in Daejeon, Korea. Journal of Anatomy 209: 671- 680.
5. Montes, G.S., Kriszta´n, R.M., Junqueira, L.C., (1985). Preservation of elastic system fibers and of collagen molecular
arrangement and stainability in an Egyptian mummy. Histochemistry 83:117–119.
Stature estimation using mandibular morphometric parameters in
Italian population: a preliminary report
C. Milani, R. Milani, G. L. Panattoni.
Department of Neurosciences, University of Turin.
INTRODUCTION
Stature estimation is one of the most important parameters in personal identification. Physical and
forensic anthropologists can extimate stature from human remains in order to define a general profile
of the victims [1-5]. It often occurs that fragmented or incomplete human remains are found by
investigators. In literature, anatomical methods based on measurements of the whole skeleton or
mathematical methods based on measurements of single bones, have been developed. By these
methods regression formulae for calculating the stature were obtained. Since abnormal development
| 27
of the mandible is involved in growth disorders [6-8], we investigated possible correlations between
some mandibular morphometric parameters and stature in normal subjects of Italian population in
relation to personal identification in anthropologic or forensic practice.
MATERIALS AND METHODS
Measures were acquired in 41 individuals of both sexes (31 males ranging from 20 to 56 years old, 10
females ranging from 20 to 61 years old) from Caucasian Italian population (born in Italy and with
Italian parents). Stature and distances between the following cephalometric landmarks of both
mandibular sides were measured: co-co (bicondylar distance); go-go (bigonial distance); co-go
(condylion-gonion distance); go-gn (gonion-gnathion distance). The stature of the subjects was
measured in standing position to the vertex by using a non-stretch, retractable anthropometric tape.
The mandibular parameters were measured by a digital anthropometric head caliper. Mandible
dimension (MD) were considered as the sum of the co-go-gn distances of both sides. The possible
statistical relationships between MD and the measured living stature (MLS) were investigated by
Pearson correlation analysis (r coefficient) in order to obtain the estimated living stature (ELS).
RESULTS
Mean age and MLS of the specimens are reported in Table 1.
MEAN AGE
(in years)
MEAN MLS
(in cm)
MALES 30.5 176
FEMALES 29.8 161.6
Table 1. Mean age and MLS of the observed specimens.
In the whole sample, ELS is expressed by the regression formula: ELS= 2.6965 x P + 89.879
with Standard Deviation = 4% and Standard Error = 5%.
The r coefficient between MD and MLS is 0.63.
DISCUSSION
As the estimated living stature obtained by mathematical method is population-specific, in this
preliminary report we examined in particular a sample of Caucasian Italian population. We choose the
sum of bilateral co-go-gn distances as a reference dimension of the mandible because these values
seem to be the most significant for representing mandibular growth. In fact, the mandible grows with
a progressive posterior increase in length of the body and in height of the rami. In literature, some
researches [9-11] show a very low correlation between mandibular morphometry and stature, while in
other works [12] the correlation is moderate like the one showed by our data; these differences could
be due to the various factors that affect the mandibular growth (e.g., orthodontic treatments).
References:
1) Fully G., Pineau H. Détermination de la stature au moyen du squelette. Ann. Med. Leg., 1960, 40: 145–154. 2) Raxter M.H., Auerbach B.M., Ruff C.B. Revision of the Fully technique for estimating statures. Am. J. Phys. Anthropol.,
2006,130: 374-84.
3) Krogman W.M., İşcan M.Y. Calculation of stature. In: Human skeleton in forensic medicine (W.M. Krogman, M.Y. İşcan, Eds.), Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, U.S.A., 1986, 302–351.
4) Trotter M., Gleser G. A re-evaluation of estimation of stature based on measurements of stature taken during life and of long
bones after death. Am. J. Phys. Anthropol., 1958, 16: 79-123. 5) Wilson R.J., Herrmann N.P., Jantz L.M. Evaluation of stature estimation from the database for forensic anthropology. J.
Forensic Sci., 2010, 55: 684-689.
6) Takakura M., Kuroda T. Morphologic analysis of dentofacial structure in patients with acromegaly. Int. J. Adult Orthodon. Orthognath. Surg., 1998, 13: 277-288.
7) Dostálová s., Sonka K., Amahel Z., Weiss v., Marek J. Cephalometric assessment of cranial abnormalities in patients with
acromegaly. J. Craniomaxillofac Surg., 2003, 31: 80-87. 8) Kjellberg H, Wikland K.A. A longitudinal study of craniofacial growth in idiopathic short stature and growth hormone-
deficient boys treated with growth hormone. Eur. J. Orthod., 2007, 29: 243-250.
9) Agnihotri A.K., Kachhwaha S., Googoolye K., Allock A. Estimation of stature from cephalo-facial dimensions by regression analysis in Indo-Mauritian population. J. Forensic Leg. Med., 2011, 18: 167-172.
10) Pelin C., Zağyapan R., Yazici C., Kürkçüoğlu A. Body height estimation from head and face dimensions: a different
method. J. Forensic Sci. 2010, 55: 1326-1330. 11) Sahni D., Sanjeev, Sharma P., Harjeet, Kaur G., Aggarwal A. Estimation of stature from facial measurements in northwest
Indians. Leg. Med., 2010, 12: 23-27.
12) Kalia S., Shetty S.K., Patil K., Mahima V.G. Stature estimation using odontometry and skull anthropometry. Indian J. Dent. Res., 2008, 19: 150:154.
Corresponding author: Gian Luigi Panattoni. Dipartimento di Neuroscienze, Università di Torino, Corso M. D’Azeglio 52,
10126 – Torino. Tel: 011-6707726 / 333-3825517. E-mail: gianluigi.panattoni@unito.it
28 |
Variabilità di marcatori uniparentali in popolazioni italiane a
diverso grado di isolamento
A. Boattini, S. Sarno, D. Luiselli, D. Pettener
Dipartimento di Scienze Biologiche, Geologiche e Ambientali, Laboratorio di Antropologia
Molecolare, Università di Bologna,
Lo studio di marcatori uniparentali del cromosoma Y – accoppiato ad una adeguata strategia di
campionamento basata su variabili biodemografiche (ad es. cognomi) – consente di ricostruire
strutture genetiche di popolazioni umane rivelatrici dei processi storici che hanno condotto alla
situazione attuale. Presentiamo alcuni risultati preliminari di ricerche di antropologia molecolare in
corso presso il nostro laboratorio. Il caso della Partecipanza di S. Giovanni in Persiceto – un peculiare
isolato socio-culturale di origine medioevale legato all'eredità patrilineare della terra – è di particolare
interesse in quanto consente di effettuare inferenze sulla storia del popolamento dell'area padana e di
ricostruire tassi di mutazione per alcuni marcatori all'interno di genealogie documentate. Uno studio
che coinvolge popolazioni non isolate dell'intero territorio italiano ha invece rivelato la presenza di
discontinuità genetiche (legate alla geografia) la cui origine risale probabilmente al tardo Neolitico e
alle successive Età dei Metalli.
Ancient DNA studies: new perspectives on old samples
D. Caramelli
Dipartimento di Biologia Evoluzionistica, Università di Firenze, Firenze, Italy
In spite of past controversies, the field of ancient DNA is now a reliable research area due to recent
methodological improvements. A series of recent large-scale studies have revealed the true potential
of ancient DNA samples to study the processes of evolution and to test models and assumptions
commonly used to reconstruct patterns of evolution and to analyze population genetics and
palaeoecological changes. Recent advances in DNA technologies, such as next-generation sequencing
make it possible to recover DNA information from archaeological and paleontological remains
allowing us to go back in time and study the genetic relationships between extinct organisms and their
contemporary relatives. With the next-generation sequencing methodologies, DNA sequences can be
retrieved even from samples (for example human remains) for which the technical pitfalls of classical
methodologies required stringent criteria to guaranty the reliability of the results. In this paper, we
review the methodologies applied to ancient DNA analysis and the perspectives that next-generation
sequencing applications provide in this field.
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Mine, yours, ours? sharing data on human genetic variation
N.Milia1,3, A.Congiu1,3, P.Anagnostou1,2, F.Montinaro2, M.Capocasa2, E.Sanna3,G.Destro
Bisol1,2
1 Università di Roma “La Sapienza”, Dipartimento di Biologia Ambientale, Roma Italy, 2Istituto
Italiano di Antropologia, Roma, Italy, 3Università di Cagliari, Dipartimento di Biologia Sperimentale,
Cagliari, Italy
The achievement of a robust, effective and responsible form of data sharing is currently regarded as a
priority for biological and bio-medical research. However, it has been argued that its possible
advantages in terms of better exploitation of data and optimized use of resources may be counteracted
by the time and economic costs required, by underlying ethical concerns, and conflicts of interest with
patenting discoveries. In this contrasting scenario, empirical evaluations of data sharing may be
regarded as an indispensable first step in the identification of critical aspects and the development of
strategies aimed at increasing availability of research data for the scientific community as a whole.
Research concerning human genetic variation represents a potential forerunner in the establishment of
widespread sharing of primary datasets. However, no specific analysis has been conducted to date in
order to ascertain whether the sharing of primary datasets is common-practice in this research field.
To this aim, we analyzed a total of 543 mitochondrial and Y chromosomal datasets reported in 508
papers indexed in the Pubmed database from 2008 to 2011. A substantial portion of datasets (21.9%)
was found to have been withheld, while neither strong editorial policies nor high impact factor proved
to be effective in increasing the sharing rate beyond the current figure of 80.5%. Disaggregating
datasets for research fields, we could observe a substantially lower sharing in medical than
evolutionary and forensic genetics, more evident for whole mtDNA sequences (15.0% vs 99.6%). The
low rate of positive responses to e-mail requests sent to corresponding authors of withheld datasets
(28.6%) suggests that sharing should be regarded as a prerequisite for final paper acceptance, while
making authors deposit their results in open online databases which provide data quality control seems
to provide the best-practice standard. Finally, we estimated that 29.8% to 32.9% of total resources are
used to generate withheld datasets, implying that an important portion of research funding does not
produce shared knowledge. By making the scientific community and the public aware of this
important aspect, we may help popularize a more effective culture of data sharing.
30 |
Metodologie e tecniche della biologia sperimentale
Light regulated enzyme activities
A. Losi1, W. Gärtner
2*
1, Physics department, University Parma, Italy;
2, Max-Planck-Institute for Chemical Energy
Conversion, Mülheim, Germany
In collaboration with G. Nagel, Univ. Würzburg, Germany, P. Hegemann, Humboldt-Univ. Berlin,
Germany
Biological photoreceptors fulfill a double duty in (i) receiving information by absorption of light and
(ii) transmitting information by generating and transducing a biological signal (which eventually will
enable the organism to adjust its lifestyle according to the environmental conditions). In many cases,
both functions are located in distinct protein domains that are fused to each other through a
“connector” peptide. Genome-wide screens reveal that often one type of sensing domain is connected
to different types of signaling domains and vice versa, i.e., the same type of signaling domain is fused
to different types of sensing functions.(1) The fact that photoreceptors are instantaneously activated or
de-activated in a non-invasive manner (light activation!), and the demonstration by nature that
combinations of various domains yield functional receptors, has triggered activities to employ
naturally occurring or synthetically formed hybrid photoreceptors in biotechnological
applications.(2,3)
In this presentation, two types of naturally occurring nucleotide cyclases will be discussed: AMP-
cyclases(4) and c-di-GMP cyclases/hydrolases.(5,6) Their function in the natural environment is well
documented, as cAMP is an important second messenger in many (micro)organisms, and c-di-GMP is
identified as a molecule that can regulate pathogenicity, biofilm formation, or motility.
Literature cited:
(1) Losi, A. and Gärtner, W. (2008) Photochem. Photobiol.. Sci. 7, 1168-1178.
(2) Christie, J.M., et al. (2012) Molecular Plant 5, 533-544.
(3) Olson, E.J. and Tabor J.J. (2012) Curr. Op. Chem. Biol. 16, 300-306.
(4) Stierl, M., et al. (2011) J. Biol. Chem. 286, 1181-1188.
(5) Wu, Y.I., et al. (2009) Nature 461, 104-108.
(6) Cao, Z., Livoti, E., Losi, A., and Gärtner, W. (2010) Photochem. Photobiol 86, 606-611.
Towards nano-physiology in mammalian cells: a multi-parametric
analysis with scanning ion conductance microscopy
M. Miragoli1,4
, S. Rossi2, M. J. Lab
3, J. Gorelik
3
1Centro di Eccellenza per la Ricerca Tossicologica, CERT, INAIL ex-ISPESL, Universita’ degli studi
di Parma, 2Dipartimento di Bioscienze, Universita’ degli studi di Parma,
3NHLI, Myocardial Function,
Functional Microscopy Unit, Imperial College London, 4Humanitas Clinical and Research Center,
Rozzano, Milano
Nanotechnologies has opened new avenues for the comprehension of physiological processes at nano-
scale levels. Indeed, atomic force microscopy, scanning probe microscopy and scanning tunneling
microscopy provide details of imaging surface and physiological processes at the atomic range.
Notwithstanding, that those techniques provide insights into various cellular function, they necessary
require manipulation, contact or destruction of the samples. In the context of the complex nature of
| 31
cell disease, in addition to the use of multiple conventional methods that address individual questions,
it would be extremely useful to develop a novel universal technique capable of correlating cell
function with morphology, macroscopic structural remodeling in intact tissue, and spatial-temporal
aspects of intracellular signalling or ion channel activity measured in single cells and subcellular
compartments. We have modified scanning ion conductance microscopy invented by Hansma et al . in
hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) to image and analyze surface topography of live
cells without contact with the samples. HPICM and a battery of associated innovative methods are
unique among current imaging techniques, not only in spatial resolution, but also in the rich
combination of imaging modalities with other functional and dynamic methods. Here we describe
HPICM technique as a converging technology to perform highly resolved dynamic and integrative
analysis of cell structure, nanophysiology and mechanisms of cardio and vascular diseases. We have
combined HPICM with i) surface confocal microscopy to study nanoparticles-cell membrane
interaction in lung and cardiac cells[1], with ii) FRET for receptors localization [2] and with localized
intracellular electrode impalement for study myofibroblast membrane potential in the presence of anti-
arrhythmic drugs [3]. Using this technique, we show that the physicochemical nature of nanoparticles
play a pivotal role in modification of cardiac membrane excitability and ion trafficking (Figure 1) by
leading to arrhythmia in clusters of neonatal rat ventricular myocytes. We also describe how 2-
receptors are de-localized from T-tubules to crest in heart failure cells and how in such pathological
conditions it is possible to study the role of myofibroblasts as target cell for cardiac arrhythmia. In
conclusion, HPICM provides a highly informative multimodal imaging platform for functional
analysis of the mechanisms of cell diseases, which should facilitate identification of novel therapeutic
strategies.
Figure1. Topographical height-coded images, obtained by HPICM, of neonatal rat ventricular
myocyte affected by 50 nm carboxyl-modified latex nanoparticles. A. 50 nm nanoparticles induced
life-compatible nanopores in the membrane. B. Zoom in the square area in A (yellow) identifies three
nanopores (a,b,c) with a 50nm profile.
Reference:
M.Miragoli, P.Novak, P. Ruenraroengsak, A.I. Shevchuk, Y.E. Korchev, M.J. Lab, T.Tedley and J. Gorelik. Functional interaction between charged nanoparticles and cardiac tissue: a new paradigm for cardiac arrhythmia? Nanomedicine UK, in
press. M.Miragoli, A.Moshkov, P.Novak, A.Shevchuk, V.O. Nikolaev I.El-Hamamsy, C.M.F. Potter, A.R. Lyon, S.E. Harding. J.A.
Mitchell, A.H Chester, M.J. Lab, Y.E. Korchev, J. Gorelik. Scanning Ion Conductance Microscopy: A Convergent High-
resolution Technology for Multiparametric Analysis of Living Cardiovascular Cells. Journal of Royal Society of Interface. J R Soc Interface. 2011 Jul 6;8(60):913-25. Epub 2011 Feb 16.
Miragoli M, Kadir SH, Sheppard MN, Salvarani N, Virta M, Wells S, Lab MJ, Nikolaev VO, Moshkov A, Hague WM, Rohr S,
Williamson C, Gorelik J. A protective antiarrhythmic role of ursodeoxycholic acid in an in vitro rat model of the cholestatic fetal heart. Hepatology. 2011 Oct;54(4):1282-92.
Corresponding author: Michele Miragoli, CERT c/o Dipartimento di Bioscienze, Address: Viale G.P Usberti 11/A 43124
Parma Tel: 0521905665 Email: m.miragoli@inail.it
32 |
Biomolecular NMR, a versatile tool for the understanding of protein
science; retinoid-binding proteins as an example
L. Franzoni1, F. Baroni
1, D. Cavazzini
2, G. L. Rossi
2, C. Lücke
3
1Department of Biomedical, Biotechnological and Translational Sciences and
2Department of
Biosciences, University of Parma, Italy; 3Max Planck Research Unit for Enzymology of Protein
Folding, Halle (Saale), Germany; 1Plesso Biotecnologico, via Volturno 39, 43125 Parma
Protein science stands at the heart of modern life sciences because it unravels fundamental biological
mechanisms and forms the basis for rapid advances in biomedicine and biotechnology. NMR
spectroscopy is uniquely suited to study various aspects of protein structure, dynamics, molecular
interactions and function, because information for individual residues can be obtained; moreover,
kinetic data, low-populated states and the possible formation of intermediates on the reaction pathway
can be determined.
The case of retinoid-binding proteins is discussed here, as an example. Vitamin A has diverse
biological functions and is essential for human survival. It circulates in blood bound to serum retinol
binding protein (RBP) and is transported into cells by a membrane receptor termed STRA6 (1). The
cellular trafficking and metabolism of vitamin A are regulated primarily by specific high-affinity
carriers called CRBP-I and CRBP-II. They represent an interesting case where structure determination
as well as the study of fast dynamics (ps-ns time scale) (2) failed to elucidate the mode of retinol
binding and thus to explain their diverse tissue distribution, functional roles and different ligand
affinities.
The highly similar structure of the apo and holo forms (a b-
barrel with two short a-helices, see the cartoon) exhibits a
closed conformation in both proteins, that seemingly offer no
access for the ligand. Given the biological relevance of
retinoids, the characterization of their protein interactions and
targeted release is of special interest. To tackle this challenging
subject we have employed a suite of NMR techniques: 15
N
relaxation dispersion experiments to investigate the proteins
dynamics in the slower ms-ms timescale, line-shape analysis of 15
N-HSQC spectra recorded during a retinol titration to get
insights into the mechanism of ligand binding and H/D
exchange experiments to investigate conformational stability.
The results allowed to derive a model of retinol uptake, which
is different for CRBP-I and CRBP-II (3, 4); moreover, a
distinct local flexibility was found to modulate their binding properties (5).
The two proteins deliver retinol to microsomal membrane-bound enzymes, either for esterification
with fatty acids (LRAT) (6, 7) or for oxidation to retinaldehyde (RDH) (8). Our current understanding
of these processes remains incomplete, but there is evidence that the membrane microenvironment
plays a role in the interactions of holo CRBPs with enzymes (8). To address this hypothesis, we have
performed a series of NMR experiments with retinol-bound CRBP-I and CRBP-II in the presence of
model membranes composed of either anionic or zwitterionic phospholipids, at varying protein:lipid
molar ratios and ionic strength.
Both homologues interact with liposomes of anionic phospholipids, but in a significantly different
way (9). A conformational rearrangement of the portal region, coupled to a change in protein
dynamics, are required for retinol exchange; these processes seem to be triggered by a membrane-
collision.
All the differences between CRBP-I and CRBP-II, when dissolved either in buffer or in the presence
| 33
of biomembrane mimetic systems, may account for their distinct functional roles in the modulation of
intracellular retinoid metabolism. Further experiments are in progress to better describe the ongoing
processes in a biological context.
References
(1) Kawaguchi R., Yu J., Honda J., Hu J., Whitelegge J., Ping P., Wiita P., Bok D., Sun H. (2007) Science, 315, 820-825.
(2) Franzoni L., Lücke C., Pérez C., Cavazzini D., Rademacher M., Ludwig C., Spisni A., Rossi G.L., Rüterjans H. (2002) J. Biol. Chem., 277, 21983-21997.
(3) Mittag T., Franzoni L., Cavazzini D., Schaffhausen B., Rossi G.L., Günther U.L. (2006) J. Am. Chem. Soc., 128, 9844-
9848. (4) Franzoni L., Reed M., Cavazzini D., Rossi G.L., Günther U.L., in preparation.
(5) Franzoni L., Cavazzini D., Rossi G.L., Lücke C. (2010) J. Lipid Res., 51, 1332-1343.
(6) Amengual J., Golczak M., Palczewski K., von Lintig J. (2012) J. Biol. Chem., 287, 24216-24227. (7) Jiang W., Napoli J.L. (2012) Biochim. Biophys. Acta, 1820, 859-869.
(8) Napoli J.L. (2012) Biochim. Biophys. Acta, 1821, 152-167.
(9) Franzoni L., Baroni F., Cavazzini D., Rossi G.L., Lücke C., in preparation.
0521-033823; lorella.franzoni@unipr.it
Application of the multiuse encapsulator agent F-500 for
environmental remediation
L. Pane, E. Giacco, G. L. Mariottini
Department of Earth, Environment and Life Sciences (DISTAV), University of Genova,
In the framework of the “Risk Assessment” procedure for the ecotoxicological evaluation of
compounds used in the aquatic environment, tests with target species have been carried out. This
paper reports the results concerning the evaluation on cladocerans Daphnia magna of the acute
toxicity of F-500 micelle encapsulator (Hazard Control Inc., USA), a mixture of ionic and non-ionic
surfactants based on fatty acid esters with aliphatic polyalcohols in watery solution used as fire fighter
agent as well as dispersant against hydrocarbon pollution, with the purpose to verify its compatibility
for the aquatic environment and its potential usefulness for the remediation of soils polluted with
hydrocarbons. F-500 has been indicated to be able to reduce hydrocarbon concentrations within the
soil environment and therefore to be active for soil remediation [1]. As a matter of fact, F-500 has
high affinity for soil particles and was demonstrated that 0.1% F.500 solutions are adsorbed almost
completely (>99%) in soils; furthermore, after elution of soil with water less than 1% of F-500 was
found into the eluate [2]. For ecotoxicological tests the artificial soil was prepared according to
standardized procedures [3]. Soil constituents were previously dried and subsequently dampened with
deionized water in order to obtain 40-60% of the maximum water retention. The artificial soil was
treated with commercial diesel and with F-500 at the concentration (1.5%) known to be non-toxic for
the organisms [4], packed up in 5 cm diameter glass columns and subsequently eluted with deionized
water to obtain the eluate, according to the EPA method [5]. The elutriate was obtained placing soil
aliquots and deionized water (1:4) in glass beakers and stirring them for 1 hour [5, 6]. For both eluate
and elutriate testings the following four samples were prepared and subsequently tested: 1) control
(only soil), 2) soil + diesel, 3) soil + 1.5% F-500, 4) soil + diesel + 1.5% F-500. Two different tests
were carried out with the eluate using two different amounts of both compounds (Test A: Diesel 10
ml, F-500 5 ml. Test B: Diesel 20 ml, F-500 10 ml), thus maintaining unchanged the Diesel/F-500 rate
(2:1). Four different tests were carried out with the elutriate maintaining unchanged the diesel amount
and varying the diesel:F-500 rate, namely 2:1 (A), 1:1 (B), 1:2 (C), 1:4(D). Daphnia magna
specimens have been obtained from Daphtoxokit ephippia (Microtox, Milano, Italy; batch
DM281009) and maintained at 25 2°C in aerated and properly screened mineral water supplemented
with 0.45 m-filtered 1:100 CaCl2 solution and 0.45 m-filtered 1:100 NaHCO3 solution. Before the
34 |
test 30 Daphnia magna females were isolated and maintained starved for 24 hours; the offspring born
during this period were used in the test and exposed for 24 hours at 20±2°C, 16:8 light:dark period, to
the eluates and to the elutriates in multiwell plates with polyethilene inserts provided with 74 mm
porosity basal membrane (NetwellTM
Corning, NY, USA). Five organisms per test in quadruplicate
against control test were utilized. The tested F-500 concentrations were chosen considering the results
of preliminary assays. The acute toxicity was evaluated estimating as end-point the percent
immobilization of treated newborn specimens after 10 sec. according to OECD [7].
The results of tests are shown in table 1 (a, b). The data confirm that F-500 is not toxic to daphnids
and show clearly that mixing F-500 to a soil pollutant (commercial diesel) the acute toxicity induced
by eluates and elutriates on cladocerans decreases remarkably. This allows to confirm the
ecocompatibility of F-500 and its suitability for soil remediation.
F-500 is an easy-to-use compound useful for the remediation of soils and effective mainly under
aerobic conditions; it is able to improve the biological degradation of contaminants by natural
microbial populations as well as to stimulate the biodegradation reducing the toxicity of the
environmental pollutants or making them innocuous. F F-500 allows to restore the usage of the treated
areas accelerating the self-regeneration of contaminated soils and restoring rapidly the ecological
equilibrium (http://www.fctservices.co.uk/F-500-land-application/).
a
Test Control F-500 1.5% Diesel Diesel + F-500 1.5%
A 6.0 8.9 0 31.8 24.4 12.7 20.0
B 0 5.0 0 46.7 17.5 16.7 12.5
b
A 0 0 70.0 14.1 70.0 14.1
B 0 0 30.0 14.1 40.0 28.2
C 2.0 4.5 0 70.0 7.0 31.8 23.5
D 2.0 4.5 0 70.0 7.0 16.0 14.0 Table 1. Percent immobilization of Daphnia magna exposed to different amounts of contaminated soil eluate (a)
and elutriate (b).
Furthermore, the overall ecocompatibility [4, 9] and the low toxicity against marine crustaceans and
fish [4, 10, 11] of F-500, evaluated through standardized parameters [8], are known. The tests carried
out in this study have shown an evident decrease of the toxicity in soils treated with diesel + F-500 in
comparison to those treated with only diesel. This result is supposed to be due to the power of the
compound to encapsulate the hydrocarbon molecules maintaining them in watery solution and
consequently making them more accessible for the remediation process and decreasing both their
toxicity and bio-availability. Like this, the hydrocarbons could be made less available to the
organisms thus resulting less toxic. Therefore, the results show a potential protective effect of F-500
against the damage exerted by pollution on aquatic organisms and, as recently reported [1], the
suitability of this compound to counteract the hydrocarbon contamination of soil.
References
[1] Alberta Environment and Patch H2S Services Limited 2010. F-500: Canadian Testing. Case Study Testing. Details of
tests completed in Canada utilising F-500 in various contaminated land scenarios. http://www.fctservices.co.uk/docs/Alberta-and-Patch-tests.pdf
[2] National Industrial Chemicals Notification and Assessment Scheme (NICNAS) 2004. Full public report. Chemical in F-
500. Australian Government Publishing Service, Canberra. File No: EX/42(NA/976): 23 pp. http://www.nicnas.gov.au/publications/car/new/ex/exfullr/ex0000fr/ex42fr.pdf
[3] OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) 1984. Guidelines for testing of chemicals No. 207.
Earthworm, acute toxicity test. OECD, Paris.
[4] Giacco E., Mariottini G.L., Pane L. 2008. Valutazione ecotossicologica del prodotto estinguente F-500 su organismi
d’acqua dolce appartenenti a diversi livelli trofici. XVIII Congresso della Società Italiana di Ecologia, “Ecologia,
emergenza, pianificazione”. Riassunti (a cura di G. Benassi, G. Giordani, P. Viaroli), Parma 1-3 settembre 2008. P.10.5 144-145.
[5] EPA 2001. Methods for collection, storage and manipulation of sediments for chemical and toxicological analyses:
Technical Manual. EPA-823-B-01-002 Oct. 2001. Chapter 5, Pp. 14-15. [6] APAT 2002. Guida tecnica su metodi di analisi per il suolo e i siti contaminati. Utilizzo di indicatori ecotossicologici e
biologici. P. Nappi, C. Jacomini (APAT)RTI CTN_SSC 2/2002.
[7] OECD (2004). Guideline for testing of chemicals. "Daphnia sp., acute immobilisation test and reproduction test". Guideline 202.
[8] GESAMP 2002. The revised GESAMP hazard evaluation procedure, Report and Studies n. 64.
| 35
[9] Clemson Final Report: Tiwet-Project – 09440 1997. A study of the physical properties, biological effects and possible
usages of F-500 in environmental protection and restoration. The Institute of Wildlife and Environmental Toxicology
Clemson University Pendleton, SC 29670 George P. Cobb, Section Leader Analytical Toxicology.
[10] EPA 2002. Oil Program Center. Technical Product Bulletin sw-30. [11] ARPA Ferrara 2005. Rapporto di prova 002971/05/FE.
Corresponding author: Luigi Pane - Department of Earth, Environment and Life Sciences (DISTAV), University of Genova,
Viale Benedetto XV 5, 16132 Genova, Italy. Tel. +390103538071; email: pane@unige.it
A photochromic bacterial photoreceptor as a novel tool for super-
resolution microscopy
C. Mandalari1,*
, A. Losi1, W. Gärtner
2, S. Raffelberg
2, F. Cella Zanacchi
3, P. Bianchini
3, A. Diaspro
3,
S. Abbruzzetti1,4
, C. Viappiani1,4
1Dipartimento di Fisica, Parma,
2Max-Planck-Institute for Bioinorganic Chemistry, Mülheim a.d.
Ruhr, Germany, 3Istituto Italiano di Tecnologia, Genova,
4NEST, Istituto Nanoscienze-CNR
We introduce a novel fluorescent reporter for super-resolution microscopy, based on the bacterial
photoreceptor YtvA [1]. YtvA (from Bacillus subtilis) comprises a photosensitive flavin based LOV
domain, efficiently photo-switchable between fluorescent and non fluorescent states [2]. The
remarkable thermal and photochemical stability of YtvA and its excellently suited properties for
imaging make flavin-binding LOV domains a powerful new class of autofluorescent proteins, which
adds to the already available GFPs toolbox. We demonstrate FPALM studies of live Escherichia coli
cells, expressing YtvA molecules (Figura 1).
Figura 1: A comparison between the conventional wide-field fluorescence image (Fig. 1a,b) and the FPALM image (Fig. 1c)
shows the remarkable resolution improvement and clearly demonstrates the suitability of YtvA for super-resolution applications
in cells.
References:
1. A. Losi, A. and W. Gärtner, Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy applications: flavins in LOV and BLUF photoreceptors. Photochem. Photobiol., 2011, 87, 491 510.
2. The LOV2 domain of phototropin: a reversible photochromic switch. J.T.M. Kennis, I.H.M. van Stokkum, S. Crosson, M.
Gauden, K. Moffat, and R. van Grondelle, J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 4512 4513.
*Corresponding author: University of Parma (www.unipr.it), Department of Physics and Earth Sciences, viale G.P. Usberti
7/A, 43100-Parma (I) Tel: +39-0521905256, e-mail: carmen.mandalari@fis.unipr.it
36 |
Study of the interaction of myelin basic protein with membranes by
means of molecular dynamics simulations
E. Polverini1*
, M. De Donatis1 and G. Harauz
2
1Department of Physics and Earth Science - University of Parma, Parma, Italy,
2Department of
Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1, Canada.
Myelin basic protein (MBP) is a highly basic multifunctional protein of the central nervous system,
whose principal role is to maintain the compactness and integrity of the myelin sheath, acting as a
“biological glue”. Because of its involvement in human demyelinating diseases, the investigation of
the interaction of MBP with membrane is particularly relevant. The three-dimensional structure of
MBP is still unknown, due to its intrinsic flexibility and dependence of conformation on environment
and on its multiple biological roles. However, three regions of the protein can potentially be
amphipathic alpha-helices [1] and, therefore, are good candidates as interaction sites with membranes.
In this study, we investigate the first, N-terminal region, ranging from residue R29 to G48 (murine
sequence numbering), which also contains a double Phe-Phe site that can strongly contribute to anchor
this segment to the membrane. Molecular dynamics (MD) simulations were performed on this peptide
in the presence of both neutral (DMPC) and mixed neutral-negatively charged (DMPC-DMPS) lipid
bilayer, to explore the effects of the electrostatic driving force. The results show a tilt and a deep
penetration of the amphipathic helix into the DMPC membrane, anchored by its hydrophobic surface.
In the mixed DMPC-DMPS bilayer, instead, the peptide remains more at the membrane surface, due
to the stronger electrostatic interaction of MBP charged residues with the charges of the lipidic
headgroups. In both cases, the helix conformation is very stable and strongly anchors the peptide to
the membrane.
Several post-translational modifications (PTMs) are known to be present all along the whole protein,
acting as a “molecular barcode” that modulates the interaction of MBP with membrane or with
signaling proteins. Among these, the more studied are the arginine deimination and the
serine/threonine phosphorylation, also present in R29-G48 peptide. In particular, deimination seems to
limits MBP’s ability to maintain compact myelin and correlates strongly with disease severity. In this
context, the effect of R31 deimination on the conformation and membrane interaction of R29-G48
fragment was investigated by MD, both in the neutral and in the mixed bilayer system. While in
neutral lipids the arginine modification does not influence the depth and the tilt of the helix in respect
of the unmodified peptide, in the DMPC-DMPS mixed bilayer it causes the exposition to the solvent
of the region around the deimination itself and, at the same time, the tilt of the N-terminal side of the
helix, that consequently becomes less deeply inserted.
The exposition by deimination was already experimentally observed for the second putative
-helix region (V83-T92), that is the primary immunodominant epitope, and this effect
was supposed to trigger the initiation of autoimmune response in MS patients [2]. Our results are in
agreement with this behavior and not only support the hypothesis of R29-G48 as a membrane
interaction site in MBP, but also underline the importance of simulating the negative charges present
at the membrane surface to take into account the effect of the electrostatic driving force. This is
particularly relevant for studying the post-translational modifications that, like the deimination,
change the net charge of the molecule.
References
[1] G. Harauz, V. Ladizhansky, J.M. Boggs, Structural polymorphism and multifunctionality of Myelin Basic Protein,
Biochemistry, 2009, 48: 8094-8104. [2] A.A. Musse, J.M. Boggs, G. Harauz, Deimination of membrane-bound myelin basic protein in multiple sclerosis exposes an
immunodominant epitope, PNAS, 2006, 103: 4422-4427.
* Corresponding author: Eugenia Polverini, Dipartimento di Fisica e Scienze della Terra, Parco Area delle scienze 7/A, 43124
Parma, Italia. Phone: +39 0521 905254. E-mail: eugenia.polverini@fis.unipr.it
| 37
Modulation of the photocycle of a flavin-based photoreceptor by
site-directed mutagenesis
A. Losi1,*
, S. Raffelberg2, C. Mandalari
1, W. Gärtner
2, C. Viappiani
1, S. Abbruzzetti
1
1: Dept. of Physics and Earth Sciences, Univ. of Parma (Italy), www.unipr.it, 2
: Max Planck Institute
for Chemical Energy Conversion, Mülheim (Germany)
The non-covalently bound flavin chromophore in blue light-sensing LOV domain proteins is
stabilized through an extended hydrogen-bonding network. Preferential interactions take place
between the C(2)=O, N(3)H, C(4)=O, and N(5) groups and a conserved bunch of glutamine and
asparagine residues (1). Less conserved aminoacids establish interactions with the apolar part of the
isoalloxazine ring. This extended network of weak interactions renders the chromophore cavity
extremely rigid and may affect both spectral properties and dynamics of the photocycle that involve
the reversible formation of a covalent FMN-cysteine adduct. In this work we studied the influence of
the network of weak interactions on the efficiency, kinetics, and energetics of a LOV protein
photocycle, specifically the protein YtvA from Bacillus subtilis. By means of site-directed
mutagenesis, aimed to change the interactions at the polar and/or apolar sides of the flavin
chromophore, and an array of biophysical techniques, we show that it is possible to modulate the
fluorescence and photocycle quantum yields, the spectral properties in the UVA region, the dynamics
of excited states and the thermal relaxation to the dark-adapted state. All mutated proteins investigated
exhibit blue-light driven formation of the FMN-cys adduct, but can be driven into a dark/adduct
photoequilibrium by illumination with UVA/violet light. The results reported here have implications
for understanding the mechanisms underlying thermal recovery and for advanced biophysical
applications such as super-resolution fluorescence microscopy (nanoscopy, Losi et al., 2012).
References
1. S. Raffelberg, M. Mansurova, W. Gärtner and A. Losi, Modulation of the photocycle of a LOV domain photoreceptor by the
hydrogen bonding network, J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 5346-5356.
2. A. Losi, W. Gärtner, S. Raffelberg, F. Cella Zanacchi, P.Bianchini, A. Diaspro, C. Mandalari, S. Abbruzzetti and C.
Viappiani, A photochromic bacterial photoreceptor with potential for super-resolution microscopy, Photochem. Photobiol. Sci,
2012, DOI: 10.1039/c2pp25254f
*Corresponding author: University of Parma (www.unipr.it), Department of Physics and Earth Sciences, viale G.P. Usberti
7/A, 43100-Parma (I), Tel: +39-0521905293, e-mail: aba.losi@fis.unipr.it
Aspetti non-algoritmici della biologia quantistica
P. Zizzi (Dipartimento di Psicologia, Università di Pavia)
I sistemi biologici sono sistemi complessi particolari: la complessità biologica è basata
sull’informazione [1]. La Biologia Quantistica [2] studia i fenomeni quantistici che avvengono a
livello molecolare, quali, ad esempio, la sovrapposizione quantistica e l’effetto tunnel [ 3], e
l’entanglement [4].
Pertanto, un sistema biologico quantistico sarà un sistema con una complessità basata sull’
informazione quantistica, e sarà quindi possibile sede di processi quanto-computazionali. .
I fenomeni quantistici prettamente quanto-computazionali come la sovrapposizione quantistica e l’
entanglement, sono descrivibili da una speciale logica quantistica del qubit, denominata Lq [5].
Quest’ ultima è stata utilizzata per descrivere formalmente i processi mentali quantistici dell’
inconscio [6] nell’ ambito della teoria quantistica della mente di Penrose-Hameroff [7], dove le unità
fondamentali di computazione quantistica (i qubits) sono le tubuline del cervello.
38 |
Come ogni logica dotata di interpretazione (semantica) anche Lq ha un suo metalinguaggio, che in più
è quantistico (QML = Quantum Meta-Language) [5].
E’ noto che tramite un metalinguaggio, è possibile formulare una proposizione di Goedel G: “ G è
vera ma non dimostrabile”.
Come suggerito da Penrose [8], G indica la presenza di un aspetto non-algoritmico della mente
umana. Infatti il matematico, tramite l’ intuito matematico, riesce a cogliere la verità di G anche senza
doverla dimostrare, mentre un computer non può. Quello che cambia a livello quantistico è che Gq è
vera con una certa probabilità e indimostrabile con una certa probabilità [9].
In altri termini, la mente umana a livello quantistico (e dunque inconscio) ha alcuni aspetti
probabilmente non-algoritmici, nel senso che c’è una certa probabilità di riuscire ad intuire la verità di
Gq, e una certa probabilità di riuscire a dimostrarla, e maggiore è l’ incertezza in un senso, minore è
nell’altro. Questo è stato lo studio svolto sugli aspetti non-algoritmici della Biologia Quantistica per
quanto riguarda il sistema nervoso a livello di macro-molecole (tubuline). Crediamo, comunque, che
ci siano aspetti non-algoritmici anche nella genetica, sempre a livello di macro-molecole (DNA).
Più in generale, qui facciamo l’ ipotesi che tutti i fenomeni biologici “ad alto livello” (come il
linguaggio, l’ apprendimento e la percezione a livello nervoso) e alcuni a livello genetico siano
descrivibili non solo da un linguaggio logico, ma anche da un meta-linguaggio. Quello che distingue il
cervello da un computer è il meta-linguaggio, e crediamo che anche ciò che distingue la vita da una
chimica complessa è il metalinguaggio, che la genetica ha, mentre la chimica non ha.
Il DNA non è mera informazione, ma neanche solamente elaborazione dell’ informazione stessa .
Il DNA fornisce istruzioni algoritmiche per costruire la cellula, ma tali algoritmi possono essere
eseguiti solo nel contesto dato dall’ ambiente cellulare. Quindi il DNA è un computer, più un aspetto
contestuale o funzionale [10] , che riguarda l’ informazione semantica dei fenomeni ad alto livello e
quindi il meta-linguaggio.
A livello quantistico, il DNA può essere visto come un computer quantistico [11], che computa ad
altissima velocità grazie alla sovrapposizione quantistica e all’entanglement. Quindi, anche il DNA
dovrà essere descritto da una logica di tipo Lq, e avrà il suo metalinguaggio quantistico.
Il fatto che l’ informazione genetica sia contestuale, non permette di adottare, nel calcolo logico dei
sequenti, la visibilità delle formule attive (indipendenza dal contesto) come invece è stato fatto nel
caso della logica della mente quantistica.
Si consideri il sequente: 2
A , dove A, l’ “antecedente” del sequente è una formula attiva (un
algoritmo), il simbolo indica il link metalinguistica “comporta” (un processo o trasformazione),
è il “conseguente”, ovvero il prodotto della trasformazione, e 2
, il modulo quadro del numero
complesso , che è il grado di asserzione della asserzione “A è vera”, è la probabilità che tale
processo avvenga.
Un tale tipo di sequente è stato usato nel calcolo deduttivo di Lq, dove per semplicità, la formula
attiva A era stata considerata indipendente da ogni contesto iniziale (che in logica sta per una
sequenza finita di proposizioni) la cui interpretazione chimico-fisica potrebbe essere quella dell’
ambiente e delle condizioni iniziali. In tal caso la formula attiva A viene detta “visibile”.
Nel caso della genetica, l’ algoritmo A non è più pensabile come indipendente dal contesto , e
quindi il sequente diventa: 2
)(, A , dove la formula attiva A dipende dal contesto , e
quindi non è più “visibile”, e la probabilità del processo 2
)( dipende dal contesto .
Questo vuol dire che un algoritmo genetico non è “visibile” nel senso che non può venire eseguito se
non nel contesto appropriato.
Comunque, nell’ambito della genetica quantistica, la proposizione di Goedel quantistica, Gq,
porterebbe ad un aspetto probabilisticamente non-algoritmico forse ancora più interessante (almeno a
| 39
livello teorico) di quello riguardante il sistema nervoso.
Infatti, il carattere probabilistico di Gq induce, nel contesto della genetica, alla formulazione di un
principio di indeterminazione quantistico-logico tra l’ incertezza sull’ esistenza della vita V (verità
logica) e l’ incertezza della sua produzione VP a partire da dati iniziali e regole formali
(dimostrazione logica): 1VPV .
Si ricorda qui che il teorema di incompletezza classico di Goedel prevede un’ incertezza V
praticamente nulla (la verità di G è certa), mentre prevede un’ incertezza VP praticamente infinita
(la dimostrazione di G è impossibile).
Nel caso quantistico, invece, c’ è un’ incertezza non nulla (grandissima probabilità) sulla verità di Gq
(sulla presenza della vita) e un’ incertezza non infinita, ma sempre grandissima (piccolissima
probabilità) sulla dimostrabilità di Gq (sulla possibilità di produrre la vita).
Questo spiegherebbe perché la vita, pur avendo una piccolissima probabilità di essere originata, lo è
stata, infatti, sulla terra, forse grazie all’enorme quantità di dati iniziali primordiali, mentre risulta
altamente improbabile poter riuscire a riprodurla in laboratorio, avendo a disposizione solo una
quantità limitata di dati iniziali. Bisogna anche dire che il carattere contestuale stesso della
computazione del DNA rende quasi impossibile poter preparare in laboratorio quel preciso contesto
che renda esecutivo quel dato algoritmo, perché la dinamica del sistema e il contenuto informativo
dello stato biologico sono fortemente accoppiati e si influenzano continuamente a vicenda.
Questa risposta parziale al problema della biogenesi 12] ovvero quello di poter scoprire un percorso
che conduca dalla non-vita alla vita, è comunque negativa, come lo sono del resto i meta-teoremi d’
incompletezza di Goedel riguardo al sogno di Hilbert, di riuscire ad avere un sistema formale
consistente e completo (dove tutte le verità sono dimostrabili).
Bibliografia
[1] E. Schrödinger, What is Life? (Cambridge University Press, Cambridge, 1944).
[2] J. McFadden, Quantum Biology (Norton, New York, 2001).
[3] A. Patel, “Why genetic information processing could have a quantum basis,” J. Biosci. 26,145-51 (2001). [4] Hefeng Wang and Sabre Kais. Quantum entanglement and electron correlation in molecular systems. Israel Journal of
Chemistry, 47(1):59–65, 2007.
[5] Paola Zizzi, “From Quantum Metalanguage to the Logic of Qubits”. PhD Thesis, arXiv:1003.5976 (2010).
[6] Paola Zizzi, When Humans Do Compute Quantum. In: A Computable Universe, Hector Zenil (Ed), Word Scientific
Publishing (2012). Forthcoming.
[7] S. Hameroff, R. Penrose,(1995) Orchestrated reduction of quantum coherence in brain microtubules: A model for consciousness. Neural Network World, Vol. 5(5): 793-804;
S.R. Hameroff, “Quantum coherence in microtubules: a neural basis for emergent consciousness?” Journal of
Consciousness Studies 1, 98–118 (1994); T.J.A.Craddock, C.Beauchemin, J.A.Tuszynski (2009), Information processing mechanisms in microtubules at
physiological temperature: model predictions for experimental test. BioSystems, vol. 97, 28-34.
[8] R. Penrose, Shadows of the Mind. Oxford University Press, London 1995. [9] Paola Zizzi and Massimo Pregnolato. The Non-Algorithmic Side of the Mind. Quantum Biosystems 2012; 4 (1): 1-8.
[10] Sara Imari Walker and Paul C.W Davies, The Algorithmic Origins of Life. arXiv:1207.4803 (2012). [11] J.McFadden, J.Al-Khalili (1999). A quantum mechanical model of adaptive mutation. BioSystems, vol.50, 203-211.
[12] P.C.W. Davies, The Origin of Life (Penguin, London, 2003); The Fifth Miracle (Simon & Schuster, New York, 1998).
Corresponding author: Paola Zizzi - Dipartimento di Psicologia, Università di Pavia,
Piazza Botta, 6, 27100 Pavia, Tel: 3475300467, paola.zizzi@unipv.it
Verso un modello generale della dinamica del citoscheletro
E. Pessa (Dipartimento di Scienze Comportamentali e del Cervello Università di Pavia)
Nel corso degli ultimi anni si è assistito ad un aumento dell’interesse nei confronti della dinamica del
citoscheletro, fomentato dalle teorie di Hameroff e Penrose sul ruolo che eventuali processi quantistici
riguardanti i microtubuli potrebbero avere nello spiegare i fenomeni connessi all’attività cognitiva e,
più in generale, alla coscienza (vedi, ad esempio, [1], [2], [3]). Data la difficoltà di effettuare
40 |
esperimenti in grado di confermare o smentire la validità di queste proposte teoriche, si rende
necessaria la costruzione di modelli della dinamica del citoscheletro che consentano la previsione di
effetti sperimentalmente verificabili. Attualmente tale costruzione risulta assai difficile, data, da un
lato, la complessità della struttura del citoscheletro e, dall’altra, l’esistenza di grosse limitazioni legate
alla simulazione di processi quantistici. In tutte le proposte di tipo modellistico finora introdotte si è
considerato il citoscheletro come una rete di biopolimeri comprendente tre tipi principali di filamenti
(vedi per una rassegna [4]): quelli di actina, i microtubuli e i filamenti intermedi. Di solito questi
ultimi vengono trascurati, dato che sembrano giocare solo un ruolo passivo di rinforzo. Quasi tutti i
modelli sono basati su descrizioni di tipo classico, focalizzate sull’idrodinamica macroscopica della
cellula, e si concentrano principalmente sugli aspetti reologici del citoscheletro, legati al ruolo del
citoscheletro nel determinare le proprietà meccaniche della cellula (vedi per rassegne [5], [6]). Alcuni
di questi modelli sono ispirati ad una teoria generale riguardante la materia biologica, nota come
teoria della tensegrità, proposta da Ingber fin dagli anni Ottanta (vedi per una sintesi [7]). Tale teoria
postula che tutte le strutture biologiche, su qualunque scala, garantiscano la stabilità della loro forma,
nonché la capacità di eseguire movimenti in modo coordinato grazie all’azione combinata di forze di
tensione e di compressione esercitate localmente. In particolare, nel citoscheletro le tensioni sarebbero
supportate dai filamenti di actina mentre i microtubuli sarebbero responsabili delle compressioni (per
un esempio di modello del citoscheletro basato sulla tensegrità vedi [8]).
In presenza di questo quadro teorico, in questo contributo viene proposto un nuovo modello della
dinamica del citoscheletro che, focalizzandosi sulla dinamica di una rete di microtubuli quantistici
interagenti, ricava le proprietà meccaniche del citoscheletro stesso in termini della risposta globale di
questa rete, vista come un insieme di motori molecolari, ricorrendo ai modelli che collegano il
comportamento globale dei filamenti di actina allo spettro di frequenza delle forze prodotte dai motori
in questione (vedi in proposito il modello già citato in [5]). Nello specifico, il modello è stato
progettato per descrivere il citoscheletro delle cellule neuronali, nelle quali i microtubuli formano
aggregati coerenti, in cui tutti i microtubuli hanno la stessa direzione, generalmente parallela a quella
della membrana cellulare (come in prossimità delle zone assonali). Questo permette di limitarsi a
considerare reti di microtubuli praticamente monodimensionali o, al massimo, bidimensionali.
Basandosi sulle ricerche fondamentali di Tuszynski et al. sui processi quantistici che hanno luogo nei
microtubuli (vedi per rassegne [9], [10]), l’attività di ogni microtubulo è stata descritta tramite un
processo markoviano quantistico continuo nel tempo (vedi su questi processi [11]), governato dalle
interazioni con l’uscita dei microtubuli spazialmente vicini, ma in cui l’uscita del segnale prodotto dal
microtubulo considerato avviene in un tempo che dipende dalla lunghezza del microtubulo stesso.
Tale lunghezza viene considerata variabile, come avviene nei microtubuli reali, e descritta da leggi di
variazione già individuate in letteratura (vedi [12], [13]). In aggiunta a tali interazioni, differentemente
da altri modelli, viene aggiunta anche l’interazione tra i microtubuli e il liquido intracellulare in cui
sono immersi. Infatti quest’ultima è responsabile della formazione nel liquido di domini coerenti che
possono fungere da ‘memoria temporanea’ dell’informazione veicolata dai microtubuli. Per questo il
liquido viene rappresentato come un sistema di spin interagenti (rappresentanti i dipoli elettrici in esso
contenuti), con interazioni tra primi vicini. Non sono state invece prese in considerazione le molecole
di tubulina rimaste nel citoscheletro dopo la disgregazione di un singolo microtubulo, dato che recenti
modelli (vedi [14]) hanno evidenziato come questa circostanza sia di secondaria importanza ai fini
della evoluzione dinamica del sistema dei microtubuli.
Le simulazioni su computer del modello, finora condotte su sistemi comprendenti alcune centinaia di
microtubuli, hanno rivelato due aspetti critici: 1) le proprietà reologiche del citoscheletro finora
osservate si possono ottenere solo con una scelta assai accurata dei valori dei parametri del modello, il
che farebbe supporre che tali proprietà siano prive di generalità; 2) non compare nessuna influenza
particolarmente significativa del carattere quantistico della dinamica dei microtubuli, tranne il caso in
cui le interazioni tra i microtubuli e il liquido intracellulare siano particolarmente intense. Queste
circostanze suggeriscono, da un lato, la necessità di una riflessione sulle teorie finora proposte
relativamente al ruolo del citoscheletro e, dall’altro, l’opportunità di una estensione del modello che
eviti approssimazioni troppo spinte di una realtà biologica assai complessa. In ogni caso, le
| 41
simulazioni condotte e l’esame critico dei loro risultati costituiscono un passo necessario nella
direzione di un costruzione di una teoria generale della dinamica del citoscheletro.
Bibliografia [1] Penrose R (1994) Shadows of the Mind. A Search for the Missing Science of Consciousness. New York: Oxford University
Press. [2] Hameroff SR (1994) Quantum Coherence In Microtubules: A Neural Basis For Emergent Consciousness? Journal of
Consciousness Studies, 1: 91.118.
[3] Hameroff SR, Penrose R (1996) Orchestrated reduction of quantum coherence in brain microtubules: a model for consciousness. In Toward a Science of Consciousness - The First Tucson Discussions and Debates, edited by: Hameroff SR,
Kaszniak A, Scott AC. Cambridge, MA, USA: MIT Press.; 507-540.
[4] Pullarkat, P.A., Fernández, P.A., Ott, A. (2007). Rheological properties of the Eukariotic cell cytoskeleton. Physics Reports, 449: 29-53.
[5] Levine, A.J., MacKintosh, F.C. (2009). The mechanics and fluctuation spectrum of active gels. Journal of Physical Chemistry B, 113: 3820-3830.
[6] Ramaswamy, S. (2010). The mechanics and statistics of active matter. Annual Review of Condensed Matter Physics, 1:
323-345. [7] Ingber, D.E., Heidemann, S.R., Lamoureux, P., Buxbaum, R.E. (2000). Opposing views on tensegrity as a structural
framework for understanding cell mechanics. Journal of Applied Physiology, 89: 1663-1678.
[8] Cañadas, P., Laurent, V.M., Oddou, C., Isabey, D., Wendling, S. (2002). A cellular tensegrity model to analyse the
structural viscoelasticity of the Cytoskeleton. Journal of Theoretical Biology, 218: 155-173.
[9] Tuszynski JA, Brown JA, Crawford E, Carpenter EJ, Nip MLA, Dixon JM, Sataric MV (2005) Molecular Dynamics
simulations of tubulin structure and calculations of electrostatic properties of microtubules. Mathematical and Computer Modelling, 41: 1055-1070.
[10] Craddock TJA, Tuszynski JA (2010) A critical assessment of the information processing capabilities of neuronal
microtubules using coherent excitations. Journal of Biological Physics, 36: 53-70. [11] Mülken, O., Blumen, A. (2011). Continuous-time quantum walks: Models for coherent transport on complex networks.
Physics Reports, 502: 37-87.
[12] Deymier, P.A., Yang, Y., Hoying, J. (2005). Effect of tubulin diffusion on polymerization of microtubules. Physical Review E, 72: 021906, 1-7.
[13] Baulin, V.A., Marques, C.M., Thalmann, F. (2007). Collision induced spatial organization of microtubules. Biophysical
Chemistry, 128: 231-244. [14] Glade, N. (2012). On the nature and shape of tubulin trails: Implications on microtubule self-organization. Acta
Biotheoretica, 60: 55-82.
Corresponding author: Eliano Pessa - Dipartimento di Scienze Comportamentali e del Cervello, Università di Pavia Piazza
Botta, 11, 27100 Pavia, Italy, tel. +39-0382986276, eliano.pessa@unipv.it
Nuove metodologie per antichi rimedi: il caso del fungo di malta
A. Rosaa, A. Rescigno
a, A. Piras
b, A. Atzeri
a, P. Scano
b, S. Porcedda
b, P. Zucca
a, M. A. Dessì
a
aDip. Scienze Biomediche,
bDip. Scienze Chimiche e Geologiche, Università degli Studi di Cagliari,
Cittadella Universitaria, SS 554, Km 4.5, 09042 Monserrato, Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39
70 675 4124; e-mail: anrosa@unica.it.
I grassi e gli oli hanno un ruolo importante nell'industria alimentare e farmaceutica. Vi è un crescente
interesse per le caratteristiche dei lipidi di oli vegetali non convenzionali come fonte di componenti
bioattivi e nutrienti funzionali1.
Il Cynomorium coccineum L. è una pianta non-fotosintetica, perenne e parassita, della famiglia delle
Cynomoriaceae, presente in diversi paesi del Bacino del mediterraneo (Spagna, Corsica, Sardegna,
Sicilia, Malta e Creta), nella costa africana occidentale e Penisola Araba2-4
. È conosciuta con nomi
diversi, tra i più comuni Fungo melitensis, Champignon o Éponge de Malt, Fungo di Malta e Tarthuth
nei paesi arabi2-4
. Le proprietà terapeutiche del Fungo di Malta sono state tenute in grande
considerazione nel corso dei secoli. È stato ampiamente utilizzato in molte culture come rimedio
medicinale per la cura di ulcere, emorragie, dissenteria, impotenza, disordini mestruali e infezioni2-4
.
Studi in vitro e in modelli animali hanno evidenziato proprietà antiemorroidali, antiossidanti,
afrodisiache, toniche, antivomitive, ipotensive e di stimolazione della spermatogenesi, degli estratti
ottenuti da questa pianta2-5
. In letteratura si trovano esempi sull'uso del C. coccineum come cibo
durante i periodi di carestia.
42 |
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di evidenziare eventuali proprietà funzionali e potenziali
effetti benefici sulla salute umana correlabili al consumo dell’olio ottenuto dal fungo di Malta. A tal
fine, attraverso l’azione congiunta di diversi gruppi di ricerca, sono state studiate la composizione
chimica e l'attività biologica dell’olio fisso
isolato dal Fungo di Malta (Figura 1A)
raccolto in Sardegna6. L'olio è stato
ottenuto mediante estrazione con anidride
carbonica in fase supercritica (CO2-SFE)6.
La CO2-SFE è una tecnica di estrazione
rispettosa dell'ambiente, utilizzata
industrialmente per l’ottenimento di oli
essenziali/fissi da spezie/piante, in
alternativa ai metodi classici. L’analisi
quali-quantitativa delle principali classi
lipidiche è stata effettuata mediante
risonanza magnetica nucleare (13
C
NMR)6. Le analisi in GC e HPLC hanno
fornito dettagliate informazioni sui singoli
acidi grassi e sullo stato ossidativo
dell'olio estratto6. Sono stati quindi
valutati gli effetti modulatori dell’olio sulla vitalità cellulare, sul profilo dei componenti lipidici (acidi
grassi e colesterolo) in cellule Caco-2 differenziate, come modello di cellule epiteliali intestinali
normali, e in cellule coloniche tumorali (Caco-2 non differenziate)6.
L’estrazione mediante CO2-SFE (250 bar, 40 °C) ha portato all’ottenimento di un olio giallo (resa
7%). Tra i principali componenti
sono stati identificati
triacilgliceroli (42.4%), 1,3
diacilgliceroli (13.1%), 1,2
diacilgliceroli (4.3%),
monoacilgliceroli (3.8%) e acidi
grassi liberi (36.3%). L’olio ha
mostrato un composizione
particolare, con elevati livelli di
18:1 n-9 (38%, 303 mg/g) e degli
acidi grassi essenziali 18:2 n-6
(20%, 159 mg/g) e 18:3 n-3
(11%, 93 mg/g). Diversi oli fissi
hanno mostrato, in colture
cellulari e modelli animali,
interessanti proprietà
antitumorali7. L’olio del C.
coccineum ha indotto in cellule
Caco-2 coloniche tumorali una
significativa riduzione della
vitalità da 100 g/mL (Figura
1B), e del 90% a 500 g/mL,
mentre non ha indotto alcuna
riduzione della vitalità in
monostrati di cellule intestinali
Caco-2 differenziate (Figura 2A). Le cellule epiteliali intestinali sono state quindi incubate con l’olio
per una valutazione dell’effetto modulatorio sui componenti lipidici e della biodisponibilità. Dopo 24
0
25
50
75
100
125
Ctrl 50 100 150 250 350 500 600 750 1000
Vit
ali
tà (
%
con
tro
llo
)
Olio fisso ( g/mL)
0
10
20
30
40
50
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Ctrl 50 100
18
:2 e
18
:3 (
g/p
iast
ra)
16
:1 e
18
:1 (
% c
on
tro
llo
)
Olio fisso ( g/mL)
16:1
18:1
18:2 n-6
18:3 n-3 c
c
ad
a
ad
a
B
A
Figura 2. Vitalità (% del controllo, test Alamarblue) (A) e valori degli acidi
grassi 16:1, 18:1 (% controllo), 18:2 e 18:3 ( g/piastra) (B) misurati nelle
cellule Caco-2 differenziate di controllo e dopo 24 ore di incubazione in
presenza dell’olio fisso di C. coccineum (B). a = P < 0.001, c = P < 0.05
versus Ctrl; d = P < 0.001, vs 50 g/mL; (n = 16).
0
20
40
60
80
100
120
ctrl 50 100 250 500 750 1000
% V
iita
lità
Olio fisso ( g/mL)
af a
adgl
adglo adglo
AB
Figura 1. Immagine digitale del Cynomorium coccineum (fungo di Malta)
raccolto in un’area costiera del sud-est della Sardegna, Italia (A). Vitalità
(% del controllo) misurata nelle cellule Caco-2 tumorali dopo 24 ore di
incubazione in presenza dell’olio fisso di C. coccineum (test MTT) (B). a =
P < 0.001, c = P < 0.05 versus ctrl; d = P < 0.001, f = P < 0.05 vs cellule
incubate con 50 g/mL; g = P < 0.001 vs 100 g/mL; l = P < 0.001, vs 250
g/mL; o = P < 0.001, vs 500 g/mL; (n = 16).
| 43
ore di incubazione è stato osservato nelle cellule trattate un significativo cambiamento nel profilo
degli acidi grassi, con un marcato incremento degli acidi grassi essenziali 18:2 n-6 e 18:3 n-3
(rispettivamente 4 e 14 volte superiori rispetto alle cellule di controllo) e, in minor misura, di 18:1 n-9
(Figura 2B). L’olio ha inoltre indotto un selettivo aumento anche nei livelli di 20:3, 22:5 n-3 e, in
misura minore di 20:5 n-3. Non è stato osservato un accumulo di colesterolo rispetto alle cellule di
controllo, mentre è stato misurato un lieve incremento del livello di idroperossidi, correlato allo stato
ossidativo dell’olio. Un simile effetto sul profilo lipidico è stato osservato nelle cellule Caco-2
tumorali. La composizione degli acidi grassi è molto importante in relazione alle caratteristiche
nutrizionali e funzionali di un olio. L’olio del Fungo di Malta è risultato una fonte naturale,
biodisponibile, di acidi grassi essenziali; ha mostrato la capacità di influenzare la vitalità in cellule
tumorali intestinali, senza alcuna tossicità nelle cellule normali. Si qualifica quindi come una risorsa
per applicazioni farmaceutiche e alimentari, potenzialmente in grado di esercitare effetti positivi sul
mantenimento della salute e di agire nella prevenzione/trattamento di condizioni patologiche.
Bibliografia
1) Al Ashaal, H.A., Farghaly, A.A., Abd El Aziz, M.M., Ali, M.A., 2010. Phytochemical investigation and medicinal
evaluation of fixed oil of Balanites aegyptiaca fruits (Balantiaceae). J. Ethnopharmacol. 127, 495–501.
2) IUCN, 2005. International Union for Conservation of Nature and Natural Resources, Centre for Mediterranean Cooperation, Cynomorium coccineum L., in: IUCN Centre for Mediterranean Cooperation Malaga (Spain) (Ed.), A Guide
to Medicinal Plants in North Africa, pp. 99–100.
3) Dharmananda, S., 2011. Cynomorium - Parasitic plant widely used in traditional medicine.
<http://www.itmonline.org/arts/cynomorium.htm>.
4) Lebling, R.W., 2003. The treasure of tarthuth. Saudi Aramco World 54, 12–17.
5) Abdel-Magied, E.M., Abdel-Rahman, H.A., Harraz, F.M., 2001. The effect of aqueous extracts of Cynomorium coccineum and Withania somnifera on testicular development in immature Wistar rats. J. Ethnopharmacol. 75, 1–4.
6) Rosa, A., Rescigno, A., Piras, A., Atzeri, A, Scano, P., Porcedda, S., Zucca, P., Dessì, A. 2012. Chemical composition and effect on intestinal Caco-2 cell viability and lipid profile of fixed oil from Cynomorium coccineum L. Food Chem.
Toxicol. 50, 3799–3807.
Corresponding author: Antonella Rosa - Dip. Scienze Biomediche, Università degli Studi di Cagliari, Cittadella Universitaria,
SS 554, Km 4.5, 09042 Monserrato, Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39 70 675 4124; e-mail: anrosa@unica.it
44 |
POSTER
P01-Qualitative comparision of olive oil mediterranean
D. Planeta a, S. Aiello
b, M. Giammanco
c, W. Randazzo
d, V. Mineo
a
a Dipartimento Sistemi Agro-Ambientali, Università degli Studi di Palermo,
b Dipartimento di Scienze
e Tecnologie Molecolari e Biomolecolari, Università degli Studi di Palermo, c Dipartimento di Studi
Giuridici, Economici, Biomedici e Psicosociopedagogici delle Scienze Motorie e Sportive, Università
degli Studi di Palermo, d Dipartimento DEMETRA, Università degli Studi di Palermo
The interest in the last few decades for olive cultivation is expanding is because they have been
achieved levels of mechanization that make olive growing economically competitive with other tree
crops, and because the recognition of the nutritional and health qualities of olive oil resulted in an
increase and a geographic expansion of demand.
The revaluation of olive oil which fat essential for a balanced diet is due to the particular lipid fatty
acid composition which, in addition to being rich in monounsaturated fatty acids, has a budget
balanced essential polyunsaturated fatty acids, with positive effects on adjustment of the level of
cholesterol in blood, on the mechanisms of cell permeability and the formation of free radicals.[1,2]
Among the minor constituents of virgin olive oils carotenes, tocopherols and phenolic substances are
hydrophilic compounds Healthy mostly related to the quality of virgin olive oil due to its antioxidant
properties.[3]
The overall quality of an oil is determined by genetic factors (cultivar), soil (chemical-physical
characteristics of the soil), climatic and cultural practices. From the interaction of these factors depend
on the chemical characteristics of an oil.[4]
The main purpose of this work was to compare quality parameters of chemical samples monovarietal
oils extracted from cultivar Sicilian and Spanish. The Sicilian cultivars are divided into three
categories: major, minor and neglected, while the oil samples were produced by Spanish cultivar
originating in Andalusia, southern Spain.
The analyzes were carried out in 2010 on 24 samples of olive oil olive oil products in the year
2008/2009, of which 19 produced by native Sicilian cultivars and 5 from Spanish cultivars.
The samples were analyzed according to the Regulation EC 1989/03 and the following parameters
were determined; free acidity, number of peroxides, spectrophotometric indices at 232 nm and 270
nm, fatty acid composition, by analysis by gas chromatography of methyl esters, phenolic substances,
by UV spectrophotometric analysis.
Revealed a high biological variability and agronomic feature of Sicilian varietal platform, unlike other
distribution areas such as the Spanish olive sector.
This genetic polymorphism is primarily responsible for the variability that affects all aspects of olive
production, including chemical and physical indices adopted for the qualitative assessment. The
survey conducted on monovarietal oils of cultivars germplasm native Sicilian and Spanish, it was
found that all the oils meet the European standards of the law, but at the same time there was a
different overall quality that contrasts the Sicilian oils to those Iberians.
The oils are collectively discreetly equipped with polyphenols, except that in the case of Manzanilla
resulting deficient. The analysis of fatty acid composition showed an imbalance in cultivars Spanish
tied to values meager of oleic acid, linoleic acid at high values and, consequently, to relations of oleic
/ linoleic quite low, less than 6. Chemical-physical precious have been found in the oils of the cultivar
Biancolilla Nerba, Crastu, Iacona, Pizzutella, Vaddarica and to a greater extent Montonica.
| 45
Bibliography
[1] L. Franzetti, M. Scarpellini, M, A. Vecchio, D. Planeta. Microbiological and safety evaluation of green table olives
marketed in Italy. Annals Of Microbiology, Vol. 61, Issue: 4, Pages: 843-851
[2] P. Conte, V. Mineo, S. Bubici, C. De Pasquale, F. Aboud, A. Maccotta, D. Planeta, G. Alonzo. Dynamics of pistachio oils
by proton nuclear magnetic resonance relaxation dispersion Analytical and bioanalytical chemistry, Vol. 400, Issue: 5, Pages:
1443-1450
[3] V. Mineo, D. Planeta, C. Finoli, S. Giuliano.
Fatty acids, Sterols and Antioxidant compounds of minor and neglected cultivar of Sicilian virgin olive oils.Progress in
nutrition, Vol. 9 Issue: 4 Pages: 259-263
[4]G. Aiello, P. Catania, M. Enea, G. La Scalia, F. Pipitone, M. Vallone.
Real time continuous oxygen concentration monitoring system during malaxation for the production of Virgin Olive Oil. Grasas
y Aceites, Vol. 63 Issue 4, Pages 475-483.
Corresponding author: Diego Planeta, Dipartimento Sistemi Agro-Ambientali, Università degli Studi di Palermo, Viale Scienze
11, 90128 Palermo, Italy; tel:+39.091 23897080; email: diego.planeta@unipa.it
P02-The control of abstinence in the treatment of alcohol
dependence: the use of acamprosate in relapse prevention.
F. Venturellaa, Asaro A.
a, G. Faillace
b, G. Spinnato
c, D. Di Majo
e; M. La Guardia
e, M. Giammanco
e,
S. Aiello d
a Dipartimento di Scienze per la Promozione della Salute G. D’ Alessandro, Università di Palermo,
bSer.T Alcamo,
c Sevizio di Psichiatria ASL Palermo 2,
d Dipartimento di Scienze e Tecnologie
Molecolari e Biomolecolari, Università di Palermo, e.
Dipartimento DISMOT, U.O. di Fisiologia e
Farmacologia, Università di Palermo
"The alcoholism can also deal with drug treatments."
This is the message that emerges from the press conference of presentation of Campral, trade name of
acamprosate, a neuromodulator specifically indicated in the maintenance of abstinence in alcohol-
dependent patients.Alcoholism is a disease characterized by: craving, loss of control, tolerance and
physical dependence.For many years the prevention of relapse in use of alcohol after detoxification
was supported almost exclusively by psychosocial procedures and techniques with modest success.
Treatment with acamprosate is a valid tool to complement psychotherapy as it does not cause
addiction, abuse or withdrawal of its suspension and does not interfere with other medications that
patients often alcoholics must take.To evaluate the effectiveness, our study evaluated the effects of
Acamprosate compared to GHB in clinical-physiological and social health in a way indicators of a
possible therapeutic success in terms of abstinence from alcohol and social reintegration. The
hypothesis of the project is that pharmacotherapy anticraving with acamprosate integrated with
psycho-social support, can reduce relapse in alcohol together with the reduction of the risk of abuse
arising from the use of GHB. This work purports to be an account of 11 months of observation of
patients treated with acamprosate.
Results: A total of 36 patients were observed, of which 5, 4 men and 1 woman at the Ser.T Alcamo
and 31, 21 men and 10 women at the Ser.T of Palermo. In the fight against alcoholism, this therapy
with acamprosate offers significant potential: decreases, in fact, the incidence, severity and frequency
of relapses (Fig. 1). As regards the craving, during the period of treatment with acamprosate, there has
been a change, in the sense of reduction, of craving for alcohol: if before therapy was in 68% of cases,
medium-high, becomes after 3-4 months after therapy in low-nil in 89% of patients observed.
It has been recorded that, after 3-4 months after receiving acamprosate, the clinical picture of the
patient is greatly improved by referring to biological markers (Fig. 2).
Conclusions: The study shows that treatment with acamprosate is an exciting opportunity within a
project of integrated care for the treatment of alcohol addiction. The acamprosate may also be used
early in the pharmacological treatment of dependence on alcohol to prevent the appearance of
46 |
55,6%
13% Relapse relapse with acamprosate
relapse with acamprosate
excitability neuronal associated abstinence.On the other hand, its use must have a duration sufficient
to allow neuronal excitability to normalize in the most enduring possible: the treatment, in fact, is
recommended for one year. In any case, the use can be continued even in the face of relapses, with the
aim to reduce the frequency or severity.In particular, the strong point seems to be the ability for the
user to experience a new sense of normalcy and to remove the desire for significant periods of alcohol.
Fig.1: Percentage of relapse
during treatment with
acamprosate.
Fig.2: Laboratory findings on biological markers before and after treatment with acamprosate.
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2011 Oct;301(4):R1032-43. Epub 2011 Jun 22.
Corresponding author: Dott. Fabio Venturella, Dipartimento di Scienze per la promozione della salute G. D’ Alessandro,Via
Del Vespro 127 Università degli Studi di Palermo, Tel. 3203354997, Email: fabio.venturella@unipa.it
95 77
43.3
356.8
91.5
17 21
61
0 40 80
120 160 200 240 280 320 360 400
MCV AST ALT G-GT
Biological markers
BEFORE
AFTER
| 47
P03-Relationship between maximal fat oxidation and oxygen
uptake: comparison between patients with type 2 diabetes and
healthy sedentary subjects.
A.Cataldo, G. Russo, D. Cerasola, D. Di Majo, S. Aiello, M. Giammanco, M. Traina
Department of Sports Science (DISMOT), University of Palermo, Italy
Purpose
Carbohydrate and fatty acids are the dominant fuels oxidized for energy production during exercise.
Their contribution is influenced by intensity of exercise1, with a progressive increase in the relative
contribution of carbohydrate oxidation to energy expenditure, whereas the absolute rate of fat
oxidation increases from low to moderate intensities of exercise and declines as exercise becomes
more intense2. In patients with type 2 diabetes (T2D) the altered metabolism and the lower capacity to
sustain efforts3 changed the choice and regulation of energy substrates for oxidation
4.
Purpose of our study was to assess the relationship between the highest value of fat oxidation rate
(FATmax) and the oxygen uptake (VO2) in sedentary T2D patients and to compare with healthy
sedentary subjects.
Methods
Fifteen sedentary T2D patients (nine males, six females), mean age 58 (range 39 – 65) and fifteen
healthy sedentary subjects (eight males, seven females), mean age 53 (range 37 – 71), were studied.
All T2D patients were being treated with diet and antiglycemic agents. Significant cardiovascular
disease was excluded in all subjects by an instrumental examination. The exercise testing started in the
laboratory at 08.00 hours after an overnight fast. All subjects performed a graded exercise test to
exhaustion on treadmill, using modified Bruce protocol. Oxygen uptake (VO2) and carbon dioxide
(VCO2) were recorded and maximum fat oxidation rate (FATmax) was determined using indirect
calorimetry, with the assumption that urinary nitrogen excretion rate was negligible. Substrate
oxidation rates were then plotted as a function of exercise intensity, expressed as percentage of
maximal oxygen uptake (VO2max). Experimental data are presented as means standard error of the
mean, and for the statistical analysis of the data linear regression analysis was used.
Results
The physical and physiological characteristics of subjetcs are shown in table 1. The average VO2max
for T2D patients and healthy subjects was 22.29 1.06 ml/Kg/min and 28.63 2.03 ml/Kg/min
respectively (P < 0.01). In T2D patients, absolute fat oxidation rate reached a maximum of 6.71 0.46
mg/Kg/min at VO2 of 15.41 0.68 ml/Kg/min (70 1.27% of VO2max) while in healthy subjects 7.19
0.77 mg/Kg/min at VO2 of 18.23 1.28 ml/Kg/min (64 2.61% of VO2max). When linear regression
analysis was performed, a positive linear correlation between FATmax and VO2 (r = 0.85; p = 0.0001)
in both groups has been found (Fig. 1). Also, positive linear correlation between FATmax and VO2max
in both T2D (r = 0.76; p = 0.001) and healthy subjects (r = 0.73; p = 0.002) has been found (Fig. 2).
Conclusions
Our data, comparable with those reported in the literature5, indicate that in T2D patients fat oxidation
rate is not impaired. VO2max, index of exercise capacity, was significantly lower in T2D patients so
that, in T2D compared to healthy subjects, we found a maximal fat rate oxidation at higher exercise
intensity. Moreover, the positive linear correlation between FATmax and both VO2 and VO2max
suggests that even in T2D patients the muscle oxidative capacity might increase in response to aerobic
training.
48 |
Table 1: Physical and physiological characteristics of subjetcs.
T2D patients Healthy subjects
n 15 15Age (y) 58 ± 1.78 53 ± 2.04
Height (cm) 168 ± 2.32 167 ± 2.58Weight (Kg) 81 ± 3.20 75 ± 4.69
BMI 28.7 ± 1.07 26.6 ± 1.3VO2max (ml/Kg/min) 22.29 ± 1.06 28.63 ± 2.03 **
FATmax (ml/Kg/min) 6.71 ± 0.46 7.19 ± 0.77
VO2 at FATmax (ml/Kg/min) 15.41 ± 0.68 18.23 ± 1.28 *
%VO2max at FATmax (%) 70 ± 1.27 64 ± 2.61 *
Data are means ± SE
* P < 0.05 for difference between healthy and T2D subjects
** P < 0.01 for differences between healthy and T2D subjects
.
Fig.1 Correlations between FATmax and VO2 in T2D (A) and Healthy (B) subjects
Fig.2 Correlations between FATmax and VO2max in T2D (A) and Healthy (B) subjects.
References
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carbohydrate metabolism in relation to exercise intensity and duration. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 265: E380–E391, 1993.
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rest and during exercise. Clinical Sc. 103: 559-566, 2002. Corresponding Author: Marco Giammanco, fax+390916236407, Email: marco.giammanco@unipa.it
9.00
11.00
13.00
15.00
17.00
19.00
21.00
23.00
3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00
VO
2 (
ml/
Kg/
min
)
FATmax (mg/Kg/min)
T2D subjects
r = 0.85
A
9.00
14.00
19.00
24.00
29.00
3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00
VO
2 (
ml/
Kg/
min
)
FATmax (mg/Kg/min)
r = 0.85 p = 0.0001
Healthy subjects
B
9.00
14.00
19.00
24.00
29.00
34.00
3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00
VO
2m
ax (m
l/K
g/m
in)
FATmax (mg/Kg/min)
T2D subjects
A
r = 0.76 p = 0.001
9.00
19.00
29.00
39.00
49.00
3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00 VO
2m
ax (
ml/
Kg/
min
)
FATmax (mg/Kg/min)
Healthy subjects
r = 0.73 p = 0.002
B
| 49
P04-The influence of hypocaloric diet, associated with moderate
physical activity and CBT (cognitive behavioral therapy), on self-
esteem and self-efficacy and their modulator role on emotional
eating.
G. Giammanco, D. Di Majo, M. Giammanco, M. La Guardia
Dipartimento DISMOT, Unità Operativa Didattico Scientifica di Fisiologia e Farmacologia
Università degli Studi di Palermo
There are many evidences that emotional factors have great influence on eating habits; this
phenomenon is defined “emotional eating” and increases the risk of obesity (1). Few studies
demonstrate that patients affected by binge eating disorder felt negative emotions before binges; the
main emotion reported was anxiety, then sadness and tiredness. The emotional factors can interfere
with a diet therapy and with keeping results at the end of a diet. Emotional eating is related to the
stress (2), so when subjects feel anxiety and depression, is more probable that they use food as
modulator of their emotions, in this way the weight develops fast with all risks of obesity.
The obesity is often attended by a specific syndrome called metabolic syndrome; the main symptoms
are insulin resistence, hyperinsulinemia, not-insulin-dependent diabetes mellitus, dyslipidemia, central
obesity, hyperuricemia, hypertension; this clinic condition predisposes to cardiovascular diseases. So
the aim of our study is to observe how two psychological constructs as “self-esteem” and “self-
efficacy”, that are demonstrated to have a protective role against negative emotions as anxiety e
depression (5), can modulate the emotional eating. For this aim, we used CBT (Cognitive Behavior
Therapy). We began to select a sample of obese subjects, and gave them few questionnaires to
evaluate the degree of anxiety and depression (STAI/BDI), the level of self-esteem (BASIC SE), and
if there was a diagnosis of Binge Eating Disorder (BED) by a Binge Eating Scale (BES). The first
results show a significant relation between anxiety and depression and low level of self-esteem, and
their relation with BED. The one subject of the sample with low self-esteem and high depression and
anxiety, but without BED, uses pharmacological therapy for anxiety and depression. Is probable that
modulator effect of food is displaced by drugs.
sesso età BMI BES BDI STAI BASIC SE
F 30 37,2 1 6 27 >80°
F 47 53,7 39 40 77 <1°
F 50 40,1 6 33 67 <5°
M 30 52,8 31 13 59 15°
M 36 37,1 4 1 35 >90°
BIBLIOGRAPHY 1) DallmanMF. “Stress-induced obesity and the emotional nervous system.”
Trends EndocrinolMetab. 2010 Mar; 21(3):159-65. Epub 2009 Nov 18. 1) MashebR.M., Grilo C.M.“Emotional overeating and its associations with eating disorder psychopatology among
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interpersonal success, happiness, or healthier lifestyle?” Psychological Science in the Public Interest, 2003 4, 1-44. 4
Corresponding Author: Giulia Giammanco, email: giugia3@tin.it
50 |
P05-Cellular drug delivery system based on vaterite particles
B. Parakhonskiy1, 2
, C. Foss1, E. Carletti
1, A. Haase
1, A. Motta
1, C. Migliaresi
1, and R. Antolini
1
1. BIOtech, University of Trento, via delle Regole 101, 38123 Mattarello, Italy
2. Shubnikov Institute of Crystallography, Russian Academy of Science, Moscow, Russia
The novel technique for the synthesis of vaterite submicron containers were developed in our work.
We present the characterization of these carriers, their loading and experiments on possible release
strategies controlling of the release rates of encapsulated substances. Biocompatibility analyses were
performed, evaluating the cytotoxicity of vaterite containers and their influence on the cell
metabolism. Finally we present in vitro cellular uptake experiments for different molecular-weight
cargos.
CaCO3 vaterite spherical particles were fabricated with controllable average sizes from 400nm up to
10 micron. As proof-of-principle experiments, fluorescent markers (low-molecular-weight Rhodamine
6G and high-molecular-weight TRITC-dextran) were encapsulated into the vaterite containers, so that
payload release dynamics could be studied by fluorescence microscopy and spectrofluorimetry. An
increase of the release rate of Rhodamine 6G into water and cell growth medium was found with
respect to ethanol coinciding with the recrystallization phase transition from vaterite to calcite after 3
days. For samples loaded with TRITC-dextran, this phase transition was inhibited, causing only small
amounts of the encapsulated markers being desorbed during one week.
Human ovarian carcinoma ES2 cells were cultured with a suspension of vaterite particles in culture
medium. Neither cytotoxicity was noticed after 2 days of incubation, nor cell reproduction was
significantly affected proving the biocompatibility of the vaterite containers. The uptake dynamics
was monitored by confocal laser microscopy after staining live cells with Calcein-AM. High- and
low-molecular-weight payload for cell uptake experiments showed diverse dynamics.
While the first exhibited fast dye release into the cells, the later showed strong indications of intact
containers accumulating within the cell also after 48h. These contrasting dynamics can be further
controlled by covering the microcontainers with additional layers of biocompatible polyelectrolyte,
which will further increase the payload release time. A change of the pH from neutral to acid
conditions instead, will lead to a destruction of the vaterite matrix followed by a quick release of the
encapsulated materials. These flexible control mechanisms make this system an interesting candidate
for pharmaceutical applications.
P06-Modelli biologici di stress ossidativo per lo studio delle
proprietà antiossidanti del carciofo
Melis M. P., Atzeri A., Cabboi B., Deiana M., Incani A., Loru D., Rosa A., M. Melis, Dessì M. A.
Dip. Scienze Biomediche, Università degli Studi di Cagliari, Cittadella Universitaria, SS 554, Km 4.5,
09042 Monserrato, Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39 70 675 4127; e-mail: mpmelis@unica.it.
É oramai ben riconosciuto il ruolo funzionale, in relazione al miglioramento dello stato di salute e di
benessere e/o riduzione del rischio di malattia, di una serie di alimenti che rientrano nelle normali
abitudini alimentari e che mostrano la loro efficacia nelle quantità normalmente consumate nella dieta.
Il carciofo, alimento da sempre apprezzato nella regione mediterranea, è una verdura caratterizzata da
elevati livelli di polifenoli (≈ 2% del peso fresco), composti in grado di esercitare un’importante
azione di prevenzione nei confronti di differenti condizioni patologiche. Tradizionalmente è stato
utilizzato nella medicina popolare per le sue proprietà coleretiche-colagoghe, diuretiche,
| 51
epatoprotettive ed ipocolesterolemizzanti, proprietà confermate da vari studi sperimentali, che hanno
avvalorato l’azione benefica del carciofo nei confronti di alcuni disturbi epatici e digestivi1, la
capacità di esplicare effetti anti-iperlipidemici2 sia ostacolando l’aumento di trigliceridi sia inibendo lo
svuotamento gastrico. È stata inoltre evidenziata un’azione ipoglicemizzante negli animali e
nell’uomo oltre ad un effetto ipocolesterolemico3 dovuto sia ad aumentato flusso biliare (e
conseguente aumento di escrezione di colesterolo), sia all’ostacolo di neo-sintesi di colesterolo
(tramite l’inibizione dell’enzima idrossi-metilglutaril CoA reduttasi). Numerosi studi hanno mostrato
l’importante azione antiossidante esplicata dal carciofo o dai suoi estratti in diversi modelli
sperimentali, in particolare in leucociti umani stimolati con diversi ossidanti tra cui H2O2, in colture di
cellule endoteliali e di monociti4, in colture primarie di epatociti di ratto trattati con cumene
idroperossido o tert-butil idroperossido5 o durante l’ossidazione di LDL mediata da ioni rameici
4,6. Le
proprietà antiossidanti del carciofo sono state correlate al contenuto di composti polifenolici presenti,
in particolare ai livelli di acido caffeico e dei suoi derivati. Altri importanti composti fenolici
identificati nel carciofo sono i flavonoidi apigenina e luteolina e i loro glucosidi e rutinosidi.
Questo studio è volto a valutare l’azione antiossidante del carciofo della cultivar “Spinoso Sardo”,
clone “Spinoso”, con l’obiettivo di fornire una nuova caratterizzazione delle proprietà di questo
pregiato ortaggio, molto importante
nell’economia della Sardegna, per
renderlo da squisito alimento
apprezzato soprattutto per la sua
bontà, oltre che per le sue proprietà
benefiche nei confronti di vari
disturbi epatici-biliari, a nuova
potenziale fonte di molecole
antiossidanti. A tale scopo è stato
studiato e comparato il potere
antiossidante di una serie di estratti
metanolici ottenuti da differenti parti
(foglie, capolini e gambi) del carciofo
Spinoso Sardo attraverso l’utilizzo di
diversi modelli di stress ossidativo di
rilevanza biologica, quali la
degradazione ossidativa dell’acido
linoleico a 37 °C e l’ossidazione del colesterolo a 140 °C. Inoltre è stato valutato l’effetto citotossico
nei confronti delle cellule Caco-2 differenziate, quale modello di cellule intestinali. Tutti gli estratti di
carciofo hanno ostacolato la degradazione dell’acido linoleico ma in maniera differente: i capolini
hanno mostrato un potere protettivo maggiore rispetto agli estratti dei gambi e delle foglie; infatti, già
da 1 g hanno protetto l’acido linoleico di circa il 50% e permesso un recupero maggiore di acidi
grassi idroperossidi a dieni coniugati (HP). Una protezione totale dell’acido grasso si è riscontrata con
5 g degli estratti dei capolini e con 50 g degli estratti dei gambi (Figura 1). Tale capacità
antiossidante probabilmente è esplicata dagli estratti di carciofo attraverso un meccanismo di
donazione di atomi idrogeno, confermato dalla capacità degli estratti di spostare il rapporto c,t/t,t degli
HP formati durante l’autossidazione dell’acido linoleico a favore degli isomeri c,t7. La protezione
verso il colesterolo è stata più simile tra gli estratti (100% di protezione da 5 g), 1 g dell’estratto dei
capolini ha permesso una protezione paragonabile tra foglie e capolini, mentre i gambi sono stati
meno efficaci.
0
50
100
150
200
250
300
0
20
40
60
80
100
120
HP
to
t (%
del
l'o
x)
ac.
lin
ole
ico
(%
del
co
ntr
oll
o 0
°C)
estratti di carciofo
1ug 2.5ug 5ug 10ug 50ug
1ug 2.5ug 5ug 10ug 50ug
Figura 1: Acido linoleico residuo (barre) espresso in % del controllo a 0 C e acidi grassi
idroperossidi totali (HP tot) (linee) espressi in % dell’ossidato (ox), formati dopo
incubazione, a 37 C per 32 ore alla luce, di 1mg di acido linoleico in assenza (ox) o in
presenza di 1-50 g di estratti in metanolo di gambi, foglie e capolini di carciofo, clone
“Spinoso”, cultivar “Spinoso Sardo”. (Valori del controllo: ac. linoleico= 0.95 0.05mg;
HP= 86.66 11.44 g, analisi in HPLC7).
52 |
Sulle cellule Caco-2 differenziate, (modello ampiamente utilizzato per la valutazione delle proprietà
delle cellule intestinali8), gli estratti in metanolo dei capolini del clone “Spinoso” non hanno mostrato
alcuna azione citotossica, valutata
con il test Alamar Blue9, nel range
di concentrazione 1-1000 mg/ml, al
contrario degli estratti metanolici
delle foglie totalmente tossici già a
concentrazione di 25 mg/ml
(Figura 2). Dai risultati ottenuti si
evince come l’uso di metodiche
semplici, poco costose e di routine
siano risultate utili per mettere in
luce virtù benefiche di un alimento
da tanti apprezzato per il suo gusto
oltre che per le sue proprietà quale
“alimento funzionale”.
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SS 554, Km 4.5, 09042 Monserrato, Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39 70 675 4127; e-mail: mpmelis@unica.it.
P07-Cardiac regeneration by pharmacologically active
microcarriers releasing growth factors and/or transporting adipose-
derived stem cells
M. Savi1,7
, L. Bocchi1,4
, E. Fiumana2,4
, C. Frati3, F. Bonafé
2,4, S. Cavalli
3, P. G. Morselli
6, J.-P.
Karam2,5
, C. Montero-Menei5, C. M. Caldarera
,2,4, C. Guarnieri
2,4, C. Muscari
2,4, D. Stilli
1,4, F.
Quaini7,4
, E. Musso1,4
.
Dipartimento di Bioscienze-Università di Parma1, Dipartimento di Biochimica-Università di
Bologna2, Dipartimento di Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali-Università di
Parma3, Istituto Nazionale per le Ricerche Cardiovascolari (INRC)
4, INSERM U 646 – Università di
Angers5, Dipartimento d Scienze Chirurgiche Specialistiche ed Anestesiologiche-Università di
Bologna6, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale - Università di Parma
7.
AIMS. In preclinical studies, cell transplantation has definitely emerged as a potential treatment
0
20
40
60
80
100
120
1 2,5 5 10 25 50 100 250 500 750 1000
Mo
rta
lità
cell
ula
re (
% d
el co
ntr
oll
o)
concentrazione estratti ( g/ml)
gambi
capolini
foglie
a, d a, #
Figura 2: Mortalità cellulare (% del controllo, 0% di mortalità o 100% di vitalità) di
cellule Caco-2 tenute in coltura per 24 ore con diverse concentrazioni (1-1000 g/ml) di
estratti di carciofo. [a= p<0.001 vs i controlli; d= p<0.001 foglie vs gambi e capolini;
#= p<0.001 gambi e foglie vs capolini]. La citotossicità degli estratti (1-1000 g/ml) è
stata saggiata su cellule CaCo-2 differenziate8, utilizzando il test Alamar Blue9.
| 53
+dP/dt (mmHg/s)
- 22%-13%
-18%-15%
0
100020003000
400050006000
7000
80009000
-dP/dt (mmHg/s)
-8000
-6000
-4000
-2000
0
- 33%
-23%
-29%-33.6%
strategy for heart failure secondary to myocardial infarction (MI) whereas data from large sample size
clinical trials are conflicting (1). To ameliorate the unsatisfactory outcome of cell therapy in clinical
settings attention has been paid to several factors such as tailoring of cell type, fine tuning of
procedural aspects, and optimization of engraftment techniques with the use of scaffolds. In recent
years, several studies documented the existence in adipose tissue of stem cells (Adipose-derived Stem
Cells: ASCs) which can be safely transplanted to an autologous or allogeneic host and differentiate
into various cell types, including cardiomyocytes (2). Further, Hepatocyte Growth Factor and Insulin-
Like Growth Factor-1 (GFs) were shown to repair the infarcted heart and improve its
electromechanical competence by respectively mobilizing resident cardiac stem cells (CSCs) and
promoting their survival and proliferation (3). Finally, pharmacologically active microcarriers (PAMs)
formed by biodegradable and non-cytotoxic poly (lactic-co-glycolic acid) microspheres which interact
with cells/molecules conveyed on their surface and tissue microenvironment were proposed for
enhancing cell engraftment in the injured myocardium (4). In the present study, we tested the
hypothesis that stem cell based cardiac regeneration through intra-myocardial delivery of ASCs, GF-
mediated local activation of CSCs, or both, can be improved by PAMs.
METHODS. ASCs were isolated by human lipoaspirates. PAMs were coated with fibronectin and
poly-lysine to improve cell adhesion and biological function. GFs were encapsulated into PAMs
during the microsphere formulation. Thirty-eight adult male Wistar rats with one-month old MI were
treated with ASCs (MI_ASC group, n=8), ASCs+PAMs (MI_ASC+PAM, n=7), GF-releasing PAMs
(MI_PAM+GF, n=6), ASCs+GF-releasing PAMs (MI_PAM+ASC+GF, n=6) or vehicle (MI_V, n=6).
Five additional rats were sham operated (SHAM). Two weeks after treatment, hemodynamic
parameters were invasively determined in Millar conductance catheter studies and inducibility of
ventricular arrhythmias was assessed during programmed stimulation in Langendorff-perfused hearts,
by Microelectrode Array (MEA) system. Eventually, the hearts were subjected to anatomical,
morphometric, and immunohistochemical analyses. ASC tracking was achieved by the detection at
tissue level of both pre-labeled cells with Dil fluorochrome and human specific sex chromosomes by
FISH.
a) b)
* * * * * * * *
Figure 1. Mean values±SE of (a) +dP/dt and (b) –dP/dt, measured in the 6 experimental groups. *
p<0.05, significant differences vs. SHAM
RESULTS. The deterioration of ventricular function in untreated MI rats was represented by an
approximately 22% reduction in the maximal rate of ventricular pressure rise and decline (±dP/dt;
Figure 1 a-b) and a 35% prolongation of isovolumic contraction and relaxation times. PAM+ASC+GF
was the most effective treatment leading to a substantial improvement of all hemodynamic parameters
whose values approached those measured in SHAM rats (Figure 1 a-b). The recovery of left
ventricular (LV) hemodynamics in MI_PAM+ASC+GF group had a structural counterpart in a 10%
reduction in LV chamber dilation together with a 20% increase in mass-to-chamber-volume ratio, thus
cancelling out the unfavorable LV remodeling induced by MI (no significant difference vs. SHAM).
In the same animals a considerable amount of cell engraftment within the infarcted hearts was clearly
documented by FISH immunohistochemical studies. Lastly, all treatments involving the use of PAM
had beneficial effects on myocardial perfusion by significantly increasing the number of arterioles in
the regenerated hearts. Again, the best results were obtained in MI_PAM+ASC+GF group (+75%;
p<0.01 vs. MI-V ).
SHAM
MI_V
MI_ADSC
MI_ADSC+PAM
MI_PAM+GFs
MI_PAM+ADSC+GFs
SHAM
MI_V
SHAM
MI_V
MI_ADSC
MI_ADSC+PAM
MI_ADSC
MI_ADSC+PAM
MI_PAM+GFs
MI_PAM+ADSC+GFs
MI_PAM+GFs
MI_PAM+ADSC+GFs
54 |
By contrast, the improvement in cardiac mechanical function and structure mediated by
PAM+ASC+GF treatment was not accompanied by a similar positive effect on electrical function.
Indeed, arrhythmias occurring during programmed stimulation trended to be larger in all treated
animals and more so in MI_PAM+ASC+GF group.
CONCLUSION. PAMs appeared to improve ASC- or GF-based approaches to regenerate the
infarcted heart and ameliorate cardiac function although caution should be paid on the
electrophysiological impact of the physical interaction of microspheres with the myocardium.
References:
1.Malliaras K, Marbán E. Cardiac cell therapy: where we've been, where we are, and where we should be headed. Br Med Bull.
2011;98:161-85.
2.Mizuno H, Tobita M, Uysal AC. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine.
Stem Cells. 2012;30:804-10.
3.Urbanek K, Rota M, Cascapera S, Bearzi C, Nascimbene A, De Angelis A, Hosoda T, Chimenti S, Baker M, Limana F,
Nurzynska D, Torella D, Rotatori F, Rastaldo R, Musso E, Quaini F, Leri A, Kajstura J, Anversa P. Cardiac stem cells possess
growth factor-receptor systems that after activation regenerate the infarcted myocardium, improving ventricular function and
long-term survival. Circ Res. 2005;97:663-73.
4.Karam JP, Muscari C, Montero-Menei CN. Combining adult stem cells and polymeric devices for tissue engineering in
infarcted myocardium. Biomaterials. 2012;33:5683-95.
Corresponding author: Donatella Stilli, Dipartimento di Bioscienze, Parco Area delle Scienze 11A, Università di Parma, 43100
PARMA. Tel.: +390521905624. E-mail donatella.stilli@unipr.it
P08-Micro-Raman mapping of bio-carbonates and polyenic
pigments in corals and shells
L. Bergamonti1, G. Predieri
1, P.P. Lottici
2
1
Chemistry Department, University, Parco Area delle Scienze 17/a, 43124 Parma – Italy, 2 Physics
and Earth Sciences Department, University, Parco Area delle Scienze 7/a, 43124 Parma – Italy
Calcifying organisms are widely studied to investigate the complex organic-inorganic structure of the
biogenic carbonates and the environmental factors influencing their formation (1). The nature of the
pigments in marine and terrestrial biogenic carbonates found in corals, shells or pearls is still debated
and, in addition, a deeper understanding of the intricate biomineralization processes is looked for to
mimic the “natural” growth techniques for specific applications.
Raman microscopy is a powerful technique to investigate both the spatial distribution of the inorganic
phases (calcite, aragonite or vaterite) and to define the nature of the organic pigments in corals, shells
and pearls, especially when resonance conditions are attained (2-6). Mixtures of methylated
(carotenoids) or non-methylated polyenes with different UV-VIS absorption spectra and chain lengths
(i.e. number N of C=C bonds) are responsible for the colors and their variations in mineralized
organisms (4-5).
Here we report on Raman mapping measurements at 632.8 nm and at 473.1 nm (resonance) in calcitic
and/or aragonitic samples: terrestrial pulmonate gastropod mollusk shells of the Liguus virgineus
species (family Orthalicidae) compared with corals (Stylaster roseus and Corallium rubrum).
The pigment in Corallium rubrum (calcitic) shows Raman frequencies typical of polyenic
unmethylated chains whereas in Stylaster roseus coral (aragonitic) the spectrum is similar to that
found in a methylated carotenoid pigment as astaxanthin or canthaxanthin. On the other hand, for the
peculiar Liguus virgineus shells investigated (mainly aragonitic), the pigments show both methylated
and unmethylayed polyenic nature. The results of the Raman mapping distribution of carbonate
species are discussed and compared with those found in marine gastropoda or bivalve shells, where
methylated polyenes are hardly found.
| 55
References:
1 - Urmos, J.; Sharma, S. K.; Mackenzie, F. T., Am. Mineral. 1991, 76, 641–646.
2 - Bergamonti, L.; Bersani, D.; Csermely, D.; Lottici, P.P., Spectrosc. Lett. 2011, 44, 453-458.
3 - Soldati, A. L.; Jacob, D. E.; Wehrmeister, U.; Hager, T.; Hofmeister, W., J. Raman Spectrosc. 2008, 39, 525–536.
4 - Karampelas, S.; Fritsch, E.; Mevellec, J.-Y.; Gauthier, J.-P.; Sklavounos, S.; Soldatos, T., J. Raman Spectrosc. 2007, 38,
217–230.
5 - Barnard, W.; de Waal, D. J. Raman Spectrosc. 2006, 37, 342–352.
6 - Hedegaard, C.; Bardeau, J.-F.; Chateigner, D., J. Mollus. Stud. 2006, 72, 157–162.
P09-La popolazione del vergante attraverso lo studio dei cognomi
L. Pedrini1, B. Pedrini
1, E. Rabino Massa
2
1Collaboratore scientifico: Museo di Antropologia ed Etnografia - Università di Torino
2Dipartimento di Scienze della vita e Biologia dei Sistemi - Università di Torino
Nel Vergante, zona collinare situata a sud-ovest del Lago Maggiore, sino a pochi decenni fa, la
migrazione dai paesi montani e collinari verso il fondovalle era scarsa. La pastorizia e l’agricoltura
fornivano alle popolazioni mezzi appena sufficienti per vivere ma non di più, per cui non vi era
neanche immigrazione. Abbiamo verificato se questa stanzialità c’è stata o c’è ancora in alcuni paesi
collinari del Vergante.
La presente ricerca si prefigge lo scopo: a- Di verificare quali siano stati i flussi migratori delle
popolazioni del Vergante nel corso delle ultime cinque generazioni; b- Di accertare l’eventuale
esistenza di una omogeneità biologica valutata sui cognomi; c- Di avviare indagini genetiche, previo
accertamento dell’ isolamento delle comunità vergantesi, d- Di utilizzare i risultati al fine di un
completamento e confronto con quelli degli studi in corso sulle popolazioni isolate delle Alpi e degli
ambienti lagunari (Progetti Antico Delfinato e L’Uomo e il Lago).
La presente ricerca rappresenta, quindi, uno studio pilota per esaminare, attraverso l’analisi dei
cognomi, l’isolamento dei seguenti 8 paesi del Vergante: Ghevio, Colazza, Pisano, Corciago,
Tapigliano, Nebbiuno Fosseno e Massino. Per ciascuno dei paesi sopra ricordati abbiano rilevato la
frequenza dei cognomi di tre decenni scelti a caso compresi nel periodo 1866- 1994 (1866-’ 75, 1930-
’39 e 1985-‘94).
Dall’esame in dettaglio dei singoli Comuni si evince che, a partire dal 1866, il ceppo originario appare
conservato, pur incidendo meno sulla totalità della popolazione. Le peculiarità più salienti si rilevano
per il Comune di Massino, che mostra il più altro grado di omogeneità, in quanto il ceppo originario
ha mantenuto un alto grado di persistenza, ed anzi il numero medio degli abitanti con lo stesso
cognome è aumentato. Al contrario del Comune di Corciago, dove il ceppo originario si è disperso,
più che dimezzandosi in 120 anni.
In conclusione si può affermare che nella maggior parte dei Comuni si è potuti risalire, attraverso ai
cognomi, alle famiglie presenti da cinque generazioni e che l’acquisizione di nuovi patronimici ha
permesso di individuare i cambiamenti dovuti all’ immigrazione.
56 |
P10-Ricerche sulla popolazione di Giaglione (TO) in epoca
preunitaria
S. De Iasio1, G. Levati
1, M. Girotti
2, M. Fagiano
2, R. Boano
2
1Dipartimento di Bioscienze, Universita' di Parma,
2Dipartimento di Scienze della Vita e Biologia dei
Sistemi , Università di Torino
La ricerca biodemografica ha storicamente privilegiato l’utilizzo di fonti di flusso (nascite, matrimoni,
morti) per le analisi sui meccanismi microevolutivi delle popolazioni. In particolare l’attenzione dei
ricercatori è stata rivolta ai registri di matrimonio. Varie circostanze hanno portato a operare verso tale
scelta: la possibilità piuttosto comune di disporre di tali documenti; la facilità nella stima di alcuni
parametri biodemografici da essi desumibili, quali ad esempio i livelli di endogamia ed esogamia.
Tuttavia le fonti di flusso non rendono sufficientemente conto della frazione di popolazione che ha
effettivamente perpetuato la comunità nel tempo, come pure non danno informazioni sulle modalità di
aggregazione dei suoi componenti, né consentono di valutare l’importanza dei diversi fattori
socioeconomici che possono avere inciso sul processo di continuità della popolazione. Una valida
alternativa alle fonti di flusso può essere l’utilizzo di fonti di stato censuarie, civili (censimenti) o
parrocchiali (gli “status animarum”), che danno una fotografia molto dettagliata sullo stato della
popolazione in un preciso momento. É bene tuttavia ricordare che esse non sono sempre facilmente
reperibili, in particolare quelle in epoca preunitaria.
In questa prospettiva di studio, il recupero e l’analisi della documentazione censuaria assume un ruolo
prioritario al fine di ovviare alle carenze proprie delle fonti di flusso.
Nel presente lavoro vengono comparati alcuni stimatori demografici relativi alla popolazione di
Giaglione (Val Susa, Torino) desunti utilizzando i censimenti civili del marzo 1799 (all’epoca facente
parte della effimera Repubblica Piemontese) e del dicembre 1858 (allora Giaglione era sotto il Regno
di Sardegna, riformato dallo Statuto Albertino, in provincia di Susa, divisione di Torino).
Al 1799 la popolazione di Giaglione risulta costituita da 1348 individui, compresi in 266 unità
abitative e ripartiti in 7 frazioni geografiche di dimensioni variabili da 120 a 303 abitanti. Al 1858 la
comunità si è accresciuta a 1695 soggetti e 344 famiglie, dislocate sul territorio in 9 frazioni, più un
certo numero di toponimi riferibili essenzialmente a piccoli gruppi di case sparse.
Le dimensioni degli aggregati abitativi al 1799 evidenziano un numero ristretto di unità formate da
solitari o da due persone soltanto, mentre quelle costituite da 3 a 7 persone sono le più comuni. Molto
poche sono le unità di ampie dimensioni (9 o più individui). Al censimento sabaudo del 1858 risultano
aumentate in modo significativo le proporzioni sia dei nuclei formati da due persone che da quelli
costituiti da almeno 9 individui, mentre si riducono percentualmente quelli di dimensioni intermedie,
segnali di un cambiamento in atto nelle modalità di aggregazione della popolazione.
Le unità abitative sono state classificate e comparate sulla base del codice predisposto da P. Laslett
(Laslett, 1977) che consente di individuare gli aggregati domestici secondo criteri di natura geografica
(gli individui che “dormono sotto lo stesso tetto”), di relazione o affinità familiare (legami familiari
naturali o acquisiti tramite matrimonio) o funzionale (coloro che condividono una certa attività). In
linea con quanto riscontrato nella letteratura demografica (Soliani et al, 1985), la popolazione risulta
strutturata principalmente in aggregati composti da coppie nucleari, con o senza figli, anche in
condizione di vedovanza, specie da parte della femmina. Tuttavia tra il 1799 e il 1858 si rileva una
accresciuta proporzione di coppie senza figli e di vedovi (maschi) con figli, mentre risulta diminuita la
quota di aggregati estesi (comprendenti anche altri parenti non costituenti un ulteriore nucleo
familiare) e soprattutto multipli (più nuclei famigliari coresidenti), sintomi che al momento della
formazione della coppia si dovrebbe avere avuto una preponderanza di matrimoni “neolocali”,
costituenti cioè nuclei familiari nuovi, senza che il partner fosse aggregato alla famiglia d’origine del
coniuge.
Nella composizione per sesso, le femmine risultano in surplus rispetto ai maschi rispettivamente di 50
individui (su 1346 totali) nel 1799 e di 17 (su 1695) nel 1858. Lo sbilanciamento si avverte soprattutto
| 57
nella fascia d’età degli adulti giovani (dai 20 ai 34 anni), difettose di maschi, presumibilmente causato
dal reclutamento di soldati per l’esercito; lo squilibrio rispetto al rapporto sessi 1:1 è rilevante anche
nelle classi più avanti con gli anni, dai 45 ai 59, ma stavolta a sfavore delle femmine. In assenza degli
atti di morte che lo possano attestare, sembra ragionevole imputare la carenza di donne dai 45 ai 59
anni alla maggior mortalità femminile collegata al logoramento fisico e all’indebolimento conseguenti
gli stress da parto.
E’ stata inoltre effettuata una analisi della discendenza legittima, conteggiando i figli minori ancora
conviventi con i genitori (almeno uno ancora in vita al momento del censimento). Naturalmente non
può che trattarsi di una stima parziale della discendenza finale in quanto molte delle spose considerate
non avevano ancora concluso il proprio periodo fertile. Inoltre dal computo mancano i figli deceduti
che non dovevano essere pochi in quanto negli anni censiti la popolazione doveva essere caratterizzata
da un “ancient regime” demografico di tipo pretransizionale, con valori di natalità e mortalità ancora
decisamente elevati. Mancano infine anche i figli sposatisi precocemente e/o che per vari motivi si
erano allontanati dalla famiglie d’origine. La distribuzione dei nuclei familiari in funzione dei figli
censiti evidenzia una differenza importante tra le due rilevazioni nel numero di coppie coniugali
giovani ancora senza figli, con una quantità di coppie ancora “sterili” molto maggiore nel censimento
più antico. Probabilmente le modalità di scrittura dei registri del 1799 per quanto concerne
l’indicazione delle relazioni tra ciascun individuo con il capofamiglia può avere dato adito ad errori
interpretativi e forse avere influito sulla correttezza dell’attribuzione di alcuni figli ai genitori giusti.
Ne è prova il rigetto dell’ipotesi di adattamento della distribuzione di frequenza osservata a quella
teorica di Poisson (p=0,04%), attesa per le popolazioni in regime di fecondità naturale. Detta
sovrastima di coppie senza figli sembra invece non verificarsi per la distribuzione di frequenza delle
dimensioni della prole per il 1858 (p=8,07%). Come suggerito da Cavalli-Sforza e Bodmer (1971), è
possibile ovviare all’errata stima delle coppie senza figli togliendole dalla distribuzione: così è stata
riscontrata la validità nell’adattamento al modello poissoniano (17,4% e 12,3% rispettivamente per il
1799 e 1958) senza evidenziare fenomeni sistematici di perturbazione sulla distribuzione dei figli vivi
in regime di fecondità naturale.
Malgrado i limiti di analisi già illustrati, è stato possibile osservare la riduzione della fecondità
all’aumentare dell’ordine di nascita cumulando i figli legittimi (ancora) vivi e rapportando fra loro i
valori di ciascun ordine di nascita con il precedente (Livi Bacci, 1981) . La riduzione della fecondità
attesa nelle popolazioni “naturali” dovrebbe essere attorno al 20% passando da un ordine al
successivo. Nel presente lavoro la riduzione percentuale della fecondità aumenta progressivamente al
succedersi degli ordini di nascita in quanto si assommano tra loro la mancata conclusione della
fecondità delle spose e gli effetti depauperativi della mortalità, soprattutto di quelli in età
preriproduttiva. Si osserva in entrambe i censimenti una caduta molto più forte nella numerosità dei
nuclei familiari passando dalle famiglie con 4 figli vivi a quelle con 5, indice della criticità nella quale
venivano a trovarsi i nuclei una volta raggiunta una certa dimensione.
Bibliografia:
L.L. Cavalli-Sforza, W.F. Bodmer, 1971, The genetics of human populations, H. Freeman, S. Francisco (USA)
P. Laslett, 1977, Famiglia ed aggregato domestico, in: (a cura di M. Barbagli) Famiglia e mutamento sociale, 30-54, Il Mulino, Bologna.
M. Livi Bacci, 1981, Introduzione alla demografia, Loescher editore, Torino.
L. Soliani, A. Anelli, R. Zanni, 1985, Aspetti della dinamica delle strutture familiari, in: (a cura di A. Moroni, A. Anelli,
O. Ravera) Atti S.IT.E., 5: 765-776, Zara Edizioni, Parma.
Corresponding author: Sergio De Iasio, Dipartimento Di Bioscienze, V.le Usberti 11/a, Parma tel. 0522 905664 e-mail
sergio.deiasio@unipr.it
58 |
P11-Distribution and phylogeny/distance-trees of prokaryotic
photoreactive domains
C. Mandalari1, A. Losi
1, W. Gärtner
2
1 Dept. of Physics and Earth Sciences, Univ. of Parma (Italy),
2 Max Planck Institute for Chemical
Energy Conversion, Mülheim (Germany)
Light is very important for the metabolism of many prokaryotic and eukaryotic organisms.
Prokaryotic organisms often use dedicated red- and blue light sensing photoreceptor functional
domains. There are two main superfamilies of non-membrane bound photoreceptors: the first ones are
bilin-binding phytocrome-related proteins based on GAF (cGMP-specific phosphodiesterases,
cyanobacterial adenylate cyclases, and formate hydrogen lyase transcription activator FhlA) domains
(bilin-GAF proteins); the second are flavin-binding proteins, photoreceptive thanks to their LOV
(Light, Oxygen and Voltage) and BLUF (Blue Light sensing Using Flavins) domains [1].
Our model sequence for LOV domains is from the LOV-protein Ytva from B. subtillis. For BLUF we
used the corresponding domain from the T. elongatus PixJ protein. We searched protein sequences
similar to LOV and BLUF domains employing the BLAST algorithm and then we try to find possible
evolutionary paths. From the research we find 498 proteins with LOV domains in 379 different
species and 751 with BLUF region in 558 organisms. Many species have more than one protein with
these domains and in some cases there is co-presence of both domains. In most cases LOV and BLUF
proteins are modular, with the photoreceptive modules associated to diverse effector or/and regulative
domains. In some organisms beyond LOV and BLUF there are also phytocrome-related proteins. We
can say that in every bacterial phyla there is at least a photoreactive domain bleonging to LOV, BLUF
or bilin-GAF, whereas archaea possess solely LOV proteins as soluble photoreceptors.
As for the phylogeny we use neighbouring-method to obtain a branching pattern, limited to LOV and
BLUF sequences, given the uncertainties in alligning bilin-GAF. We can observe that most of proteins
coming from different strains of the same organism are in the same cluster and, in general, domains
from organisms of the same phyla are neighbour. We can also observe that proteins with the same
functional domains are in the same cluster, so that we should more correctly speak of distance-trees.
From these observation we can think that proteins could have the same function or they could be
involved in similar signal-transduction/metabolic pathways.
References
1. A. Losi, W. Gartner, “Bacterial bilin- and flavin-binding photoreceptors”, Photochem. Photobiol. Sci., 2008, 7, 1168-1178
*Corresponding author: Mandalari Carmen - University of Parma (www.unipr.it), Department of Physics and Earth Sciences, viale G.P. Usberti 7/A, 43100-Parma (I)
Tel: +39-0521905256, e-mail: carmen.mandalari@fis.unipr.it
P12-Biomarcatori per la diagnosi precoce del tumore al polmone
P. Mozzoni1,2
, I. Banda1,M. Goldoni
1,2, M. Rusca
3, P. Carbognani
3, A. Casalini
3, M. Corradi
1, A.
Mutti1.
1Università degli studi di Parma;
2INAIL Istituto Nazionale per l’Assicurazione contro gli Infortuni
sul Lavoro; 3Azienda Ospedaliera di Parma
Il cancro al polmone è la prima causa di morte per patologia neoplastica nei paesi industrializzati. La
prognosi di tale malattia è limitata a causa della mancanza di validi approcci finalizzati al
riconoscimento tempestivo delle lesioni che permettano di attuare una diagnosi precoce. Appare
perciò evidente l’importanza di sviluppare metodiche in grado di individuare lesioni iniziali. (1-2).
Numerose evidenze sperimentali mostrano il coinvolgimento dei miRNA nella regolazione di processi
| 59
biologici che portano alla formazione del tumore, tra cui l’adesione, l’invasione, la migrazione, la
transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e l’angiogenesi (3). I microRNA (miRNA) sono una
classe di piccoli RNA non codificanti, generalmente lunghi tra i 18-25 nucleotidi, in grado di regolare
l’espressione genica a livello post-trascrizionale attraverso la degradazione di specifici RNA
messaggeri o attraverso l’inibizione della traduzione in proteina (4).
Il presente lavoro si pone l’obbiettivo di identificare potenziali biomarcatori da utilizzare nella
diagnosi precoce del tumore polmonare non a piccole cellule (NSCLC) in matrici di facile accesso,
quali il plasma e, per la prima volta, il condensato dell’aria espirata (CAE) con lo scopo di ottenere un
test diagnostico non invasivo con una buona sensibilità e specificità. Sono stati valutati come
biomarcatori due microRNA: il miRNA-21 e il miRNA-486, correlati all’espressione di oncogeni e
oncosoppressori tumorali
Fig. 1. A: Rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel plasma di soggetti sani (CTR, ) e di soggetti affetti da NSCLC(▲). B: Curva
ROC del rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel plasma. E’ indicato il punto di flesso
Fig. 2. A: Rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel CAE di soggetti sani (CTR,) e di soggetti affetti da NSCLC (▲). B: Curva
ROC del rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel CAE. E’ indicato il punto di flesso.
Nel plasma l’espressione del miRNA-21 è risultata essere significativamente maggiore nei soggetti
con NSCLC rispetto ai soggetti di controllo sani (P<0.0001), mentre l’espressione del miRNA-486 ha
evidenziato una significativa riduzione di espressione nei soggetti malati rispetto ai soggetti sani
(P<0.0001). Lo stesso andamento è stato evidenziato nel CAE, anche in questo caso il miRNA-21
presentava una maggiore espressione nei soggetti affetti da NSCLC, rispetto ai soggetti sani
(P=0.0253); al contrario il miRNA-486 mostrava una minore espressione nei soggetti malati rispetto
ai sani. (P=0.0294). Inoltre, considerando il fatto che i soggetti con valori elevati di miRNA-21
presentavano generalmente bassi livelli di miRNA-486, è stato valutato il loro rapporto in entrambe le
matrici, ottenendo un aumento del potere discriminante messo in evidenza dalle rispettive curve ROC
(Fig.1 e 2). La curva ROC generata dal rapporto tra il miRNA-21 e il miRNA-486 nel plasma
presentava una sensibilità dell’87.5% e una specificità dell’86.8%. L’area sotto la curva era di 0.901
A B
CTR NSCLC0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
Rel
ativ
e E
xpre
ssio
n
miR
NA
-21/m
iRN
A486 C
AE
P=0.0289
*
P<0.0001
***
A
CTR NSCLC0.1
1
10
100
Rel
ativ
e E
xpre
ssio
n
miR
NA
-21/m
iRN
A-4
86 P
lasm
a
B
60 |
(IC95 0.827-0.975), significativamente diversa da 0.5. La curva ROC generata dal rapporto tra il
miRNA-21 e il miRNA-486 nel CAE presentava una sensibilità dell’60% e una specificità dell’71.1%.
L’area sotto la curva era di 0.678 (IC95 0.549-0.806), significativamente diversa da 0.5.
Utilizzando gli indicatori valutati nel plasma e nel CAE, che nel confronto tra gruppi erano risultati
statisticamente differenti come variabili predittive e come variabile dipendente lo status (malato o
sano), è stata effettuata la regressione logistica binaria per valutare la capacità di tali indicatori nel
classificare i soggetti. Nell’insieme il miRNA-21 e il miRNA-486 erano in grado di distinguere
correttamente i soggetti con tumore polmonare nel 76.5% dei casi (13/17) e i soggetti senza tumore
nel 96.6% dei casi (28/29), con una percentuale globale dell’89.1%.
Questi risultati, seppur preliminari, evidenziano come i miRNA possano essere considerati dei buoni
biomarcatori precoci per la diagnosi di NSCLC, in matrici periferiche di facile accesso, quali il sangue
e per la prima volta il condensato dell’aria espirata. Questo risultato è molto importante perché
permetterebbe di diagnosticare la malattia senza l’utilizzo di esami strumentali invasivi. Si potrebbe
quindi pensare ad un loro ipotetico utilizzo a fianco delle tradizionali tecniche di imaging a scopo
diagnostico e prognostico.
Bibliografia
1. Al-Kattan K, Sepas E, Fountain SW, Townsend ER. (1997), “Disease recurrence after resection for stage I lung cancer”.
Eur J Cardiothorac Surg;12:380-384. 2. Westeel V, Choma D, Clement F, Woronoff-Lemsi MC, Pugin JF, Dubiez A, Depierre A. Relevance of an intensive
postoperative follow-up after surgery for non-small cell lung cancer. Ann Thorac Surg 2000; 70:1185-1190.
3. Lages E, Ipas H, Guttin A, Nesr H, Berger F, Issartel JP. MicroRNAs: molecular features and role in cancer. Front Biosci. 2012 Jun 1;17:2508-40.
4. Hussain MU. Micro-RNAs (miRNAs): genomic organisation, biogenesis and mode of action. Cell Tissue Res. 2012
Aug;349(2):405-13.
Corresponding author: Dott.ssa Paola Mozzoni Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Via Gramsci, 14 – 43126
Parma; Tel 0521-033078; e-mail: paola.mozzoni@unipr.it
P13-Comparative analysis of cytotoxic effects INDUCED BY N4-
ethylmorpholine citronellalthiosemicabazone complexes in different
human cancer cell lines
F. Biscegliea, R. Alinovi
b, S. Pinelli
b, P. Tarasconi
a, A. Buschini
c, F. Mussi
c, G. Pelosi
a
a Department of Chemistry,
bDepartment of Clinical and Experimental Medicine,
c Department of
Biosciences, University of Parma,
Thiosemicarbazone and their metal complexes are a class of compounds that present interesting
biological properties among which the ability to inhibit proliferation of a wide variety of cancerous
cell lines. In the course of our studies, we have assessed that their activity is certainly due to more
than one cellular target and, interestilngly, is strongly dependent on the typology of tumour cells.[1]
Their high selectivity is highlighted in in vitro models: some cell lines are very sensitive and others
are totally insensitive. In previous papers we have reported that in human leukaemia cell line U937
two N4-ethylmorpholine citronellalthiosemicarbazone complexes, [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] and
[Cu(Etmorph-S-tcitr)2], showed strong antiproliferative activities.[2, 3] The aim of this study is
therefore to perform a comparative analysis of cytotoxic effects (apoptosis and oxidative stress
induction) of these two compounds in four cancer cell lines of different malignancies: the histiocytic
lymphoma cell line U937, the promyelocytic leukemia cell line HL-60, the colon adenocarcinoma cell
line HT-29 and the neuroepithelioma cell line SK-N-MC.
A first comparison of IC50 values evidenced that the copper complex is systematically more potent.
Both complexes exhibit the highest cytotoxic activity on U937, while SK-N-MC cells resulted to be
the most resistant (Tab. 1).
| 61
IC50 (µM)
[Ni(Etmorph-S-tcitr)2] [Cu(Etmorph-S-tcitr)2]
U937 12.3 + 0.9 2.3 + 0.4
HL60 15.4 + 1.8 6.0 + 0.9
HT29 52.6 + 6.3 14.9 + 3.4
SK-N-MC 21.2 + 2.7 5.7 + 1.2
Table 1. IC50 values for the tested cell lines exposed to compounds [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] and [Cu(Etmorph-S-tcitr)2]
More specifically, treatment with the IC50 concentration of each compound resulted in a significant
induction of apoptosis in U937, HL 60 and SK-N-MC cells but not in HT-29 line. These results were
confirmed by the DNA fragmentation assay and caspase activation: no modification of caspase
activities was observed in HT-29.
Figure 1. Caspase activity (above) and ROS levels (below) induced by compounds [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] (left) and
[Cu(Etmorph-S-tcitr)2] (right)
The same trends in ROS (Reactive Oxygen Species) intracellular levels were observed for U937 and
SK-N-MC cells: [Cu(Etmorph-S-tcitr)2] caused a time-dependent increase and [Ni(Etmorph-S-tcitr)2]
only an early transient increase. These oxidative stress markers were not modified in HL-60 cells by
both complexes. Intracellular ROS of HT-29 were more than 4 fold the control value during the early
phases of [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] exposure; a lower and later increase of ROS was observed during
[Cu(Etmorph-S-tcitr)2] treatment (Fig. 1).
The effects of [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] and [Cu(Etmorph-S-tcitr)2] on different cell lines are extremely
heterogeneous. This different “sensitivity” makes difficult to hypothesise a general action mechanism
and to generalize structure-activity correlation. The choice of the cellular model used to investigate
the interaction of thiosemicarbazone complexes with the biological systems has come out to be a
crucial phase in in vitro studies.
U937 HL60 HT29 SK-N-MC
100
1000
***
*
**
**
*
***
*
***
Cas
pase
act
ivity
(% a
s co
mpa
red t
o co
ntro
ls)
U937 HL60 HT29 SK-N-MC
100
1000
Cas-8
Cas-9
Cas-3
*
***
* *
***
* **
U937 HL60 HT29 SK-N-MC0
100
200
300
400
500
**
***
***
****
ROS
(% a
s co
mpa
red t
o co
ntro
ls)
[Ni(Etmorph-S-tcitr)2
] [Cu(Etmorph-S-tcitr)2
]
U937 HL60 HT29 SK-N-MC0
100
200
300
400
5001 h
4 h
24 h
*****
***
***
*
***
[Ni(Etmorph-S-tcitr)2
] [Cu(Etmorph-S-tcitr)2
]
62 |
References
1.G. Pelosi Thiosemicarbazone Metal Complexes: From Structure to Activity The Open Crystallography Journal, 2010, 3, 16-
28. 2.M. Belicchi-Ferrari, F. Bisceglie, A. Buschini, S. Franzoni, G. Pelosi, S. Pinelli, P. Tarasconi and M. Tavone Synthesis,
structural characterization and antiproliferative and toxic bio-activities of copper(II) and nickel(II) citronellal N4-
ethylmorpholine thiosemicarbazonates, J. Inorg. Biochem. 2010, 104, 199-206. 3.F. Bisceglie, S. Pinelli, R. Alinovi, P. Tarasconi, A. Buschini, F. Mussi, A. Mutti and G. Pelosi, Copper(II)
thiosemicarbazonate molecular modifications modulate apoptotic and oxidative effects on U937 cell line, J. Inorg. Biochem.
2012, 116, 195-203.
Corresponding author: Giorgio Pelosi - Department of Chemistry, University of Parma, Parco Area delle Scienze 17A 43124 Parma (Italy), tel. +390521905420, e-mail: giorgio.pelosi@unipr.it
P14-Effetti citotossici degli ossidi di cobalto e di titanio su cellule
A549.
R. Alinovi2, S. Pinelli
2, M. Goldoni
1, P. Mozzoni
1, D. Dallatana
3, A. Perotti
2, A. Mutti
2
1CERT Centro di Eccellenza per la Ricerca Tossicologica,
2Dipartimento di Medicina Clinica e
Sperimentale, 3Dipartimento di Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali, Università degli
Studi di Parma.
La continua e rapida espansione delle nanotecnologie ha comportato la diffusione negli ambiente di
vita e di lavoro di nanoparticelle (NP) che costituiscono un rilevante problema sanitario: per le loro
dimensioni (inferiori a 100 nm) sono in grado di penetrare nell’apparato respiratorio fino a
raggiungere gli alveoli polmonari, con conseguenti insorgenze od aggravamenti di patologie
respiratorie e cardiopolmonari (1). Un contributo fondamentale alla comprensione dell’interazione fra
NP e sistemi biologici, dei meccanismi d’azione e dei possibili effetti viene fornito dagli studi in vitro
(2). In seguito ad esposizione a NP costituite da metalli e dai loro ossidi sono stati evidenziati
alterazioni mitocondriali, danni al DNA, produzione di radicali liberi e fattori pro-infiammatori (3, 4).
Tra le NP di interesse industriale quelle di diossido di Titanio (TiO2) e di ossido di Cobalto (Co3O4)
sono diffusamente utilizzate, oltre che come pigmenti e catalizzatori, nella produzione di schermi per
raggi UV (Ti NP) e di sensori (Co NP).
In questo studio sono stati confrontati gli effetti di NP di ossido di Co e di ossido di Ti su cellule
A549, derivate da un adenocarcinoma polmonare. Questa linea cellulare è stata scelta perché
l’apparato respiratorio costituisce la principale via di inalazione ed assorbimento di NP e quindi un
potenziale bersaglio (5).
Nel medium di coltura le NP tendono ad aggregarsi, formando agglomerati di notevoli dimensioni
(alcuni µm).
Solo concentrazioni molto elevate di NP riducono la vitalità cellulare senza indurre processi
apoptotici: IC50 201.13+59.51 e 459.03+83.37 µg/ml rispettivamente per Co e Ti. Concentrazioni non
letali (50 e 100 µg/ml) di entrambe le NP sono tuttavia in grado di disturbare l’adesione delle cellule
al substrato di coltura ed di provocare alterazioni nel ciclo cellulare di A549 esposte a Co, con una
significativa diminuzione delle cellule in fase S e G2/M.
Nel corso dell’esposizione a Co si osserva inoltre un elevato incremento dose-dipendente di specie
reattive dell’ossigeno (ROS), con conseguente significativo aumento dei prodotti dello stress
ossidativo sulle proteine (gruppi carbonilici), sui lipidi di membrana (TBARS-Thiobarbituric acid
reactive substances) e con induzione di attività enzimatiche scavenger (eme ossigenasi-1). Nelle fasi
iniziali del trattamento (1 h) compare anche un lieve danno genotossico, evidenziato col metodo del
Comet alcalino. Questo effetto precoce è reversibile ed il recupero, presente già dopo 4 h, è
completato dopo 24 h.
Il nostro studio ha dimostrato che modelli sperimentali in vitro costituiscono una fase importante per
la comprensione dei meccanismi di tossicità di nanoparticelle di uso industriale e che le peculiari
| 63
caratteristiche chimico-fisiche delle NP rendono impossibile qualsiasi generalizzazione.
E’ inoltre stato confermato che NP metalliche, in particolare Co NP, producono ROS, in grado di
provocare danni a livello di macromolecole e strutture cellulari. E’ tuttavia ipotizzabile che l’azione
delle NP si esplichi con un meccanismo multi-target.
Finanziato dalla Ricerca Finalizzata RF-2009-1472550: Integrated approach to evaluate biological
effects on lung, cardiovascular system and skin of occupational exposure to nanomaterials (NanO I-
LuCaS).
Bibliografia:
1.NIOSH National Institute for Occupational Safety and Health. Approaches to the safe nanotechnology. Managing the health and safety concerns associated with engineered nanomaterials. USA, 2009.
2.Han X., Corson N., Wade-Mercer P. et al. Assessing the relevance of in vitro studies in nanotoxicology by examining
correlations between in vitro and in vivo data. Toxicology 2012, 297; 1-9. 3.Lewinski N., Colvin V., Drezek R. Cytotoxicity of nanopartcles. Small 2008, 4: 26-49.
4.Rivera Gil P., Oberdorster G., Elder A., Puntes V., Parak W.J. Correlating physico-chemical with toxicological properties of
nanoparticles: the present and the future. ACS Nano 2010, 4, 5527-5531. 5.Yang W., Peters J.I., Williams R.O. Inhaled nanoparticles. A current review. Int. J. Pharm. 2008, 356: 239-247.
Corresponding author: Alinovi Rossella - Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università degli Studi di Parma,
Via Gramsci, 14 - 43126 Parma
Tel. 0521 033093 e-mail: rossella.alinovi@unipr.it
P15-Enzimatic biomarkers in the gilthead seabream juveniles fed
with graded concentrations of alchylphenols
I. Traversi1,3*
, E. Gambetta1, V. Nozzi
2, F. Maradonna
2, O. Carnevali
2,3, A. Mandich
1,3
1Dipartimento di Scienze della Terra, dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi di Genova,
viale Benedetto XV 5,16132 Genova, 2Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente, Università
Politecnica delle Marche, via Brecce Bianche, 60131 Ancona, 3INBB Consorzio Interuniversitario di
Biosistemi e Biostrutture, via Medaglie d’Oro, 00136 Roma
The presence of different types of organic pollutants, in both wild and cultured teleosts, has been
widely reported. Among organic pollutants, 4-t-octylphenol (OCT), and 4-nonylphenol (NP) are man-
made contaminants possessing controversial endocrine disruption properties [1]. Gilthead seabream
(Sparus aurata L) is one of the most important commercial species for Mediterranean aquaculture and
one of the marine species more frequently used as bioindicator of endocrine disruption [2]. The aim of
this study was to investigate in seabream juveniles the effects of OCT and NP enriched diet on
biotransformation, measured as ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity (phase I) and
glutathione-S-transferase (GST) activity (phase II). The effects on the activity of antioxidant defences
was determined by measuring catalyse (CAT) activity. Vitellogenin (Vtg) and Zona radiata protein
(Zrp) expressions were used as endocrine biomarkers of exposure [3]. Seabream juveniles were
divided into 8 groups of 20 animals (10g/bw) each: control, solvent control (ethanol) and 6 groups
exposed to 3 graded concentrations of OCT (5, 50 e 100 mg /kg/day OCT1, OCT2, OCT3
respectively) and NP (5, 50 e 100 mg /kg/day NP1, NP2, NP3 respectively) for 21 days. At the end of
the exposure, liver was immediately frozen for the enzymatic activity assays and for RNA extraction
for Vtg and Zrp mRNA assay. Liver weight was recorded for hepatosomatic index (HSI). VTG e Zrp
gene expression was evaluated by Q-RT-PCR by using Sybergreen method. EROD activity was
measured in microsome suspension recording the increase in fluorescence for the resorufin formation;
GST activity in the cytosolic fraction was analyzed with spectrophotometer, following the formation
of s-2,4-dinitro phenyl glutathione, at 340 nm; CAT was spectrophotometrically assayed at 240 nm,
by consumption of H2O2. Significant increase of HIS was observed in NP1, NP2 and OCT1. mRNA
Vtg expression was significantly higher in both NP1 and NP2 and in OCT2. Vtg and Zrp gene
expression valuation on NP3 and OCT3 groups are still in progress. OCT significantly inhibited CAT
64 |
activity (p<0,0005) in all groups, while CAT activity was significantly (p<0,0005) inhibited only in
NP1 and in NP3 (p<0,01). GST activity was significantly increased in NP1 and NP2 (p<0,05) and
decreased in OCT3 (p<0,005). EROD activity was significantly lower (p<0,05) only in NP2 and NP3,
while all OCT concentrations induced lower EROD activity. Concluding the obtained results
evidenced negative effects of both NP and OCT exposure in every concentrations here analyzed,
although a dose dependent response was not evidenced, suggesting a detrimental effects on the
reproduction of this important economic model.
Progetto F-2009-1536185, finanziato dal Ministero della Salute.
Bibliografia.
[1] Pérez Carrera E., García-López A., Martín del Río M.P., Martínez-Rodríguez G., Solé M., Mancera J. M. Effects of 17β-estradiol and 4-nonylphenol on osmoregulation and hepatic enzymes in gilthead sea bream (Sparus auratus). Comparative
Biochemistry and Physiology, Part C (2007), 145: 210–217
[2] Teles M., Pacheco M., Santos M. A. Sparus aurata L. liver EROD and GST activities, plasma cortisol, lactate, glucose and erythrocytic nuclear anomalies following short-term exposure either to 17h-estradiol (E2) or E2 combined with 4-nonylphenol.
Science of the Total Environment (2005) 336: 57– 69
[3] Arukwe, A., Goksory, A. Eggshell and egg yolk proteins in fish: hepatic proteins for the next generation: oogenetic,
population, and evolutionary implications of endocrine disruption. Review. Comparative Hepatology (2003) 2:4
http://www.comparative-hepatology.com/content/2/1/4
Corresponding author: Traversi Ilaria, Dipartimento di Scienze della Terra, dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi
di Genova, viale Benedetto XV 5,16132 Genova tel 0103538046 – 3202622463 e-mail traversiilaria@gmail.com
P16-Hepatic activities in Sparus Aurata L. juveniles fed with
bisphenol A enriched diet.
I. Traversi1,3
, A. Scorolli2, G. Gioacchini
2, G. Roncoli
1, O. Carnevali
2,3, A. Mandich
1,3
1Dipartimento di Scienze della Terra, dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi di Genova,
viale Benedetto XV 5,16132 Genova, 2Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente, Università
Politecnica delle Marche, via Brecce Bianche, 60131 Ancona, 3INBB Consorzio Interuniversitario di
Biosistemi e Biostrutture, via Medaglie d’Oro, 00136 Roma
A large number of compounds have been reported to exhibite endocrine modulating activity. These
include chemicals such as Bisphenol-A (BPA), a man-made contaminant, extensively used for human-
manufactured products [1]. Recently, from 60 to 90% BPA-contamined fish has been found along
South-Italian coasts, demonstrating increasing impact of this contaminant in the marine environment
[2]. Gilthead seabream (Sparus aurata L) is one of the most important commercial species for
Mediterranean aquaculture and one of the marine species more frequently used as bioindicator of
endocrine disruption [3]. This study aimed to relate the effects of BPA-enriched diet to catalase
(CAT), CYP1A-dependent 7-ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) and glutathione S-transferase
(GST) activities in seabream juveniles. Vitellogenin (Vtg) and Zona radiata protein (Zrp) expressions
were measured as endocrine biomarkers of exposure [4]. Eight groups 8-10g/bw seabream juveniles
(n=20) were reared for 21 days under laboratory condition in 200 l tanks, at 18°C, 10L/14D
photoperiod. Two groups were kept as control (C) and solvent control (CSP). Experimental groups
were fed on commercial diet enriched with increasing concentrations of BPA (BPA1:5 mg/g/day,
BPA2: 50 mg/g and BPA3: 100 mg/g). At the end of the exposure, liver was immediately frozen for
enzymatic activities and mRNA extraction. Liver weight was recorded for hepatosomatic index
(HSI). EROD activity was measured in microsome suspension recording the increase in fluorescence
for the resorufin formation; GST activity in the cytosolic fraction was analyzed to spectrophotometer,
following the formation of s-2,4-dinitro phenyl glutathione, at 340 nm; CAT was
spectrophotometrically assayed at 240 nm, by consumption of H2O2. VTG e Zrp gene expression was
evaluated by Q-RT-PCR by using Sybergreen method. More than 50% BPA3 exposed juveniles died
after two week exposure and only two groups (BPA1 and BPA2) were available for analyses at the
| 65
end of the trials. Significant increase of HSI, Zrp and Vtg expression was observed in both BPA1 and
BPA2 (p<0,05) with significantly higher levels of both biomarkers in BPA1. EROD and CAT
activities were significantly (p<0,001) inhibited in BPA1 and BPA2.
In conclusion the results here obtained clearly showed that the selected biomarkers will be useful for
monitoring the presence of Bisphenol-A on marine environment as well as on commercial diet widely
employed on aquaculture practice.
Progetto F-2009-1536185, finanziato dal Ministero della Salute.
Bibliografia
[1] Vandenberg L. N., Maffini M. V., Sonnenschein C., Rubin B. S., Soto A. M. Bisphenol-A and the Great Divide: A Review
of Controversies in the Field of Endocrine Disruption. Endocrine Reviews (2009) 30(1):75–95.
[2] Mita L., Bianco M., Viggiano E., Zollo F., Bencivenga U., Sica V., Monaco G., Portaccio M.,
Diano N., Colonna A., Lepore M., Canciglia P., Mita D.G. Bisphenol A content in fish caught in two different sites of the
Tyrrhenian Sea (Italy). Chemosphere (2011), 82: 405–410.
[3] Teles M., Pacheco M., Santos M. A. Sparus aurata L. liver EROD and GST activities, plasma cortisol, lactate, glucose and
erythrocytic nuclear anomalies following short-term exposure either to 17h-estradiol (E2) or E2 combined with 4-nonylphenol.
Science of the Total Environment (2005) 336: 57– 69.
[4] Arukwe, A., Goksory, A. Eggshell and egg yolk proteins in fish: hepatic proteins for the next generation: oogenetic,
population, and evolutionary implications of endocrine disruption. Review. Comparative Hepatology (2003) 2:4
http://www.comparative-hepatology.com/content/2/1/4
Corresponding author: Traversi Ilaria, Dipartimento di Scienze della Terra, dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi
di Genova, viale Benedetto XV 5,16132 Genova tel 0103538046 – 3202622463 e-mail traversiilaria@gmail.com
P17-K:D-Rib un inibitore della proliferazione delle cellule tumorali
ed un promotore del folding di DNAzima.
L.Bruni1,2,3
S.Croci1,2
1Dipartimento di Neuroscienze - Unità di Biofisica e Fisica Medica - Università di Parma,
2INBB
Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi – ROMA, 3Fondazione Valsè Pantellini
Le cellule tumorali mostrano un aumento della glicolisi anche in presenza d’ossigeno disponibile.
Questo processo chiamato “Effetto Warburg” è uno dei fondamentali switch metabolici che una
cellula cancerosa manifesta se paragonata ad una cellula non cancerosa. Tra i trasportatori del
glucosio c’è la famiglia SGLT (cotrasportatore Na+/glucosio). L’elevata concentrazione totale di
sodio in lesioni mammarie tumorali misurata con 23
Na-MRI sembra essere un indicatore del livello
cellulare di malignità [1].
Il ruolo del D-ribosio e dello ione potassio (K+) sono ampiamente noti: il D-ribosio è un aldopentoso,
assiste il metabolismo energetico della cellula oltre ad esser un precursore d’alcuni aminoacidi; lo ione
K+ è coinvolto in molti processi tra cui apoptosi, genesi e mantenimento del potenziale di membrana e
stabilizza il folding dei G-quadruplex. C'è un interesse crescente nell’utilizzo di G-quadruplex anche
come sensori per lo ione K+ [2].
Per saggiare l’effetto del K:D-Rib sulla proliferazione delle linee cellulari non si sono potuti utilizzare
i comuni saggi metabolici (MTT assay, WST-1 assay ecc) in quanto K:D-Rib interagisce con il
bromuro di tetrazolio riducendolo a formazan [3].
Ci siamo perciò avvalsi di un metodo d’uso comune: le cellule (4000 cell/ml trattate con K:D-Rib
5mM e incubate per 12 gg) sono state contate utilizzando il programma ImageJ ed in seguito si è
calcolato il tempo di duplicazione. Il controllo ha mostrato un tempo di duplicazione di 44 ore, mentre
il trattato di 59 ore. L’effetto rilevato è un progressivo rallentamento della proliferazione cellulare del
trattato rispetto al controllo.
Il saggio delle colonie, nel quale si contano gruppi cellulari di almeno 50 unità, ha confermato i
risultati delle curve di crescita, mostrando ancora una volta un effetto antiproliferativo del K:D-Rib sia
sulla linea HTB-126 [3] che HTB-30 (metastasi pleurica di carcinoma mammario). Quest’ultima linea
66 |
cellulare ha mostrato 15 colonie per il controllo e nessuna colonia per i trattati. Questi dati
sperimentali unitamente ad una ricca bibliografia sui canali K+ [2] e sul ruolo stesso del K
+ ci hanno
portato a ipotizzare che una fine regolazione della concentrazione di K+ stia alla base del “corretto
funzionamento” delle cellule. Da qui l’esigenza di valutare se K+
entri o no nelle cellule in seguito al
trattamento con K:D-Rib. La concentrazione di K+ è stata misurata sfruttando la formazione di una
macromolecola chiamata DNAzima [4]. Dalla concentrazione di DNAzima si è in grado, attraverso
spettroscopia UV-VIS, di misurare se lo ione K+ è presente nella soluzione. Abbiamo quindi
verificato la formazione di questa molecola in presenza di K:D-Rib 5mM. Il DNAzima così formato
può essere utilizzato come biosensore per la misura della concentrazione del K+ nel mezzo cellulare,
prima e dopo il trattamento. Risultati preliminari sembrano indicare che il surnatante delle HTB-126
trattate con K:D-Rib 5mM per 48h mostrano una concentrazione di DNAzima inferiore rispetto al
DMEM (terreno di coltura delle cellule) con K:D-Rib 5mM, ma superiore al solo DMEM ed al
surnatante del controllo (HTB-126 non trattate). Possiamo dire che una parte di K+
entri all’interno
della cellula e che il DNAzima possa essere utilizzato come biosensore di K+.
Bibliografia:
[1] Ronald Ouwerkerk, Michael A. Jacobs , Katarzyna J. Macura, Antonio C. Wolff, Vered Stearn, Sarah D. Mezban, Nagi F.
Khouri, David A. Bluemke, Paul A. Bottomley Elevated tissue sodium concentration in malignant breast lesions detected with
non-invasive 23Na MRI. Breast Cancer Res Treat (2007) 106:151–160.
[2] Zhiguo Wang Roles of K+ channels in regulating tumour cell proliferation and apoptosis. Eur J Physiol (2004) 448: 274–
28:
[3] S. Croci, L. Bruni, S. Bussolati, M. Castaldo, M. Dondi Potassium bicarbonate and D-ribose effects on A72 canine and
HTB-126 human cancer cell line proliferation in vitro. Cancer Cell International (2011) vol. 11 11-30.
[4] Travascio P, Li Y, Sen D.. DNA-enhanced peroxidase activity of a DNA-aptamer-hemin complex. Chem Biol (1998) 5:5
05–517.
P18-Contenuto e mappa di distribuzione del magnesio intracellulare
in cellule farmaco-resistenti e -sensibili
E. Malucelli,1,5
, S. Lagomarsino2, L. Merolle
1, C. Marraccini
3, A. Sargenti
1, C. Cappadone
1, G.
Farruggia1,5
, A. Cedola4, M. Fratini
4, A. Notargiacomo
4, M. Lombardo
6, C. Trombini
6,
7A.
Gianoncelli, S. Iotti1,5
.
1Dipartimento Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;
2Istituto per i Processi Chimico-
Fisici, c/o Dipartimento di Fisica, Università la Sapienza, Roma, 3Dipartimento di Scienze della Vita,
Università di Modena e Reggio Emilia; 4Istituto di Fotonica e Nanotecnologie - CNR, Roma;
5Istituto
Nazionale Biostrutture e Biosistemi; 6Dipartimento di Chimica, Università di Bologna;
ELETTRA -
Sincrotrone Trieste S.c.p.A., Basovizza Trieste
Introduzione
Il magnesio nelle cellule gioca un ruolo importante sia strutturale che di regolazione. Nonostante la
copiosa mole di dati che si possono trovare sulla biochimica del magnesio, la fotografia della sua
distribuzione e la comprensione della sua omeostasi sono ancora incomplete sia per limitazioni
strumentali che per difficoltà concettuali. I recenti sforzi nell’applicazione di nuove tecniche di
imaging nel campo della ricerca sul magnesio non hanno permesso ancora l'accurata mappatura édella
distribuzione e del contenuto intracellulare di questo ione perché l'acquisizione di informazioni
dettagliate su processi intracellulari richiede una elevata risoluzione spaziale, dati quantitativi e
informazioni chimiche. Per riuscire a soddisfare tutti questi requisiti, abbiamo dimostrato in un
recente articolo [1] che è possibile unire informazioni sulla composizione degli elementi chimici,
utilizzando X-Ray Fluorescence Microscopy (XRFM) e sulla morfologia cellulare, tramite Atomic
Force Microscopy (AFM). Combinando queste due tecniche è possibile quantificare la concentrazione
di qualsiasi elemento. Grazie ai recenti miglioramenti delle sorgenti di raggi X dei sincrotroni di terza
generazione e al miglioramento delle ottiche di focalizzazione, la XRFM rappresenta la tecnica ideale
| 67
per effettuare questo tipo di misure. In particolare, la XRFM è un metodo con elevata sensibilità per
mappare la distribuzione di elementi all’interno delle cellule come Carbonio, Azoto, Ossigeno, Sodio
e Magnesio in una singola acquisizione.
Obiettivo
Lo scopo di questo studio è confrontare il contenuto e la distribuzione di Magnesio in linee cellulari
tumorali chemio-resistenti e -sensibili fissate chimicamente. Il modello sperimentale utilizzato è una
linea cellulare umana di carcinoma del colon (LoVo) sensibili e resistenti alla doxorubicina, uno dei
farmaci maggiormente utilizzato nella terapia di tumori solidi.
Metodi
XRFM può mappare il contenuto degli elementi ma non la concentrazione, che è la variabile rilevante
nel contesto biologico. Abbiamo affrontato questo problema combinando XRFM (risoluzione spaziale
0.5x0.5 micrometri) con la AFM (risoluzione spaziale 0.12x0.12 micrometri) che consente di misurare
lo spessore della cellula analizzata. Questa combinazione di tecniche ha richiesto l'implementazione di
un nostro algoritmo di "multimodal fusion" che consente di allineare immagini ottenute con tecniche e
risoluzioni spaziali diverse. Questo nuovo approccio sperimentale offre il vantaggio di combinare le
informazioni sul contenuto degli elementi con informazioni morfologiche di una singola cellula
entrambe con risoluzione spaziale sub-micrometrica.
Risultati
Utilizzando questo approccio abbiamo determinato:
i) Nella cellule farmaco resistenti analizzate, il contenuto (espresso in frazione in peso) di magnesio è
maggiore che nelle cellule sensibili. In particolare nelle cellule resistenti abbiamo ottenuto un valore
di magnesio oltre 5 volte superiore rispetto alla sensibile in una ROI (8x8 mm) posizionata in
corrispondenza del nucleo.
ii) La mappa di magnesio intracellulare mostra una marcata differenza nel pattern di distribuzione tra le
cellule farmaco-resistenti e -sensibili.
Conclusioni
I risultati di questo lavoro confermano anche in cellule doxorubicina resistenti un maggiore contenuto
di magnesio intracellulare rispetto alle sensibili come recentemente osservato con assorbimento
atomico in una linea cellulare cis-platino resistente [2]. Inoltre la diversa distribuzione riscontrata
fornisce una ulteriore evidenza del ruolo del magnesio nella genesi del fenotipo della farmaco-
resistenza. Riteniamo quindi che questa metodologia di analisi possa diventare un sistema di
riferimento non solo per la misura del Magnesio, ma anche per altri elementi leggeri. Inoltre
rappresenta un prezioso strumento per un’accurata mappatura di diversi elementi intracellulari sia in
condizioni patologiche che normali.
Bibliografia
1. Lagomarsino S., Iotti S., Farruggia G., Cedola A., Trapani V., Fratini M., Bukreeva I., Notargiacomo A., Mastrototaro L., Marraccini C., Sorrentino A., McNulty I., Vogt S., Legnini D., Kim S., Giagnoncelli A. Maier J.A.M, Wolf. F.I. Intracellular
concentration map of magnesium in whole cells by combined use of X-ray fluorescence microscopy and atomic force
microscopy. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 66 (11–12), 834–840, 2011 2. Marverti G., Ligabue A., Montanari M., Guerrieri D., Cusumano M., Di Pietro M.L., Troiano L., Di Vono E., Iotti S.,
Farruggia G., Wolf F.I., Monti M.G., Frassineti C. Characterization of the cell growth inhibitory effects of a novel DNA-
intercalating bipyridyl-thiourea-Pt(II) complex in cisplatin-sensitive and-resistant human ovarian cancer cells. Invest New Drugs, 29(1), 73-86, 2011.
Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, 40127 Bologna,
tel. 051 2095625, e-mail giovanna.farruggia@unibo.it
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P19-Modificazioni del contenuto intracellulare di magnesio durante
l’apoptosi mitocondrio-mediata: studi degli eventi precoci correlati
al potenziale mitocondriale
1L. Merolle,
1C. Cappadone,
1,2G. Farruggia,
3C. Marraccini,
1A. Sargenti,
4A. Colanardi,
1,2S. Iotti
1Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;
2 Istituto Nazionale Biostrutture e
Biosistemi, 3Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio Emilia;
4Istituto di
Farmacologia Traslazionale- CNR L'Aquila.
L’apoptosi non solo è un processo geneticamente controllato per il mantenimento dell’omeostasi
tissutale, ma è uno degli effetti antineoplastici indotti da molti agenti chemioterapici. Diversi cationi
sono coinvolti nei processi apoptotici, e la maggiore enfasi è stata posta sul ruolo giocato dagli ioni
calcio, considerato un importante secondo messaggero intracellulare. Più recentemente l’attenzione si
e' focalizzata nel coinvolgimento del magnesio nei processi apoptotici, anche se la letteratura
sull'argomento è tuttora piuttosto scarsa e spesso presenta risultati contraddittori.
Uno studio recente ha evidenziato l’attività antitumorale di un nuovo derivato indolico, MM67, che è
in grado di attivare l’apoptosi mitocondrio-mediata e di determinareun calo del contenuto
intracellulare di magnesio in cellule di adenocarcinoma umano del colon, HT-29 [1]. Le cellule
trattate con questo agente proapoptotico mostrano un arresto nella fase G2/M del ciclo cellulare, un
aumento significativo dell’espressione di Bax, la depolarizzazione della membrana mitocondriale e
un netto rilascio di citocromo c dal compartimento mitocondriale [2]. Il mitocondrio è l’organello di
stoccaggio del magnesio intracellulare [3], e l’osservazione che nell’apoptosi indotta da MM67 si
osserva una diminuzione dello ione ci ha fatto ipotizzare che il magnesio sia coinvolto nella via
intrinseca di induzione di apoptosi.
Scopo di questo lavoro è stato quello di seguire le variazioni temporali del magnesio, sia libero che
totale, durante l’apoptosi indotta da MM67 e di valutarne la correlazione con le variazioni del
potenziale mitocondriale (Δ m). Tutte le analisi sono state effettuate in citofluorimetria: il potenziale
mitocondriale è stato valutato mediante la marcatura delle cellule con la sonda mitocondriale
DiOC6(3), mentre il magnesio libero è stato determinato mediante marcatura con la sonda
commerciale MagFluo4-AM [4] e il magnesio totale mediante marcatura con la sonda non
commerciale di recente sintesi DCHQ5 [5].
Nei primi trenta minuti dopo il trattamento si è riscontrato un aumento del Δ m, seguito da una
marcata depolarizzazione nelle successive 48 ore. Il magnesio libero intracellulare ha mostrato un
andamento parallelo, con un incremento nella prima mezzora, seguito da una diminuzione nelle ore
successive. Il magnesio totale invece decresceva fino dai primi minuti.
Possiamo quindi concludere che l’apoptosi indotta da MM67 è caratterizzata da una diretta
correlazione tra il ΔΨm e il magnesio libero intracellulare, in accordo con quanto riportato in
letteratura [3]. I nostri dati inoltre confermano che i due pool cellulari di magnesio, quello libero e
quello totale hanno ruoli diversi e meccanismi indipendenti di regolazione.
Questo rappresenta uno studio preliminare perché rimane da chiarire se questi movimenti del
magnesio che seguono il trattamento con MM67 siano un epifenomeno o se siano coinvolti nei
meccanismi della cascata apoptotica mitocondrio-mediata.
Bibliografia
1. Cappadone C, Merolle L, Marraccini C, Farruggia G, Sargenti A, Locatelli A, Morigi R, Iotti S., Intracellular magnesium
content decreases during mitochondria-mediated apoptosis induced by a new indole-derivative in human colon cancer cells (2012) Magnes. Res. 25(3):104-11.
2. Andreani A, Granaiola M, Locatelli A, Morigi R, Rambaldi M, Varoli L, Calonghi N, Cappadone C, Farruggia G, Stefanelli
C, Masotti L, Nguyen TL, Hamel E, Shoemaker RH, Substituted 3-(5-imidazo[2,1-b]thiazolylmethylene)-2-indolinones and analogues: synthesis, cytotoxic activity, and study of the mechanism of action (2012) Med Chem; 55:2078-88.
3. Kubota T, Shindo Y, Tokuno K, Komatsu H, Ogawa H, Kudo S, Kitamura Y, Suzuki K, Oka K. Mitochondria are
intracellular magnesium stores: investigation by simultaneous fluorescent imagings in PC12 cells (2005) Bioch. et Biophys. Acta 1744 19–2 .
| 69
4. Lee S, Lee HG, Kang SH. Real-time observations of intracellular Mg2+ signaling and waves in a single living ventricular
myocyte cell (2009) Anal Chem.,812:538-42.
5. Farruggia G, Iotti S, Lombardo M, Marraccini C, Petruzziello D, Prodi L, Sgarzi M, Trombini C, Zaccheroni N. Microwave
assisted synthesis of a small library of substituted N,N'-bis((8-hydroxy-7-quinolinyl)methyl)-1,10-diaza-18-crown-6 ethers (2010) J.Org.Chem.,75,6275-6278
Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, via S. Donato 19/2, 40127 Bologna, tel.
0512095625, e-mail giovanna.farruggia@gmail.com
P20-Valutazione dell’efflusso di magnesio indotto da cAMP in cellule
HL60 mediante un nuovo chemosensore fluorescente derivato dall’8-
idrossichinolina
1Marraccini C.,
2Sargenti A.,
2Merolle L.,
2Cappadone C.,
2,3G. Farruggia,
2,3.S. Iotti.
1Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio Emilia;
2Dipartimento di
Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna; 3Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi.
L’omeostasi del magnesio intracellulare è attivamente oggetto di studio, poiché è noto l’importante
ruolo che questo ione ricopre nelle funzioni cellulari. Molti studi hanno evidenziato che stimoli
metabolici o ormonali possono indurre flussi di magnesio attraverso la membrana plasmatica in brevi
intervalli di tempo. Questi flussi sono caratterizzati da piccole variazioni del magnesio libero
intracellulare ed elevate variazioni del magnesio totale. In particolare, è stato riportato che la
stimolazione con AMP ciclico (cAMP) provoca una variazione del magnesio totale entro 10 minuti
dal trattamento in cardiomiociti, suggerendo che questo stimolo induca un efflusso di magnesio nelle
cellule eccitabili [1]. In questo studio abbiamo voluto verificare se altri tipi di cellule manifestino
un'analoga risposta al trattamento con cAMP. A questo scopo abbiamo come modello la linea
leucemica promielocitica umana HL60, cellule non eccitabili ma altamente proliferanti. Per valutare
le variazioni del magnesio totale abbiamo utilizzato la sonda fluorescente DCHQ5, derivato fenilico
della famiglia di sonde basate su un estere azacrown coniugato con due 8-idrossichinoline. Questa
sonda ha una kd per il magnesio nell’ordine micromolare e pertanto è adatta alla determinazione del
magnesio totale intracellulare; inoltre è molto ritenuta all’interno delle cellule e la fluorescenza
intracellulare è stabile per piu’ di 30 minuti [2].
Il magnesio intracellulare è stato valutato mediante un saggio fluorimetrico, marcando le cellule con la
sonda alla concentrazione 15 microM. Le cellule sono state trattate con il sale butirrico del cAMP a
diverse concentrazioni, comprese tra 0,6 e 2 mM, e la fluorescenza è stata seguita per 10 minuti dopo
la stimolazione. In tutti i casi si è verificata una diminuzione della fluorescenza entro i primi tre minuti
dallo stimolo, diminuzione che poi è proseguita in modo molto più moderato nei minuti successivi.
L’analisi quantitativa rivela che circa il 10% del magnesio viene estruso, confermando che cAMP
induce un efflusso di magnesio anche in questo tipo di cellule. Abbiamo inoltre verificato, con un
saggio citofluorimetrico con Propidio Ioduro che la diminuzione della fluorescenza non è imputabile a
fenomeni aspecifici che inducono una permeabilizzazione membrana plasmatica.
Inoltre, mediante la marcatura delle cellule sonde commerciali e analisi citofluorimetriche, abbiamo
confermato che anche in questo modello cellulare la stimolazione con cAMP non comporta una
variazione della frazione libera ionizzata [3] mentre induce una iperpolarizzazione del mitocondrio,
come riportato in letteratura [4].
In conclusione abbiamo dimostrato che la stimolazione con cAMP correla con l’efflusso extracellulare
di magnesio anche in cellule proliferanti. Questo fornisce ulteriori evidenze all’ipotesi che il magnesio
possa considerarsi un secondo messaggero intracellulare. Infine queste misure hanno confermato che
la DCHQ5 è uno strumento di analisi estremamente utile per lo studio dell’omeostasi del magnesio, e
che può essere utilizzata sia per la determinazione quantitativa del magnesio cellulare che per
monitorare i flussi di questo ione.
70 |
Bibliografia
1. Romani A, Dowell E, Scarpa A. Hormonal stimulation of Mg2+ uptake in hepatocytes. Regulation by plasma membrane and
intracellular organelles (1991), J Biol Chem, 266:24376-24384;
2. Marraccini C, Farruggia G, Lombardo M, Prodi L, Sgarzi M, Trapani V, Trombini C, Zaccheroni N, Wolf F.I, Iotti S. Diaza-
18-crown-6 hydroxyquinoline derivatives as flexible tools for the assessment and imaging of total intracellular magnesium
(2012), Chemical Science, 3, 727-734
3. Romani AM. Cellular magnesium homeostasis. (2011), Arch. Biochem. Biophys., 512:1-23.
4. Zungu IL, Hawkins Evans D, Abrahamse H. Mitochondrial responses of normal and injured human skin fibroblasts following
low level laser irradiation-an in vitro study (2009), Photochem. Photobiol., 85(4):987-996;
5. Li FY, Chaigne-Delalande B, Kanellopoulou C, Davis JC, Matthews HF, Douek DC, Cohen JI, Uzel G, Su HC, Lenardo MJ.
Second messenger role for Mg2+ revealed by human T-cell immunodeficiency (2011), Nature, 475(7357):471-6.
Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, 40127 Bologna,
tel. 051 2095625, e-mail giovanna.farruggia@unibo.it
P21-Nuove prospettive nella determinazione del magnesio
intracellulare
1Sargenti A.,
1Merolle L. ,
1Malucelli E.,
2Andreani G.,
1Cappadone C.,
1,4Farruggia G.,
1,4Iotti S.,
3Marraccini C.,
4Trombini C.,
4Lombardo M.
. 1Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;
2Dipartimento di Scienze Mediche
Veterinarie, Università di Bologna; 3Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e
Reggio Emilia; 4
Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi, 4Dipartimento di Chimica, Università di
Bologna.
Il magnesio è essenziale per moltissimi processi biologici, ma la sua omeostasi cellulare non è ancora
stata completamente chiarita. In particolare è noto che il magnesio libero ionizzato e quello totale sono
sottoposti a meccanismi di regolazione diversi e indipendenti tra loro: risulta quindi cruciale potere
discriminare tra le due frazioni. Mentre per il magnesio libero ionizzato sono disponibili molte sonde
fluorescenti, non esistono sonde commerciali in grado di valutare il magnesio totale. Pertanto è di
notevole interesse una nuova famiglia di sonde ottenuta coniugando ad un etere corona due residui di
8-idrossichinolina (DCHQ) diversamente sostituita. Queste sonde mostrano una notevole affinità e
specificità per il magnesio [1]. In particolare, la sonda capostipite (DCHQ1) ha permesso di
visualizzare la distribuzione intracellulare del magnesio in cellule vitali e di determinare, con un
saggio spettrofluorimetrico, il contenuto di magnesio in campioni cellulari. I dati sono sovrapponibili
a quelli ottenuti mediante spettrometria di assorbimento atomico (AAS). Rispetto a questa tecnica, il
dosaggio effettuato mediante questa sonda presenta l’indubbio vantaggio di richiedere campioni molto
più ridotti (di almeno dieci volte), e l'utilizzo di strumentazioni di più larga diffusione e con minori
problematiche riguardanti la sicurezza [2].
Tuttavia, la sonda DCHQ1 ha mostrato alcune limitazioni di utilizzo, come una bassa ritenzione
intracellulare e un parziale "fotobleaching". Inoltre è eccitabile solo nell’UV, limitandone l'uso in
citofluorimetria o in microscopia confocale.
Un nuovo derivato fenilico, DCHQ5, mostra invece caratteristiche molto più interssanti: è altamente
ritenuta nelle cellule, il complesso con il magnesio è altamente fluorescente, è molto stabile e può
essere eccitato anche nel visibile [3].
Lo scopo di questo lavoro è quindi stato quello di valutare l’applicabilità della DCHQ5 alla
determinazione del magnesio totale intracellulare attraverso saggi citofluorimetrici e
spettrofluorimetrici.
Il modello cellulare utilizzato sono cellule leucemiche umane HL60, una leucemia promielocitica che
può essere indotta a differenziare con dimetilsolfossido (DMSO). Questo trattamento induce già dopo
3 giorni il blocco proliferativo delle cellule in fase G0/G1 e parallelamente il dimezzamento del
| 71
magnesio totale, che passa da una media di 25 nmoli/106 cell a circa 12 nmoli/10
6 cell [2].
L’analisi citofluorimetrica effettuata utilizzando la sonda DCHQ5 sia eccitando nell’UV che nel
visibile evidenzia che l’intensità di fluorescenza nelle cellule differenziate è circa dimezzata rispetto
alle cellule proliferanti, come mostrato nella tabella I che riporta i dati di un tipico esperimento.
Dato che l’analisi citofluorimetrica fornisce solo un dato semiquantitativo, abbiamo valutato la
capacita' analitica di questa sonda ad un classico saggio di tipo fluorimetrico, utilizzando campioni di
cellule lisate per sonicazione. I risultati ottenuti hanno mostrato un’ottima sovrapponibilità con i quelli
ottenuti sugli stessi campioni in AAS, come riportato nella tabella II.
Possiamo quindi concludere che la sonda DCHQ5 risulta un ottimo chemosensore per la
determinazione sia quantitativa che qualitativa del magnesio intracellulare, ampliando l'applicabilità di
questa famiglia di sonde a sistemi biologici.
Tab. II Quantificazione del magnesio intracellulare in diversi campioni di
cellule, utilizzando il saggio fluorimetrico con la sonda DCHQ5 e la
determinazione mediante AAS
Campione DCHQ5
Mg (nmol/106 cells)
AAS
Mg (nmol/106 cells)
HL60 121p 19,75 ± 0,76 22,78 ± 0,38
HL60 124p 22,93 ± 1,30 20,70 ± 0,61
HL60 128p 23,77 ± 1,14 24,70 ± 0,89
HT29 67p 24,31 ± 1,13 23,94 ± 0,89
HT29 69p 23,96 ± 0,37 21,17 ± 0,71
Bibliografia
1] Farruggia G., Iotti S., Prodi L., Montalti M., Zaccheroni N., Savage P.B., Trapani V., Sale P., Wolf F.I. 8-hydroxyquinoline
derivatives as fluorescent sensors for magnesium in living cells. Journal of the American Chemical Society 128, 344-50, 2006
2] Farruggia G., Iotti S., Prodi L., Zaccheroni N., Montalti M., Savage P., Andreani G., Trapani V., Wolf F.I.,
Hydroxyquinoline derivatives as Fluorescent Probes to Measure Intracellular Magnesium: Insight into Characteristics and Biological Applications, Journal of Fluorescence, 19, 11–19, 2009
3] Marraccini C., Farruggia G., Lombardo M., Prodi L., Sgarzi M., Trapani V., Trombini C., Zaccheroni N., Wolf F.I., Iotti S.
Diaza-18-crown-6 hydroxyquinoline derivatives as flexible tools for the assessment and imaging of total intracellular magnesium. Chemical Science, 3, 727-734, 2012
Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, 40127 Bologna, tel. 051 2095625, e-mail giovanna.farruggia@unibo.it
P22-La carenza di magnesio inibisce la progressione del ciclo
cellulare in cellule di osteosarcoma umano
1Cappadone C.,
1,2Farruggia G.,
1Merolle L.,
3Marraccini C. ,
1Sargenti A.,
1,2Malucelli E.,
1,2Iotti S.
1Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;
2 Istituto Nazionale di Biostrutture
e Biosistemi; 3 Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio
Vi sono molte evidenze che suggeriscono una correlazione tra la disponibilità di magnesio e la
proliferazione cellulare e, in particolare, è stato ampiamente dimostrato che la carenza di questo ione
inibisce la proliferazione in molte linee cellulari di diversa origine, normali e trasformate [1]. Tuttavia,
i meccanismi molecolari che sottendono a questo fenomeno non sono ancora stati ben chiariti. In
questo lavoro abbiamo quindi studiato l’effetto della carenza di magnesio sulla proliferazione e
Tab.I. Canale medio della distribuzione di fluorescenza di cellule marcate con
DCHQ5 5 µM
Eccitazione 360 nm Eccitazione 488 nm
HL60 proliferanti 94 83
HL60 differenziate 45 43
72 |
sull’espressione di alcune proteine coinvolte nella progressione del ciclo cellulare in cellule di
osteosarcoma umano SaOs-2 e U2OS.
Le cellule sono coltivate per 24 ore in terreno privo di magnesio e contenente lo 0,5% di siero fetale
bovino (FBS) deprivato dello ione. Questo trattamento ha sincronizzato le cellule nella fase G0/G1 e
ha ridotto il contenuto di magnesio intracellulare. Le cellule sono state quindi coltivate in terreno
contenente il 5% di FBS e in presenza o in assenza di MgCl2 1 mM per 24 ore. Sebbene sia riportato
che le cellule tumorali sono meno sensibili alla deprivazione di magnesio [2], la presenza dello ione
nel terreno di coltura ha incrementato notevolmente la proliferazione delle cellule di osteosarcoma
rispetto alle cellule deprivate. L’analisi del ciclo cellulare mediante citofluorimetria a flusso, indica
che le cellule deprivate sono bloccate in G0/G1 anche dopo l’aggiunta di FCS, mentre nelle cellule
coltivate in terreno completo di magnesio si osserva un netto aumento delle cellule in fase S e in fase
G2/M.
A livello della transizione G1/S le attività delle chinasi ciclino-dipendenti sono regolate positivamente
dal legame con le loro cicline e negativamente dagli inibitori CKI. Abbiamo quindi investigato
l'espressione della proteina p21 e del suo attivatore trascrizionale p53.
Dopo l'aggiunta di siero, le cellule coltivate in assenza di magnesio presentano un netto calo del
contenuto di questo ione, mentre non presentano variazioni significative di p21 e p53 rispetto alle
cellule in terreno contenente MgCl2. Alla luce dei risultati ottenuti, si può concludere che l'arresto
proliferativo dipende dalla riduzione del contenuto di magnesio, ma è p53 indipendente. Studi futuri
saranno indirizzati a chiarire i meccanismi e i bersagli molecolari responsabili di questo blocco.
Bibiliografia
1. Ikari A, Sawada H, Sanada A, Tonegawa C, Yamazaki Y, Sugatani J. Magnesium deficiency suppresses cell cycle
progression mediated by increase in transcriptional activity of p21(Cip1) and p27(Kip1) in renal epithelial NRK-52E
cells. J. Cell. Biochem. 2011 :112(12):3563-72
2. Wolf F., Trapani V. Cell (patho)physiology of magnesium. Clin. Sci. 2008: 114(1):27-35
Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, tel 051 2095626, e
mail giovanna.farruggia@unibo.it
P23-Behavior of classical and non-classical soluble HLA class I
molecules in patients with chronic hepatitis C virus infection before
and after pegylated interferon and ribavirin treatment: potential
role as markers of immune activation and response to antiviral
treatment.
G. Murdaca1, P. Contini
1, P. Cagnati
1, S. Marenco
2, G. Pieri
2, F. Lantieri
3, A. Picciotto
2, F. Puppo
1
1Clinical Immunology Unit, Department of Internal Medicine, University of Genoa, Genoa, Italy
2Gastroenterology Unit, Department of Internal Medicine, University of Genoa, Genoa, Italy
3Department of Health Sciences, Biostatistic Unit, University of Genoa, Genoa, Italy
The human major histocompatibility complex encodes two sets of HLA class I (HLA-I) molecules,
which have been termed class Ia (or classical) and class Ib (or non-classical) molecules. The class Ia
antigens include the gene products of HLA-A, -B and –C loci and are characterized by a broad tissue
expression and by a high degree of polymorphism.1,2
The class Ib antigens include the gene products
of HLA-E, -F and –G loci and are characterized by a restricted tissue distribution and by a limited
polymorphism.1,3
We have previously reported that their serum levels were significantly elevated in
human immunodeficiency virus (HIV)-1-infected subjects as compared to HIV-negative controls4-7
,
| 73
that their increases correlated with disease progression and development of the Acquired
Immunodeficiency Syndrome (AIDS), and, finally, that their decreases significantly correlated with
virological and immunological response to Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART).4-6,18
These results suggest that the measurement of sHLA-A, -B, -C and sHLA-G antigens serum levels
might represent a useful surrogate marker to monitor virological response and immune reconstitution
in HIV-positive subjects undergoing HAART treatment. In the present study, we measured the sHLA-
A, -B, -C and sHLA–G serum levels in 40 HCV genotype 1-infected patients treated with PEG-IFN-α
plus ribavirin at baseline (T0) and at months 3, 6 and 12 (T3, T6 and T12) and, finally, 6 months (T18)
after the end of the antiviral treatment. Finally, we correlate the baseline sHLA-A, -B, -C and sHLA–
G serum levels with the levels detected in a group of viremic HAART treatment-“ naïve” HIV-1-
infected patients and in a groupof healthy controls. sHLA-A, -B, -C antigen serum levels at T0 were
significantly higher in both groups of responder (R) and non responder (NR) HCV-infected patients as
compared to healthy controls and viremic HIV-infected individuals. sHLA-G serum levels at T0 were
also significantly higher in both groups of R and NR patients as compared to healthy controls but
lower as compared to viremic HIV-infected individuals. sHLA-A, -B, -C and –G antigen serum levels
significantly decreased in the group of R patients from T0 to T18. Decrease of both sHLA-A-B-C and
sHLA-G serum levels significantly correlated with the decrease of serum HCV-RNA levels, AST,
ALT, γGT and ALP in the group of R patients. In conclusion, sHLA-A, -B, -C and sHLA–G antigens
play a role in the pathogenesis and progression of HCV infection. PEG-IFN-α and ribavirin
association therapy induced a significant reduction of circulating soluble HLA molecules correlating
with viral clearance. Therefore, sHLA-A, -B, -C and -G serum level could be proposed as a useful
surrogate marker to monitor patients with HCV during PEG-IFN-α and ribavirin association therapy
and, finally, to discriminate R from NR HCV-infected subjects.
References
1. Contini P, Ghio M, Poggi A, Filaci G, Indiveri F, Ferrone S, Puppo F. Soluble HLA-A, -B, -C and –G molecules induce
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5. Murdaca G, Contini P, Setti M, Cagnati P, Lantieri F, Indiveri F, Puppo F. Behavior of non-classical soluble HLA class G
antigens in human immunodeficiency virus 1-infected patients before and after HAART: comparison with classical soluble HLA-A, -B, -C antigens and potential role in immune-reconstitution. Clin Immunol 2009;133(2):238-44.
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Corresponding author: G. Murdaca, MD PhD DIMI, Viale Benedetto XV, n. 6 16132 Genova – Italy, Phone: +390103537924,
Fax: + 390105556950, e-mail: Giuseppe.Murdaca@unige.it
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