View
0
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
A dUTPáz kifejeződés hatása a DNS bázisösszetételére és a
genom épségére
Doktori értekezés
Horváth András
Okleveles biológus
Témavezető: Prof. Vértessy G. Beáta
Az MTA doktora, egyetemi tanár
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológia Doktori Iskola,
Szerkezeti Biokémia Program
A doktori iskola vezetője: Prof. Erdei Anna
Programvezető: Prof. Nyitray László
Készült: Magyar Tudományos Akadémia, Természettudományi Kutatóközpont,
Enzimológiai Intézet
2012. Budapest
Egyéni szerepem a disszertáció elkészítésében
A doktori értekezésemben közölt egyermények több kutató közös munkájának köszönhető.
Egyes szám első személyben fogalmaztam, amennyiben a leírt kísérletet kizárólag én
végeztem el. Egyes szám többes személyben kívánom jelezni azt, ha az eredmény
megszületésében mások is közreműködtek. A dolgozatban minden közreműködő kollégámat
külön megemlítem.
Tartalomjegyzék
Köszönetnyilvánítás ................................................................................................................... 1
A dolgozatban gyakran használt rövidítések jegyzéke .............................................................. 2
1. Irodalmi áttekintés .................................................................................................................. 7
1.1. A sejtbeli dNTP egyensúlyt kialakító tényezők .............................................................. 7
1.1.1. A dezoxiribonukleotidok de novo szintézise ............................................................ 7
1.1.2. Timidilát bioszintézis ............................................................................................... 9
1.1.3. Menekítő útvonalak ................................................................................................ 12
1.2. A nukleotid metabolizmus hatása a DNS összetételére ................................................ 13
1.2.1. A dNTP arányok és a mutagenezis ........................................................................ 13
1.2.2. Nem konvencionális nukleotidok beépülése a DNS-be ......................................... 15
1.2.3. Nem konvencionális nukleotidok eltávolítása a dNTP készletből ......................... 18
1.2.4. Nem konvencionális nukleotidok eltávolítása a DNS-ből ..................................... 20
1.2.4.1. Direkt javítómechanizmusok ........................................................................... 20
1.2.4.2. Báziskivágó javítás .......................................................................................... 20
1.2.4.3. Hibáspár javítás ............................................................................................... 24
1.2.4.4. Nukleotid kivágó javítás .................................................................................. 26
1.3. A nukleotid metabolizmus szinkronizálása a sejtciklushoz .......................................... 27
1.3.1. Transzkripciós szabályzás ...................................................................................... 27
1.3.2. Poszttranszkripciós szabályzás ............................................................................... 28
1.3.3. A dNTP koncentráció fluktuációjának jelentősége ................................................ 29
1.4. A nukleotid metabolizmus hatása a genom integritására .............................................. 30
1.4.1. A DNS épségének preventív védelme .................................................................... 30
1.4.2. A genom integritását veszélyeztető nukleotid metabolitok .................................... 31
1.5. A DNS károsodás sejtválasz ......................................................................................... 34
1.5.1. A DNS károsodás aktivált sejtciklus leállás ........................................................... 37
1.5.2. A DNS károsodás aktivált nukleotid metabolizmus és javítás ............................... 39
1.5.3. A DNS károsodás által kiváltott sejthalál .............................................................. 40
2. Célkitűzések ......................................................................................................................... 43
3. Anyagok és módszerek ......................................................................................................... 47
3.1. Nukleinsav izolálás és a plazmidok létrehozása............................................................ 47
3.1.1. Felhasznált Escherichia coli törzsek és a pBS-dutP plazmid létrehozása.............. 47
3.1.2. DNS tisztítás ........................................................................................................... 48
3.1.3. Uracil-szubsztituált DNS fragmentumok előállítása PCR-el ................................. 48
3.1.4. Genomi DNS minták előkészítése az uracil PCR-alapú kimutatásához ................ 49
3.1.5. Promóter - riporter rendszerek létrehozása ............................................................ 49
3.1.5.1. EGFP riporter rendszerek ................................................................................ 49
3.1.5.2. Luciferáz riporter rendszerek .......................................................................... 50
3.1.5.3. β-galaktozidáz riporter rendszerek .................................................................. 50
3.1.6. Plazmidok a dUTPáz overexpresszáló muslicatörzsek létrehozásához ................. 51
3.2. Eukarióta sejtvonalak .................................................................................................... 51
3.2.1. Sejtvonalak és fenntartásuk .................................................................................... 51
3.2.2. Drosophila S2 sejtek transzfektálása ...................................................................... 52
3.2.3. A sejtek drogkezelése ............................................................................................. 52
3.3. Muslica törzsek és módszerek ....................................................................................... 52
3.3.1. Gének csendesítése ................................................................................................. 52
3.3.2. dUTPáz túltermelés ................................................................................................ 53
3.3.3. Promóter - riporter rendszereket hordozó transzgenikus törzsek ........................... 55
3.4. Muslica szövetek gyűjtése és festése ............................................................................ 55
3.4.1. Embrió gyűjtés ....................................................................................................... 55
3.4.2. β-galaktozidáz hisztokémia .................................................................................... 55
3.4.3. Immuncitokémia ..................................................................................................... 56
3.4.4. TUNEL próba ......................................................................................................... 57
3.4.5. BrdU próba ............................................................................................................. 58
3.5. Kimutatási módszerek és a felhasznált műszerek ......................................................... 58
3.5.1. Kvantitatív valós idejű PCR ................................................................................... 58
3.5.2. Szcintillációs detekció ............................................................................................ 60
3.5.3. Luciferáz teszt ........................................................................................................ 60
3.5.4. Áramlási citrometria ............................................................................................... 60
3.5.5. Mikroszkópia .......................................................................................................... 61
3.5.6. Alamar sejt életképesség vizsgálat ......................................................................... 61
4. Eredmények bemutatása és kiértékelése .............................................................................. 62
4.1. A DNS uraciltartalmának kvantitatív kimutatása .......................................................... 62
4.1.1. DNS uraciltartalom kimutatása szintetikus DNS-ből ............................................. 65
4.1.2. DNS uraciltartalom kimutatása fiziológiás DNS mintákból .................................. 67
4.2. A dUTPáz expressziós mintázat hatása a muslica genom uraciltartalmára .................. 70
4.2.1. Az ecetmuslica dUTPáz expressziós mintázata ..................................................... 71
4.2.2. Az uracil-DNS stádium- és szövetspecifikus megjelenése .................................... 72
4.2.3. A dUTPáz csendesítés hatása a muslica genom uraciltartalmára .......................... 74
4.3. A muslica dUTPáz expressziós mintázatáért felelős mechanizmus vizsgálata ............. 75
4.3.1. A dUTPáz promóter vizsgálata S2 sejtvonalban .................................................... 78
4.3.2. A dUTPáz promóter stádium-és szövetspecifikus regulálása ................................ 80
4.3.3. A dUTPáz expressziós reguláció jelentősége ......................................................... 84
4.4. A dUTPáz jelentőségének vizsgálata a genom integritásának megőrzésében .............. 86
4.4.1. A dUTPáz csendesítés hatása a muslica genom integritására ................................ 87
4.4.1.1. A dUTPáz csendesítés sejtautonóm hatásának kimutatása ............................. 87
4.4.1.2. A dUTPáz csendesítés okozta fenotípus molekuláris jellemzése .................... 89
4.4.2. A dUTPáz hozzájárulása az 5-fluorodezoxiuridin toleranciához ........................... 93
5. Összefoglalás, konklúzió ...................................................................................................... 96
6. Összegzés ........................................................................................................................... 105
7. Summary ............................................................................................................................ 106
8. Irodalomjegyzék ................................................................................................................. 107
9. Közlemények listája ........................................................................................................... 123
1
Köszönetnyilvánítás
Mindenekelőtt szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Prof. Vértessy
Beátának, aki lehetővé tette, hogy a csoportjában dolgozzak, amiért a téma iránt felkeltette az
érdeklődésemet, és megismertette velem a téma alapjait. Köszönöm, hogy szakértelemmel és
odafigyeléssel irányított, a felmerülő problémák megoldásában segített, és támogatta
részvételemet konferenciákon és szakmai gyakorlatokon.
Szeretnék köszönetet mondani Dr. Muha Villőnek, aki korábbi munkájával számos e
dolgozatban bemutatott eredményt alapozott meg. Ezen túl sokat segített szakmai
tapasztalatok elsajátításában, a felmerülő problémák megoldásában. Jelen dolgozatban
bemutatott eredményekhez is jelentősen hozzájárult muslica minták gyűjtésével és azokon
végzett mérésekkel. Köszönet jár kollégámnak, Róna Gergelynek, aki számos ötlettel és
javaslattal támogatta munkámat, valamint sokat segített a dolgozatban bemutatott
mikroszkópiás eredmények megszületésében. Köszönetet szeretnék mondani Batki Júliának,
aki szakdolgozóként és tudományos diákköri hallgatóként vett részt a munkákban az
irányításom alatt, és végig rendkívüli lelkesedéssel és érdeklődéssel követte az elvégzett
kísérleteket. Köszönetet mondanék Dr. Békési Angélának, aki szintén hozzájárult a téma
alapjaihoz, valamint számos tanácsot adott, lelkesedését rám is átragasztotta. Köszönet jár
még Dr. Merényi Gábornak, aki számos tanácsot adott sejtkultúrák kezeléséhez, és aki az
eredményekhez felhasznált humán sejtvonalakat hozott létre.
Szeretnék köszönetet mondani Dr. Erdélyi Miklósnak és Dr. Vilmos Péternek a
Szegedi Biológiai Központ Genetikai Intézetéből, akik számos, e dolgozatban bemutatott
kísérletekhez felhasznált muslica törzset hoztak létre. Ezen kívül szakértelmükkel számos
genetikai kísérlet kiértékelésében segítettek, a kísérletek elvégzéséhez hasznos tanácsokat
adtak.
Szeretném még megköszönni Dr. Kiss Endre segítségét az ELTE Immunológiai
Tanszékéről, aki az áramlási citometriás méréseket végezte és az eredmények kiértékelésében
is részt vett. Továbbá szetetnék köszönetet mondani Prof. Hilde Nilsen-nek és Dr. James
Sellers-nek az Osloi Egyetemről és az NIH-ről, amiért a kísérleteimhez sejtvonalakat
adományoztak. Szeretenék köszönetet mondani Prof. Jure Piskur-nak, akinek a laborjában
három hónapot tölthettem a Lund-i Egyetemen doktori éveim alatt, és számos tapasztalatot
szereztem.
Végül szeretnék köszönetet mondani Prof. Buday Lászlónak az Enzimológiai Intézet
igazgatójának, aki lehetővé tette, hogy az Intézeti infrastruktúrát kísérleteimhez hasznosítsam.
2
A dolgozatban gyakran használt rövidítések jegyzéke
2-OH-A 2-hidroxiadenin
2-OH-G 2-hidroxiguanin
3-metil-A 3-metiladenin
5FdU 5-fluoro-dezoxiuridin
5FU 5-fluorouracil
5-OH-C 5-hidroxicitozin
5-OH-U 5-hidroxiuracil
7-metil-G 7-metilguanin
8-OH-dATP 8-hidroxi-dezoxiadenozin trifoszfát
8-OH-dGDP 8-hidroxi-dezoxiguanozin difoszfát
8-OH-dGMP 8-hidroxi-dezoxiguanozin monofoszfát
8-OH-dGTP 8-hidroxi-dezoxiguanozin trifoszfát
8-OH-G 8-hidroxiguanin
9-1-1 Rad9, Rad1, Hus1 "clamp loader" komplex
A adenin
ADP adenozin difoszfát
AP-hely bázismentes hely a DNS-ben
APC Anaphase Promoting Complex
APE1 AP endonukleáz 1
APOBEC apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like
enzim család
ARP aldehid reaktív próba
Art8 Arginin metiltranszferáz 8
ATM Ataxia telangiectasia mutated kináz
ATP adenozin trifoszfát
ATR ATM-related kináz
BER Báziskivágó javítás
bp bázispár
BrdU 5-bromo-dezoxiuridin
BSA Bovine serum albumin
C citozin
C. elegans Caenorhabditis elegans
3
CD95 cluster of differentiation 95/FAS receptor
CDA citidin dezamináz
cDNS mRNS reverz transzkripcióval előállított, intronokat nem tartalmazó
DNS
CDP citidin difoszfát
CHO hörcsög ovárium sejtvonal
CNS Central Nervous System - központi idegrendszer
Ct qPCR kvatifikációs ciklus, az a ciklusszám, melynél a felszaporítás
során a DNS koncentráció elér egy bizonyos küszöbértéket
C-terminális karboxi-terminális
D. melanogaster Drosophila melanogaster
dA dezoxiadenozin
dADP dezoxiadenozin difoszfát
dAMP dezoxiadenozin monofoszfát
DAPI 4',6-diamidino-2-fenilindol
dATP dezoxiadenozin trifoszfát
dC dezoxicitidin
dCDP dezoxicitidin difoszfát
dCMP dezoxicitidin monofoszfát
DCTD dezoxicitidin monofoszfát dezamináz
dCTP dezoxicitidin trifoszfát
DCTPP1 dezoxicitidin trifoszfát pirofoszfatáz 1
DDR DNS károsodás sejtválasz
dG dezoxiguanozin
dGDP dezoxiguanozin trifoszfát
dGMP dezoxiguanozin monofoszfát
dGTP dezoxiguanozin trifoszfát
DHF dihidrofolát
DHFR dihidrofolát reduktáz
dIDP dezixiinozin difoszfát
dIMP dezoxiinozin monofoszfát
dITP dezoxiinozin trifoszfát
dNDP dezoxiribonukleotid difoszfát
dNMP dezoxiribonukleotid monofoszfát
4
DNS dezoxiribonukleinsav
dNTP dezoxiribonukleotid trifoszfát
DRE DNA Replication-related Element transzkripciós faktor kötő DNS
motívum
DREF DNA Replication-related Element binding Factor transzkripciós faktor
dRP dezoxiribóz foszfát
DSB dupla szálú DNS törés
dT dezoxitimidin
dTDP dezoxitimidin difoszfát
dTMP dezoxitimidin monofoszfát
dTTP dezoxitimidin trifoszfát
dU dezoxiuridin
dUDP dezoxiuridin difoszfát
dUMP dezoxiuridin monofoszfát
dUTP dezoxiuridin trifoszfát
dUTPáz dezoxiuridin trifoszfát pirofoszfatáz
dXTP dezoxixantozin trifoszfát
E. coli Escherichia coli
EGFP enhanced Green Fluorescent Protein - zöld fluoreszcens fehérje
FANCD2 Fanconi anemia komplementációs csoport D2 fehérje
FBS Foetal bovine serum - marha magzati szérum
G guanin
GDP guanozin difoszfát
GTP guanozin trifoszfát
H2AV H2AX hisztonvariáns muslica homológja
HEK humán embrionális vese sejtvonal
HeLa méhnyakrák sejtvonal
HIV humán immundeficiencia vírus
hmU 5-hidroximetil-uracil
HT29 humán vastagbél karcinóma sejtvonal
ITPáz inozin trifoszfát pirofoszfatáz
LigI DNS ligáz I
LigIII DNS ligáz III
MEF egér embrionális fibroblaszt sejtvonal
5
MGMT 6-oxo-metilguanin transzferáz
MPG 3-metilpurin glikoziláz/3-alkiladenin DNS glikoziláz (AAG)
MRN Mre11, Rad50, Nbs1 komplex
mRNS hírvivő/messenger RNS
MTHF metilén-tetrahidrofolát
MTX metotrexát
MX metoxiamin
NDP ribonukleotid difoszfát
NDPK nukleotid difoszfát kináz
NK nukleotid kináz
NLS sejtmagi lokalizációs szignál
NMP ribonukleotid monofoszfát
NMPK nukleotid monofoszfát kináz
N-terminális amino-terminális
NTP ribonukleotid trifoszfát
OD optikai denzitás
OpiE2 Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrosis vírus promoter
p53R2 p53 indukálható ribonukleotid reduktáz kis alegység
PARP poli-ADP ribóz polimeráz
PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen replikációs kapocs
PCR polimeráz láncreakció
Pfu Pyrococcus furiosus
pH2AX foszforilált H2AX hisztonvariáns
Polβ DNS polimeráz β
qPCR kvantitatív valós idejű PCR
R1 ribonukleotid reduktáz nagy alegység
R2 ribonukleotid reduktáz kis alegység
Rb retinoblasztoma tumor szupreszor fehérje
RdgB inozin trifoszfát pirofoszfatáz Escherichia coli homológja
RecA Az eukarióta Rad51 Escherichia coli homológja
RFC replikációs faktor C
RNAi RNS interferencia
RNázH ribonukleáz H
RNR ribonukleotid reduktáz
6
RNS ribonukleinsav
ROS Reactive oxigen species - reaktív oxigén gyökök
RTX Raltitrexed /Tomudex (TDX)
S. cerevisie Saccharomyces cerevisiae
S. pombe Schizosaccharomyces pombe
S2 Drosophila melanogaster 20-24 órás embrióból származó heterogén
sejtvonal
SHMT szerin-hidroximetil transzferáz
SSB egyes szálú DNS törés
ssDNS egyes szálú DNS
SW620 colorectal adenocarcinoma sejtvonal
T timin
THF tetrahidrofolát
TK1 timidin kináz
TMPK timidilát kináz
TRIS 2-Amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol
TS timidilát szintáz
TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling
U uracil
UDP uridin difoszfát
UTR nem transzált régió
UV ibolyántúli (ultraviola) fény
V93Q valin-glutamin csere a 93. aminosav helyén
W vad típusú allél
WRN Werner szindróma fehérje
WT vad típus
X-gal 5-bromo-4-kloro-indolil-β-D-galaktopiranozid
Y285A tirozin-alanin csere a 285. aminosav helyén
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
7
1. Irodalmi áttekintés
Dolgozatomban elsősorban a dUTPáz fiziológiás szerepének megértését célzó
vizsgálatokat szeretném ismertetni. Ehhez szeretném bemutatni a nukleotid metabolizmussal
és a genom stabilitását biztosító rendszerekkel kapcsolatos folyamatokat, melyekben a
dUTPáz az irodalmi adatok alapján részt vehet. Emellett szeretném bemutatni azokat a sejtbeli
rendszereket, amelyek a dUTPáz fiziológiás funkciójával analógiát mutatnak, így a dUTPáz
szerepének megértéséhez támpontot adnak.
1.1. A sejtbeli dNTP egyensúlyt kialakító tényezők
Nagy mennyiségű információ tárolásának hatékony módja az elemi információt tároló
egységek szekvenciális elrendezése. Az élővilágban ezt a polimer ribonukleotidok (RNS), és
dezoxiribonukleotidok (DNS) valósítják meg. Mindkettő kovalensen összekapcsolt cukor-
foszfát láncból, és az elemi információt hordozó bázisokból áll. A DNS generációkon
keresztül, hosszú távon tárolja az információt, ennek megfelelően az RNS-nél jóval
stabilabbnak, kevésbé reaktívnak kell lennie. Ezért ribonukleotid-monofoszfátok (NMP)
helyett a 2’-hidroxil csoporttal nem rendelkező dezoxiribonukleotid-monofoszfátok (dNMP)
építik fel, továbbá a DNS az élővilágban legtöbbször komplementer kettős szálú hélixet alkot.
A DNS és az RNS báziskomponenseinek összetételében csak minimálisan különbözik, ami a
kémiai stabilitást nem befolyásolja: mindkét molekula tartalmazhat adenin, guanin és citozin
bázisokat, a DNS-ben azonban az RNS-re jellemző uracil helyett az 5-metilcsoporttal is
rendelkező timin fordul elő. A DNS szintézisét a DNS polimerázok végzik
dezoxiribonukleotid trifoszfát (dNTP) szubsztrátokból. Az egyes dNTP molekulák
koncentrációja a sejtben szigorúan szabályozott. Ennek megfelelően a dNTP szintézisnek
összhangban kell lennie a DNS szintézisével, amit számos mechanizmus biztosít. A dNTP
metabolizmus főbb útvonalai az 1.1. ábra láthatók. A továbbiakban részletesen bemutatom,
hogy ezen útvonal résztvevői hogyan járulnak hozzá a dNTP szintéziséhez, és milyen
jelentőséggel bírnak a dNTP arányok kialakításában.
1.1.1. A dezoxiribonukleotidok de novo szintézise
A dTTP szintézis kulcslépése a ribonukleotid-difoszfátok (NDP) redukciója
dezoxiribonukleotid-difoszfáttá (dNDP). Ezt a folyamatot a ribonukleotid reduktáz (RNR)
katalizálja 1. (Egyes archea és baktérim ribonukleotid reduktázok az NTP-t fogadják el
szubsztrátként.) Az RNR kétféle alegységből alkot funkcionális heterotetramert: a nagy R1 és
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
8
a kis R2. A nagy alegység katalizálja a redukciót, amihez a reaktív gyököt a kis alegység
biztosítja 2.
Az RNR aktivitását az R1 alegységen kétféle allosztéria befolyásolja. Az általános
aktivitást szabályzó hurok (a-hely) adenozin trifoszfátot (ATP) vagy dezoxiadenozin
trifoszfátot (dATP) képes kompetitív módon kötni. Bár az ATP sejtbeli koncentrációja jóval
magasabb a dATP-nél, utóbbi affinitása az a-helyre 100-szor nagyobb 3. Mindkét nukleotid
kötődése az R1 alegység hexamerizációját segíti elő, azonban az ATP-vel komplexált forma
inaktív 4. Az a-helyen történő allosztérikus szabályozás tehát lehetővé teszi, hogy az enzim
érzékelje a sejtbeli dNTP koncentrációt, és ahhoz hangolja az aktivitását. Az allosztérikus
specificitást szabályzó két hurok (s-hely) az aktív hely közelében van, és ATP, dATP, dGTP
és dTTP kötésére képes. Az egyes nukleotidok kötődése az s-helyre befolyásolja az NDP
molekulák kötődését és azok enzimatikus redukcióját. Az ATP és a dATP kötődése a citidin
difoszfát (CDP) és az uridin difoszfát (UDP) redukcióját stimulálja, míg a dTTP a guanozin
1.1. ábra. A dezoxinukleotid metabolizmus útvonalai eukarióta sejtekben
CDA: citidin dezamináz, DCTD: dCMP dezamináz, DCTPP1: dCTP pirofoszfatáz 1,
DHF: dihidrofolát, DHFR: dihidrofolát reduktáz, MTHF: metilén-tetrahidrofolát, NDPK:
nukleotid difoszfát kináz, NK: nukleotid kinázok, NMPK: nukleotid monofoszfát kináz,
RNR: ribonukleotid reduktáz, SHMT: szerin hidroximetil transzferáz, THF:
tetrahidrofolát, TS: timidilát szintáz
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
9
difoszfát (GDP ), a dGTP az adenozin difoszfát (ADP) redukcióját segíti 5. Ennek a
szabályozásnak köszönhetően az egyik dNTP komponens sejtbeli koncentrációjának
egyensúlyitól való eltérése kihatással van a többi dNTP szintézisére. Ezt támasztja alá az a
megfigyelés is, hogy az RNR s-helyét érintő mutációk az élesztősejtek dNTP egyensúlyát
jelentősen felborítják 6.
A dNDP molekulák foszforilálását dNTP-vé a nukleozid difoszfát kináz (NDPK)
katalizálja 7. Ez az enzim nem bázis vagy dezoxiribóz specifikus, tehát részt vesz az NTP
szintézisben is. Feltehetően az NDP kinázokon kívül más nem specifikus kinázok is
elláthatják ezt a funkciót, mint a piruvát kinázok vagy a foszfoglicerát kinázok 7.
1.1.2. Timidilát bioszintézis
A timidinnek nincs ribonukleotid megfelelője, így annak szintézise csak uridin vagy
citidin prekurzorokból lehetséges. Mindkét útvonal dezoxiuridin monofoszfát (dUMP)
intermedieren keresztül valósul meg.
Eukariótákban és Gram pozitív baktériumokban jelentős útvonalat képvisel a
dezoxicitidin monofoszfát (dCMP) konverziója dUMP-vé, amit a dCMP dezamináz (DCTD)
katalizál 8. A ribonukleotid reduktázhoz hasonlóan a DCTD aktivitása is allosztérikusan
szabályozott: a dTTP gátolja, a dCTP viszont serkenti a katalizált reakciót 9. Az eddig vizsgált
emlős sejtvonalakban a dCMP dezamináció bizonyult az elsődleges forrásnak a de novo dTTP
szintézis számára, amihez hozzávetőlegesen 60-80%-ban járul hozzá 10,11
. A DCTD funkció
csökkentése emlős sejtvonalakban a dNTP arányok drasztikus felborulását eredményezi, a
sejtbeli dCTP koncentráció a többszörösére nő, míg a dTTP koncentráció csökken 12,13
. A
DCTD szubsztrátját de novo feltehetően a dCTP pirofoszfatáz 1 (DCTPP1) állítja elő a
dCTP hidrolízisével. Ez a fehérje a dCTP mellett a dATP és a dTTP hidrolízisét is képes
katalizálni 14,15
.
A másik jelentős útvonal a dUMP prekurzort dezoxiuridin trifoszfátból (dUTP) állítja
elő. A dUTP származhat az RNR termékéből (dUDP), amit aztán az NDP kinázok
foszforilálnak, illetve dCTP dezaminálásából, amit a dCTP dezamináz (DCD) végez. Utóbbi
a Gram negatív baktériumokra jellemző 16
. A dUTP hidrolízisét a dUTPáz végzi, amely széles
körben elterjedt az élővilágban. Bizonyos baktériumokban mint a Mycobacterium
tuberculosis, egy bifunkciós dCTP dezamináz - dUTPáz (DCD-DUT) enzim is jelen lehet,
mely dCTP - dUTP - dUMP konverziót katalizál 17
. Mindhárom enzim (DCD, dUTPáz, DCD-
DUT) a dUTPáz szupercsaládba tartozik és számos szerkezeti hasonlóságot mutat 18
. A
katalitikusan aktív enzim három alegységből alakít ki egy homotrimert, ami hármas
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
10
szimmetriát mutat, körülölelve egy központi csatornát. Az aktív helyek a szomszédos
alegységek határán alakulnak ki, amelyekhez hozzájárulnak az egyes alegységek C-terminális
flexibilis karja is.
A dUTPáz a dUTP foszfát láncát hasítja el az α és β foszfát között. Ezt a reakciót a
magnézium ion a foszfátlánc koordinálásával jelentősen felgyorsítja. A katalízist követően
pirofoszfát és proton szabadul fel. A C-terminális kar konzervált motívuma rendelkezik egy
P-hurok szerű motívummal, ami jellemző a nukleotid hidrolízist katalizáló enzimekre 19
. A
Caenorhabditis nemzetség 20
, valamint korábbi, eddig nem publikált megfigyelésünk alapján
a Drosophila virilis genomjában a dUTPázt kódoló gén háromszoros tandem ismétlődésben
van jelen egy leolvasási keretben, amiről egy polipeptid termék képződik. Ez a termék
monomerként valósítja meg a homotrimerre jellemző szerkezetet. A szerkezetet kialakító
három feltekeredési egység szekvenciája kis mértékben divergens. Ez a divergencia a hármas
szimmetria kismértékű csökkenésével a három feltekeredési egység esetleges specializációját
eredményezheti a homotrimer enzimekhez képest. Egyes organizmusok homodimer
dUTPázokkal rendelkeznek, amelyek nem a trimerikus dUTPázokkal, hanem a DCTPP1-el
mutatnak homológiát 14
. Homodimer dUTPázok találhatók a Trypanosomatida rendbe tartozó
organizmusok genomjában mint a Trypanosoma brucei és a Leishmania major esetében, de
néhány Gram pozitív baktériumban és azok fágjaiban is előfordulnak 14
.
dUTPáz hiányos sejtekben eddig még nem végeztek teljes körű dNTP készletre
vonatkozó vizsgálatot, azok csupán a sejtbeli dUTP és dTTP koncentrációra korlátozódtak.
Vastagbél és tüdőrák sejtvonalakban vizsgálták a dUTPáz expressziós szintek és a sejtbeli
dTTP és dUTP koncentráció összefüggését. A dUTP egyik esetben sem volt kimutatható. A
HT29 sejtvonalban negyedakkora dUTPáz aktivitás mellett feleakkora dTTP koncentráció
volt megfigyelhető az SW620 sejtvonalhoz képest 21
. Ilyen összefüggést azonban nem sikerült
kimutatni a tüdőrák sejtvonalak esetében 22
. A dUTPáz csendesítése tumoros sejtvonalakon
szintén nem járt egyértelmű következményekkel. A legtöbb esetben a dTTP koncentrációja
nem változott jelentős mértékben a csendesített sejtekben, azonban dUTP
koncentrációnövekedést több esetben sikerült kimutatni 23–25
. A dUTPáz csendesítés hatása
tehát feltehetően sejttípus függő. Az, hogy a dUTPáz csendesítés nem volt egyértelmű
hatással a timidilát bioszintézisre alátámasztja, hogy a dCMP dezamináció a domináns
útvonal. A dUTPáz csendesítés hatásának hiányára egy másik lehetséges magyarázat, hogy a
csendesítés ellenére elegendő enzimatikus aktivitás maradt a dTTP koncentráció zavartalan
fenntartásához. Mivel a dUTP nem allosztérikus modulátora a ribonukleotid reduktáznak 26
,
nem várható, hogy annak dUTPáz hiányában megemelkedett koncentrációja a dNTP
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
11
egyensúly felborulásához vezet. Mivel számos prokariótában nincs jelen a DCTD, ezekben az
élőlényekben a timidilát de novo szintézisében jóval nagyobb szerepe juthat a dUTP-nek és a
dUTPáznak.
A timidilát szintézis szűk keresztmetszete a dUMP, melynek metilációját a timidilát
szintáz (TS) katalizálja egy redukáló kofaktor jelenlétében 27
. A legtöbb élőlényben
kofaktorként és metil-donorként a metilén-tetrahidrofolát (MTHF) szolgál, amelyet az enzim
az uracil metilálását követően dihidrofoláttá alakít (DHF). A prokarióták egy csoportjára
azonban egy nem kanonikus, az előbbivel nem rokon, az ún. flavin-függő timidilát szintáz
(FDTS) jellemző 28
. Ez NAD(P)H redukáló kofaktort és MTHF metil-donort hasznosít,
utóbbit tetrahidrofoláttá (THF) alakítva a reakció során. A DHF regenerálása egy újabb
katalitikus ciklushoz két lépésben zajlik: a dihidrofolát reduktáz (DHFR) alakítja át
tetrahidrofoláttá, amit aztán a szerin-hidroximetil transzferáz (SHMT) alakít tovább
metilén-tetrahidrofoláttá, egy szerin-glicin konverzióval egyidejűleg 29
. Számos eukarióta
egysejtű parazita timidilát szintáz-dihidrofolát reduktáz (TD-DHFR) bifunkciós enzimmel
rendelkezik, mint a Leishmania, Plasmodium és Trypanosoma fajok 27
. A folát metabolizmus
a timidilát bioszintézis mellett kapcsolatban van a DNS metilációval 30
és a purin
bioszintézissel 31
, így megzavarása a dNTP készlet egyensúly felborítása mellett a DNS
metiláció által érintett epigenetikus információ tárolását is összezavarhatja.
Mivel a TS egy kulcsfontosságú folyamatot katalizál, kedvelt kemoterápiás célpont.
Timidilát deficiens egér sejtvonalban a külső timidin forrás megszüntetését követően a dTTP
és dGTP készlet csökkenését és a dATP készlet expanzióját figyelték meg 32
. Az 5-
fluorouracil származékok metabolitja, az 5-fluoro-dUMP irrevezibilis inhibitora a timidilát
szintáznak 33
. Emlős sejtvonalak 5-fluorouracil (5FU) és 5-fluoro-dezoxiuridin (5FdU)
kezelése hasonló hatással van sejtekre, mint a TS hiányos sejtekre a timidin megvonás 32,34
.
Ezen kívül számos esetben a dUTP készlet expanzióját is megfigyelték 5FU és 5FdU kezelést
követően 21,23,35,36
. Számos antimetabolit folátszármazék is létezik, amely hatással van a
timidilát bioszintézisre. Ezek némelyike a folát ciklust zavarja meg, vagy közvetlenül a
timidilát szintázt gátolja. A metotrexát (MTX) és az aminompterin a DHFR ismert inhibitorai,
egyúttal gátolják a metil transzferhez szükséges folát ciklust is. Sejtek mindkét droggal
történő kezelése esetén megfigyelték a dTTP készlet csökkenését és a dUTP készlet
növekedését 30,37–40
. Más antifolát származékok, mint a raltitrexed (RTX vagy más néven
tomudex, TDX) vagy pemetrexed (PTX) a timidilát szintázzal komplexálva gátolják a
szintézist, szintén ugyanilyen hatással vannak a dTTP és dUTP készletre 23,35,38,41
. A ZD-9331
antifolát esetében a dUTP felhalmozódást is megfigyelték a sejtbeli dTTP koncentráció
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
12
csökkenése és a dUTP koncentráció növekedése mellett 22
. Folát hiányos patkányokban és
folsav megvonásos diétán élő emberek limfocitáiban is növekedett a dUTP koncentráció a
dTTP-hez képest. Csökkentett foláttartalmú médiumon növesztett sejtvonalak az 5FdU
kezelésre nagyobb mértékű dTTP készlet csökkenéssel és dUTP készlet expanzióval
reagáltak. A TS gátlását követően a dUTP készlet növekedését kimutathatóan befolyásolja a
dUTPáz expressziója is 21
. A dUTPáz túltermelés csökkent mértékű, a csendesítés
megnövekedett dUTP készlet expanziót tesz lehetővé 23,36
.
A nukleotid monofoszfát kinázok (NMPK) jellemzően a dNTP bioszintézis menekítő
útvonalában vesznek részt. A timidilát kináz (TMPK) kivételt képez ez alól, ugyanis
elengedhetetlen a dTMP foszforilációjához. A dTMP mellett a dUMP-t is elfogadja
szubsztrátjaként. A keletkező dezoxitimidin difoszfát (dTDP) és dUDP molekulákat a
nukleotid difoszfát kinázok alakítják tovább dTTP-vé és dUTP-vé 42
.
1.1.3. Menekítő útvonalak
A de novo nukleotid metabolizmus mellett a sejtek képesek lehetnek ara is, hogy külső
forrásokat használjanak fel a dNTP szintézishez. Ehhez szükség lehet a megfelelő
transzporterekre és nukleotid kinázokra. A dezoxinukleozid kinázok katalizálják a sejt által
felvett dezoxinukleozidok átalakítását dNMP molekulákká. Az emlősök négyféle
dezoxinukleotid kinázzal rendelkeznek, melyek egymás paralógjai: a timidin kináz (TK1)
timidint; a mitokondriális timidin kináz (TK2) timint és dezoxicitidint; a dezoxicitidin kináz
(dCK) dezoxicitidint, dexoxiadenint és dezoxiguanint; a mitokondriális dezoxiguanozin kináz
(dGK) dezoxiadenint és dezoxiguanint foszforilál 43
. Számos organizmus azonban nem képes
a dezoxinukleotidok ilyen széles palettájának foszforilálására. A prokarióták közül csak a
gram pozitív baktériumok között (pl. a Bacillus subtilis) találunk olyan fajokat, amelyek ilyen
sokféle kinázzal rendelkeznek. Escherichia coli-ban csak egy timidinre specifikus kináz van
jelen 44
. Az ecetmuslica szintén csak egyetlen egy dezoxinukleozid kinázzal rendelkezik, ez
azonban mind a négyféle nukleozidot képes foszforilálni 45
. Az élesztő nem rendelkezik
dezoxinukleozid kinázokkal 6. A dezoxinukleozid kinázok szerepe akkor értékelődhet fel, ha a
dNTP metabolizmus zavara folytán asszimetria lép fel. Timidin kináz túltermeltetés pre-B
limfocita sejtvonalban helyreállítja a dNTP komponensek helyes arányát MTX jelenlétében.
Ez a sejtvonal interleukin-3 függő módon növekszik, megvonását követően a dNTP készlet
komponenseinek aránya felborul, és a dCTP dominál. A timidin kináz túltermelése azonban
interleukin-3 hiányában is helyreállítja a dNTP egyensúlyt 39
. Más esetben azonban a
dezoxinukleozid kinázok egyértelműen kiegészítő szerepet játszak a dNTP szintézisben a de
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
13
novo szintézis mellett: dezoxicitidin kináz deficiens hörcsög ovárium (CHO) sejtekben
csökkent dCTP koncentráció volt kimutatható 46
. A dezoxinukleozid kinázok fontos szerepet
játszanak a kemoterápiás céllal adagolt nukleozid analógok metabolizmusában is, mint az
5FdU, vagy az antiretrovirális azidotimidin (AZT) 42
.
A menekítő útvonalak kapcsán a már bemutatott TMPK mellett meg kell említeni a
többi nukleotid monofoszfát specifikus kinázokat: az uridilát-citidilát kináz (UMP-CMPK)
széles szubsztrátspecificitással rendelkezik, dUMP, dCTP és dAMP foszforilálására képes.
Emlőssejtek 5-féle adenilát kinázzal rendelkeznek melyek közül elsősorban az AK3-as és az
AK5-ös foszforilál dAMP-t, utóbbi azonban a dCMP-t is elfogadja szubsztrátként. A guanilát
kinázok két csoportra oszthatók, az ún. nukleotid foszforiláló guanilát kinázok (NP-GUK) és
az SH3 motívumot és PDZ domént tartalmazó membrán asszociált guanilát kinázok (MA-
GUK) 42
.
A timidilát bioszintézishez járulhat hozzá a citidin dezamináz (CDA), amely a dCMP
dezaminázhoz hasonlóan az APOBEC enzimcsaládba tartozik. A CDA dezoxicitidint képes
átalakítani dezoxiuridinná, ami aztán a kinázoknak köszönhetően a dUMP vagy a dUTP
készletet gyarapíthatja 47,48
.
1.2. A nukleotid metabolizmus hatása a DNS összetételére
Az eddigiekben bemutatott dNTP bioszintézisben szerepet játszó enzimek a dNTP
készlet komponenseinek koncentrációjának meghatározásával befolyásolni képesek a DNS
szintézist. Mivel a DNS által kódolt információt a bázisok hordozzák, rendkívül fontos a
bázissorrend hibamentes reprodukálása. Ennk biztosítását a dNTP egyensúly fenntartásán túl
további tényezők is lehetővé teszik, melyeket a továbbiakban igyekszem bemutatni.
1.2.1. A dNTP arányok és a mutagenezis
A dNTP készlet komponenseinek aránya a sejtekben nem egyenlő. Szembetűnő, hogy a
legkisebb koncentrációban a dezoxiguanozin trifoszfát (dGTP) van jelen emlős sejtekben 5, S-
fázisú HeLa sejtekben 49
és S-fázisú sarjadzó élesztőben 6. A legnagyobb koncentrációban a
dezoxitimidin trifoszfát (dTTP) van jelen. Ezek az arányok ugyan nem tükrözik az egyes
nukleotidok előfordulását a genomban, feltehetően inkább a DNS polimerázok optimális
működéséhez vannak hangolva. Az arányok meghatározásánál nem vették figyelembe a
komponensek esetleges kompartmentalizációját.
A legtöbb DNS polimeráz (a terminális dezoxinukleotidil-transzferáz kivételével)
templátfüggően szintetizál DNS-t, és ehhez szüksége van egy, már a komplementer szálra
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
14
hibridizált dezoxinukleotid monofoszfát (dNMP) 3’-hidroxil csoportjára. Az aktív helyre
véletlenszerűen kötődnek be a dNTP molekulák, az egyes nukleotidok a lokális
koncentrációjuknak megfelelően. Az aktív helyre kötött dNTP DNS lánchoz történő
konjugálását megelőzően a polimeráz kétféle mechanizmussal is ellenőrzi a helyes
bázispárosodás kialakulását. Ennek ellenére az egyes dNTP komponensek lokális túlsúlyának
következtében mutagén hatású nukleotid szubsztitúció történhet. Amellett, hogy a DNS
polimerázok a DNS 5’ - 3’ irányba történő szintézisét katalizálják, rendelkeznek egy ún
proofreading 3’ - 5’ exonukleáz doménnel is, ami 35 Å távolságra van az aktív helytől. Ez a
domén képes arra, hogy a polinukleotid lánc 3’ végéről levágja az utolsó nukleotidot,
amennyiben az aktív helyről fluktuál. A fluktuáció annál gyakoribb, minél kevésbé illeszkedik
a komplementer bázishoz. Miután a DNS polimeráz beépít egy nukeotidot és továbbmozdul a
DNS-en, a következő nukleotid beépítéséig van lehetőség kivágni a hibásan beépített
nukleotidot. Tehát minél gyorsabban építi be a polimeráz a következő nukleotidot, annál
kisebb az esély a hiba kijavítására. Amennyiben a következő nukleotidnak megfelelő dNTP
nagy mennyiségben van jelen, annak beépülése gyorsabb, csökkentve ezzel a proofreading
hatékonyságát a korábban beépült nukleotidra nézve. Ezt a jelenséget „következő nukleotid
hatás”-nak (next nucleotide effect) nevezzük 50
.
A hibáspárok kialakulásán keresztül a dNTP aránytalanság rövid inszerciók vagy
deléciók megjelenésének gyakoriságát is növelheti. Ez akkor valósulhat meg, amikor a
hibáspár egyik bázisa egy közeli nukleotiddal alakít ki bázispárt, és ilyen módon egy-két
nukleotidos kihurkolódást stabilizál 51
.
A dGTP készlet nem véletlenül a legalacsonyabb a sejtekben: a dGTP sejtbeli
koncentrációjának mesterséges megemelése nagymértékben növeli a mutációs frekvenciát.
Sokkal kisebb mértékű változást okoz a dCTP vagy a dTTP készletek növelése 13
. Az E. coli
NDPK enzimének kiütése a dCTP koncentráció két nagyságrenddel történő emelkedéséhez, és
a mutációs ráta növekedéséhez vezet. Ebben a törzsben a magas dCTP koncentrációnak
megfelelően számos T:A G:C transzverzió volt megfigyelhető 52
. A törzsben számos
inszerciós-deléciós esemény is megfigyelhető volt, különösen a hibáspár javítómechanizmus
hiányában 53
. A Saccharomyces cerevisiae RNR R1 alegységében a specifitás hurok Y285A
aminosavcseréje a dCTP és dTTP sejtbeli koncentrációját egy nagyságrenddel növeli, ami
nagymértékben fokozza a mutációs rátát 6. A timidilát szintáz inhibitor 5-fluoro-dUMP a
DNS-be is beépülhet timin analógként, azonban a timidin metabolizmus gátlásával
egyidejűleg kiváltott dNTP készlet aránytalanság következtében hibáspárként is beépül az
örökítőanyagba 54
.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
15
Érdekes módon a mutációs frekvencia akkor is megnő, ha az amúgy normális arányban
jelen lévő dNTP komponensek koncentrációja magas. Ilyen körülményt idéztek elő E. coli-
ban az RNR túltermelésével, ami a dNTP készlet egy nagyságrenddel való növelése mellett a
mutációs gyakoriságot is jelentősen fokozta. Ez azzal magyarázható, hogy a magas dNTP
koncentráció gyorsabb nukleotid beépítést tesz lehetővé, és a „következő nukleotid hatás”-hoz
hasonlóan, kevesebb idő jut a proofreading számára. Ezt támasztja alá az az in vitro
megfigyelés is, hogy a fiziológiás dNTP készlet koncentrációja optimális a tökéletesen
illeszkedő, de szuboptimális a rosszul illeszkedő 3’-OH szálvég továbbírásához 49
.
A mitokondriumok külön enzimkészlettel rendelkeznek a nukleotid bioszintézishez,
amelynek a mitokondriális genomszintézishez kell igazodnia. HeLa sejtek timidin kezelése a
dTTP és dGTP készlet emelkedését és a dATP készlet csökkenését eredményezi mind a
citoplazmában, mind a mitokondriumban, utóbbiban azonban a dCTP koncentráció is
jelentősen csökken. Hosszabb távú kezelés eredményeként a mitokondriális genomban hosszú
deléciók jelennek meg. A deléciók kialakulására az lehet a magyarázat, hogy a korlátozottan
elérhető dNTP komponenseknek köszönhetően megszakadó DNS szintézis során a 3’-OH
szálvégek letekeredhetnek, és szekvenciahasonlóságot mutató egyéb DNS szakaszokra
hibridizálhatnak. Ilyen deléciók figyelhetőek meg néhány mitokondriumot érintő betegségnél
is, melyek kapcsolatba hozhatók egyes, a nukleotid metabolizmusban részt vevő, gének
mutációjával 49
.
1.2.2. Nem konvencionális nukleotidok beépülése a DNS-be
Ahogy fentebb bemutattam, a dNTP készletek aránytalansága hatással van a DNS
bázisösszetételére. A DNS-ben azonban a négyféle komponensen kívül előfordulhatnak
szokatlan bázisok is, amelyek a konvencionális bázisok metabolikus-enzimatikus útvonal
vagy valamilyen környezeti stressz által módosított származékai. Ezek a bázisok gyakran az
eredetitől eltérő kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek, ami a DNS infomációtartalmára
nézve módosulást jelenthet. A bázismódusulást okozó hatások történhetnek a DNS-en, így
azonban a sejtnek csak egy behatárolt kompartmentumára korlátozódnak. Ellenben a DNS
szintézis prekurzorai a sejt egész oszlanak el, ezért sokkal érzékenyebbek a reaktív
körülményekre. A módosult dNTP a konvencionális nukleotidokkal versenyezve beépülhet a
DNS-be.
Az egyik leggyakoribb bázismódosulás az oxidáció, melyért a sejtben megjelenő
oxidatív gyökök (Reactive Oxigen Species - ROS) felelősek. Az aerob légzés során
felhasznált oxigén 1-4%-a alakul át reaktív oxigén gyökké, de gyökök keletkezhetnek ionizáló
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
16
sugárzás, közeli UV vagy nitrogén-monoxid (NO) hatására is. A két leggyakoribb oxidált
bázis a 8-hidroxiguanin (8-OH-G), más néven 8-oxoguanin és a 2-hidroxiadenin (2-OH-A). A
8-OH-G és a guanin kétféle, syn és anti konformációt vehet fel, ennek megfelelően alakít ki
bázispárosodást: a 8-OH-G syn konformációban adeninnel, míg anti konformációban
citozinnal, a 2-OH-A pedig syn konformációjú guaninnal. Mindkét syn konformációt
tartalmazó bázispár mutagén. A különböző DNS polimerázok eltérő preferenciával építenek
be oxidált purinokat. A transzléziós DNS polimerázok (Polζ, Polη, Polκ, Polι) és az X típusú
polimerázok (Polβ, Polλ) a többi polimerázhoz képest nagy preferenciával építenek be 8-OH-
dGMP-t a DNS-be dAMP-vel szemben 55
. A citozin oxidált származékai az 5-hidroxicitozin
és az 5-hirdoxiuracil, melyek szintén beépülhetnek premutagén bázisként, előbbi adeninnel
vagy citozinnal, utóbbi citozinnal szemben 56
. Ezen kívül az 5-hidroximetiluracil
timinalalógként szintén beépülhet a DNS-be 57
. A Bacillus subtilis θe fágja 5-
hidroximetiluracil (hmU) szubsztituált genomot tart fenn, amihez egy speciális dTTP és dUTP
hidrolizáló enzim is hozzájárul 58
. Más fágokra is jellemző, hogy szokatlan bázisokat építenek
be a genomjukba: az E. coli T2, T4 és T6 fágok DNS-ében citozin helyett 5-
hidroximetilcitozin van jelen 59
.
A sejtek nukleotid készlete az oxidáción kívül alkiláló ágenseknek is ki lehet téve. A
környezeti faktorokon (pl. dohányzás, ionizáló sugárzások, aflatoxin) kívül ennek egyik
sejtbeli forrása az S-adenozilmetionin (SAM), amely metildonorként hasznosul számos
enzimatikus reakció esetén. Az alkilálódás során keletkező módosult bázisok a 3-
metiladenin, 7-metilguanin, 6-oxo-metilguanin vagy 4-oxo-metiltimin lehetnek. Utóbbi
kettőről kimutatták, hogy a HIV reverz transzkriptáz és az E. coli DNS polimeráz I képes
beépíteni DNS-be 60–62
.
A nukleotid készleten történő módosulások egy további részéért a spontán dezamináció
a felelős. A bázisok dezaminációja során az adeninből inozin, a guaninból xantin és a
citoziből uracil keletkezik. Az inozin és a xantin dezoxiinozin trifoszfát (dITP) illetve
dezoxixantozin trifoszfát (dXTP) szubsztrátként formában vehet részt a DNS szintézisében 63
.
A dUTP egyrészt a dCTP dezamináció, másrészt a dTTP metabolizmus köztitermékéből
származhat, és timin helyett épülhet be DNS-be 64
. Élesztőben kimutatták, hogy a timint
helyettesítő dUMP beépülés aktív transzkripció alatt a legnagyobb mértékű 65
. Léteznek a
genomban timin helyett uracilt felhalmozó fágok, mint a Bacillus subtilis BPS2 és a Yersinia
enterolitica θR1-37 66,67
.
Az archea replikatív polimerázok különlegesek abból a szempontból, hogy ugyan
képesek dUMP-t beépíteni a DNS-be, de az ilyen bázisokat tartalmazó DNS további
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
17
replikációjára képtelenek 68
. Ezek a DNS polimerázok ugyanis rendelkeznek egy dezaminált
bázis-kötő hellyel, mely nagy affinitással kötődik a DNS-ben található uracil bázisokhoz,
legátolva az enzim polimeráz aktivitását. DNS szintézis során az archea Pyrococcus furiosus
DNS polimeráza (a rekombináns DNS technikákhoz gyakran használt ún. Pfu DNS
polimeráz) a DNS templátban található uracil bázistól 5’ irányban, 4-6 bázis távolságra állítja
le a DNS szintézist 69
. Ennek a távolságnak a megtartásához a polimeráz proofreading
aktivitása is felelős 70
. Az archea DNS polimerázok uracil kötő helye tehát egy jól definiálható
zseb, amely a polimeráz aktív centruma előtt haladva letapogatja a templát bázisait. A zsebet
érintő V93Q mutáció megszünteti az uracillal szembeni diszkriminációt 71
(1.2. ábra). Az
uracil-felismerő zseb és az aktív hely közötti együttműködést mutathatja az, hogy ez a V93Q
mutáció a polimeráz aktivitását a felére csökkenti. Az archea DNS polimerázokat a
templátban található uracil mellett a hipoxantin bázisok is gátolják 72
.
A sejtbeli ribonukleozid trifoszfátok két nagyságrenddel nagyobb koncentrációban
vannak jelen, mint a nekik megfelelő dezoxiribonukleotid trifoszfátok 73
. Bár a DNS
polimerázok nagyfokú szelektivitással rendelkeznek a dNTP felhasználására amit az aktív
hely szerkezete is biztosít, bizonyos valószínűséggel előfordulhat ribonukleotidok beépülése
a DNS-be 74
. Az élesztő egyik replikatív polimerázának (pol ε) konzervált 645 tirozinja és 644
metioninja részt vesz az aktív helyről az NTP-t kizáró sztérikus gát létrehozásában. A 644
metionin leucinra cserélése növeli, míg glicinre cserélése csökkenti a szelektivitást, ennek
megfelelően a polimeráz kevesebb, illetve több NMP-t épít be a DNS-be. Becslések szerint a
1.2. ábra. A Pyrococcus furiosus DNS polimeráz uracil-DNS diszkriminációja
A vad típusú archea DNS polimeráz által katalizált DNS szintézis során a primer elongáció
a templátbeli uraciltól 4 bázisra elakad. Az uracil-felismerő zsebet érintő V93Q mutáció
azonban lehetővé teszi, hogy a templátbeli uracilt a polimeráz ne vegye figyelembe, így a
DNS szintézis zavartalanul folytatódik.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
18
humán sejtek replikációja során 7600 nukleotidonként 1 ribonukleotid épül be. Nagyobb
gyakorisággal épülhetnek be NMP molekulák a ribonukleotid reduktáz hidroxiureával történő
gátlása esetén, amelynek köszönhetően a dNTP/NTP koncentrációk aránya csökken. A DNS-
ben jelen lévő ribonukleotidok 2’-OH csoportjának köszönhetően a DNS érzékenyebb lehet a
hidrolízisre. Genomi ribonukleotidokat felhalmozó sejtekről kiderült, hogy nagyobb
gyakorisággal jelennek meg bennük G-A szubsztitúciók és 2-5 bázispáros deléciók.
Ribonukleotidok a templátban gátló hatással lehetnek a DNS szintézisre, amit érdekes módon
befolyásol az NTP kizárásáért felelős sztérikus gát is. Egymás közelségében több
ribonukleotid a templátban a replikációs villa leállásához vezet 75,76
.
Gyulladás során eozinofil illetve neutrofil granulociták által termelt peroxidázoknak
köszönhetően hipobrómos illetve hipoklóros savak keletkeznek. Ezek a nukleotidokkal
reagálva halogénezett bázisokat hozhatnak létre, mint pl. az 5-bromouracil vagy az 5-
klorouracil. Ismert, hogy 5FdU és 5-bromo-dezoxiuridin (BrdU) kezelés esetén 5-fluoro-
dUMP illetve 5-bromo-dUMP épül be a DNS-be 49
. Bár a halogénezett uracilszármazékoktól
adeninnel történő bázispárosodást várunk, humán sejtek 5FdU kezelése esetén az 5FU egy
része hibáspárként, guaninnal szemben épül be 54
. Fiziológiás pH-n a pirimidin gyűrűn
található fluor atom hozzájárulhat ahhoz, hogy az 5FU guaninnal létesítsen bázispárt 33
.
Azonban, mivel az 5FdU metabolit 5-fluoro-dUMP a gátolja a timidin bioszintézist felborítva
ezzel a dNTP készlet arányait, az 5-fluorouracil hibáspárban való jelenléte következhet a
replikáció hűségének csökkenéséből is 77
.
1.2.3. Nem konvencionális nukleotidok eltávolítása a dNTP készletből
Mint ahogy korábban említésre került, a sejtben szétszórtan jelen lévő nukleotid készlet
a legérzékenyebb a környezeti és egyéb reaktív hatásokra. A sejtek számára ezért rendkívül
fontos, hogy preventív módon megakadályozzák a módosult nukleotidok DNS szintézis során
történő felhasználását. Ez általában a dNTP származékok hidrolízisével valósul meg. A
módosult dNTP-k hidrolízisét katalizáló enzimek a 1.1. táblázatban láthatók.
Az oxidált dezoxinukleotidok hidrolizálásáért felelős enzimek egy konzervált
foszfohidroláz (Nudix) motívummal rendelkeznek. E. coli-ban a 8-OH-dGTP hidrolizálását
elsősorban a MutT fehérje végzi. Az Orf135 elsősorban a 2-OH-dATP-t hidrolizálja, de
kisebb mértékben képes hidrolizálni a 8-OH-dGTP-t is. Az Orf17 a 8-OH-dATP, a 8-OH-
dGTP és kisebb aktivitással a 2-OH-dATP hidrolízisét képes katalizálni. Emlősökben az
MTH1 és MTH2 hidrolizálja a 8-OH-dGTP-t, valamint a NUDT5 képes a 8-OH-dGDP
hidrolízisére. Mindegyik enzimatikus reakció esetében a termék az oxidált dNMP. Ezen
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
19
enzimek hiányában az oxidált bázisok DNS-beli felhalmozódását, és megnövekedett mutációs
rátát figyeltek meg a vizsgált organizmusokban 78,79
. MTH1 aminosavcserék esetén egérben
megnövekedett mértékű spontán tumorképződést figyeltek meg.
E. coli homológ Szupercsalád szubsztrátspecificitás
MTH1 MutT Nudix 8-OH-dGTP
MTH2 MutT Nudix 8-OH-dGTP
NUDT5 Nudix 8-OH-dGDP
ITPáz RdgB HAM1 dITP, dXTP
NUDT16 Nudix dIDP, dITP
dUTPáz dUTPáz dUTPáz dUTP, 5-fluoro-dUTP
DCTPP1 MazG 5-kloro-dCTP, 5-bromo-
dCTP, 2-kloro-dATP, 2-OH-
dATP, 5-metil-dCTP
1.1. táblázat. Módosult nukleotidokra specifikus hidrolázok
Az E. coli RdgB fehérjéjéről kimutatták, hogy a (az eukarióta Rad51-el homológ) RecA
hiányában nélkülözhetetlen a genom integritás megőrzésében. Ennek a fehérjének a
homológjait emlősökben (ITPáz) és Metanococcus jannaschii-ben is azonosították, amelyek
purinok (inozin és xantin) által alkotott nukleotid trifoszfátokra specifikus nukleotid hidroláz
aktivitást mutattak. 63,80
. E. coli-ban az RdgB kiütése megnöveli az inozin beépülési arányát a
genomba, amit jelentősen felerősít az adenoszukcinát szintetáz (purA) és IMP dehidrogenáz
(purB) gének kiütése, melyek az inozin trifoszfát (ITP) illetve a xantozin trifoszfát (XTP)
átalakítását katalizálják ATP és GTP molekulákká. Érdekes módon ezekben a törzsekben a
genom xantin tartalma nem emelkedik kimutathatóan. Saccharomyces cerevisiae-ben sem az
RdgB homológ Ham1, sem a purA homológ ADE12 kiütése nem növeli jelentősen a genom
inozin tartalmát, a kettő együttes kiütése azonban jelentős mértékű beépülést eredményez 81
.
Egérben is létrehoztak ITPáz hiányos törzset, amelyből izolált sejtvonal genomja
megemelkedett mennyiségben tartalmazott dIMP-t. Az enzim jelenléte egérben
esszenciálisnak bizonyult 82
. Ezenkívül az emlős NUDT16 kimutathatóan rendelkezik dIDP
és némi dITP nukleotid hidroláz aktivitással, mely kiegészítheti az ITPáz működését 83
.
A dUTPáz timidilát bioszintézisben betöltött szerepe mellett fontos szerepet játszik a
dNTP készlet dUTP-től való megszabadításában. A hiányában megnőtt a dUTP sejtbeli
koncentráció timint helyettesítő uracil beépülést eredményez. E. coli-ban és élesztőben is
kimutatták az uracil bázisok feldúsulását a DNS-ben dUTPáz hiányában 84,85
. A dUTPáz
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
20
feltehetően a fluoropirimidinek DNS-be történő beépülését is megakadályozza, képes ugyanis
hidrolizálni az 5-fluoro-dUTP-t 86
.
A halogénezett pirimidin trifoszfátok hidrolíziséhez hozzájárulhat még a DCTPP1 is,
mely széles szubsztrátspecificitással rendelkezik. Hatékonyan katalizálja az 5-bromo-dCTP,
5-kloro-dCTP, 2-kloro-dATP, az oxidált purin trifoszfátok közül a 2-OH-dATP, valamint az
5-metil-dCTP hidrolízisét, de gyenge aktivitást mutat a dUTP és 5-fluoro-dUTP
szubsztrátokra nézve is 15
.
1.2.4. Nem konvencionális nukleotidok eltávolítása a DNS-ből
A sejtek DNS hibajavító mechanizmusai a felelősek a nem szokványos nukleotidok
eltávolításáért. Ezek a nukleotidok vagy rendellenes bázispárosodást alakítanak ki, ami
torzulást okoz a DNS szerkezetében, vagy szerkezetileg-kémiailag más karakterrel
rendelkeznek, mint a szokványos bázisok, ami befolyásolhatja a kölcsönhatást a DNS kötő
fehérjék felszínével. Utóbbi esetben a nagy árok felől a purinok 5, 6, 7, 8-as, és a pirimidinek
4, 5, 6-os pozícióban történő módosulásai, a kis árok felől pedig csupán a purinok 2, 3, 4-es és
a pirimidinek 6-os pozícióban történő módosulásai hozzáférhetők. Az ezekben a pozíciókban
található eltérések befolyásolhatják a hibajavító enzimek dokkolását.
1.2.4.1. Direkt javítómechanizmusok
A direkt javítómechanizmusok a legkíméletesebbek a DNS integritása szempontjából.
Ezek többnyire közvetlenül a módosult bázist alakítják vissza az eredeti, konvencionális
bázissá. Erre példa a 6-oxo-metilguanin átalakítása, melyet E. coli-ban az Ada, emlősökben a
6-oxo-metilguanin transzferáz (MGMT) katalizál. A reakció során a metilcsoport az enzim
aktív helyének egy ciszteinjére kerül, amely módosulás az enzim inaktiválódásához és
ubiquitin-mediált degradálódásához vezet. Alkilált bázismódosulások eltávolítására
specializálódott továbbá az E. coli AlkB, illetve emlős homológjai, az ABH2 és ABH3. Ezek
a 1-metiladenin és 3-metilcitozin javítását végzik 87
.
1.2.4.2. Báziskivágó javítás
A báziskivágó javító mechanizmus során a módosult bázis eltávolítása történik DNS-
ből. A módosult bázisok felismerését számos fajta ún. DNS glikoziláz végzi. Ezek a DNS
hélixen gördülve kifordítják a bázisokat az aktív helyük felé, mely sztérikus preferenciával
rendelkezik az eltávolítandó bázisra nézve. A monofunkcionális DNS glikozilázok egy
katalitikus vízmolekula segítségével elhasítják az N-glikozidos kötést, egy ún. abázikus-, vagy
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
21
AP-helyet hagyva maguk után. A bifunkcionális DNS glikozilázok a katalízis során az N-
glikozidos kötés mellett DNS cukor-foszfát gerincét is elhasíthatják 3’ irányban egyes
száltörést létrehozva. A bifunkcionális DNS glikozilázok egy része emellett a hátra maradt
dezoxiribóz-foszfát (dRP) eltávolítását is katalizálja. A DNS glikozilázok listája a 1.2.
táblázatban látható.
E. coli homológ katalitikus tulajdonság szubsztrátspecificitás
MUTYH MutY monofunkciós 8-OH-G:A, 2-OH-A
OGG1 Nth bifunkciós 2-OH-G:C
NTH1 Nth bifunkciós 5-OH-C
NEIL1 Nei bifunkciós, dRP eltávolítás 8-OH-G
NEIL2 Nei bifunkciós, dRP eltávolítás 5-OH-U, 5-OH-C
MPG monofunkciós 3-metil-A, 7-metil-G,
xantin
UNG UNG monofunkciós U, 5FU
TDG MUG monofunkciós U:G, T:G
SMUG monofunkciós U, 5FU, hmU
MBD4 monofunkciós U:G, T:G, 5FU:G
1.2. táblázat. DNS glikozilázok emlősökben
A 8-OH-G felismerésére több DNS glikoziláz is specializálódott. Az adeninnel
bázispárt alkotó 8-OH-G-t az E. coli MutY illetve a humán MUTYH monofunkciós DNS
glikoziláz ismeri fel. Ez az enzim a bázispárból az adenint vágja ki, tehát elsődleges funkciója
az oxidált guaninnal szemben beépülő adenin eltávolítása. Így akár a mutációt stabilizálhatja,
amennyiben a 8-OH-G épült be hibásan az adeninnel szemben. A MUTYH a 2-OH-A bázis
eltávolítását is képes katalizálni. A MUTYH működése replikációhoz kapcsolt, kölcsönhat az
RPA és a PCNA fehérjékkel. Emlős sejtekben a DNS-be beépülő 8-OH-G eltávolításáért
túlnyomórészt az E. coli Nth homológja, az OGG1 felelős. Ez egy bifunkciós DNS
glikoziláz, mely a 8-OH-G:C bázispárból az oxidált guanint távolítja el, hiányában jelentősen
megnő a genom 8-OH-G tartalma 88
. A humán sejtek 8-OH-dGTP kezeléselése esetén
megnőtt mutációs rátát a MUTYH csendesítése csökkenti, ami magyarázható annak mutációt
stabilizáló tulajdonságával. Az OGG1 csendesítése nem változtatja érdemben a kezelt
sejtekben megfigyelhető mutációs rátát, noha annak növekedését várnánk 79
. Az E. coli Nth
másik emlős homológja az NTH1 szintén bifunkciós DNS glikoziláz, mely az 5-OH-citozint
vágja ki. Az E. coli Nei enzim emlős homológjai különböző oxidált bázisokra
specializálódtak: a NEIL1 8-OH-G, a NEIL2 5-OH-uracil és 5-OH-citozin bázisokat ismer
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
22
fel. Mindkét enzim bifunkcionális DNS glikoziláz, azaz a dRP csoport eltávolítását is
katalizálják, végeredményként egy 3’-foszfát és egy 5’-foszfát csoportot hátrahagyva. Előbbit
a polinukleotid-kináz/foszfatáz alakítja át 3’-OH véggé. Muslicában nem találhatóak meg a
Nei ezen homológjai. Az E. coli Nei paralóg MutM fehérjéje szintén bifunkcionális DNS
glikoziláz, mely főleg oxidált purinokat ismer fel 89,90
.
A monofunkcionális 3-metilpurin glikoziláz (MPG) (más néven 3-alkiladenin DNS
glikoziláz (AAG)) széles szubsztrátspecificitással rendelkezik alkilált bázisokra, többek közt
3-metiladeninre és 7-metilguaninra. Az MPG hipoxantin kivágását is képes katalizálni. Bár
szekvenciális hasonlóságot nem mutat, a bakteriális AlkA DNS glikoziláz hasonló
szubsztrátpreferenciával rendelkezik 60,91,92
.
Az uracil kivágására specializálódott DNS glikozilázok mind monofunkciósak, azaz
csak az N-glikozidos kötés elhasítását katalizálják. Az uracil-DNS glikoziláz szupercsalád
osztályai azonban némileg eltérő szubsztrátkörnyezetre specializálódtak 93
. Az 1-es családba
tartozik az E. coli-ban, élesztőben, C. elegans-ban és emlősökben megtalálható UNG. Nincs
jelen azonban teljes átalakulással fejlődő rovarokban. Az UNG képes uracilt illetve 5-
fluorouracilt kivágni egyes és kettős szálú DNS szubsztrátokból. Az uracil-specifikus DNS
glikoziláz aktivitás túlnyomó részéért ez az enzim felelős. Ellentétben a legtöbb élőlénnyel, a
Bacillus subtilis PBS2 fágja uracillal dúsított genomot tart fenn, ennek érdekében a fertőzött
sejtben Ugi fehérjét expresszál, amely az 1-es családba tartozó összes UNG enzimet képes
specifikusan gátolni 94
. Emlősökben az UNG-nak két izoformája van jelen, a mitokondriális
UNG1 és a sejtmagi UNG2. Az UNG a MUTYH enzimhez hasonlóan kölcsönhat a PCNA és
az RPA fehérjékkel, ami arra utal, hogy működése replikációhoz kapcsolt 95
. A 2-es családba
tartozó uracil-DNS glikozilázok elsősorban T:G, U:G vagy 5FU:G hibáspárra specifikusak.
Ide tartozik a bakteriális MUG és az emlős TDG, valamint a muslica Thd1 96
. Ezek
elsősorban a citozin illetve metilcitozin dezaminációval keletkező uracilt vagy timint vágják
ki. Az emlős TDG szerepe azonban elsődlegesen a DNS demetiláció: feltehetően egy
demetilációs komplexben van jelen, amelyben az aktiváció-indukált citozin dezamináz (AID)
a metilcitozint timinné alakítja, végül utóbbiból a TDG inicializált BER állítja helyre a
citozint 97
. A 3-es családba tartozó SMUG hasonló szubsztrátpreferenciával rendelkezik, mint
az UNG, beleértve az egyes és kettős szálú DNS-ben található uracil és 5-fluorouracil bázist.
Azonban további módosult bázisokat is felismer, mint a hmU 98
. Ez az enzim az emlősök
mellett muslicában is jelen van. Az uracil-DNS glikoziláz szupercsaláddal ugyan nem rokon,
de a TDG-hez hasonló aktivitással (U:G, T:G és 5FU:G), rendelkezik a monofunkcionális
MBD4 (vagy más néven MED1) 99
.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
23
A monofunkcionális DNS glikozilázok után hátra maradt abázikus helyet az AP
endonukleáz 1 (APE1) ismeri fel, mely egyes száltörést hoz létre a helytől 5’ irányban, 5’-
dRP és 3’-OH szálvégeket hátrahagyva. A nukleotid újraszintézisét a DNS polimeráz β
(Polβ) végzi, mely dRP liáz aktivitással rendelkezik, amelynek köszönhetően a dRP
eltávolításával létre hozza a transzkripcióhoz szükséges 3’-OH helyet 91,100
. A Werner
szindróma fehérje (WRN) a DNS helikázok RecQ családjába tartozik. A BER során
feltehetően a DNS kitekerését végzi, és szintén kölcsönhat a Polβ valamint az APE1
enzimekkel 100,101
. A Polβ nem rendelkezik proofreading doménnel, azonban a WRN-ről
feltételezik, hogy ezt kompenzáló tulajdonsággal bír, ugyanis rendelkezik 3’-5’ exonukleáz
aktivitással 101
. Érdekes, hogy az exonukleáz aktivitást blokkolják a DNS-ben jelen lévő
oxidált bázisok 102
illetve muslicában az uracil bázisok és az abázikus helyek 103
.
A BER útvonal kétféle módon történhet. Az ún. „short patch” vagy rövid BER során
csupán egy nukleotid vágódik ki, és a Polβ csupán az egy javításra szoruló nukleotid
beépítését végzi a DNS-be. Ezt követően a DNS ligáz III (LigIII) állítja helyre a DNS
cukorfoszfát gerincének integritását A „long patch” vagy hosszú BER akkor fordulhat elő, ha
a javítást monofunkcionális DNS glikoziláz inicializálja, és többnyire akkor indokolt, ha a
dRP csoport valamilyen okból (pl. oxidáció vagy egyéb kémiai módosulás) miatt nem
távolítható el a Polβ által. Ekkor FEN1 endonukleáz távolítja el a 3’-dRP csoportot illetve
további 2-8 nukleotidot. A DNS szintézist egy polimeráz cserét követően a DNS polimeráz β,
δ, ε vagy λ fejezi be. Utóbbi nagy hasonlóságot mutat a Polβ-vel, szintén rendelkezik dRP liáz
aktivitással. A DNS polimeráz δ és ε javításbeli szintézise a PCNA és replikációs faktor C
(RFC) jelenlétét is igényli. A Polβ nem igényel PCNA fehérjét a működéséhez, azonban
aktivitását jelentősen megnöveli. A folyamat végén a DNS ligáz I (LigI) kapcsolja össze a
DNS szálakat. Az esetek többségében a rövid útvonalú BER dominál humán sejtekben (75-
90%) 100,104
.
A BER útvonal számos a részt vevő fehérje komplexálódását igényli. Az XRCC1
állványfehérje az APE1 enzimmel hat kölcsön a Polβ és a LigIII vagy LigI mellett. A
komplexlódáshoz ugyan nélkülözhető, de jelentősen hozzájárul a poli-ADP-ribóz polimeráz 1
(PARP-1), mely egyesszáltöréseket és nick-eket ismer fel a DNS-ben, majd aktiválódik. Ez a
fehérje NAD+ szubsztrátot felhasználva kapcsol ADP-ribóz polimereket (PAR) többek közt
önmagára illetve olyan fehérjékre, melyek a kromatin szerkezet kialakításában és a DNS
metabolizmusban vesznek részt. A makromolák PAR-al történő feljelölése végül az XRCC1
toborzását segíti a száltörés helyére. A javítófehérjék komplexálódásában részt vehet még a
p53 fehérje is, melyről leírták, hogy in vitro kölcsönhat az APE1 és a Polβ enzimekkel.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
24
Továbbá a Polβ aktivitásának stimulálását írták le a Rad9/Rad1/Hus1 (9-1-1) komplex és a
hősokk fehérje 70 (HSP70) esetében 105
.
Bár nem tekinthető klasszikus BER javítóenzimnek, a DNS-be beépült ribonukleotidok
kivágását inicializáló RNázH által elindított javítási folyamat résztvevői nagy mértékben
átfednek a hosszú báziskivágó javítással. Az RNázH a DNS cukorfoszfát gerincét a ribóztól
5’ irányba elvágja, majd a lézió eltávolítása a FEN1 endonukleáz segítségével fejeződik be. A
két alegységből álló RNázH egyik alegysége a PCNA-val is kölcsönhat, ami replikációhoz
kapcsolt működést tesz lehetővé. Az RNázH hányában jelentősen megnő a genom
ribonukleotid tartalma, és a mutációs rátája 75,76
.
A hipoxantin kivágása E. coli-ban az AlkA DNS glikozilázon kívül megvalósulhat a
szigorúan vett BER-en kívüli útvonalon is. Az Endonukleáz V felismeri a DNS-ben mind a
xantin, mind a hipoxantin bázisokat, és egy bevágást ejt mellettük. A módosult bázisokat
tartalmazó rövid DNS szakasz ezután eltávolításra kerül, majd újraszintetizálódik 106
. Az
Endonukleáz V enzimnek eukarióta homológjait is azonosították, továbbá az egérből
származó enzim aktivitását is kimutatták in vitro hipoxantint tartalmazó DNS szubsztráton 107
.
Mivel a módosult bázisok felismerő enzimeinek szubsztrátspecificitása néhol átfed, a
DNS glikozilázok kiütése többnyire nem végzetes az élőlények számára. Ez alól az egyedüli
kivétel a TDG, mely a demetilációban való érintettsége miatt nélkülözhetetlen emlősökben
108. A DNS glikozilázok által inicializált folyamatok a BER többi javítóenzime
közreműködésével integrálódnak. Ennek megfelelően az integrált javítófázisokban részt vevő
enzimek (APE1, XRCC1, Polβ, FEN1) esszenciálisak egérben 87,104
. A ribonukleotidok
eltávolítása a DNS-ből szintén kiemelt jelentőségű lehet, ugyanis az RNázH kiütése egérben
embrionális letalitáshoz vezet 76
.
1.2.4.3. Hibáspár javítás
A DNS polimerázok által létrehozott hibáspárok a helytelen illeszkedés miatt torzulást
okoznak a DNS-ben. A hibáspár javítás ilyen torzulások felismerésére specializálódott, ami a
replikáció hűségének 50-1000-szeres növekedését is eredményezheti 109
. Azonban a DNS-be
épült módosult bázisok is okozhatnak olyan térszerkezeti változásokat, melyeket a hibáspár
javítómechanizmus hibaként azonosít, például a 8-OH-G esetén 110
. A TDG és az MBD4
szubsztrátjai (T:G vagy U:G) szintén célpontjai lehetnek a hibáspár javításak. Humán sejtek
5FdU kezelését követően kimutatták, hogy a hibáspár javítómechanizmus hiányában az 5-
fluorouracil bázisok nagyobb hányada alakít ki guaninnal bázispárt, mint a működő javítás
esetén 54
. Ez arra utal, hogy a hibáspár javítás az 5-fluorouracil eltávolításában is jelentékeny
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
25
szerepet játszik. Azonban az 5FU nem biztos, hogy a DNS-ben mutatott kémiai
tulajdonságainak köszönheti a hibáspár javítás általi eltávolítását tekintve, hogy az 5FdU
kezelés következtében csökkent replikációs hűség egyébként is hibáspárokat eredményez
(lásd. 1.2.2. fejezet).
A hibáspár felismerését az E. coli MutS homodimer, eukariótákban a MutS homológ
MSH2-MSH6 vagy az MSH2-MSH3 heterodimer végzi. Utóbbi 1-2 nukleotidos hibáspárnál
nagyobb léziókat ismer fel, és bár a legtöbb eukariótában elterjedt, muslicában hiányzik az
MSH3 gén. A MutS alegységek két különböző doménje aszimmetrikus módon alakítja ki az
aktív helyet, amely eukariótáknál a MutS homológ heterodimerek divergens evolúciójával
valósult meg. A hibáspár felismerését követően kötődik a komplexhez szintén homodimer E.
coli MutL, eukariótákban a MutL homológ MLH1-PMS2 heterodimer. A hibáspár helyes
nukleotidjának meghatározása szempontjából kulcsfontosságú a DNS szál diszkrimináció,
azaz a frissen szintetizálódott DNS szál meghatározása. Baktériumok esetén ez a GATC
szekvencák segítségével történik, melyek idővel metilálódnak az N6 pozícióban a sejtciklus
során. A MutH endonukleáz a frissen szintetizált, ideiglenesen hemimetilált szekvenciákat
ismeri fel, és hasít a nem metilált szálon. Eukariótákban azonban a DNS szál diszkrimináció
mechanizmusa egyelőre tisztázatlan, de a javítás itt is igényel egy, a hibáspártól 5’ vagy 3’
irányban található bevágást. 5’ bevágás esetén PCNA és RFC függő módon az MLH1-PMS2
a hibáspártól 3’ irányba ejt bevágást endonukleáz aktivitásának köszönhetően, 3’ bevágás
esetén azonban ez a komplex nélkülözhető. E. coli-ban bevágást követően a nukleotidokat a
hibáspárral együtt eltávolítja az ExoI vagy ExoX exonukleáz 3’5’ irányban, az ExoVII
vagy RecJ exonukleáz 5’3’ irányban. Eukariótákban az Exo1 mindkét irányban képes
katalizálni a nukleotidok eltávolítását. A visszamaradt egyes szálú DNS-t E. coli-ban az SSB,
eukariótákban az RPA fehérjék stabilizálják. A DNS szál újraszintézisét a replikatív E. coli
DNS polimeráz III illetve az eukarióta DNS polimeráz δ végzi. Végül az E. coli DNS ligáz
illetve az eukarióta LigI köti össze a DNS szálvégeket. A MutS, MutL komplexek illetve
eukarióta homológjaik ATPáz aktivitással rendelkeznek, ennek megfelelően az ATP kötés és
hidrolízis befolyásolja a hibáspár felismerését és processzálását. Az E. coli MutL a DNS
polimeráz III „clamp loader” alegységével, az MLH1 a PCNA-val hat kölcsön, ami
transzkripcióhoz kapcsolt javítást teszlehetővé, illetve eukariótákban hozzájárulhat a szál
diszkriminációhoz. A PCNA fehérjével az MSH2, MSH3 és MSH6 komponensek is
kölcsönhatnak.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
26
Az MSH2 és MLH1 gének mutációja gyakori a vastagbél tumorokban, és elsődleges
okozója a HPNCC (hereditary non-polyposis colorectal cancer) és egyéb rákos
megbetegedéseknek 111
.
A hibáspár javítómechanizmus versenghet más javítómechanizmusokkal ugyanazért a
DNS hibáért, amennyiben az szintén egy hibás bázispárosodást hoz létre. Nagy jelentőséggel
bír az, hogy végül melyik mechanizmusra kerül sor. A hibáspár javítás ugyanis több kilobázis
nukleotid eltávolításával jár, ami a sejt számára energetikailag rendkívül megterhelő, és a
genom integritása szempontjából is a legnagyobb veszélyt jelenti. Bizonyos esetekben
azonban kölcsönhatás is lehet a javítómechanizmusok között: a MUTYH DNS glikoziláz az
MSH6 78
, az MBD4 az MLH1 fehérjével képes kölcsönhatni 100
.
1.2.4.4. Nukleotid kivágó javítás
A nukleotid kivágó javítás (nucleotide excision repair - NER) nagyobb, DNS hélixet
torzító módosulások eltávolítására specializálódott, amit nukleotidok közötti keresztkötések és
beékelődő komplexek alakíthatnak ki. A NER-ben résztvevő gének genetikai betegségekért
felelős komplementációs csoportokba tartoznak, mint a xeroderma pigmentosum (XP) és a
Cockayne szindróma (CS). A NER esetében kétféle útvonalról beszélhetünk: a konstitutívan
aktív „global genome” azaz GG-NER-ről és a transzkripcióhoz kapcsolt (transcription-
coupled) TC-NER-ről. A két folyamat a hibák felismerésében különbözik, majd egy közös
útvonalba torkollik. Előbbi során az UV-DDB és XPC-RAD23B, utóbbi esetén az RNS
polimeráz II leállása indikálja a hibát. TC-NER során az E. coli-ban a TCRF, S. cerevisiae-
ben a Rad26, a humán sejtekben a CSA, CSB, XAB2 és HMGN1 fehérjék érzékelik a
transzkripció leállását, indukálják az RNS polimeráz disszociációját, és további NER
fehérjéket toboroznak. Ezt követően mind a GG-, mind a TC-NER azonos útvonalon zajlik le,
mely során a módosulást okozó léziónál a TFIIH széttekeri a DNS-t, és az egyes szálú DNS-
re RPA és XPA fehérjék kötnek. A leválasztott DNS szálat az XPF-ERCC1 és XPG
endonukleázok vágják ki a léziótól 5’ illetve 3’ irányban. A DNS szál újraszintézisét a
replikatív DNS polimeráz δ vagy ε végzi PCNA és RFC függő módon. Ezek mellett a DNS
polimeráz κ részvételére is vannak adatok. A szálvégek összekapcsolását végül a DNS ligáz I
vagy az XRCC1-Ligáz III komplex katalizálja. E. coli-ban a DNS torzulás felismerését az
UvrB végzi UvrA-val komplexálva. Az endonukleáz akivitásért az UvrA és UvrC felelős. A
javítás során E. coli-ban 13, míg eukariótákban 29 nukleotid eltávolítására kerül sor.
Muslicában egyelőre nem sikerült kimutatni TC-NER mechanizmust.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
27
A dNTP készletből beépülni képes hibás nukleotidok közül a 8-OH-G esetében vannak
arra utaló jelek, hogy a TC-NER CSA és CSB enzimei részt vesznek annak javításában.
Ennek ellentmond az, hogy a DNS-ben lévő 8-OH-G nem gátolja az RNS polimeráz II-t in
vitro 87,112
.
1.3. A nukleotid metabolizmus szinkronizálása a sejtciklushoz
A DNS szintézis túlnyomórészt a sejtciklus S fázisában történik, ennek az igénynek
megfelelően van szabályozva a dNTP készlet. Replikáció alatt élesztőben háromszorosára,
emlős sejtekben 20-szorosára emelkedik a sejtbeli dNTP koncentráció a G1 fázishoz képest
113. Ezt a sejtek többnyire a nukleotid bioszintézisben részt vevő genek expressziójának
transzkripciós, vagy posztranszlációs módosításával érik el.
1.3.1. Transzkripciós szabályzás
E. coli-ban az RNR expresszió a replikációval összhangban, a DNS szintézis dNTP
igényének megfelelően történik az nrdAB génről. Az rndAB promóteréhez többek közt a
DnaA, a transzkripció incicializálásában kulcsfontosságú fehérje képes kötődni, melynek ATP
kötött formája kis koncentrációban derepresszáló, nagy koncentrációban represszáló hatása
van 114
. S. cerevisiae és Schizosaccharomyces pombe élesztőkben az R1 és R2 expresszió
fluktuációjáért a transzkripció szintjén a Crt1 represszor illetve a MFB aktivátor/Nrm1
represszor faktorok felelősek.
Komplex eukariótákban a G1-S fázis átmenet során aktiválódnak a ciklin D-Cdk4/Cdk6
illletve a ciklin E-Cdk2 kinázok melyek hiperfoszforilálják a Retinoblasztóma (Rb) tumor
szupresszort. A hipofoszforilált Rb számos S-fázis specifikus fehérje expresszióját gátolja az
E2F transzkripciós faktorokkal komplexálódva, egyrészt gátolva az E2F transzaktiváló
hatását, másrészt E2F-el és hiszton deacetilázokkal komplexálva represszálni képes bizonyos
géneket. Az Rb ciklin D illetve ciklin E-függő defoszforilálása az E2F által szabályozott
gének aktivációjához vagy derepresszálódásához vezet. Bizonyos vírus onkoproteinek
(adenovírus E1A, papilloma E7, polioma large T antigen, herpeszvírus ciklin-D szerű fehérje)
szintén képesek az Rb gátlásán keresztül aktiválni az E2F transzkripciós faktorokat, ezzel
osztódásra kényszerítve és onkogén transzformáció felé elbillentve sejteket 115
. Az E2F1 által
regulált gének közé tartozik a DNS polimeráz α, PCNA és a pre-replikációs komplex fehérjéi,
mint az Orc6, de számos dezoxinukleotid bioszintézisben szerepet játszó gén is 116
. Az
onkogén illetve virális stimulusra történő E2F aktiválásával kényszerített sejtosztódással a
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
28
nukleotid bioszintézis nem tud lépést tartani, ehhez szükség van a c-Myc fehérjére is, mely az
E2F faktorok célfehérjéin kívül egyéb szintézishez fontos géneket is aktivál 117
.
Egérben az RNR R1 alegységének expresszióját az YY transzkripciós faktor
szabályozza, mely S-fázis specifikus. Az R2 alegységet kódoló gén promóterét az NF-Y
képes aktiválni, de csak az ahhoz közeli E2F kötőhely derepresszióját követően. S-fázison
kívül a represszió az E2F4-Rb komplex által valósul meg 118
. Muslicában szintén az E2F
helyeken történő derepresszió teszi lehetővé az S-fázis specifikus expressziót, ahol az E2F2
disszociációja stimuláló hatású 119
. Emlősökben az E2F1 szabályozza a DHFR és a TK
expresszióját is 120
. A dUTPáz promóterében egy NFκB kötőlyely, 3 darab Sp1 és egy E2F
kötőhely található, melyek mindegyike aktiváló hatással van a promóterre. Utóbbihoz az
E2F1 asszociálódik 121
.
Az UNG promótere szintén rendelkezik aktiváló Sp1, AP-2 és derepresszálható E2F1
helyekkel, valamint egy represszálható c-Myc kötőhellyel 122,123
. Ennek megfelelően S-fázis
specifikus expressziót mutat 124
. Muslicában E2F2 szabályozza a TS és a dezoxinukleotid
kináz 119
, valamint az MSH2 gének expresszióját is 125
.
Az egér TS bidirekcionális promóterrel rendelkezik, melyről mindkét irányban
keletkeznek transzkriptumok. A promóter rendelkezik egy potenciális Ets, USF és Sp1
transzkripciós faktor kötő helyekkel, azonban az S-fázis specifikus expresszióért egy intron
felelős, mely feltehetően valamilyen poszttranszkripciós szabályzás alá kerül 126
. S-fázisban
specifikus expressziót mutattak még ki humán sejtekben a TMPK 127
és a MUTYH 128
enzimek is.
1.3.2. Poszttranszkripciós szabályzás
Az S-fázis specifikus expresszióhoz bizonyos esetekben poszttranszlációs módosítások
is hozzájárulhatnak. A G1-fázis előtt az RNR R2 alegysége ubiquitinálódik a Cdh1-APC
(anaphase promoting complex) -el való kölcsönhatásának következtében, majd proteolitikusan
degradálódik. Ehhez a folyamathoz az R2 alegységen található KEN-box kulcsfontosságú
113,118. A TK1 szintén rendelkezik ilyen KEN-box-al, és degradálódik a Cdh1-APC által. A
TMPK expresszió Cdc20 vagy Cdh1-APC mediált proteolízis következtében csökken a késői
M-fázisban. E két fehérje proteolitikus szabályzásának hiányában a dTTP készlet
koncentrációja nagymértékben megnő, ami a fiziológiás dGTP arányokat is felborítja 129
.
Az S-fázis specifikus szabályzás egy másik szintje a metabolikus enzimek
nukleocitoplazmás transzportján alapul. Az RNR kis alegysége a sejtmagba transzportálódik,
S. cerevisiae esetében a Dif1, S. pombe esetén az Spd1 fehérjéknek köszönhetően, korlátozva
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
29
ezzel az RNR komplex összeszerelődését a citoplazmában, ahol az R1 alegység dúsul. S-
fázisban azonban a Dif1 fehérje koncentrációja alacsony, így az RNR kis alegység újra
megjelenhet a citoplazmában. Az Spd1 egyúttal az RNR aktivitását és összeszerelődését is
gátolja a S. cerevisiae Sml1 fehérjéhez hasonlóan 113
. A ribonukleotid redukcióval ellentétben
a timidin metabolizmus enzimeinek működése többnyire a sejtmaghoz kötött, mint például a
S. cerevisiae TS esetében, mely a nukleáris perifériára lokalizálódik 130
. Humán sejtekben
szintén a nukleáris laminához asszociálódik az SHMT, DHFR és a TS S-fázis és a G2/M
átmenet alatt 31
. Többsejtű eukariótákban a dUTPáz többnyire sejtmagi lokalizációt mutat.
Kollégám, Muha Villő kimutatta, hogy muslica embrióban a sejtciklus során mind a nukleáris
lokalizációs szignállal (NLS) rendelkező illetve nem rendelkező izoforma fluktuál a nukleáris
és citoplazmás kompartmentek között. Azonban csak az előbbi halmozódik fel a sejtmagban
az S-fázis alatt 131
.
1.3.3. A dNTP koncentráció fluktuációjának jelentősége
Értelemszerű, hogy az S-fázisra jellemző magas dNTP készlet a replikációs
mechanimzus igényeit elégíti ki, azonban nem világos, hogy miért van szükség az S-fázis
előtti csökkenésre. S. cerevisiae-ben a dATP visszacsatolás mechanizmusában hibás RNR
túltermelése, mely folyamatosan magas dNTP koncentrációt tart fenn, a sejtciklus
késlekedését eredményezi 132
. A humán sejtekben a TK1 és TMPK G1 fázis előtti
degradációjának gátlása, mely dTTP túlsúlyt okoz, szintén gátló hatással van a sejtpopuláció
növekedésére 129
. S. cerevisiae esetében a sejtciklus gátlás nem függ össze a dNTP készlet
aránytalanságával. A vad típusú promóterrel meghajtott, azaz S-fázis specifikus regulációnak
alávetett, azonban allosztérikus helyeken elrontott RNR mutagén hatású a felborított arányok
miatt, de ha a dNTP komponensek egyike sem esik a vad típusú sejtekben mérhető
koncentráció alá, nem okoz késlekedést a sejtciklusban 6. Elképzelhető, hogy a dNTP
koncentrációjának fluktuációja a replikáció pontos időzítéséhez szükséges. Azonban nem
tisztázott, hogy a replikáció előtt milyen módon érzékeli a sejt a nem megfelelő dNTP
koncentrációkat.
A replikáció inicializálása előtt a sejteknek szükségük van egy csúcsra a dNTP
koncentrációban, aminek a megjelenése gátolható az RNR gátló hidroxiurea segítségével S.
cerevisiae-ben. A dNTP csúcs elmaradása gátolja a G1/S átmenetet, azonban a preiniciációs
komplex összeszerelődésére nincs hatással. A replikáció elongációjának megindulása, azaz a
„firing”, tehát különösen magas dNTP koncentrációt igényel 133
.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
30
1.4. A nukleotid metabolizmus hatása a genom integritására
A nukleotid metabolizmus zavara esetén beépült bázismódosulások amellett, hogy
mutagének lehetnek, a genom integritására is veszélyt jelenthetnek. Ez megvalósulhat
egyfelől a replikáció elakadása, másfelől éppen a módosult bázisokat eltávolítani hivatott
javítómechanizmusok által, melyek a közvetlen javítómechanizmusoktól eltekintve mindig
egyes száltörések átmeneti megjelenésével járnak. A sejtek sorsa szempontjából nagy
jelentőségű, hogy a beépült módosult bázisokat az átfedő szubsztrátspecificitással rendelkező
javítómechanizmusok közül melyik távolítja el. A felsorolt javítómechanizmusok közül a
hibáspár javítás energiaigénye a legnagyobb, de a genom integritása szempontjából is a
legkockázatosabb a sejt számára. A javítás köztitermékeként kialakuló több kilobázis hosszú
egyes szálú szakaszok nagyobb mértékben vannak kitéve további károsodásnak, ami akár
DNS kettősszáltörések gyakoribb megjelenéséhez is vezethet. A genom integritásának
csökkenése drasztikus hatással lehet a sejtek életciklusára. A DNS fragmentáció vezethet a
sejtek szeneszcenciájához a telomérák rövidülését okozva, vagy a mitokondriális genom
károsodásának következtében a mitokondriumok számának csökkenésével. A nukleáris
genom károsodása okozója lehet karcinogén elváltozásoknak, de bizonyos sejtválaszoknak
köszönhetően a sejtciklus leállását vagy sejthalált is kiválthat.
1.4.1. A DNS épségének preventív védelme
A módosult bázisok nukleotid trifoszfát metabolitjait hidrolizálni képes enzimek a
javítás szempontjából preventív hatásúak, funkciójuk ugyanis megelőzi a
javítómechanizmusok szubsztrátjainak megjelenését a DNS-ben. A preventív nukleotid
hidrolázok és a DNS javítás egyensúlyának vizsgálatára a legegyszerűbb modellek
létrehozására az E. coli-ban került sor. E. coli-ban a MutT hiányából nem következik a genom
fragmentálódása még a RecA elmutálásával együtt sem 134
. A prokarióta sejtekben a 8-OH-
dGTP kialakulása tehát nem olyan jelentős, hogy a DNS szintézis során beépülve
veszélyezteti a genom épségét. Feltehetően egy további külső oxidatív hatás is szükséges
ahhoz, hogy a DNS oxidált bázistartalma olyan mértékű legyen, aminek javítása a genom
fragmentálódásához vezet. Az RdgB azonban, amennyiben nincs jelen működőképes RecA,
valóban a genom szétdarabolódását okozza. A száltörések megjelenéséért ebben az esetben a
xantin és hipoxantin kivágását katalizáló Endonukleáz V felelős 63
. A humán NUDT16
csendesítése HeLa sejtekben szintén a genom fragmentálódásához vezet 83
.
A dUTPáz az eddig vizsgált organizmusokban esszenciálisnak bizonyult. Eddig E. coli-
ban 135
, élesztőben 136
, Caenorhabditis elegans-ban 137,138
, Trypanosoma brucei-ben 139
és
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
31
Arabidopsis thaliana-ban 140
karakterizálták a dUTPáz deficiencia következményeit. Ezek
többségében igazolták, hogy a dUTPáz hiánya a genom fragmentálódásával jár együtt. Az E.
coli dUTPáz teljes génjének kiütése nem komplementálható más gének kiütésével 141
. Egyéb
dUTPázt gént érintő mutációk a genom fragmentálódásához vezetnek, amit az UNG
kiütésével komplementálni lehet 135,142
. Emellett a S. cerevisiae és C. elegans UNG
homológjai szintén képesek részben komplementálni a dUTPázt érintő letális mutációt illetve
csendesítést 85,136,137
. Tehát a dezaminált purin és pirimidin bázisok dezoxinukleotid trifoszfát
származékai a többi dNTP komponenshez képest jelentős arányban keletkeznek, ami a
megfelelő nukleotid hidrolázok hiányában a genom integritását veszélyeztetik a funkcionális
DNS javítómechanizmusoknak köszönhetően. A Bacillus subtilis PBS2 fág, mely uracil
szubsztituált genomot tart fenn, a baktériumban ismeretlen mechanizmussal gátolja a dUTPáz
aktivitását, és az Ugi fehérje termelésével az UNG működését a genom fragmentálódásának
elkerülése érdekében 94
.
Az, hogy a dUTPáz rezisztenciát biztosít az 5FU és 5FdU toxicitással szemben, arra
utal, hogy a fluoropirimidinek beépülését is megakadályozza a DNS-be 21,86,140,143–146
. Ez
felveti annak a kérdését, hogy a fluorouracil milyen módon okoz genotoxicitást. A dUTPáz
ugyanis az 5-fluoro-dUTP hidrolízisével az 5-fluoro-dUMP keletkezését katalizálja, ami a
timidilát szintáz inhibitora. Ez alapján a rezisztencia mechanizmusa nem a timidilát
bioszintézis gátlásának mérséklésén alapul. A dUTPáz túltermelés egyéb, más mechanizmusú
TS gátlószerek toxicitását is mérsékelni képes 22,40,139,147
.
Érdekes módon a dUTPáz egyéb genotoxikus hatások ellen is védelmet nyújt, melyek
nem hozhatók szoros kapcsolatba az aktivitásával: a dUTPáz túltermelése élesztőben
rezisztenciát biztosít a hidrogén-preoxid és a kadmium toxicitással szemben. A hidrogén
peroxiddal szemben mutatott védő hatás humán sejtekben is kimutatható 148
. Az e
megfigyelések mögött álló mechanizmus egyelőre nem ismert.
1.4.2. A genom integritását veszélyeztető nukleotid metabolitok
A dNTP metabolizmus enzimeinek gátlása nem szokványos bázisok nukleotid trifoszfát
származékainak megjelenéséhez és a dNTP készlet kényes arányainak felborulásához
vezethet. Sok esetben maga a gátló molekula is beépülhet a DNS-be, mint például az 5-fluoro-
dUMP esetén. Sejtek 5FdU vagy antifolát kezelése a timidilát szintáz gátlás következtében a
dNTP készlet komponenseinek felborulását eredményezi. A dTTP koncentráció
csökkenésével párhuzamosan azonban dUTP is beépülhet a DNS-be.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
32
Az E. coli-ban történő Ugi expresszió, mely az UNG specifikus inhibitora, némi
rezisztenciát biztosít az 5FdU-val szemben 149
. S. cerevisiae-ben egy timidilát szintázt érintő
mutáció uracil felhalmozódáshoz vezet a magi és a mitokondriális genomban, egyúttal
növekedési defektust eredményez, azonban utóbbi fenotípus menekíthető az UNG kiütésével
150. Ugyanebben az organizmusban az 5FU és az antifolát aminopterin toxicitást is mérsékli az
UNG funkció elvesztése. 5FU kezelés esetén menekítő hatásúnak bizonyult a FEN1
endonukleáz kiütése is, azonban AP endonukleázok kiütése érzékenyítette a sejteket 40,151
.
Továbbá, a C. elegans UNG csendesítése is menekítő hatásúnak bizonyult az 5FU kezelésre
152.
Érdekes módon, az emlős és csirke sejtekben az UNG szerepe eltérő az előbbiekhez
képest: a timidilát szintáz 5FdU-val vagy antifoláttal történő gátlását nem menekíti az UNG
kiütése vagy gátlása 35,153–156
. Elmondható, hogy emlős sejtekben 5FdU kezelés esetén a DNS-
be beépülő uracil és 5FU kivágását elsősorban az UNG katalizálja, azonban ez a katalízis nem
veszélyezteti a genom integritását. Mégis elegendő ahhoz, hogy a drogkezelt sejtek
genomjában ne legyen kimutatható az uracil, és 5FdU hatására csak UNG deficiens sejtek
genomjában tud felhalmozódni az uracil. Feltehetően sejttípustól függő, illetve törzsek közti
egyedi különbséggel magyarázható az az egyedi megfigyelés amely során az UNG
csendesítése menekítő hatással volt HeLa sejtek 5FdUR kezelésére 124
. A többi uracil-DNS
glikoziláz szerepe az eddigieknél is összetettebb lehet: egér embrionális fibroblaszt sejtekben
a SMUG némi védettséget nyújt 5FdU ellen 154
, a TDG pedig érzékenyít 157
. Az MBD4
kiütése egérben csökkenti az apoptotizáló sejtek számát 5FU kezelést követően 158
. Azonban a
SMUG, TDG és MBD4 kiütésének hatása nem volt kimutatható humán sejtvonalakban sem
5FU, sem 5FdU kezelés esetén, elképzelhető tehát, hogy ezek a jelenségek egér specifikusak
156. Hörcsög ovárium eredetű CHO sejtvonalakban az APE1 katalitikusan inaktív formájának
túltermelése érzékenyít 5FU és 5FdU kezeléssel szemben 159
. A metoxiamin (MX) az AP-
helyekkel reagálva gátolja azok további processzálását az APE1 által. Azonban az MX
kezelés hatása az FdU érzékenységre ellentmondásos: Liu és társai azt tapasztalták, hogy
HeLa sejtek érzékenyebbek lesznek, míg Pettersen és társai szintén HeLa sejtekben ennek
ellenkezőjét, rezisztencia növekedést írtak le 156,160
, Az inaktív APE1 domináns negatív hatása
a CHO sejtvonal 5FdU érzékenységére inkább az előbbi megfigyelést támasztja alá. Szintén
ellentmondásos Pettersen és társai megfigyelése Geng és társai megfigyelésével szemben:
Pettersenék a PARP gátlást menekítő hatásúnak találták az 5FdU toxicitással szemben, míg
Geng éppen ellenkező, érzékenyítő hatást figyelt meg 161
. Hozzá kell tenni, hogy Pettersenék
meglehetősen szokatlan dózishatást írtak le ebben az esetben: az FdU kezelés ugyanis
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
33
alacsonyabb koncentrációknál nagyobb mértékű toxicitást okozott, mint magasabb
koncentrációknál. Ilyen karakterisztikát Geng és társai nem tapasztaltak. Geng és társai
emellett az XRCC1 és az APE1 csendesítését is érzékenyítő hatásúnak találták az 5FdU
toxicitásra nézve, de az 5FU toxicitásra nem. Ennek az lehet az oka, hogy az 5FU és az 5FdU
kezelés eltérő módon lehet toxikus. Mindkét molekula a sejtbe bejutva és metabolizálva
elsősorban az RNS-be épül be, azonban az 5FdU egy része képes a DNS-be is beépülni 156
.
Tehát az 5FU toxicitás elsősorban nem genotoxikus. Ebből a szempontból tehát Pettersen és
Geng eredményei is megegyeznek: egyik DNS javításban részt vevő komponens hiánya sem
változtatja meg az 5FU toxicitást mértékét. Azok a megfigyelések, melyek szerint a BER
komponenseinek kiütése az előbbiekel szemben befolyásolják az 5FU reziszteciát
magyarázhatóak azzal, hogy különböző sejttípusok máshogy metabolizálják az 5FU-t. A
dUTPáz 5FU citotoxicitással szemben mutatott védő hatása az érintett sejtekben az 5FU
genotoxicitásra utal.
A DNS polimeráz β kiütése menekítő hatásúnak bizonyult egér embronális fibroblaszt
sejtek RTX toxicitására nézve 162
. Mivel a hosszú BER nem feltétlenül igényli a DNS
polimeráz β jelenlétét, elképzelhető, hogy a polimeráz β hiányában mutatott rezisztencia a
rövid BER elmaradásának köszönhető, azaz a rövid BER általi javításnak súlyosabbak a
következményei 163
.
A hibáspárpár javítás MSH2 és MLH1 enzimei kulcsfontosságúak lehetnek a timidilát
szintáz esetén tapasztalható toxicitáshoz, kiütésük nagymértékben növeli a rezisztenciát 5FdU
és RTX-re nézve 54,160,161
. A vastagbélrákos elváltozások 10-15%-ára jellemző a hibáspár
javító enzimeket kódoló kromoszómarészének elvesztése vagy epigenetikus csendesítése, ami
ezeknek a sejteknek rezisztenciát biztosít kemoterápiás kezelésekre. Pettersen és társai
azonban a többi megfigyeléssel ellentétben nem tapasztaltak menekítő hatást az MSH2
kiütését követően az 5FdU toxicitásra nézve 156
, ami lehet annak a következménye, hogy
különböző transzformált sejttípusok máshogy reagálhatnak a kezelésre. Pettersenék
kimutatták, hogy az 5FU szubsztitúciók kivágásában a BER-hez képest nem vesz részt
jelentősen a hibáspár javítás. Azonban a TS gátlás következtében felborult dNTP készlet miatt
számos más konvencionális bázis is hibáspárként épülhet be, aminek a hibáspár javítás által
történő javítása nagymértékben veszélyezteti a genom integritását. Elképzelhető, hogy a
Pettersenék által vizsgált sejtvonalak a dNTP aránytalanságból következő toxicitásra
reszisztensek valamilyen módon. Az egér MBD4 uracil-DNS glikoziláz kiütése esetén
tapasztalt 5FU rezisztencia magyarázható annak kölcsönhatásával az MLH1-el, ami
összekapcsolhatja az BER és a hibáspár javítómechanizmusokat 164
.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
34
A dezoxitimidin analóg hmU szintén toxikus emlős sejtek számára, azonban a TS
aktivitásra nincs hatással, azaz a dNTP arányokat feltehetően nem befolyásolja jelentősen.
CHO sejtek hmU kezelése során a genom fragmentációjáért a SMUG bizonyult felelősnek
165,166.
Az alkiláló ágensek (pl. metil-, metán szulfonát azaz MMS) toxicitása ellen a közvetlen
javítómechanizmusok (E. coli AlkB, illetve humán ABH2, ABH3, valamint MGMT) védő
hatással vannak, azonban ezek nem is veszélyeztetik a DNS épségét. Az alkilált bázisokra
specializált MPG DNS glikoziláz szintén protektív az alkiláló külső hatások ellen 60
. A
katalitikusan inaktív APE1 az 5FdU mellett számos alkiláló ágenssel valamint hidrogén-
peroxiddal szemben szintén érzékenyít CHO sejteket 159,167
. Tehát az AP-helyek gyors
kijavítása mind a TS gátlás, mind az alkiláló és oxiadív károsodások után is fontos a DNS
épségének megőrzése érdekében. Az XRCC1 kiütése és a PARP gátlás is érzékenyíti a
sejteket az alkiláló szerekkel szemben 105
. Nehéz azonban magyarázatot találni arra, hogy az
UNG kiütése miért érzékenyíti a sejteket a hidrogén peroxid kezeléssel szemben 168
. Érdekes
módon a DNS polimeráz β a TS gátló drogokkal ellentétben az alkiláló ágensekkel szemben
védelmet nyújt 169
. Bizonyos alkilált bázisok kijavítása az 5FU-hoz hasonlóan a hibáspár
javításnak köszönhetően válhat kritikussá, ennek hiányában a sejtek ellenállóbbá válnak a 6-
oxo-metilguanin kiváltott toxicitásra 170
.
1.5. A DNS károsodás sejtválasz
DNS károsodást kiváltó hatások folyamatosan érik a sejteket, melyeket a preventív és
DNS javító enzimek minimalizálni képesek. Kiterjedtebb károsodás azonban komplexebb,
magasabb szintű sejtválaszt igényel, a gyakori hibák ugyanis számos sejtfunkciót
megzavarhatnak. A genom drasztikus károsodása esetén szükséges lehet a sejtciklus leállítása,
a DNS szintézisben és javításban szerepet játszó fehérjék expressziójának stimulálása és
végső esetben a sejthalál aktiválása. A DNS károsodást ezekkel a folyamatokkal az ún DNS
károsodás sejtválasz (DDR - DNA damage response) kapcsolja össze. A DDR számos
komponense része az ún. integrált stresszválasznak (integrated stress response), ami pl. az
endoplazmatikus retikulum stressz alatt váltódik ki 171
. A DDR-t a DNS kettősszáltörések
vagy a DNS replikáció leállás, lassulás vagy DNS javítási köztitermékek során kialakuló
egyes szálú DNS perzisztens megjelenése képes kiváltani. Az ssDNS és DSB által kiváltott
útvonalak a DDR-en belül nagyrészt elkülönülnek, de részben átfedhetnek (1.3. ábra).
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
35
A DNS kettős száltörés (DSB - DNA double strand break) érzékelése az ún MRN
komplex (Mre11, Rad50, Nbs1) által történik, amely a sérüléshez toborozza az ATM (Ataxia
telangiectasia mutated) kinázt. Ez inaktív állapotban homodimerként van jelen, majd
aktiváció során transz-autofoszforilálódik, és aktív monomerekre disszociál. Az aktiváció
során az ATM az 1981, 367és 1893-as szerin oldalláncokon fosszorilálódik, melyek közül az
utóbbi kettő nélkülözhetetlen a teljes aktiválódáshoz. Az aktiváció során a Tip60 acetil
transzferáz is acetilálja az ATM kinázt. Az ATM a DSB-hez közve számos szubsztrátot
foszforilál, melyek a hiba közelében komplexálódnak, vagy a foszforilációt követően
disszociálnak és további sejtválaszokat aktiválnak. Ide tartozik a H2AX hiszton, az MRN
komplex Nbs1 fehérjéje, az SMC1 kohezin, a homológ rekombinációban szerepet játszó
BRCA1 és CtIP. Az ATM továbbá foszforilálja a p53 MDM2 és MDMX regulátorait
valamint a p53 fehérjét, utóbbit stabilizálva. Az ATM foszorilálja az útvonal másik fő
fehérjéjét, a Chk2-t a 68-as treonin oldalláncán. A Chk2 ezt követően autofoszforilálódik,
disszociál és további szubsztrátokat foszorilál. A Chk2 szintén foszforilálja a p53 és MDMX
fehérjéket és a BRCA1-et, de szubsztrátja az E2F1 transzkripciós faktor is.
1.3. ábra. A DNS károsodás sejtválasz (DDR) útvonalai
A DNS duplaszáltörés (DSB) által aktiválódó ATM/Chk2 (A.) és az egyes szálú DNS
(ssDNS) által aktiválódó ATR/Chk2 (B.) útvonalalak főbb komponensei és szubsztrátjai.
P: foszforiláció, Ac: acetilálódás.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
36
Az egyes szálú DNS (ssDNS) megjelenését az RPA (RPA1, RPA2 komplex) detektálja,
mely beburkolja az egyes szálú láncot. Az RPA-ssDNS komplexhez az ATR (ATM-related)
kináz az ATRIP fehérjével együtt kötődik, majd további mediátorok segítségével aktiválódik.
Ilyen mediátorok a TopBP1, melyet az 9-1-1 (Rad9, Rad1, Hus1) „clamp loader” komplex
kapcsol az ssDNS-hez. További mediátor a replikációs villához asszociált Claspin, a Timeless
és a Tipin, melyek a Chk1 kináz kötését és ATM általi foszforilációját segítik. Az ATR és
Chk1 az aktiváció során a egymást is foszforilálja, valamint a Chk1 autofoszforiláción is
átesik. A Chk1 a 317 és 345-ös szerin oldalláncokon foszforilálódik, ami a C-terminális
domén általi gátlást szünteti meg. Az aktivációt kövezően a Chk1 disszociál, és további
szubsztrátokat foszforilál. A H3 hiszton foszforilációja feltehetően a lókuszról történő
transzkripciót represszálja. Ezen kívül a Chk1 foszforilálja a Rad51 és BRCA2 homológ
rekombinációban részt vevő fehérjéket is. Az ATR illetve a Chk1 foszforilálni képes a DNS
szálak közti keresztkötések javításában és homológ rekombinációban részt vevő Fanconi
Anemia ubiquitin ligáz komplex bizonyos komponenseit (FANCA, FANCE), valamint annak
szubsztrátját (FANCD2, FANCI) 172
. A Clk2 fehérje a Chk1 stabilitásához járul hozzá 173
,
valamint az ATR kinázzal kölcsönhatva asszociálja a Fanconi Anemia komplex FANCM és
FAAP24 komponenseit is 174
. Az ATM-hez hasonlóan az ATR is képes a TopBP1 fehérjéhez
asszociálva foszforilálni a H2AX hisztont a 139-es szerin oldalláncon 175
.
Általánosságban tehát elmondható, hogy az ATM/Chk2 a DSB, az ATR/Chk1 a
replikációs késlekedés és ssDNS expozíció során aktiválódik. Azonban a két útvonal részben
átfedhet: kis valószínűséggel az ATM/Chk2 aktiválódhat az ssDNS jelenlétében. A DSB
során az újravágást követően az ATR útvonal is aktiválódik: az ATM és a BRCA1 a DSB-hez
toborozza a CtIP-t. Utóbbi stimulálni képes az Mre11 endonukleáz aktivitását, amely rövid
ssDNS szakaszokat hoz létre. Ezeket a szakaszokat BLM (Bloom syndrome protein) helikáz
és az Exo1 exonukleáz kibővíti, így az ATR is kötődni képes. A két útvonal együttműködése
ilyen módon tehát a DSB homológ rekombináció által történő javítását teszi lehetővé.
Az ATM/Chk2 útvonal bizonyos tumorokban is előfordul, az útvonalat érintő
homozigóta mutációk nem letálisak. Azonban az ATR/Chk1 útvonal létfontosságú osztódó
sejtek számára. Ez azzal magyarázható, hogy ez az útvonal az S-fázis során folyamatos,
alacsony aktivitást mutat, aminek fontos szerepe lehet a replikáció kontrollálásában 176
. A
Chk1 folyamatos jelenléte szupresszálja a Kaszpáz 2-t. A Kaszpáz 2 önmagában elegendő az
apoptózis kiváltására, ennél fogva a Chk1 hiánya sejthalálhoz vezet 177
.
Az RNR gátló hidroxiurea a korlátozott dNTP koncentrációnak köszönhetően a DNS
replikációt gátolja vagy lassítja. Ennek megfelelően az ATR/Chk1 útvonal aktiválódását
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
37
figyelték meg humán és C. elegans sejtekben 178,179
. Utóbbi organizmusban az útvonal
aktivációja érdekes módon a WRN helikáztól is függ. További érdekesség, hogy a MUTYH
DNS glikoziláz csendesítése esetén az útvonal aktiválása mérsékeltebb 180
. Az onkogén
aktivált sejtosztódás során, amennyiben a dNTP szintézis nem elégséges a replikációhoz,
szintén megfigyelhető a H2AX hiszton forszorilációja 117
.
C. elegansban a dUTPáz hiány okozta letalitást a Chk1 és a Clk2 csendesítése képes
részben kompenzálni, ami az ATR/Chk1 útvonalra utal 137
. Arabidopsis thaliana-ban a
dUTPáz csendesítése a Rad51 expresszió emelkedéséhez és a homológ rekombináció
gyakoriságának növekedéséhez vezet, ami szintén lehet az uracil szubsztituált genom
hiperaktív javításának köszönhetően aktivált DDR következménye 140
.
A TS inhibitorok ATR/Chk1 útvonal aktiváló hatását számos sejtvonalon
karakterizálták. Mivel a dUTPáz és a TS egymással összekapcsolható funkciókkal bír érdekes,
hogy míg a Chk1 hiánya dUTPáz hiány okozta letalitást menekítette C. elegans-ban, humán
és csirke sejtvonalakban a Chk1 kiütése vagy csendesítése érzékenyít az 5FU toxicitással
szemben 181,182
. A Chk1 részletes kiütése a hibáspár javítás hiányában is érzékenyítő hatású
183. Az 5FU már említett sejttípustól függő genotoxikus hatásának lehet köszönhető, hogy
vastagbélrák sejtvonalakban az ATR az előbbiekkel szemben csak az 5FdU toxicitást
mérsékli, míg az 5FU toxicitást nem 161
. A hibáspár javítómechanizmus szükséges a FdU
kezelés indukált Chk1 foszforilációhoz 160
. Mind az 5FdU, mind az RTX antifolát kezelés a
H2AX hiszton foszforilációját váltja ki humán sejtekben 155
. Az RTX az ATR/Chk1 útvonalat
aktiválja, mely során Rad51 expresszió is stimulálódik. A Rad51 védő hatással bír az RTX
toxicitással szemben 184
. Elképzelhető tehát, hogy az timidin bioszintézis gátlás genotoxikus
következményeit a homológ rekombináció mérsékli.
Az alkiláló környezeti hatások szintén az ATR/Chk1 útvonal aktiválódását okozzák.
Ecetmuslicában alkiláló ágensek hatására megfigyelték a Chk1 foszforilációját és a p53
stabilizálódását 185
. Humán sejtekben kimutatták, hogy az alkiláló drogok hatására a hibáspár
javítás komponensei fizikai interakcióba lépnek az ATR/Chk1 útvonal fontos komponenseivel
186. Az oxidatív stressz is képes DDR sejtválaszt kiváltani: magas oxigén koncentráció és
hidrogén peroxid kezelés mind az ATM/Chk2, mind az ATR/Chk1 útvonalat képes aktiválni
187.
1.5.1. A DNS károsodás aktivált sejtciklus leállás
A DNS károsodás érzékelését követően szükséges a replikáció leállítása, hogy a sejt
időt hagyjon a hibák kijavítására. Mind az ATM/Chk2, mind az ATR/Chk1 útvonal képes
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
38
leállítani a sejtciklust különböző fázisokban. Az ATM/Chk2 útvonal aktiválta p53 a p21
fehérje indukciója által a G1 stádiumban tudja leállítani a sejtciklust. A p21 a ciklin függő
kináz (Cdk) - ciklin komplexekhez kötve gátolja azok aktivitását. Az ATR/Chk1 útvonal nem
képes a G1 fázis stop-ot indukálni annak ellenére, hogy ebben az útvonalban is leírták a p53
aktivációját 176
. Az ATM/Chk2 útvonal aktivációjára utal, hogy 5FU kezeléssel sikeresen
kiváltottak p53 függő G1 fázis leállást emlőrák sejtvonalban 188
. Antifolát kezelés hatására is
megfigyelték sejtek G1 fázisban történő felsúsulát 189
.
Az S fázis alatt azonban mindkét útvonal képes blokkolni a sejtciklust. Az ATM az
Nbs1 foszforilálásával járul hozzá ehhez, továbbá a sejtciklus leállásához szükséges a
FANCD2 ATM általi foszforilációja is 172
. A Cdc25A foszfatázt mind a Chk2, mind a Chk1
képes foszforilálni. A Cdc25A a foszforiált formában inaktív Cdk2-t defoszforilálja, így
utóbbi asszociálni képes a ciklin E és A fehérjékkel. A foszforilált Cdc25A azonban a
degradálódik, így nem tudja aktiválni a Cdk2-t. Az ATR/Chk1 még ismeretlen
mechanizmusok által képes az S-fázisban lelassítani a replikációs villa mozgását és
megakadályozni az inicializált replikációs origókról induló elongációt („firing”). A redukált
dNTP készlettel rendelkező RNR mutáns S. cerevisiae osztódása az S-fázisban leáll, azonban
ez a blokk feloldható a Chk1 funkcionális homológ Rad53 kiütésével 6. A hidroxiurea
elsősorban S-fázis blokkolóként ismert, mely Chk1 foszforilációt vált ki 190,191
. A TS
csendesítése egér sejtvonalban szintén a sejtciklus leállást eredményezi az S-fázis-ban 192
. A
TS 5FU és antifolát általi gátlása hasonló, Chk1 foszforilációtól függő S-fázis blokkot
eredményez, ami a hibáspár javítómechanizmus kiütésével vagy dTTP hozzáadásával
feloldható 181,182,184,193,194
. A NUDT16 csendesítése humán sejtekben enyhe osztódási gátlást
okoz, ami az S-fázisú sejtek felhalmozódását eredményezi 83
.
A G2 fázis leállítását szintén mindkét útvonal képes kiváltani. Mind a Chk2, mind a
Chk1 foszforilálni képes a Cdc25C foszfatázt. A Cdc25C a Cdk1 (vagy más néven CDC2)
ciklin függő kinázt aktiválja. A foszforilált Cdc25C azonban a 14-3-3 fehérjékkel asszociálva
inaktiválódik. A Chk1 emellett foszforilálja, és ezáltal aktiválja a Wee1 kinázt, ami
inaktiválni képes a Cdk2-t. Bár a Chk1 elsősorban sejtmagi fehérje, a centroszómákban is
jelen van, ahol a ciklin B/Cdk1 komplex aktivációját regulálva, kontrollálva ezzel a sejt
belépését az M-fázisba. Az M-fázisba való belépés gátlása igényli a Clk2-FANCM-FAAP24
komplexet, amely funkció független a Fanconi Anemia ubiquitin ligáz szerepétől 174
. A
hasonlóságok ellenére az ATM/Chk2 és az ATR/Chk1 útvonalak eltérő módon váltják ki a G2
leállást. Az ATM/Chk1 egy azonnali G2 blokkot, míg az ATR/Chk1 hatása hosszabban tartó
G2 felhalmozódást okoz 176
. Humán fibroblaszt sejtekben a hidroxiurea kezeléssel a G2-M
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
39
átmenetet blokkolták, amely az ATR gátlásával feloldható178
. A hidroxiurea muslica
embrióban a Wee1 kináztól függő módon képes gátolni az M-fázisra jellemző kromatin
kondenzációt 191
. Humán vastagbélrák sejtekben 5FdU hatására indukálható egy hibáspár
javítás független S-fázis lassulás és egy hibáspár javítás függő G2/M sejtciklus blokk 160
.
Alkiláló ágensek hatására humán sejtek szintén G2 fázisban fázisú feldúsulást mutatnak 195
.
1.5.2. A DNS károsodás aktivált nukleotid metabolizmus és javítás
A DNS károsodás során a hiba gyors kijavítása és az érintett szakasz újraszintézise
szükséges. Ennek érdekében a DDR gyakran indukálja a dNTP szintézis és a DNS javítás
fehérjéinek termelődését vagy relokalizációját.
A dNTP készlet koncentrációja élesztőben négyszeresére növekszik DNS károsodás
hatására az S-fázishoz képest. Ez többnyire az RNR szabályzása által valósul meg. A S.
cerevisiae ATR homológ fehérjéje (Mec1) aktiválódik DNS károsodás hatására és
foszforilálja a funkcionális Chk1 homológját (Rad53). A Rad53 stimulálja a Dun1 fehérjét
amely foszforiláció által inaktiválja a Crt1 fehérjét, amely represszálni képes az RNR géneket.
Emellett a Crt1 a represszora az FSH3 génnek is, ami feltehetően egy dihidrofolát reduktáz. A
Dun1 emellett az RNR inhibitor Sml1 degradációját is serkenti, valamint a Dif1
foszforilálásával megakadályozza az RNR kis alegységének sejtmagi transzportját. Az S.
pombe ATR homológ fehérjéje (Rad3) hasonló elven regulál. A Rad3 a Cds1 fehérjét
aktiválja, mely az RNR R1 alegység génjét represszáló Nrm1 promóterről történő
disszociációját váltja ki.
Emlős sejtekben p53 hatására sokszorosára indukálódik az R2 paralóg p53R2
expressziója, így az funkcionális RNR komplexet képes alkotni az R1 alegységgel. Ennek
ellenére a dNTP készlet koncentrációjának emelkedése nem figyelhető meg DNS károsodás
hatására 113
. Azonban az RNR a DNS károsodást követően az érintett helyeken
akkumulálódik, ezáltal feltehetően a dNTP koncentráció lokális feldúsulásához járul hozzá.
Az RNR DNS károsodás fókuszpontokhoz történő lokalizációja a Tip60 acetil transzferáz és
az R1 alegység kölcsöhatásától függ 113,196
. Ez a megoldás annak tükrében is előnyösebb lehet
a sejt számára annál, mintha a dNTP készletet az egész sejtben növelné, mert nem módosítja a
dNTP koncentrációk sejtciklustól függő koncentrációját, ami, mint ahogy korábban be lett
mutatva, a G1-S fázis átmenethez létfontosságú (lásd. 1.3.3. fejezet). A
rekomartmentalizációra egy másik példa az NDPK sejtmagba irányuló transzportja UV és
hidrogén peroxid kezelés hatására humán sejtekben 197
. A TS és DHFR aktivitásának
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
40
stimulálódását is megfigyelték röntgen besugárzást követően egérben 198
. A TS expressziója
5FU kezelés hatására is stimulálódik 199
.
A DDR hatására ATM vagy ATR függő módon stabilizálódik az E2F1, ami az általa
regulált gének átíródását is aktiválja 200
. Ez tapasztalható például humán sejtek 5FU kezelése
esetén 188
. Mivel számos dNTP metabolizmusban érintett gén promótere E2F1 által regulált
(lásd. 1.3.1. fejezet), ezek aktiválása is megtörténhet. Az E2F1 a Chk2 mellett az ATM vagy
az ATR által is foszforilálódhat, azonban a DDR hatására számos más poszttranszlációs
módosuláson is áteshet 201
. A humán dUTPáz promótere rendelkezik aktiválható E2F1
kötőhellyel, azonban érdekes módon az enzim expressziója csökkenést mutat DNS-t károsító
hatásokat követően. Ez annak köszönhető, hogy a dUTPáz promótere a p53 által
represszálható 121,202
. Azonban a p53 175-ös hisztidin oldalláncát érintő mutáció esetén
aktiváló hatás tapasztalható 144
. A humán UNG expresszió E2F1 által szabályzott, azonban
különböző sejttípusok eltérő módon reagálnak az 5FdU kezelésre: bizonyos sejttípusok az
UNG termelődés gyors növekedésével, majd repressziójával (humán fibroblaszt sejtvonalak),
mások az UNG repressziójával (HT29) reagálnak, valamint vannak olyan sejttípusok,
amelyekben nem változik a drogkezelés hatására az UNG kifejeződés (HeLa) 124
. A
különbség annak is betudható, hogy a transzformált sejtek expressziós profilja gyakran
jelentősen eltér a normálistól.
A DNS károsodás hatására az UNG transzkripciós változások mellett a lokalizáció
megváltozásával is reagálhat. A humán UNG N-terminális része a PCNA mellett az ssDNS-t
beburkoló RPA fehérjével is képes kölcsön hatni. Ennek köszönhetően hidroxiurea által
indukált DNS károsodás helyén fókuszpontokban megjelenik 95
.
1.5.3. A DNS károsodás által kiváltott sejthalál
A DNS károsodást követően aktivált DDR a sejtciklus leállításával és a DNS javítás
serkentésével a sejt túlélését segíti, azonban aktivál pro-apoptotikus útvonalakat is. Mind az
ATM/Chk2, mind az ATR/Chk1 útvonal aktiválódása esetén megfigyelhető a p53 aktivációja.
Muslicában a p53 aktiválja az apoptózis indukáló Hid, Grim és Reaper géneket, melyek az
anti-apoptotikus IAP1-et gátolják. Gyakran megfigyelték, hogy a DNS károsodás gyakran p53
függetlenül is képes sejthalált kiváltani. A p53 alternatívája ebben az esetben a p53 családba
tartozó p73 lehet, amely a p53-hoz hasonló módon képes kiváltani apoptózist. Mind a p53,
mind a p73 aktiválódhat az E2F1 transzkripciós faktornak köszönhetően, azonban eltérő
mechanizmussal. Az E2F1 aktiválni képes a p14ARF
expresszióját, amely gátolni képes az
MDM2 mediált p53 degradációt. Az E2F1 emellett a p73 promóterét is képes aktiválni. A p73
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
41
közvetlenül foszforilálódhat a Chk1 által a 47-es szerin oldalláncon. A p73 további fontos
aktivátora a c-Abl kináz, melyet az ATM képes foszforilálni, de az ATR/Chk1 útvonal is
képes stimulálni. A c-Abl a 99-es treonin oldalláncon foszforilálja a p73-at, de visszahat az
ATM/Chk2 és ATR/Chk1 útvonalakra is 203
.
A p53 és a p73 alapvetően kétféle úton képes apoptózist kiváltani. Az ún. „Extrinsic”
útvonal során a CD95 sejthalál receptor expresszióját illetve sejtfelszíni prezentációját
stimulálják, mely a CD95 ligand kötésével a DISC (death-inducing signaling complex)
komplexet alakítja ki. A DISC a FADD adaptor közvetítésével a Kaszpáz 8 és 10 iniciátor
kaszpázokat aktiválja. Az iniciátor kaszpázok a Kaszpáz 3, 6 és 7 effektor kaszpázokat
stimulálják. Az „Intrinsic” útvonal során a p53 vagy a p73 a Noxa és a PUMA fehérjék által
közvetített módon a Bax fehérje mitokondriális transzlokációját stimulálják. Ennek hatására a
mitokondriumból kiszabadul a Citokróm C, mely az Apaf1 fehérjével és a Kapszpáz 9
iniciátor kaszpázzal komplexálva apoptoszómát hoz létre. Az effektor kaszpázokat ebben az
esetben az apoptoszóma aktiválja 177,204
.
Genotoxikus stressz hatására egyéb lehetséges p53 független útvonalakat is
megfigyeltek. A stressz aktivált mitogén-aktivált kinázok közé tartozó JNK és p38 kinázok az
apoptózis intrinsic útvonalát képesek aktiválni 170,205
. A p38 emellett a p53 hiányában a
STAT1 transzkripciós faktor foszforilálásával a CD95 sejtfelszíni expresszióját is stimulálni
képes 206
. Az p38 vagy a JNK aktiválási mechanizmusa az ATM/Chk2 és ATR/Chk1
útvonalak által nem ismert, azonban az ATR/Chk1 útvonalak esetén megfigyelték 207
. Az
egyik lehetséges mechanizmus a GADD45 fehérjén keresztül képzelhető el. A GADD45 egy
p53 által aktiválható fehérje, azonban a BRCA1 is stimulálhatja 208
.
A kaszpáz 2 az egyetlen sejtmagban folyamatosan jelen lévő prokaszpáz, aktivációjával
p53 független apoptózist lehet kiváltani. Bizonyos DNS károsító hatásokra sikerült kaszpáz 2
függő sejthalált kiváltani, azonban az aktiváció mechanizmusa egyelőre ismeretlen 170
.
A TS csendesítése a p53 stabilizálásához és a Kaszpáz 3 effektor kaszpáz
aktiválódásához vezet humán sejtvonalban 192
. A TS 5FU, 5FdU és antifolát általi gátlása
estén is kimutatható a p53 stabilizálódása, ami az poptózis intrinsic és extrinsic útvonalát is
stimulálja 188,189,209
. Az 5FU többi TS gátló droghoz képest eltérő hatásmechanizmusára utal,
hogy csak az RTX és 5FdU kezelésre történő p53 és CD95 indukciót mérsékli a TS
túltermelése 193
. Az RTX-el kezelt sejtek érzékenyebbek a CD95 aktiválására, azonban 5FU
kezelés esetén ez az érzékenyítés sejttípus függő. A CD95 aktivált apoptózis érzékenyítése TS
gátlás esetén nem feltétlenül a CD95 receptor expressziójának növekedésével, hanem annak
sejtfelszíni prezentálásával valósulhat meg, ami 53 független, STAT1 függő folyamat 206,210
.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
42
A FdUR kezelés timidin hozzáadásával szupresszálható, p53 és CD95 független apoptózist is
képes kiváltani 211
. A CD95 mellett egyéb sejthalál receptorok is érzékenyíthetik a sejteket a
TS gátlására: vastagbélrák sejtek interferon gamma kezelése antifolát által kiváltott sejthalálra
érzékenyít 212
. A Chk1 csendesítése szintén érzékenyíti a sejteket az 5FU által kiváltott
apoptózisra, amely során mind az intrinsic, mind az extrinsic útvonal effektor kaszpázai
aktiválódnak, de a kaszpáz 8 aktiválódik előbb 181
.
Bár a genotoxikus stressz többnyire apoptózist vált ki, C. elegans-ban kimutatták, hogy
a dUTPáz csendesítést követően autofágiára is jellemző gének aktiválódnak. A sejthalál
dUTPáz hiányában nem függ a p53-tól, de az Apaf1 és kaszpáz aktivitás szükséges hozzá 138
.
Az alkiláló metil-metánszulfonát muslicában a p53 aktivációját váltja ki 185
. Humán
sejtekben alkiláló ágensek hatására stabilizálódik a p73 és aktiválódik a GADD45α hibáspár
javítás és c-Abl függő módon 195
.
Oxidatív stressz hatására a p53 ATM függő módon stabilizálódik, valamint ATR függő
módon foszforilálódik 187
. Szinglet oxigén és hidrogén peroxid kezelés humán sejtekben a p38
fehérje foszforilációhoz és genom apoptotikus fragmentálódásához vezet. A p38 gátlásável ez
a fragmentáció megszüntethető a szinglet oxigén kezelés esetén. Mindkét esetben az intrinsic
útvonal érintett az apoptózisban, ugyanakkor a kaszpáz 8 is szükséges a sejthalálhoz 213
.
CÉLKITŰZÉSEK
43
2. Célkitűzések
A dNTP metabolizmuson belül a timidilát bioszintézis jól elkülöníthető, mégis
esszenciális komponens. Ennél fogva, különösen a TS útvonalban betöltött megkerülhetetlen
szerepének köszönhetően nagy érdeklődésre tart számot. A TS fontos terápiás célpont,
gátlásával alapvető sejtfunkciók, a DNS replikáció, a sejtosztódás és a sejthalál
befolyásolható. A számos szerteágazó hatás szétválasztása tanulsággal szolgálhat a különböző
sejtfunkciók vizsgálatához és a genom metabolizmus mélyebb megértéséhez. A timidilát
bioszintézis elkülönült útvonalai például felvetik a timinmentes világ lehetőségét, ahol az
RNS-hez hasonlóan a DNS timin bázisai uracillal szubsztituáltak. Néhány bakteriofág szolgál
példaként arra, hogy ez lehetséges élő rendszerekben, de a genomi uracil szubsztitúció
korlátozott megjelenése összetettebb organizmusokban is érdekes lehet. A bevezetés alapján
elmondhatjuk, hogy az uracil genomi felhalmozódását elsősorban két enzim korlátozza, a
dUTPáz és az UNG. Ezek mellett egy kérdéses szereplő lehet a hibáspár javítómechanizmus,
amely gerincesekben a TS gátlással szembeni érzékenység egy fontos komponensének tűnik.
Nagy vonalakban megfogalmazható célom olyan élő rendszerek vizsgálata, melyekben a fenti
szereplők szerepe vizsgálható az uracil-szubsztituált genom fenntarthatósága szempontjából.
Az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) egy olyan teljes átalakulással fejlődő rovar,
melynek egyedfejlődési stádiumai embrionális, három lárvális, báb és felnőtt stádiumokra
osztható. A lárvális struktúrák kialakulása az embrionális stádiumban történik. A lárvák
szövetei a funkcionális differenciált, és a nem differenciált imaginális prekurzor szövetekre
osztható. A differenciált lárvális szövetek bár nem osztódnak, azonban a sejtek az
endoreplikációnak köszönhetően növekednek. Ilyen módon alakulnak ki a lárvális nyálmirigy
politén kromoszómái 214
. Ezzel szemben az imaginális szövetek (például imaginális korongok,
imaginális gyűrűk vagy a bél imaginális szigetei) folyamatos osztódásban vannak, és csak a
báb stádiumban differenciálódnak. A báb stádiumban bekövetkező metamorfózis sokat
tanulmányozott jelenség. Ebben a stádiumban a Hid, Grim és Reaper fehérjék átal irányított
módon a differenciált lárvális szövetek elhalnak.
Az ecetmuslica nem rendelkezik az UNG enzimmel, azaz az uracil felhalmozódását a
DNS-ben csupán a másik két DNS glikoziláz, a SMUG és a Thd1 korlátozhatja. Kollégám,
Békési Angéla kimutatta, hogy muslicában a dUTPáz expresszió csupán bizonyos
egyedfejlődési stádiumokra és szövetekre jellemző 215
. Az embrióban mutatható ki
legnagyobb mennyiségben a dUTPáz fehérje, aztán a lárvális stádiumok alatt drasztikusan
lecsökken. Az ezt követő báb stádiumban újra megerősödik a dUTPáz expressziója, kifejlett
CÉLKITŰZÉSEK
44
állapotban azonban csak a nőstényekben kimutatható. A lárvális stádiumok alatt a dUTPáz
csak az imaginális korongok szöveteiben kimutatható. A kifejlett állatokban az ováriumokban
expresszálódik a dUTPáz, ahol anyai hatással az dUTPáz mRNS az embrióba is eljut 215
. A
lárvális szövetek tehát heterogén módon expresszálják a dUTPázt amellett, hogy az UNG
sincs jelen. Feltételezhetjük, hogy a dUTPázt nem expresszáló differenciált lárvális szövetek
genomjában dúsul az uracil a dUTPázt expresszáló imaginális primordium szövetekéhez
képest. Az ecetmuslica lárvális szövetei ideális modellként szolgálhatnak az uracil-
szubsztituált genom funkcionális vizsgálatához. Dolgozatomban mindezek alapján az alább
megfogalmazott problémák és kérdések megoldását tűztem ki célul:
1. A vizsgálatok kiterjesztéséhez mindenekelőtt szükséges egy megbízható módszer a
genombeli uracil kvantitatív kimutatására, amivel vizsgálható a sejtek dUTPáz illetve uracil-
kivágó javítás hiányos állapota. Célul tűztem ki egy kvantitatív módszer kifejlesztését és
optimalizálását a DNS-ben található uracil bázisok kimutatására.
2. A kifejlesztett módszerrel vizsgálni kívánom a muslicában megfigyelhető dUTPáz
expressziós mintázat hatását a genom uracil tartalmára. Mivel az egyedben a dUTPáz
expresszió térben és időben is változik, különböző egyedfejlődési állapotokat és szöveteket
kívánok összehasonlítani. Ezzel összefüggésben vizsgálni szeretném, hogy a dUTPáz
csendesítésével lehetséges-e növelni az uracil bázisok előfordulási gyakoriságát a
szövetekben.
3. Azok a korábbi kísérletes adatok, amelyek azt mutatják, hogy a dUTPáz expresszió
elsősorban a muslica nem differenciált szöveteire korlátozódik összeegyeztethető azokkal az
irodalmi áttekintésben bemutatott megfigyelésekkel, hogy a dNTP metabolizmus enzmei a
sejtciklus S-fázisában termelődnek. Ezért gyakran a transzkripciót reguláló Rb-E2F rendszer
felelős, mint ahogy a humán dUTPáz esetén is (lásd. 1.3.1. fejezet). Vizsgálni kívánom az
ecetmuslica dUTPáz expressziós mintázatáért felelős transzkripciós regulációs mechanizmust,
vizsgálataimat minél több szövetre igyekszem kiterjeszteni.
A dNTP metabolizmus sejtciklus-függő szabályozásának a célja, mint ahogy az
irodalmi áttekintésben is bemutattam, feltehetően a dNTP koncentráció fluktuációjának
kialakítása, ami a replikáció helyes inicializálását szabályozza (lásd. 1.3.3. fejezet). Ehhez a
folyamathoz nem tisztázott a dUTPáz hozzájárulása. Nem tisztázott azt sem, hogy muslicában
miért lehet megkülönböztetett a dUTP DNS-ből való kizárása szempontjából a differenciált és
CÉLKITŰZÉSEK
45
az osztódó szövet különösen arra való tekintettel, hogy ebben az organizmusban nincs jelen
jól karakterizált uracil-DNS intoleranciát kiváltó mechanizmus. A muslicában megfigyelt
dUTPáz expressziós mintázat egyedfejlődésben betöltött szerepének vizsgálata a gén
csendesítésével vagy kiütésével, illetve a fehérje differenciált szövetekre is kiterjedő
túltermelésével valósítható meg. Kollégáim, Muha Villő és Békési Angéla kimutatták, hogy
az ecetmuslica dUTPáz csendesítése végzetes következményekkel jár a lárvális stádiumok
végén. Hogy ezt a megfigyelést kiegészíthessük, célul tűztem ki olyan állatok
karakterizálását, melyekben a dUTPáz termelődését differenciált szövetekben stimulálom.
4. A dUTPáz expresszió genom integritását védő hatását eddig E. coli, S. cerevisiae,
Trypanosoma brucei, C. elegans és Arabidopsis thaliana organizmusokban vizsgálták.
Utóbbiban és humán sejtekben csupán a TS gátlás viszonylatában sikerült kimutatni a
dUTPáz jelentőségét. Az RNS interferencia segítségével lehetőségünk nyílt muslicában is
tanulmányozni a dUTPáz genom épségét védő hatását. Muha Villő és Békési Angéla
megfigyelése alapján a dUTPáz minden szövetre kiterjedő csendesítése az egyedfejlődés
leállását és letalitást eredményez a késői lárva és a korai báb állapotban. Ez azt jelenti, hogy
bár a dUTPáz hiánya tolerálható a differenciált lárvális szövetekben, a metamorfózison áteső
szövetek számára nélkülözhetetlen. Kérdés, hogy milyen módon eredményezi a dUTPáz
hiánya a fejlődési defektust, és hogy van-e hozzá köze genom integritás csökkenésének a
DNS esetlegesen feldúsult uraciltartalmának köszönhetően. Fel szeretném tehát deríteni a
letalitásért felelős molekuláris mechanizmust.
Az a megfigyelés, hogy a dUTPáz expresszió védelmet nyújt a TS gátló drogokkal
szemben, arra utalhat, hogy a DNS-be épült uracil vagy 5FU okozza a toxicitást. A hibáspár
javítás humán és csirke sejtek érzékenységhez való hozzájárulása (lásd. 1.4.2. fejezet) arra
utal, hogy ezek a bázisok hibáspárként jelennek meg a DNS-ben. A hibáspárokat a dTTP
hiány miatt aszimmetrikus dNTP készlet jelenlétében hozhatják létre a DNS polimerázok,
azonban ilyen körülmények bármilyen bázis hibás beépülését is katalizálhatják. A kérdés
tehát az, hogy a beépült módosult bázisok, vagy a dNTP aránytalanság okozza a TS gátlás
esetén megfigyelhető toxicitást. Előbbi kapcsán a dUTPáz szerepe értelmezhető, de az utóbbi
esetén nem. Ugyanis a TS gátlása céljából gyakran alkalmazott 5FdU kezelés során a
nukleotid metabolizmus során keletkező 5-fluoro-dUTP-t a dUTPáz éppen a TS gátló
molekulává alakítja (lásd. 1.2.3. és 1.4.1. fejezetek). A kérdés megválaszolásához a dUTP
koncentrációt kívánom megnövelni emlős sejtekben a dUTPáz enzimfunkció kiiktatásával
vagy a sejtek nukleozidos kezelésével, és vizsgálni kívánom azt, hogy mindez mindez miként
CÉLKITŰZÉSEK
46
befolyásolja a TS gátlószerek toxicitását. Kísérleteimtől azt várom, hogy a dUTP
koncentráció növelésével kompenzált dNTP hiány hatását a hibáspároktól függetlenül és a
DNS-be épült módusult bázisok tulajdonságaitól függően tudom vizsgálni.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
47
3. Anyagok és módszerek
3.1. Nukleinsav izolálás és a plazmidok létrehozása
Név Szekvencia Specificitás
pBS-Fw ATAGGGCGAATTGGGTACCG pBlueScript SK+
pBS-Rev AAAGGGAACAAAAGCTGGAGC pBlueScript SK+
d1Fw CGTGCAGAAGATCTTGCGGATTCAGC
Drosophila
melanogaster 2L
kromoszóma;
GeneID:
34528,34529
d2Fw GGGGTACCCGTGCTAAATAGAGGTGTGTTAATCAAC
TAC
d3Fw GGGGTACCGTTGCTTATCAGGGTTGGTTGTGATTGG
d1aRev GGATCCGCAGAATTCTGGTCTGAAAATAACGCGG
d1bRev CGGGATCCGCAGAATTCTGGTCTGAAAATAACGCGG
d2Rev CGGGATCCCTACCAAAAAATCTTAAGTCAGCTTTGC
d3Rev CGGGATCCAATTGGCGGACTTCCAGTGTTGC
DRE1Fw CAACTACAATAGGCTCGATATATCGATAGGGTTGCT
TATC
DRE1Rev GATAAGCAACCCTATCGATATATCGAGCCTATTGTA
GTTG
DRE2Fw CAACTACAATAGTATCGATAGCTCGATAGGGTTGCT
TATC
DRE2Rev GATAAGCAACCCTATCGAGCTATCGATACTATTGTA
GTTG
DRE12Fw CAACTACAATAGGCTCGATAGCTCGATAGGGTTGCT
TATC
DRE12Rev GATAAGCAACCCTATCGAGCTATCGAGCCTATTGTA
GTTG
bgaldFw CGGGATCCGGGTGCCACGAAAATTGTGCAC
bgaldRev GGGGTACCGCAGAATTCTGGTCTGAAAATAACGCGG
DmDut_attB1Fw GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCCAC
CATGCCATCAACCGATTTCG Drosophila
melanogaster 2L
kromoszóma;
GeneID: 34529 DmDut_attB2Rev
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCGTAGC
AACAGGAGCCGG
3.1. táblázat. Klónozáshoz használt primerek
3.1.1. Felhasznált Escherichia coli törzsek és a pBS-dutP plazmid létrehozása
A plazmidok termelése XL1-blue vagy One Shot Omni MAX 2 T1R (Invitrogen)
törzsekben történt. A pDONR221 Gateway entry vektor One Shot ccdB Survival 2 T1R
(Invitrogen) sejtekben lett termelve. Plazmidok uraciltartalmának meghatározásához a pBS-
dutP plazmidot XL1-blue, BL21(DE3) Ung-151, és CJ236 (dut-1, ung-1) termeltem, majd
overnight kultúrából izoláltam. A genom uraciltartalmának meghatározásához XL1-blue,
BL21(DE3) Ung-151, és CJ236 (dut-1, ung-1) törzseket növesztettem a stacioner vagy
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
48
exponenciális (OD600=0,5) fázisig. A az exponenciális fázisban gyűjtött BL21(DE3) Ung-151
sejtek egy részét 30,7 vagy 61,3 μM 5FdU (Sigma-Aldrich) jelenlétében növesztettem. A
sejtek Luria Broth (LB) médiumban lettek növesztve 37°C-on.
A pBS-dutP plazmid létrehozásához ecetmuslicából izolált genomi DNS-t templátként
használva a d1Fw és d1aRev primerekkel (3.1. táblázat) felszaporítottam a Drosophila
melanogaster dUTPáz géntől (CG4584) 5’ irányban található régiót (a másik érintett gén az
ellentétes orientációjú Art8, azaz CG16840). A termék 5’ végeit Polinukleotid kinázzal
(Fermentas) foszforiláltam, majd EcoRV emésztett pBlueScript SK+ plazmidba építettem
tompa végű ligálással. Restrikciós próbaemésztéssel és szekvenálással meggyőződtem róla,
hogy a fragmens a dUTPáz gén iránya alapján a plazmiddal azonos orientációban épült be. A
klónozáshoz a Fusion High Fidelity DNS polimerázt (Finnzymes) és New England Biolabs
(NEB) restrikciós enzimeket és DNS ligázt használtam.
3.1.2. DNS tisztítás
Plazmidokat kis mennyiségben a Qiagen Plasmid Miniprep Kit-el, nagyobb
mennyiségben a PureYield Plasmid Midiprep System (Promega) -el tisztítottam. Genomi
DNS-t a MasterPure DNA Purification Kit-el izoláltam. DNS fragmentumok gélből történő
izolálása a Qiagen Gel Extraction Kit-el történt. Az DNS koncentrációját Nanodrop ND-1000
spektrofotométerrel (Thermo Scientific) mértem meg.
3.1.3. Uracil-szubsztituált DNS fragmentumok előállítása PCR-el
Különböző dUMP tartalmú DNS fragmentumok előállítása PCR-el történt a pBS-dutP
plazmidrot templátként használva 50 μl végtérfogatban. A reakcióhoz a RedTaq DNS
polimerázt (Sigma-Aldrich) és 200-200 nM pBS-Fw és pBS-Rev primereket használtam (3.1.
táblázat). A reakcióban 200-200 nM dATP, dGTP, dCTP és 200 nM dUTP+dTTP keverék
volt jelen (Fermentas). A dUTP/dNTP arány a következő volt a különböző mintákban: 0; 0,1;
0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 2; 3; 4; és 5%. Hogy az izotóptartalom segítségével is ellenőrizni tudjam
a dUTP beépülést, a 0,1 és 0,2% dUTP/dNTP arányú minták egy részében a dUTP 10%-a, a
0,4; 0,8; 1; 2; 3; 4 és 5% dUTP/dTTP arányú minták egy részében pedig a dUTP 1%-a
triciummal jelölt dUTP[5-3H] (American Radiolabeled Chemicals Inc.) volt. A PCR reakció
körülményei a következők: 95°C 30 másodperc; majd ezt követően 35 ciklusban 95°C 30
másodperc; 55°C 1 perc; 72°C 1 perc; végül 72°C 10 perc. A PCR terméket gélből
tisztítottam, koncentrációját Nanodrop ND-1000 spektrofotométerrel (Thermo Scientific)
megmértem.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
49
3.1.4. Genomi DNS minták előkészítése az uracil PCR-alapú kimutatásához
A genom uraciltartalmának PCR alapú kimutatásához az E. coli a glicerinaldehid-
foszfát dehidrogenáz (GAPDH), az egér dUTPáz és a muslica dUTPáz - Art8 génjeit
kívántam felszaporítani. Ahhoz, hogy a reakciókhoz feldúsítsam a templátként hasznosítható
fragmentumokat, a genomi DNS-t olyan restrikciós enzimekkel kezeltem, amelyek a
genomban körbeveszik a felszaporítandó régiót. Ezért az E. coli genomi DNS-t NdeI, az egér
genomi DNS-t EcoRI, a muslica genomi DNS-t NheI enzimekkel emésztettem. Az emésztett
genomot 1%-os agaróz gélen elválasztottam, majd abból a felszaporítandó fragmentumnak
megfelelő méretű frakciót izoláltam. Ez az E. coli esetén kb. 5; egér esetén 1,5; muslica esetén
4-5 kilobázisos tartomány volt.
3.1.5. Promóter - riporter rendszerek létrehozása
3.1.5.1. EGFP riporter rendszerek
pEGFPd: A promóter nélküli riporter létrehozásához a pEGFP-N3 (Clontech) plazmidot
NheI és NdeI enzimekkel emésztettem, a szálvégeket Klenow enzimmel feltöltöttem, és
ligáltam. Az így kapott plazmidban el lett távolítva a CMV promóter jelentős része.
pEGFPd-dutP: A pBS-dutP plazmidból KpnI és BamHI restrikciós enzimek
segítségével izoláltam a dUTPáz feltételezett promóter szekvenciáját, és azt a pEGFPd
plazmidba klónoztam ugyanazokat a restrikciós endonukleázokat használva.
pEGFPd-dutPb: A pEGFP-dutP plazmidot BglII enzimmel emésztettem, a vektort
izoláltam majd a végeket újrazártam.
pEGFPd-dutP2, pEGFPd-dutP3: A pBS-dutP plazmidról a d2Fw illetve d3Fw forward
és d1bRev reverz primerek segítségével (3.1. táblázat) felszaporított fragmentumot KpnI és
BamHI hasítóhelyekkel építettem be a pEGFPd plazmidba.
pEGFPd-dutPx1 és pEGFPd-dutPx2: A pBS-dutP plazmidról a d1Fw forward, és a
p2Rev illetve p3Rev primerekkel (3.1. táblázat) felszaporított fragmenst KpnI és BamHI
hasítóhelyekkel építettem be a pEGFPd plazmidba.
pEGFPd-dutP-DRE1, pEGFPd-dutP-DRE2, pEGFP-dutP-DRE12: A pEGFPd-dutP
plazmidon QuickChange helyspecifikus mutagenezist hajtottam végre a DRE1Fw és
DRE1Rev, valamint a DRE2Fw és DRE2Rev primerpárokkal (3.1. táblázat). Az egyik
mutagenezis során kapott pEGFPD-dutP-DRE1 plazmidot további mutagenezissel, DRE12Fw
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
50
és DRE12Rev primerpárok felhasználásával mutagenizáltam, és alakítottam át pEGFPd-
DRE12 plazmiddá.
3.1.5.2. Luciferáz riporter rendszerek
pRL-Opi: A pIZ/V5-His plazmidból BamHI és SalI restrikciós enzimek segítségével
izoláltam az OpiE2 promótert, majd azt a BglII és SalI emésztett pEGFP-N3 plazmidba
ligáltam. Az így kapott pEGFP-N3-OpiE2 plazmidból NheI és BamHI enzimekkel kivágott
fragmentumot ligáltam az NheI, BglII emésztett pRL-TK (Promega) plazmiddal.
pGL3: Promega promóter nélküli plazmid.
pGL3-dutP, pGL3-dutP2, pGL3-dutP3, pGL3-dutPx1, pGL3-dutPx2, pGL3-dutP-
DRE1, pGL3-dutP-DRE2, pGL3-dutP-DRE12 : A pEGFPd-dutP, pEGFPd-dutP2, pEGFPd-
dutP3, pEGFPd-dutPx1, pEGFPd-dutPx2, pEGFPd-dutP-DRE1, pEGFPd-dutP-DRE2 és
pEGFPd-dutP-DRE12 plazmidokból a promótert kódoló fragmentumot KpnI és BamHI
enzimekkel kivágtam, és a KpnI, BglII enzimekkel emésztett pGL3 plazmidba ligáltam
pGL3-dutPb: A pGL3-dUTP plazmidot KpnI és BglII enzimekkel emésztettem, és a
vektort izoláltam, majd újrazártam.
3.1.5.3. β-galaktozidáz riporter rendszerek
pCAUG-dutP, pCAUG-dutP-DRE12: A pEGFPd-dutP és pEGFP-dutP-DRE12
plazmidokat templátként felhasználva a bgaldFw és bgaldRev primerpár segítségével (3.1.
táblázat) PCR reakcióban felszaporítottam a dUTPáz feltételezett promóterét. A
fragmentumot BamHI és KpnI emésztést követően az ugyanezekkel az enzimekkel emésztett
p{CaSpeR-AUG-betagal} plazmidba építettem így megkapva a p{CaSpeR-AUG-betagal}-
dutP és p{CaSpeR-AUG-betagal}-dutP-DRE12 plazmidokat, melyeket a továbbiakban
röviden pCAUG-dutP és pCAUG-dutP-DRE12 plazmidoknak fogok hívni.
pCAUG-dutP2: A pEGFPd-dutP plazmidot templátként felhasználva a d2Fw és
bgaldRev primerpárral (3.1. táblázat) PCR reakcióban felsokszorosítottam, majd BamHI és
KpnI enzimekkel emésztettem. Az így kapott fragmentumot az ugyanezekkel az enzimekkel
emésztett p{CaSpeR-AUG-betagal} plazmidba ligáltam. A keletkező p{CaSpeR-AUG-
betagal}-dutP2 plazmidot a továbbiakban pCAUG-dutP2-ként fogom rövidíteni.
A plazmidok szekvenciájának helyességét restrikciós endonukleázokkal és
szekvenálással teszteltem.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
51
3.1.6. Plazmidok a dUTPáz overexpresszáló muslicatörzsek létrehozásához
Ecetmuslica genomi DNS-t felhasználva PCR reakcióval felszaporítottam a dUTPázt
kódoló gént a DmDut_attB1Fw - DmDut_attB2Rev primer párokkal (3.1. táblázat). A
primerekkel a dUTPázt kódoló fragmentumokhoz attB1 és attB2 Cre által felismerhető
rekombinációs helyeket és Kozak-szekvenciát fúzionáltam. Az így kapott fragmentumokat
pDONR221 entry vektorba rekombináltam a Gateway BP Clonase II Kit-el (Invitrogen), majd
One Shot Omni MAX 2 T1R E. coli törzsbe transzformáltam. Az izolált kolóniákból tisztított
plazmidot restrikciós próbával és szekvenálással ellenőriztem. Ezt követően az ilyen módon
kapott pDONR221-DmDut plazmidot pTWF plazmiddal rekombináltam Gateway LR
Clonase II Kit-el, majd One Shot Omni MAX 2 T1R E. coli törzsbe transzformáltam és
kitisztítottam. A kapott pTWF-DmDut plazmid szekvenciáját restrikciós enzimekkel és
szekvenálással ellenőriztem. A pTWF vektorba integrált fehérjéhez egy 3xFLAG peptid van
fúzionálva.
3.2. Eukarióta sejtvonalak
3.2.1. Sejtvonalak és fenntartásuk
A muslica embrió eredetű S2 sejteket (James Sellers, NIH) Schneider médiumban
(Sigma-Aldrich) tartottam fenn 10% hőinaktivált FBS szérummal (Gibco) és 1% Pen/Strep
antibiotikummal (Gibco) kiegészítve 27°C-on. Az egér embrionális fibroblaszt (Mouse
Embryonal Fibroblast - MEF) sejtvonalakat (Hilde Nilsen, University of Oslo) vad típusú,
illetve ung(-/-)
egérből nyerték ki 153
. A kétféle sejtvonalat Sigma DMEM/F12 Ham
médiumban (Sigma-Aldrich) tartottam fenn kiegészítve 0,5 mM nátrium-piruváttal, 1%
NEAA ( 100x non-essential amino acids, Gibco) oldattal, 10% hőinaktivált FBS szérummal
(Gibco) és 1% Pen/Strep antibiotikummal (Gibco). T-REx-HeLa sejteket (Invitrogen) Sigma
DMEM/F12 Ham médiumban (Sigma-Aldrich) tartottam fenn 10% hőinaktivált szérummal
(Gibco) és 1% Pen/Strep antibiotikummal (Gibco) kiegészítve. A pCDNA6/TR Tet
represszorral szabályozható, dUTPáz csendesített HeLa sejteket Merényi Gábor állította elő
86. Ezeket a sejteket a T-Rex-HeLa sejtekével azonos módon, azonban tetracilkin-mentes FBS
szérummal (Clontech) kiegészítve tartottam fenn, hogy ne legyen jelen dUTPáz csendesítést
indukálni képes tetraciklin a médiumban. A dUTPáz csendesítő RNS-t és a Tet represszort
kódoló plazmidokat 2 ug/ml puromicin és 6 ug/ml blasticidin szelekcióval tartottam fenn a
sejtekben. A dUTPáz csendesítést 1μg/ml tetraciklin hozzáadásával indukáltam Az emlős
sejtvonalakat 37°C-on 5% CO2 inkubátorban növesztettem.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
52
3.2.2. Drosophila S2 sejtek transzfektálása
Az S2 sejteket a transzfektálás előtt egy nappal 24-lyukú lemezre helyeztem, egy lyukba
2x105 - 1,5x10
5 sejtet rakva. Másnap a médiumot 280 μl friss médiumra cseréltem. 3 órával
később 18 μl HBS oldatot (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5,5 mM Dextróz, 49,5 mM KCl,
0,7 mM Na2HPO4, pH=7,1) és 1,1 μg plazmidot raktam egy mikrocentifuga csőbe, majd
vortexeltem. Ezután 1,1 μl 2,5 M CaCl2 oldatot raktam a csőbe és ismért megkevertem. 20
perc múlva az elegyet folyamatos rázás mellett a 24-lyukú lemezen lévő sejtekre
csöpögtettem. Másnap a transzfektáló médiumot friss médiumra cseréltem.
Az EGFP-t kódoló riporter plazmidokat puromicin rezisztenciát kódoló pSUPER.puro
plazmiddal együtt transzfektáltam. A transzfektálást követően a sejteket 40 μg/ml
puromicinnel szelektáltam, ennek köszönhetően a riporter plazmiddal rendelkező sejtek
feldúsultak.
3.2.3. A sejtek drogkezelése
MEF sejteket 25 vagy 75 cm2 flaskában 4 napig növesztettem 1; 20; vagy 100 μM
5FdU (Sigma-Aldrich) jelenlétében. HeLa sejtvonalak 5FdU dózishatásának
meghatározásához a sejteket 96 lyukú lemezre raktam (2000 sejt/lyuk) a kezelés előtt egy
nappal. A kezelés során a sejteket 3 napig 5FdU, dU, dT, vagy ezek kombinációjával
kezeltem. A médiumot a droggal együtt naponta friss médiumra cseréltem annak elkerülése
érdekében, hogy a tetracilkin bomlása ne eredményezzen csökkenést a dUTPáz siRNS
indukálásában.
3.3. Muslica törzsek és módszerek
3.3.1. Gének csendesítése
A dUTPáz összes szövetben történő csendesítéséhez 21883 vagy 21884
csendesítőallélokal rendelkező hímeket kereszteztem Act-Gal4 szűz nőstényekkel (3.2.
táblázat). A keresztezésből kétféle utód származhat: dUTPáz siRNS/W; Act-Gal4/W; vagy
dUTPáz siRNS/W; CyO, GFP/W (a W vad típusú allélt jelöl). A kétféle utódot lárvális
stádiumban a GFP expressziónak köszönhetően Leica DM IL LED Fluo fluoreszcens
mikroszkóp alatt különítettem el.
A dUTPáz szárny szövetekben történő csendesítéséhez a 21883 vagy 21884 hímeket
25706 vagy 25752 driver törzsekből származó szűz nőstényekkel kereszteztem (3.2. táblázat).
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
53
A driver törzsek közül előbbi a szárny dorzális felszínén, utóbbi az engrailed expressziós
mintázatnak megfelelően a szárny poszterior felében indukál expressziót. A driver törzsek
által kialakított expressziós mintázatot az actMoeCherry törzzsel történő keresztezéssel
teszteltem. Az e törzs genomjában kódolt Moesin-Cherry fúziós fehérje termelődését a kikelt
utódok lárváiban fluoreszcens mikroszkóppal ellenőriztem.
3.3.2. dUTPáz túltermelés
Az ecetmuslica dUTPázt kódoló pTWF-DmDut plazmid P-elem inszerciós helyekkel
rendelkezik, melyek transzpozáz jelenlétében véletlenszerű integrációval beépülni képesek az
ecetmuslica genomba. A pTWF-DmDut és a transzpozáz forrás plazmid embrió csíravonalba
történő injektálását kolleborációs partnereink, Erdélyi Miklós és Vilmos Péter végezték, akik
a sikeresen transzformált DmDut20 és DmDut29 stabil törzseket létrehozták (3.2. táblázat).
Továbbá ezeket a törzseket keresztezték a 21883 és a 21884 törzsekkel, így olyan vonalakat is
létrehoztak, melyek mind a dUTPáz csendesítő, mind a dUTPáz túltermelésére képes
allélokkal is rendelkeznek (21883, DmDut20; 21883, DmDut29; 21884, DmDut20 és 21884,
DmDut29 törzsek).
A dUTPáz túltermelés indukálásához DmDut20, DmDut29 hímeket vagy ezek dUTPáz
csendesítőallélokkal rendelkező kombinációit Act-Gal4 vagy 25706 driver törzsekből gyűjtött
szűz nőstényekkel kereszteztem (3.2. táblázat). Az Act-Gal4 keresztezésből kikelt lárvák
közül a GFP fluoreszcencia hiánya alapján válogattam ki azokat az egyedeket, amelyekben
jelen van a Gal4 forrás.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
54
Törzs neve Genotípus Eredet
W1118 vad típus Szegedi Drosophila
Törzsközpont Oregon-R vad típus
Act-Gal4 W; Act-Gal4/CyO, GFP
25706 MS1096; UAS-Dcr2 Bloomington Stock Centre
25752 UAS-Dcr2; en-Gal4
21883 W; P{GD11362}v21883 VDRC
21884 W; P{GD11362}v21884
actMoeCherry W; UAS-actMoeCherry
Erdélyi Miklós, SZBK,
Genetikai Intézet
DmDut20 W; SM6b/Sp; DmDut20/TM3(Sb)
DmDut29 W; SM6b/Sp; DmDut29/TM3(Sb)
21883, DmDut20 W; P{GD11362}v21883; DmDut20
21883, DmDut29 W; P{GD11362}v21883; DmDut29
21884, DmDut20 W; P{GD11362}v21884; DmDut20
21884, DmDut29 W; P{GD11362}v21884; DmDut29
6193-1/1 W; W; dutPu2-Bgal/TM3(Sb)
BestGene
6193-1/2 W; dutP2-Bgal/CyO
6193-1/3 W; dutP2-Bgal/CyO
6193-1/4 W; dutP2-Bgal/CyO
6193-1/5 W; W; dutP2-Bgal/TM3(Sb)
6193-1/6 W; dutP2-Bgal/CyO
6193-1/7 W; dutP2-Bgal/CyO
6193-1/8 W; dutP2-Bgal/CyO
6193-1/9 W; W; dutP2-Bgal/TM3(Sb)
6193-2/1 W; dutP-Bgal/CyO
6193-2/3 W; W; dutP-Bgal/TM3 (sb)
6193-2/4 W; dutP-Bgal/CyO
6193-2/5 W; W; dutP-Bgal/TM3 (sb)
6193-2/6 W; dutP-Bgal/CyO
6193-2/7 W; W; dutP-Bgal/TM3 (sb)
6193-2/8 W; W; dutP-Bgal/TM3 (sb)
6193-2/10 W; W; dutP-Bgal/TM3 (sb)
6193-3/2 W; DRE12-Bgal/CyO
6193-3/3 W; DRE12-Bgal/CyO
6193-3/4 W; DRE12-Bgal/CyO
6193-3/7 DRE12-Bgal/FM7i
6193-3/8 W; DRE12-Bgal/CyO
6193-3/9 W; DRE12-Bgal/CyO
3.2. táblázat. A dolgozat témájához felhasznált Drosophila törzsek jegyzéke
Genotípus jelölése: 1. kromoszóma; 2. kromoszóma; 3. kromoszóma. A különböző
allélokkal rendelkező kromoszómapárokat ferde vonallal, az azonos kromoszómán lévő
géneket vesszővel választottam el. A CyO, TM3 (Sb), SM6b, FM7i kromoszómális
balanszerek homozigóta formában letális és domináns szelekciós markerekkel ellátott
allélokal rendelkeznek. A W vad típusú allélokat jelöl.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
55
3.3.3. Promóter - riporter rendszereket hordozó transzgenikus törzsek
A pCAUG-dutP, pCAUG-dutP2 és pCAUG-dutP-DRE12 plazmidok P-elem inszerciós
helyekkel rendelkeznek, melyek transzpozáz jelenlétében véletlenszerű integrációval az
ecetmuslica genomba képesek integrálódni. Az embrionális csíravonalba történő integrálást és
a transzformált törzsek létrehozását a BestGene cég végezte. Így az egyes promóter-riporter
kombinációkra számos független törzset kaptunk. 8 db. pCAUG-dutP, 9 db. pCAUG-dutPu2
és 6 db. pCAUG-dutP-DRE12 törzs állt rendelkezésünkre, melyekben a transzgén különböző
genomi pozíciókba integrálódott (3.2. táblázat).
Hogy elkerüljem a β-galaktozidáz riporter fehérje anyai hatásnak köszönhető jelenlétét
az embriókban, hím promóter-riporter transzgénnel rendelkező egyedeket W1118 szűz
nőstényekkel kereszteztem, és az ilyen nőstények által lerakott petéket vizsgáltam.
3.4. Muslica szövetek gyűjtése és festése
3.4.1. Embrió gyűjtés
10-20 db. szűz nőstényt és hím egyedeket, tenyésztőtápot (100 ml-ben: 2 g agar; 10 g
szacharóz; 10 g élesztő; 400 μl propionsav, 40 μl foszforsav, 500 μl 0,5 g/ml etanolban oldott
Nipagin) tartalmazó csőbe helyeztem. A tenyésztőtápot tartalmazó csöveket naponta
cseréltem, a petéket összegyűjtöttem, majd vízzel felére hígított háztartási nátrium-hipoklorid
oldatban dekorionizáltam. Ezt követően az embriókat NaCl-Triton pufferrel (0,7% NaCl,
0,04% TritonX-100) kétszer mostam.
3.4.2. β-galaktozidáz hisztokémia
Az embriókat 2 ml 18,81 mM NaH2PO4; 81,17 Na2HPO4; 4% formaldehid oldat és 2 ml
n-heptán szuszpenziós elegyben 350 rpm rázatás mellett szobahőn 20 percig üvegcsőben
fixáltam. Ezt követően az embriókat NaCl-Triton pufferrel (0,7% NaCl, 0,04% TritonX-100)
kétszer mostam, és 5 percig rehidratáltam. Majd az embriókat 37°C-os X-gal festőoldatba
helyeztem (3,16 mM NaH2PO4; 6,84 mM Na2HPO4; 150 mM NaCl; 1 mM MgCl2; 3 mM
K4[Fe(CN)6]; 3 mM K3[Fe(CN)6]; 0,3% Triton X-100). Az X-gal festőoldatban 50-szeresére
hígítottam 100 mg/ml DMF (N,N-dimetilformamid)-ban oldott X-gal szubsztrátot (5-bromo-
4-kloro-indolil-β-D-galactopiranozid). A festés egy órán át tartott 37°C-on. Az X-gal
festőoldat eltávolítása után az embriókhoz 2 ml n-heptánt és 2 ml jéghideg metanolt adtam,
majd erőteljesen ráztam, hogy a vitellin membránt eltávolítsam. Ezután az n-heptán – metanol
elegyet eltávolítottam és elpárologtattam, az embriókat 100%; 75%; 50%; 25% és 0% etanol -
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
56
PBS (130 mM NaCl2; 7 mM Na2HPO4; 3 mM NaH2PO4; pH=7,2) elegy sorozatban
rehidratáltam.
Muslica lárvális és felnőtt szövetek festéséhez harmadik lárvastádiumú vagy kifejlett
állatokat gyűjtöttem. A lárvákból PBS-ben sztereomikroszkóp és 0,05 mm x 0,01 mm csipesz
segítségével a központi idegrendszer (Central Nervous System – CNS), imaginális szárny
diszkusz, középbél és here szöveteket kiboncoltam. A felnőtt állatokból a heréket vagy az
ováriumot boncoltam ki. A szöveteket PBS-ben oldott 1% glutáraldehidben fixáltam 15
percig szobahőmérsékleten. Ezután kétszer 10 percig mostam Na-P/0,2TX oldatban (72 mM
Na2HPO4; 28 mM NaH2PO4; 0,2% Triton-X100; pH=7,2). Ezután a szöveteket 37°C-os X-gal
festő oldatba helyeztem (7,2 mM Na2HPO4; 2,8 mM NaH2PO4; 150 mM NaCl; 1 mM MgCl2;
3 mM K3[Fe(CN)6)]; 3 mM K4[Fe(CN)6]). Az X-gal festőoldatban 50-szeresére hígítottam
100 mg/ml DMF-ben oldott X-gal szubsztrátot. A festés 37°C-on 15 percig tartott. Az X-gal
festőoldat eltávolítása után a szöveteket PBS-el mostam.
3.4.3. Immuncitokémia
Muslica lárvális szövetek festéséhez harmadik lárvastádiumú állatokat gyűjtöttem. A
lárvákból PBS-ben sztereomikroszkóp és 0,05 mm x 0,01 mm csipesz segítségével a CNS,
imaginális szárny diszkusz, középbél, nyálmirigy és here szöveteket kiboncoltam. A
szöveteket 4% formaldehidet és 2,5% Tween-20 detergenst tartalmazó PEM oldatban (100
mM PIPES; 1 mM MgCl2; 1 mM EGTA; pH=6,9) fixáltam 50% n-heptán emulzióban 1 órán
át szobahőmérsékleten. Ezután a szöveteket háromszor 10 percig mostam 50 mM TRIS; 150
mM NaCl; 0,5% Tween-20; pH=7,4 oldatban. Majd a szöveteket blokkoló 0-ban (1,5% BSA
(Bovine Serum Albumin); 0,1% Tween-20; 1% TritonX-100; 0,001% NaN3; 250 mM NaCl; 7
mM Na2HPO4; 3 mM NaH2PO4; pH=7,2) és 2,5% FBS-el valamint 2,5% kecske szérummal
kiegészített blokkoló 0-ban inkubáltam szobahőmérsékleten 2-2 órán át. A dUTPáz és
3xFLAG elleni festés esetén az antitesteket blokkoló 1-ben (5% FBS; 1% BSA; 0,01%
Tween-20; 0,1% Triton X-100 és 0,001% NaN3-al kiegészített PBS) higítottam (anti dUTPáz
1:10000 (Prof. Erdei Annától, ELTE Immunológiai Tanszék, nyúl poliklonális); anti FLAG
1:1000 (Sigma, egér monoklonális)). Ebben az oldatban festettem a szöveteket 4°C-on egy
éjszakán át. A festést követően a szöveteket újabb blokkoló 2-ben (1,5% BSA; 0,05% Tween-
20; 0,5% TritonX-100; 0,001% NaN3; 250 mM NaCl; 7 mM Na2HPO4; 3 mM NaH2PO4;
pH=7,2) háromszor 2 órán át, majd blokkoló 1-ben egy éjszakán át mostam. A másodlagos
antitesteket blokkoló 1-ben higítottam ki 1:1000 arányban. A másodlagos antitesttel történő
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
57
festés két órán át sötétben szobahőmérsékleten történt. Ezután a mintákat blokkoló 2-ben
háromszor 35 percig mostam.
A foszfo-H2AX festés esetén a festést megelőzően blokkoló A-ban (1% BSA; 2,5%
FBS; 2,5% kecske szérum; 0,1% Tween-20 és 1% Triton X-100-al kiegészített PBS)
inkubáltam a mintákat, majd a festés blokkoló B-ben (1% BSA; 5% FBS; 0,01% Tween-20 és
0,1% Triton X-100-al kiegészített PBS) történt. Az anti foszfo-H2AX antitestet 1:250
hígításban használtam (Millipore, Ser139, egér monoklonális). A festés után négyszer 1 órán
át blokkoltam a mintákat blokkoló C-ben (1% BSA; 5% FBS; 0,01% Tween-20; 0,1% Triton
X-100-al kiegészített PBS). A másodlagos antitesttel történő festés blokkoló B-ben történt. A
másodlagos festés után a mintákat háromszor 30 percig blokkoló C-ben inkubáltam.
A festések után a szöveteket kétszer mostam PBS-ben és 10 percig 1:10000 higított
1μg/ml Hoechst 33342 (Molecular Probes) vagy 1μg/ml DAPI (4′6′-diamidino-2-fenilindol)
(Sigma-Aldrich) sejtmagi festékkel festettem. A használt másodlagos antitestek: kecskében
termelt Alexa 488 konjugált anti nyúl és Alexa 546 konjugált anti egér (Invitrogen).
3.4.4. TUNEL próba
Késői 3. lárva stádiumú muslica egyedeket gyűjtöttem és kiboncoltam az imaginális
szárny diszkuszokat. A szöveteket 1% formaldehid; 0,1 M PIPES; 2 mM MgSO4; 1 mM
EDTA; 1% Triton X-100; pH=6,9 oldatban fixáltam 30 percig szobahőmérsékleten. Ezután a
szöveteket háromszor 10 percig mostam 50 mM TRIS; 150 mM NaCl; 0,5% Tween-20;
pH=7,4 oldatban, 50% n-heptán szuszpenzióban. Majd a szöveteket háromszor mostam PBT
pufferben (PBS + 0,1% Triton X-100) és kétszer PBT5X pufferben (PBS + 0,5% Triton X-
100). A sejteket permeabilizáltam 0,1 M nátrium-citráttal kiegészített PBT-ben 30 percig 65
°C-on. Ezután a szöveteket 10 percig inkubáltam 0,1 M TRIS; pH=7,5; 3% BSA; 20% FBS
oldatban. Ezt követően a mintákat mostam kétszer PBT5X és háromszor PBT pufferben.
Majd 10 percig előinkubáltam TUNEL reakciópufferben (30 mM TRIS; 140 mM nátrium-
kakodilát; 1 mM CoCl2; pH=6,6). A TUNEL reakció egy órán át tartott 5 μM Cy5 konjugált
dUTP (GE Healthcare) és 0,2 U/μl terminális dezoxinukleotidil transzferáz (TdT) (New
England Biolabs) jelenlétében 25°C-on TUNEL reakciópufferben. A reakció leállításához a
reakciópuffert lecserétem PBT5X pufferre. Ezt háromszoros PBT, majd egyszeres PBS mosás
követte.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
58
3.4.5. BrdU próba
Késői 3. lárva stádiumú muslica egyedeket gyűjtöttem, kiboncoltam az imaginális
szárny diszkusz és CNS szöveteket, majd Schneider médiumba helyeztem őket. A próbához
Roche 5-Bromo-2’-deoxy-uridine Labeling and Detection Kit I -et használtam. A médiumba
10 μM Bróm-dezoxiuridint (BrdU) mértem, majd egy órán keresztül szobahőmérsékleten
inkubáltam. Az inkubálást követően a szöveteket egyszer mostam Schneider médiummal. A
szöveteket Carnoy oldattal (etanol - ecetsav - kloroform 6:3:1 arányú elegye) fixáltam 20
percig szobahőmérsékleten. Ezt 30 perc 7:3 arányban etanolt és 50 mM glicint (pH=2)
tartalmazó oldattal történő kezelés követte -20 °C-on. A mintákat 50%, 30% és 0% etanol -
PBT puffer (PBS + 0,1% Triton X-100) keverékben rehidratáltam. Majd a szöveteket 5 percig
mostam a kithez mellékelt Washing buffer-el. Az anti-BrdU festés a kithez mellékelt
Incubation solutionban történt 4°C-on egy éjszakán át. Ezután 6-szor 10 percig mostam a
mintákat PBT pufferben. A fluoreszceinnel jelölt anti-egér Ig másodlagos antitestet 0,3%
BSA-t tartalmazó PBS-ben oldottam fel a kit gyártója által javasolt koncentrációban. A festés
2 órán át szobahőmérsékleten tartott. Majd a mintákat kétszer 10 percig PBT-ben mostam.
Hoechst oldatot 10000-szeresére hígítottam PBT pufferben, melyben ezután a szöveteket
további 10 percig festettem. Végül a mintákat PBS-ben mostam.
3.5. Kimutatási módszerek és a felhasznált műszerek
3.5.1. Kvantitatív valós idejű PCR
A kvantitatív valós idejű PCR (qPCR) reakciót 10 μl végtérfogatban Stratagene
MX3000P készülékkel végeztem, melyben 1 μl mérendő DNS vagy cDNS minta volt jelen.
Minden egyes mintából kétszeres vagy tízszeres higítási sort készítettem és mértem, így
meghatároztam azt a koncentrációtartományt, amelyben a Ct (kvantifikációs ciklus) és a
templát koncentráció logaritmusa lineáris. Ez többnyire 5-10 higítási lépést foglalt magába. A
Pyrococcus furiosus (Pfu) DNS polimerázzal végzett reakciók összetétele: 0,5 U/μl PfuTurbo
Hotstart (vad típusú Pfu DNS polimeráz) vagy PfuTurbo Cx Hotstart (V93Q mutáns Pfu DNS
polimeráz) (Stratagene); 0,175 - 0,175 μM primer (Eurofins MWG Operon, HPLC
tisztaságú); 200 μM dNTP mix (Fermentas); 20-szorosára hígított EvaGreen (Biotium); 30
nM Passive Reference Dye (Stratagene) és 5-szörösére hígított a gyártó által a DNS
polimerázhoz javasolt reakciópuffer. Reakciókörülmények: 95°C 2 perc; 40 ciklusban 95°C
15 másodperc; 57°C 10 másodperc; 72°C 50 másodperc (544 bp felaszaporítása esetén) vagy
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
59
70 másodperc (hosszabb termékek esetén). A Taq polimerázzal végzett reakciók összetétele:
2-szeresére hígított ImmomMix PCR mastermix (Bioline); 0,175 - 0,175 μM primer (Eurofins
MWG Operon, HPLC tisztaságú); 200 μM dNTP mix (Fermentas); 20-szorosára hígított
EvaGreen (Biotium); 30 nM Passive Reference Dye (Stratagene). Reakciókörülmények: 95°C
10 perc; 40 ciklusban 95°C 15 másodperc; 57°C 10 másodperc; 72°C 70 másodperc. A
különböző arányban uracilt tartalmazó PCR-el előállított DNS templátokat kétféle
primerpárral vizsgáltam, melyekkel egy 544 bázispáros (PUbsd-Fw, PUbsd-R544 primerek)
vagy 1057 bázispáros (PUbsd-FW, PUbsd-R544 primerek) terméket szaporítottam fel. A
genom uraciltartalmát E. coli esetén a gdh565 - Fw, gdh565_Rev; MEF sejtvonalak esetén a
MEFdut-1168Fw - MEFdut-1168Rev, muslica minták esetén a PUbsd-FW - PUbsd-R985
primerpárok segítségével határoztam meg 565, 1168 illetve 985 bázispáros szakaszt
felszaporítva (3.3. táblázat).
Név Szekvencia Specificitás
PUbsd-Fw TCGGGATGACTTTTGGGTTCTG Drosophila melanogaster, 2L
kromoszóma; GeneID:
34528,34529 PUbsd-R544 AGTGACCAAACTACAGATCCACG
PUbsd-R985 CGCGGTTTAACACAGCGTCGG
PUbsd-R1057 CCGCTCTAGAACTAGTGGATC pBlueScript SK+
MEFdut-1168Fw GCAGGCACAGTGTGATGAAGG Mus musculus,2. kromoszóma;
GeneID: 110074 MEFdut-1168Rev GTGGCTTTAACCCACTGGTGAC
gdh656_Fw GACGGTCATCTGATCGTTAACG Escherichia coli; GeneID:
947679 gdh656_Rev ACTACGTCATCTTCGGTGTAGC
3.3. táblázat. Kvantitatív PCR-hez felhasznált primerek
A DNS uraciltartalmának meghatározása a következőképpen történt: a vad típusú Pfu
DNS polimerázzal mért Ct értékeket a minták hígítási értékeinek logaritmusával ábrázoltam
és egyenest illesztettem. Az egyenes meredekségéből kiszámítható a Pfu DNS polimeráz
hatékonysága (M = log(D) / log(1+E), ahol M az egyenes meredeksége, D az alkalmazott
hígítás, E a PCR hatékonysága, azaz mennyivel növekszik ciklusonként a felszaporítandó
DNS mennyisége.) Emellett a DNS teplátbeli uracilra intoleráns Pfu DNS polimerázzal mért
referencia (azaz uracil tartalomra nézve 0-nak tekintett) mintához tartozó hígítási lépések Ct
értékekeit ábrázoltam az uracil-DNS toleráns polimerázzal mért megfelelő Ct értékekkel és
egyenest illesztettem. Az egyenes által meghatározott függvénnyel az uracil toleráns DNS
polimerázzal mért Ct értékek behelyettesítésével kiszámoltam, hogy a referenciához
hasonlítani kívánt minták milyen Ct értéket adnának a vad típusú Pfu DNS polimerázzal, ha
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
60
nem lenne jelen uracil (Ct0
Pfu). A Ct0
Pfu értékeket kivontam a megfelelő vad típusú Pfu DNS
polimerázzal mért Ct értékekből (CtPfu). Az így kapott Ct különbségből (ΔCt) és a vad tíusú
Pfu DNS polimeráz hatékonyságából kiszámoltam a megfelelő templát koncentrcióbeli arányt
(R = (E+1)ΔCt
). Ez az arány azt mutatja meg, hogy a reakcióban jelen lévő kezdeti DNS
teplátok közül mennyit volt képes a vad típusú Pfu DNS polimeráz felszaporítani, azaz
mennyi templát nem taramazott uracilt a felszaporítandó szakaszon. Annak a valószínűsége,
hogy egy s hosszú DNS templát nem tartalmaz uracilt (1-U)s, ahol az U az uracil szubsztitúció
előfordulási valószínűsége. Ez alapján egy mintában az U = 1 - R1/s
. Az adatokat Origin 8.0
szoftverrel értékeltem ki. A minták átlagos uraciltartalmát és standard hibáját (standard error)
3 - 10 párhuzamos adatból számoltam ki.
3.5.2. Szcintillációs detekció
A dUTP[5-3H] jelenlétében szintetizált DNS-t 5 ml Optifluor Liquid Scintillation
Counting Coctail-ban oldottam fel. A tricium aktivitást PerkinElmer Wallac 1049 folyadék
szintillátorral mértem meg. A mérés kalibrálásához dUTP[5-3H] hígítási sort használtam.
3.5.3. Luciferáz teszt
A luciferáz aktivitás meghatározásához a Promega Dual-Luciferase Reporter Assay
kitet használtam. S2 sejteket 24 lyukú lemezen pGL3 (szentjánosbogár luciferáz) és pRL
(Renilla luciferáz) riporter plazmidokkal kotranszfektáltam. Minden egyes transzfekciót
párhuzamosan háromszor végeztem. Másnap a sejteket a kithez mellékelt Passive Lysis
Buffer-ben felszuszpendáltam és 15 percig szobahőmérsékleten rázattam. A lizátumot 20-20
μl-enként triplikátumokban Greiner Lumitrac 600 High binding 96-lyukú lemezre mértem.
Ezután a lyukakhoz 100-100 μl Luciferase Assay Buffer II-ben feloldott Luciferase Assay
Substrate-ot adtam. A szentjánosbogár luciferáz lumineszcencia megmérése után a lizátumhoz
100-100 μl Stop & Glo Buffer-ben oldott Stop & Glo szubsztrátot adtam, majd megmértem a
Renilla luciferáz lumineszcenciát is. A lumineszcenciát PerkinElmer Wallac-VICTOR2 1420
plate reader-el határoztam meg lyukanként 5 másodperc beolvasási idővel.
3.5.4. Áramlási citrometria
A puromicin szelekcióval feldúsított EGFP riportert termelő S2 sejteket 0,5%
formaldehiddel kiegészített PBS-ben fixáltam (pH=7,4) 10 percig szobahőmérsékleten.
Ezután a sejteket kétszer mostam PBS-ben és végül PBS-ben felszuszpendáltam. A sejtek
EGFP fluoreszcenciáját az ELTE Immunológiai Tanszékén Kiss Endre mérte meg BD
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
61
FACSCalibur áramlási citométer segítségével. A mért EGFP hisztogramokból meghatátoztam
az autofluoreszcenciánál magasabb fluoreszcenciát mutató sejtek arányát (GF) és átlagos
fluoreszcenciáját (Fmean). Majd az Fmean érték a GF értékkel történő összeszorozásával
normalizálva meghatároztam a sejtpopulációra jellemző fluoreszcenciát. A promóter-EGFP
konstrukciók fluoreszcenciáját mindig a dutP-EGFP konstrukció esetén mért
fluoreszcenciához hasonlítottam. A kísérlet során egy promóter-EGFP rendszerhez három
párhuzamosan létrehozott sejtvonal fluoreszcenciáját határoztam meg.
3.5.5. Mikroszkópia
A vizsgált szöveteket Mowiol beágyazóba (6 g glicerol; 2,4 g Mowiol 4-88 (Sigma); 6
ml víz; 12 ml 0,2 M TRIS; pH=8,5; 2,5% DABCO (1,4-diazobicyclo-[2.2.2]-oktán))
ágyaztam. A β-galaktozidáz riporter fehérjét expresszáló muslica szöveteket a Leica DMLS
mikroszóppal és Spot RT colour digital kamerával (Diagnostic Instruments) vizsgáltam. Az
immuncitokémiával, TUNEL vagy BrdU próbával festett muslica szöveteket Zeiss LSM 710
konfokális mikroszkóppal fényképeztem. A mikroszkópia során kapott képeket ImageJ
szoftverrel analizáltam.
3.5.6. Alamar sejt életképesség vizsgálat
A 96 lyukú lemezen növesztett sejteken lévő 100 μl tápoldathoz 10 μl Alamar Blue
reagenst (Biosource) adtam, majd 4 órán keresztül 37°C-on inkubáltam. Ezt követően a
rezazurin redukciót BioTek SynergyMX plate reader-el mértem 530 nm gerjesztés mellett az
590 nm emissziót detektálva.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
62
4. Eredmények bemutatása és kiértékelése
4.1. A DNS uraciltartalmának kvantitatív kimutatása
A DNS-ben megjelenő károsodások és módosult bázisok kimutatására számos közvetett
és közvetlen módszer létezik. A közveten módszerek során a módosulás a minta megfelelő
előkészítése után valamilyen analitikai módszerrel (pl. tömegspektrometriával) mutatható ki.
A közvetett módszerek során a bázismódosulást tartalmazó DNS-t valamilyen azt felismerő
enzimmel kezelik, tehát a szenzor szerepét ez specifikus enzim látja el. Ezután a kezelt termék
analízisére kerül sor. Erre példa az DNS uraciltartalom UNG enzimmel történő kimutatása,
amikor a kivágott uracil bázisokat vagy a DNS-ben hagyott bázismentes helyeket
tömegspektrométerrel 155,216–218
, aldehid reaktív próbával (ARP) 84
, vagy az bázismentes
helyek további emésztését követően a DNS frakcionálással mutatják ki 153,194,219
. Ezeken kívül
bizonyos DNS módosulásokat PCR alapú technikákkal is ki lehet mutatni. Az ilyen
kimutatási módszerek a DNS polimerázok hibákkal szembeni érzékenységét használják ki.
Valós idejű kvantitatív PCR (qPCR) technikák lehetővé teszik a DNS hibák DNS
polimerázokkal történő közvetlen kimutatását. Ilyen módszereket dolgoztak ki többek között a
DNS-beli 8-oxoguanin 220,221
, valamint egyéb oxidáció vagy alkiláció okozta DNS
károsodások kimutatására 222–226
. Továbbá DNS károsodások mellett a citozin metiláció
kimutatására is létezik PCR alapú módszer 227
. A DNS-ben előforduló uracil bázisok
kimutatására a szokványos qPCR-ben használatos DNS polimerázok azonban nem
alkalmasak. Mint ahogy az irodalmi áttekintésben bemutatásra került (lásd. 1.2.2. fejezet és
1.2. ábra), atöbbi DNS polimerázzal ellentétben, a Pyrococcus furiosus (Pfu) DNS polimeráza
elakad az uracil bázist tartalmazó DNS replikálása során. A Pfu DNS polimerázt és
módosított változatait széles körben használják DNS fragmentumok PCR-ben kevés hibával
történő felszaporítására. Köszönhetően azonban annak, hogy a DNS-ben található uracil
blokkolja a Pfu DNS polimerázt, csupán az uracilt nem tartalmazó DNS templátokat képes
felsokszorosítani. A polimeráznak ezt az uracil-DNS diszkrimináló tulajdonságát az
alábbiakban bemutatott módon kívántam kihasználni a DNS uraciltartalmának kimutatására.
A módszer részletes leírását és fiziológiás mintákon való alkalmazását a Nucleic Acids
Research folyóiratban is közzétettük (lásd. Közlemények listája).
A qPCR széles körben elterjedt pontos módszer egy mintában található templát
koncentrációjának meghatározására. Az ilyem mérésekhez felhasznált Taq polimeráz
valamint a Pfu DNS polimeráz V98Q módosított változata (lásd. 1.2.2. fejezet és 1.2. ábra) az
egy mintában található összes integrált DNS templát felszaporítására képes. Az ilyen
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
63
polimerázokkal végzett qPCR tehát az összes templátmennyiségről ad információt. Ezzel
szemben a vad típusú Pfu DNS polimeráz felhasználásával csupán az uracil-mentes DNS
templátok koncentrációját mérhetjük meg. Mivel a biológiai eredetű DNS-ben az uracil
megjelenése várhatóan véletlenszerű (néhány kivételtől eltekintve, pl. az Aktiváció Indukált
Citozin Dezamináz azaz AID helyspecifikus aktivitása esetén), a DNS-ben jelenlévő uracil
bázisok arányát jellemezhetjük az egy bázisra eső uracil szubsztitúció gyakoriságával (U).
Egy s-bázis hosszú DNS szakasz a következő valószínűséggel nem tartalmaz uracil bázisokat:
(1)
A véletlenszerű eloszlásból következik, hogy egy PCR során felhasznált mintában jelen lévő
DNS templátok a PS,U valószínűséggel megegyező arányban nem tartalmaznak uracilt:
(2)
Az uracil-mentes templát koncentráció a qPCR reakcióban a vad típusú Pfu DNS polimeráz,
az összes templát a V93Q mutáns Pfu vagy Taq polimeráz által katalizált reakcióban
határozható meg. Hangsúlyozni kell, hogy e feltételezés szerint a reakcióban jelen lévő uracil-
DNS nem csökkenti a Pfu DNS polimeráz hatékonyságát, azaz az uracil-mentes DNS
templátokat zavartalanul képes átírni a polimeráz az uracil-DNS jelenlétében.
Az általam kidolgozni kívánt rendszerben a vizsgálandó mintákat hígítási sorozatban
használtam. A kvantitatív valós idejű PCR során kapott kvantifikációs ciklus értékek
korrelálnak a DNS templátkoncentráció logaritmusával (1.1. ábra A). A különböző hígítási
pontok Ct értékeit a hígítás léptékének logaritmusával ábrázolva egy egyenest kapunk,
aminek meredeksége arányos a PCR hatékonyságával, azzal az értékkel (E), amennyivel
minden egyes ciklus során növekszik a DNS koncentrációja (lásd. 3.5.1. fejezet). A PCR
hatékonysága 100%, amennyiben ciklusonként a DNS teplát koncentráció kétszeresére
növekszik. A 4.1. ábra A-panelén látható, hogy a PCR hatékonysága nem függ a DNS
uraciltartalmától sem a Pfu vad típusú (WT) DNS polimerázt, sem a Pfu V93Q polimerázt
használva, az uraciltartalmú és referencia minták hígítási soraiból nyert egyenesek
meredeksége ugyanis megegyezik. A kétféle polimeráz azonban eltérő hatékonysággal
szaporítja fel a DNS mintákban található DNS-t.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
64
Minden méréshez szükséges referencia minta használata, melynek a DNS-beli uracil
tartalmát nullának tekintjük, illetve a mérendő mintát ahhoz hasonlítjuk. A Pfu V93Q DNS
polimerázzal kapott két minta egyenese közötti Ct tengely mentén megfigyelhető eltoldódás a
mintákban található összes DNS templát koncentráció különbségéről árulkodik. A vad típusú
Pfu DNS polimerázzal kapott Ct eltolódáshoz azonban mind a koncentrációkülönbség, mind
az uracil-mentes DNS teplátok arányaiban mutatkozó különbség hozzájárul. Ezért a vad
típusú Pfu DNS polimerázzal mért Ct különbséget normalizálnunk kell a Pfu V93Q DNS
polimerázzal kapott Ct különbséggel:
(3)
A (3) egyenletben az EWT és EV98Q a vad típusú és V93Q Pfu DNS polimerázok hatékonysága,
a ΔCtWT és ΔCtV93Q a vad típusú és V93Q Pfu DNS polimerázok felhasználásával mért minták
közti Ct különbség. Amennyiben a Pfu V93Q és vad típusú Pfu DNS polimerázokkal a két
mintán mért Ct értékeket egymásnak megfeleltetve ábrázoljuk (4.1. ábra B), a CtWT tengely
mentén tapasztalható eltolódásért a vizsgálandó minta referencia mintához képest magasabb
DNS templátbeli uraciltartalma felelős. Az eltolódás mértéke egy olyan Ct különbség, mely
adott CtV93Q értékekhez, azaz bemérési koncentrációkhoz tartozó uraciltartalombeli
különbségről ad információt. Ebből a Ct különbségből a vad típusú Pfu DNS polimeráz
hatékonysága ismeretében kiszámolható az [uracil-mentes templát] / [összes templát] arány
és a DNS uraciltartalma (lásd. 3.5.1. fejezet).
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
65
4.1.1. DNS uraciltartalom kimutatása szintetikus DNS-ből
A fentiekben leírt kísérleti megközelítést Taq DNS polimerázzal különböző
dUTP/dNTP arány mellett PCR során szintetizált DNS fragmentumokon kívántam tesztelni.
Várakozásaim szerint az alkalmazott dUTP koncentráció arányos lesz a DNS-be beépülő
uracil bázisokkal. A DNS fragmentumokat 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 2; 3; 4; és 5%
dUTP/dNTP arányok jelenlétében szintetizáltam.
Mivel a (2) egyenlet alapján a mérési módszer érzékenysége függ a templát hosszától, a
szintetizált uracil-DNS mintákból többféle hosszúságú templát szakaszt kívántam
felszaporítani. A hosszabb szakaszon végzett szintézis ugyanis nagyobb valószínűséggel
ütközik templátbeli uracilba, ami a [uracil-mentes templát] / [összes templát] arányt
csökkenti, azaz érzékenyebbé teszi a detekciót. A qPCR során kétféle primerpárt használtam,
melyekkel 544 vagy 1057 bázispár hosszú fragmentumok felszaporítása lehetséges.
Referenciaként azt a mintát használtam, melynek szintézise során nem volt jelen dUTP. A 4.2.
ábra A-panelén látható, hogy a CtWT eltolódás mértéke a referencia mintához képest a minták
4.1. ábra.
(A.) A Pfu V93Q DNS polimerázzal (Pfu V93Q) és a vad típusú Pfu DNS polimerázzal
(Pfu WT) mért referencia (ref) és uracil-DNS tartalmú minták Ct értéke a higítás
logaritmusával ábrázolva. Az egyenesek meredeksége a PCR hatékonyságával arányos.
(B.) A vad típusú Pfu DNS polimerázzal (CtWT) és V93Q mutáns Pfu DNS polimerázzal
(CtV93Q) mért referencia (ref) és uracil-DNS tartalmú minták Ct értékei egymásnak
megfeleltetve a különböző hígítási pontokban. A szürke nyíl az uracil-DNS tartalmú minta
referenciához képest történő eltolódását mutatja a CtWT tengely mentén.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
66
szintézisekor használt dUTP koncentrációnak megfelelő módon növekszik. A 4.2. ábra B-
panelén látható, hogy CtWT eltolódás nagyobb mértékű, amennyiben hosszabb DNS
fragmentumot szaporítunk fel a qPCR során. Ez annak köszönhető, hogy egy hosszabb
szakaszon nagyobb valószínűséggel tartalmaz uracil bázist egy templát, azaz a vad típusú Pfu
DNS polimeráz jóval kevesebb uracil-mentes DNS templátot fog tudni hasznosítani.
A dUTP jelenlétében szintetizált minták egy részénél tricium jelölt dUTP-t használtam,
hogy a termékekből szcintillációs detekcióval, egy független módszerrel ki tudjam mutatni a
beépült dUMP-t. A minták ilyen módon kapott DNS-beli uracil tartalmát össze tudtam
4.2. ábra.
(A.) Különböző dUTP koncentrációk jelenlétében szintetizált fragmentumok hígítási
pontjainak V93Q mutáns (CtV93Q) és vad típusú (CtWT) Pfu DNS polimerázzal mért Ct
értékei egymásnak megfeleltetve. Jelölések: 0 (fekete négyzet); 0,2 (piros kör); 0,6 (zöld
fordított háromszög); 1 (üres kör); 2 (kék négyzet); 3 (szürke kör); 4 (narancs fordított
négyzet); 5 (üres háromszög) % dUTP/dNTP arányok mellett szintetizált minták. A
mérések 544 bp fragmentum kvantitatív valós idejű PCR-ben történő felszaporításával
születtek (B.) Referencia (négyzetek) és 0,6% dUTP/dNTP arány mellett szintetizált DNS
minták (körök) hígítási pontjainak megfelelő mért Ct értékek. A kvantitatív PCR során 544
bp fragmentum felszaporításával mért értékek (folytonos vonal, fekete négyzet illetve kör)
jóval kisebb mértékű CtWT eltolódást mutatnak, mint az 1057 bp fragmentum
felszaporításával mért értékek (szaggatott vonal, üres négyzet illetve kör).
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
67
hasonlítani a qPCR segítségével mért értékkel. A kétféle módszerrel és különböző
primerpárokkal mért DNS-beli uraciltartalom nagymértékű egyezést mutat (4.3. ábra).
Megállapíthatjuk tehát, hogy a DNS uraciltartalom kimutatását megcélzó kísérleti
rendszer lehetővé teszi az uracil szubsztitúció valóshoz közeli mértékének kimutatását. A
rövid szintetikus DNS fragmentumok qPCR-ben történő vizsgálata után fiziológiás mintákra
is ki akartam terjeszteni a módszert, ami jóval komplexebb kezelést és kiértékelést igényelhet.
4.1.2. DNS uraciltartalom kimutatása fiziológiás DNS mintákból
A Pfu DNS polimerázon alapuló módszer fiziológiás mintákon való teszteléséhez olyan
organizmusokra volt szükségem, melyekben a timidilát bioszintézis vagy a dUMP beépülés
prevenciója hibás, ami a sejtekben DNS-beli uracil megjelenésének forrása lehet. Ezen kívül
az uracil-kivágó kapacitásában defektusos organizmusokat is vizsgálni kívántam.
4.3. ábra.
A különböző dUTP koncentrációk jelenlétében szintetizált DNS fragmentumok
uraciltartalma különböző módszerekkel mérve. Fekete négyzetek: tricium-jelölt dUMP
beépülésből számolt uraciltartalom 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1; 2; 3; 4; és 5% dUTP/dNTP
mellett szintetizált mintákban. Narancs kör: 544 bp felszaporításával kvantitatív valós
idejű PCR-el mért uraciltartalom 0; 0,2; 0,6; 1; 2; 3; 4; és 5% dUTP/dNTP mellett
szintetizált mintákban. Szürke háromszög: 1057 bp felszaporításával kvantitatív valós
idejű PCR-el mért uraciltartalom 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 és 2; % dUTP/dNTP mellett
szintetizált mintákban.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
68
A dUTPáz mutáns E. coli csupán az UNG mutáció mellett fenntartható (dut-1, ung-1).
Ezen kívül rendelkezésemre állt egy UNG mutáns ung-151 törzs. Kontrollként az XL1-blue
törzset használtam. Ezekkel a törzsekkel plazmidot termeltettem, melyet egy éjszakán át
növesztett kultúrából izoláltam. A plazmidokból vad típusú és V93Q mutáns Pfu DNS
polimerázok segítségével uracil tartalmat mértem, referenciaként az XL1-blue-ból izolált
plazmidot használtam fel. Míg az ung-151 törzsből izolált plazmid esetén nem tapasztaltam
kimutatható változást az uraciltartalomra nézve, a (dut-1, ung-1) törzs jelentős mértékű CtWT
eltolódást mutatott (4.4. ábra A). Az ebbből a törzsből izolált plazmid 1 millió bázisából
5490±85 uracil.
Az E. coli törzsekben a genom uraciltartalmát is meg akartam határozni. A három
törzsből, melyeket egy éjszakán át történő növesztés után (stacioner fázis) vagy
exponencionális fázisban gyűjtöttem, genomi DNS-t izoláltam. Az exponenciális fázisig
növesztett ung-151 kultúrához 30,7 vagy 61,3 μM 5FdU-t adtam. Annak érdekében, hogy
4.4. ábra.
(A.) Stacioner fázisú XL1-blue, ung-151 és (dut-1, ung-1) tözsekből izolált plazmidok vad
típusú és V93Q Pfu DNS polimerázokkal mért Ct értékei hígítási pontonként. A kvantitatív
valós idejű PCR során 544 bp felszaporítására került sor. Referenciaként az XL1-blue
trözsből izolált plazmidot használtam. CtWT eltolódást csupán a (dut-1, ung-1) -ből izolált
plazmid mutatott. (B.) Stacioner és exponenciális fázisban gyűjtött XL1-blue, ung-151 és
(dut-1, ung-1) tözsekből izolált genomi DNS uraciltartalma. Referenciaként a stacioner
fázisú XL1-blue genomi DNS-t használtam.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
69
feldúsítsam a templátként hasznosítani kívánt DNS fragmentumok arányát a mintákban, a
genomi DNS-t restrikciós endonukleázzal emésztettem, azt a frakciót, amelyben a templát
nagy mennyiségben jelen van, agaróz gélből izoláltam. Érdekes módon, a (dut-1, ung-1)
törzsből származó mintákból a vad típusú Pfu DNS polimerázzal csak többszörös hígítást
követően sikerült DNS fragmentumot felszaporítani, azaz magas koncentrációban a minta
gátolta a reakciót. Ez azzal magyarázható, hogy a nagy mennyiségben jelen lévő nem
templátként funkcionáló urailt tartalmazó DNS a polimerázhoz kötött, gátolva azt. A gátlás
csak több hígítási lépés után szűnt meg, amelynél elegendő szabad Pfu DNS polimeráz
hasznosulhatott a reakcióhoz. A mintákat tehát egy hígítási sorban érdemes vizsgálni, így meg
tudjuk határozni azt a tartományt, ahol a Ct és a templát koncentráció logaritmusának
összefüggése lineáris. Az E. coli törzsek genomi DNS-ében mért uracilmennyiség a 4.4. ábra
B-panelén látható. Referenciaként a stacioner fázisú XL1-blue genomi DNS-ét használtam.
Ehhez képest a stacioner fázisú ung-151 kutúra csupán alig kimutatható mértékben dúsított fel
uracilt a genomjában (90±61 uracil/millió bázis). A stacioner fázisú (dut-1, ung-1) törzs
jelentős mennyiségű uracilt halmoz fel genomi DNS-ében (8063±167 uracil/millió bázis). Az
exponenciális fázisú XL1-blue törzsben nem figyelhető meg kimutatható mértékű genomi
uraciltartalom dúsulás. Azonban az exponenciális fázisú ung-151 törzs genomjában millió
bázisonként 537±37 uracil jelenik meg, ami 30,7 és 61,3 μM FdU kezeléssel tovább növelhető
653±55 illetve 770±54 értékre. Míg az exponenciális fázisú növekedés az UNG defektus
mellett a genomi uracil növekedéséhez vezet, az exponenciális fázisú (dut-1, ung-1) törzs
genomjában millió bázisonként 6850±174 uracil fordul elő, ami bár szintén magas, a stacioner
fázisban mért értéknél érdekes módon alacsonyabb (szemben az ung-151 törzsek által
mutatott tendenciával).
Az E. coli törzsekben mért genomi uraciltartalom összehasonlítható más kutatók által
kapott eredményekkel. ARP módszerrel detektált (dut-1 ung-1) E. coli törzsek genomi
uraciltartalma 3000-től 7700 uracil/millió bázisig terjedően volt kimutatható 84
. Az általam
kidolgozott módszer további pontosítást tesz lehetővé, ugyanis jóval szűkebb tartományban
sikerült az uracil felhalmozódás mértékét meghatározni. Szintén egyezést mutat
eredményeimmel az, hogy az ung-151 törzs exponenciális fázisban növesztve nagyobb
mennyiségű uracilt halmoz fel genomjában mint stacioner fázisban 84
.
Spontán immortalizált, vad típusú és UNG kiütött egérből izolált embrionális fibroblaszt
sejtvonalakat (MEF) használva lehetőségem volt vizsgálni az UNG hatását a genom
összetételére eukariótákban is. Referenciaként a vad típusú MEF sejteket használtam. Az ung(-
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
70
/-) sejtek genomjában nem emelkedett meg kimutatható mértékben a genom uraciltartalma. A
sejtek 5FdU-val történő kezelése után azonban az ung(-/-)
sejtek genomjában millió
bázisonként 341±87 uracil jelent meg. A vad típusú sejtek genomjának az összetételét az
5FdU nem befolyásolta (4.5. ábra).
Az a megfigyelés, hogy az 5FdU kezelés DNS-beli uracil felhalmozódást az UNG
aktivitástól függő módon növeli, korábban is leírták ugyanezekben a sejtvonalakban és UNG
gátolt HEK sejtekben 153,155
. Azonban egyes irodalmi adatokkal ellentétben nekem nem
sikerült kimutatni a kezeletlen ung(-/-)
MEF sejtekben megemelkedett genomi uraciltartalmat.
Ebben a kérdésben az irodalmi adatok sem egységesek: míg bizonyos esetekben az UNG
kiütése vagy mutációja önmagában elegendő volt a genomi uraciltartalom növeléséhez
153,228,229, más esetekben semmilyen hatás nem volt tapasztalható
155.
4.2. A dUTPáz expressziós mintázat hatása a muslica genom
uraciltartalmára
Kollégám, Békési Angéla korábbi eredményei alapján bemutatta, hogy a dUTPáz
expressziója ecetmuslicában csupán néhány szövetre korlátozódik. A dUTPáz fehérje
jelenléte kimutatható embrionális állapotban és az embrió eredetű S2 sejtvonalban, a lárvális
stádiumban pedig az imaginális korongokra korlátozódik. A felnőtt állatokban csupán az
4.5. ábra.
Vad típusú és UNG kiütött egerekből származó embrionális fibroblaszt sejtek (MEF)
genomi uraciltartalma kezelés nélkül és 100 μM 5FdU kezelés után.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
71
ováriumban van jelen, hím egyedekben pedig nem kimutatható a fehérje 215
. Tekintve, hogy a
muslicában nincs jelen az UNG, a dUTPázt nem kifejező szövetek feltehetően hasonló genom
metabolizmust mutathatnak, mint a (dut-1, ung-1) E. coli, azaz a genom uraciltartalmának
emelkedése várható. Ez érvényes lehet a dUTPáz differenciált lárvális szövetekre, melyek a
lárva fejlődése során a sejttérfogat növelésével és endoreplikációval tartanak lépést az egyed
növekedésvel. Ezekben a szövetekben ugyanis a DNS szintézis dUTPáz hiányában történik. A
dUTPáz expressziós mintázat és annak genom összetételét befolyásoló hatásának
vizsgálatához az expressziós mintázat részletes vizsgálatát és a muslica szövetek genombeli
uraciltartalmának kimutatását kívántuk megvalósítani. Vizsgálataink eredményeit a PLoS
Genetics folyóiratban is közzétettük (lásd. Közlemények listája).
4.2.1. Az ecetmuslica dUTPáz expressziós mintázata
Annak érdekében, hogy a dUTPáz expresszió és a genom uraciltartalmának
összefüggését muslicában teljes körűen jellemezni tudjuk, szerettem volna kiterjeszteni
Békési Angéla vizsgálatait további muslica szövetekre a dUTPáz expressziót illetően. Vad
típusú W1118 állatokból szöveteket gyűjtöttem és fixáltam. Az dUTPáz elleni
immuncitokémiát és a minták konfokális mikroszkóppal történő fényképezését Róna Gergely
végezte. A korábban is bemutatott imaginális korong és kifejlett ovárium szövetek mellett
dUTPáz expressziót sikerült kimutatni a CNS szöveteiben, a középbélben található
ventriculus és a nyálmirigy imaginális gyűrűjében, valamint a here primordiumokban (4.6.
ábra).
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
72
4.2.2. Az uracil-DNS stádium- és szövetspecifikus megjelenése
Mivel a dUTPáz expressziója a muslica egyedfejlődés során változik, valamint bizonyos
stádiumokban az egyed különböző szöveteiben heterogén eloszlású, az uracil-DNS
megjelenését stádium és szövetspecifikus módon kívántuk vizsgálni. Kollégám, Muha Villő
vad típusú, Oregon-R állatokból embrió, első, második, hramadik stádiumú lárva, báb és
kifejlett imágó egyedeket gyűjtött. Ezen túl harmadik lárva stádiumú állatokból imaginális
korong és nyálmirigy szöveteket izolált. A szövetekből genomi DNS-t izoláltunk, melynek az
uraciltartalmát megmértük. Referenciaként az embrióból izolált genomi DNS-t használtuk. A
4.7. ábra A-panelén látható, hogy a lárva stádiumok alatt a genom uraciltartalma az állat
méretének növekedésével párhuzamosan folyamatosan nő (Lárva 1: 307,3±14; Lárva 2:
378,2±10,7; 811,1±25,4 uracil/millió bázis). A báb állapotra azonban csökken a genom
uraciltartalma (477,9±30,6 uracil/millió bázis). A kifejlett állatra azonban az embrióhoz
képest továbbra is magas genomi uraciltartalom jellemző (389,1±15,7 uracil/millió bázis).
4.6. ábra.
Vad típusú ecetmuslicába szövetekben immuncitokémiával kimutathatott dUTPáz
expresszió.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
73
A harmadik lárva stádiumú imaginális korongok genomi DNS-ében nem mutatható ki
jelentős mértékű uracil felhalmozódás. A nyálmirigyben azonban drasztikusan magas genomi
uraciltartalmat mértünk (1607,3±309,3 uracil/millió bázis), ami ugyan nem olyan mértékű,
mint ami a (dut-1, ung-1) E. coli-ban tapasztalható, de eukarióta organizmusokban az eddig
mért legmagasabb (4.7. ábra B).
A dUTPáz expressziót mutató embrionális szövetek genomi DNS-éről Muha Villő
kimutatta, hogy az XL1-blue vad típusú E. coli törzsben növesztett plazmidhoz képest nem
mutatható ki benne uracil. Ez az UNG deficiens emlős sejtvonalak kapcsán felmerült
ellentmondást (lásd. 4.1.2. fejezet) abba az irányba billenti el, hogy az UNG enzimnek a
normális dUTPáz expresszió mellett nem kell jelentős mennyiségű uracilt eltávolítania a
DNS-ből. Emellett abban is megerősített minket, hogy az embrió genomi DNS kiváló
referenciaként szolgál muslica szövetek genomi uraciltartalmának meghatározásához.
Figyelemreméltó, hogy az imaginális korongok genomi uraciltartalma alacsony, ami a
korábbi adatokkal illetve a 4.6. ábra. összevetve feltehetően a magas dUTPáz expressziónak
köszönhető. Ezzel párhuzamosan, a szintén dUTPáz expressziót mutató embrióban sem
mutatható ki genomi uracil. A lárva stádiumok alatt a differencilt szövetek
endoreplikációjának köszönhetően emelkedik a muslica genom uraciltartalma. Ez a báb
4.7. ábra.
(A.) Vad típusú ecetmuslica egyedfejlődési stádiumaira jellemző genomi uraciltartalom. E:
embrió, L1, L2, L3: első, második és harmadik stádiumú lárva, P: báb, I: imágó. (B.)
Harmadik stádiumú vad típusú állatokból izolált imaginális korong és nyálmirigy genomi
uraciltartalma.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
74
állapottól kezdve szakad meg, amikor a lárvális differenciált szövetek a hid, grim és reaper
által mediált programozott sejthalálnak köszönhetően degradálódnak, arányuk csökken az
állatban. A kifejlett állatban megfigyelhető, az embrióhoz képest még mindig magas genomi
uraciltartalom azzal magyarázható, hogy a báb állapot során differenciálódó szövetekben
idővel megszűnik a dUTPáz expresszió.
4.2.3. A dUTPáz csendesítés hatása a muslica genom uraciltartalmára
Annak érdekében, hogy ellenőrizzük, valóban a dUTPáz expresszióval összefüggésben
tapasztalható-e a muslica szövetekben megfigyelhető uracil-DNS mintázat, szerettük volna
vizsgálni a dUTPáz csendesítés hatását a genom összetételére. A csendesítési kísérletet Muha
Villő hajtotta végre, aki 21883 dUTPáz csendesítőallélokkal rendelkező állatokat, melyekben
a csendesítő RNS (RNAi) az élesztő UAS promóterével meghajtható, Act-Gal4 driver törzzsel
keresztezett össze (Anyagok és módszerek 3.2. táblázat). Utóbbi aktin promóter által
meghajtott Gal4 élesztő transzkripciós faktorral rendelkezik. Azok az utódok, melyekben az
UAS-RNAi és az Act-Gal4 allélok egyszerre jelen vannak, minden szövetre kiterjedően
csendesítik a dUTPáz expressziót. Muha Villő ilyen harmadik lárva stádiumú egyedekből
imaginális korongokat gyűjtött, a szövetekből genomi DNS-t izolált. A megfelelő
mintaelőkészítés után megmértük a DNS uraciltartalmát. Referenciaként vad típusú embrió
genomi DNS-t használtunk. A csendesített imaginális korongokban jelentősen megnő a
genom uraciltartalma (1097,6±55,7 uracil/ millió bázis) (4.8. ábra), ami egy nagyságrendbe
esik a vad típusú nyálmirigyben mért értékkel.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
75
A dUTPáz csendesített imaginális korongban tapasztalt DNS összetételbeli változás
megerősíti azt a feltételezést, hogy a differenciált szövetek genomi uraciltartalma a dUTPáz
expresszió hiányának köszönhetően emelkedik. Hangsúlyozni kell azonban, hogy a dUTPáz
hiányában a genomi uracil felhalmozódásához feltehetően az UNG hiánya is hozzájárul.
4.3. A muslica dUTPáz expressziós mintázatáért felelős mechanizmus
vizsgálata
Az a megfigyelés, hogy a dUTPáz többnyire nem differenciálódott, osztódásban lévő
szövetekben fejeződik ki, hasonló regulációs mechanizmust sejtet, mint a számos dNTP
metabolizmusban részt vevő enzimek, pl. az RNR, a TS és a humán dUTPáz esetén. Vizsgálni
szerettem volna, hogy az ecetmuslica dUTPázban is van-e hasonló transzkripciós szintű
regulációs mechanizmus. Továbbá vizsgálni kívántam, hogy organizmus szintjén milyen
jelentősége van ennek a szabályozásnak, azaz mennyire fontos a muslica számára az uracilt
tartalmazó és nem tartalmazó DNS párhuzamos fenntartása a különböző szövetekben.
Az eddigi genom szekvenálási projektek során meghatározott Drosophila fajok DNS
szekvenciája alapján lehetséges a muslica dUTPáz gént potenciálisan reguláló genomi régiók
összehasonlítására. A Drosophila melanogaster dUTPázt kódoló gén (CG4584) a 2.
4.8. ábra.
Vad típusú és dUTPáz csendesített harmadik lárvastádiumú állatokból izolált imaginális
korongok genomi uraciltartalma.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
76
kromoszóma bal karján található. A géntől 5’ irányban az Arginin metiltranszferáz 8 fordított
orientációban helyezkedik el, aminek köszönhetően a két gén transzkripcióját reguláló régiók
átfedhetnek (4.9. ábra A, 4.10. ábra B). Mind a 12 genom szekvenciája alapján
elmondható, hogy a dUTPáz gén 5’ szomszédja egy ellentétes orientációjú gén. A
melanogaster csoportban, melybe a D. melanogaster is tartozik, négy fajban is az Arginin
metiltranszferáz 8 található ebben a genomi pozícióban. További 8 fajban azonban egy Ran
GTPáz aktiváló fehérje, és egy fajban egy feltételezett oxidoreduktáz a dUTPáz gén 5’
szomszédja (4.9. ábra B).
A Drosophila melanogaster dUTPáz start kodonját kódoló régiótól (+1 pozíció) -289 - -
282 és -281 - -274 bázis távolságra lévő pozícióban egymás mellett található két azonos
palindrom szekvencia (TATCGATA), melyek az ún. „DNA Replication-related Element
binding Factor” (DREF) potenciális felismerő helyei (DRE) 230
. A 12 Drosophila faj
feltételezett dUTPáz promóterének szekvenciáját MAFFT 6 programmal összeillesztettem (E-
4.9. ábra.
(A.) A Drosophila melanogaster dUTPázát kódoló gén (CG4584) genomi környezete.
Art8: Arginin metiltranszferáz 8. (B.) A 12 ismert genommal rendelkező Drosophila faj
dUTPázát kódoló génjétől 5’ irányban, ellentétes orientációban található gének. Forrás:
FlyBase.org.
A
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
77
INS-i paraméter használatával) 231
. Ez alapján a DRE hely némi konzerváltságot mutat 10
Drosophila fajban (4.10. ábra A). A DREF transzkripciós faktor szabályozza a muslica DNS
polimeráz α és PCNA expresszióját is 232
. A DREF funkciója emlősökben is konzervált,
számos egyéb osztódással kapcsolatos gént is regulál, és többek között az E2F transzkripciós
faktorral is kooperál. A sejteket érő differenciációs szignálok gátolják a DREF transzaktiváló
hatását. Erre példa a Cut transzkripciós faktor, mely antagonisztikus módon tud kötni a DRE
motívumokhoz represszálva az osztódással kapcsolatba hozható géneket 233
. Az illesztés
alapján további konzerváltságot mutató régiókat a 4.10. ábra B-panelén jelöltem, az egyik a
transzkripció iniciációs régiót is magába foglalja.
A Drosophila melanogaster dUTPázának feltételezett promóterét promóter-riporter
rendszerekben kívántam vizsgálni. A riporter gén aktivitása alapján következtetni tudok a
4.10. ábra.
(A.) 10 Drosophila faj dUTPáz feltételezett promóterében található konzervált potenciális
DRE kötőhelyek. Szürkével kiemelve a DRE motívumok. (B.) A Drosophila melanogaster
dUTPáz feltételezett promóterének felépítése. A DRE motívumokat zöld, az egyéb
konzerváltságot mutató régiót szürke téglalapokkal jelöltem.
D. melanogaster -289 ---tatcgata----tatcgatagggttg
D. simulans -148 ---tattgata----tatcgataa-----
D. sechellia -147 ---tattgata----tatcgataa-----
D. yakuba -278 ---tatcgata----tatcgatag---tg
D. erecta -286 ---tatcgatatacatatcgat--gaatg
D. pseudoobscura -315 attgagatggcagtgcttcgataa-----
D. persimilis -316 attgagatggcagtgcttcgataa-----
D. mojavensis -391 ------gtggcggcttatcgataa-----
D. virilis -445 ------gtggtggtccaccgatat-----
D. grimshawi -381 ------gtggtggtccgccgatat-----
A
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
78
promóter működésére. Vizsgálni kívántam a feltételezett promóter különböző régióinak
szerepét, beleértve a két DRE motívumot a dUTPáz szövet és stádiumspecifikus expressziós
mintázatának kialakításában. Emelett tanulmányozni kívántam az expressziós mintázat
egyedfejlődésben betöltött szerepét a fejlődési mintázat megzavarásával. A muslica dUTPáz
expressziós mintázatot kialakító mechanizmust érintő vizsgálataim eredményei egyelőre
publikációra való előkészítés alatt állnak.
4.3.1. A dUTPáz promóter vizsgálata S2 sejtvonalban
A feltételezett dUTPáz promóter vizsgálatához a transzkripciós start szekvenciát kódoló
régiótól számított -3 -tól -1048 bázispár hosszú fragmentumot EGFP és luciferáz riporter
rendszerekbe helyeztem. A továbbiakban erre a szakaszra teljes hosszú dUTPáz promóterként
(dutP) fogok hivatkozni, noha elképzelhető, hogy távolabbi régiók is részt vesznek a dUTPáz
transzkripciójának szabályozásában, vagy épp ellenkezőleg, jóval rövidebb szakasz elegendő
lehet a szabályozáshoz. A feltételezett promóter különböző mértékben rövidített változatait is
létrehoztam, és riporter rendszerbe illesztettem. A dutPb és dutP2 konstrukciókban részben
vagy teljesen el lettek távolítva a DRE kötő helyektől 5’ irányban található régiók, a dutP3
konstrukcióban további rövidítéssel a két DRE hely is el lett távolítva. A 3’ irányból rövidített
régiók közül a dutPx2 konstrukció esetén a dUTPáz 5’ UTR szekvenciája, a dutPx1 esetén
pedig további 52 bázispárnyi régió lett eltávolítva. A DRE1 konstrukciót teljes hosszú
dUTPáz prómóter alkotja azzal a különbséggel, hogy a dUTPáz aminosavszekvenciát kódoló
régiótól távolabbi DRE motívum irányított mutagenezissel el lett rontva. Ehhez a
TATCGATA motívum első két nukleotidját GC-re módosítottam. Az irodalmi adatok alapján
ez a mutáció elegendő a kötőhely inaktiválásához 230
. A DRE2 konstrukcióban a kódoló
régióhoz közelebbi, a DRE12 konstrukcióban pedig mindkét DRE motívumot elrontottam
(4.11. ábra).
A promóter-EGFP riporter rendszereket S2 sejtekbe transzfektáltam és stabil
sejtvonalakat hoztam létre, melyekben a plazmidot hordozó sejtek feldúsultak. A promóter
aktivitását az EGFP aktivitás alapján áramlási citométerrel vizsgáltam. Az eredmények a 4.11.
ábra A-panelén láthatóak. A DRE motívumoktól 5’ irányban található régiók eltávolítása nem
eredményezte a promóter aktivitásának jelentős csökkenését. Azonban amennyiben a két DRE
hely is el lett távolítva, a promóter aktivitása drasztikusan lecsökkent közel a promóter nélküli
rendszer szintjére. A DRE motívumok külön-külön történő elrontása is jelentősen
csökkentette a promóter aktivitását, a két elem közül fontosabbnak azonban a dUTPáz
aminosavszekvenciát kódoló régiótól távolabbi DRE1 motívom bizonyult. Mindkét DRE
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
79
motívum elrontása eredményezi a legdrasztikusbb aktivitás csökkenést. A dUTPáz promóter
3’ irányból történő rövidítése is jelentős aktivitás csökkenéssel jár: az 5’ UTR eltávolítása
nagy mértékben csökkenti az aktivitást, ami a további rövidítés esetén közel a promóter
nélküli konstrukció szintjére esik.
4.11. ábra.
A dUTPáz feltételezett promóterének különböző rövidített és mutagenezissel elrontott
verziói riporter rendszerekben. A két DRE motívumot zöld körökkel, az elrontott helyeket
pedig szürke körökkel jelöltem. (A.) A promóter-EGFP riporter rendszerek aktivitása a
rendszert stabilan hordozó S2 sejtvonalakban. (B.) A promórer-luciferáz riporter
rendszerek aktivitása S2 sejtekben. A kétféle megközelítéssel kivitelezett promóter -
riporter rendeszer közel azonos eredményeket adott.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
80
A promóter luciferáz riporter rendszereket szintén S2 sejtekben vizsgáltam. Mivel
ebben az esetben a kevés sikeresen transzfektált sejt is mérhető jelet ad, nem volt szükség a
plazmiddal rendelkező sejtek feldúsítására. Referenciaként az Orgyia pseudotsugata
multicapsid nucleopolyhedrosis virus OpiE2 promóterét használtam. A promóter konstrukciók
a luciferáz rendszerben hasonló eredményt adtak, mint promóter-EGFP rendszerek (4.11. ábra
B). Csupán annyi különbség figyelhető meg, hogy a DRE helyeket érintő mutációk
drasztikusabbak és az 5’ UTR eltávolítása kevésbé csökkenti a promóter aktivitását. Érdekes,
hogy míg a DRE motívumoktól 5’ irányban található régiók eltávolítása az EGFP riporter
rendszerekben enyhe csökkenést, addig a luciferáz riporter rendszerekben enyhe növekedést
eredményezett a promóter aktivitásában.
4.3.2. A dUTPáz promóter stádium-és szövetspecifikus regulálása
A dUTPáz promótert az embrió eredetű S2 sejteken kívül szövetekben is vizsgálni
szerettem volna. Ezért létrehoztam olyan riporter rendszereket, melyekben a promóter az E.
coli eredetű β-galaktozidáz riporter gént hajtja meg. Ezek a rendszerek P-elem transzpozon
integrációs helyekkel rendelkeznek, melyeknek köszönhetően muslica embrióba injektálva a
genomba beépíthetők, és transzgenikus törzsek létrehozására alkalmasak. Háromféle
promóter-β-galaktozidáz riporter rendszert hoztam létre, melyek a teljes hosszú (dutP), a DRE
motívumoktól 5’ irányban csonkított (dutP2) és teljes hosszú, de elrontott DRE motívumokkal
rendelkező promóter fragmentummal rendelkeznek. Mindhárom konstrukcióból számos
párhuzamos transzgenikus törzset hoztunk létre (4.12. ábra és Anyagok és módszerek 3.2.
táblázat). Minden törzsbe véletlenszerű integrációval épültek be a promóter-riporter
rendszerek.
4.12. ábra.
A dUTPáz promóter-β-galaktozidáz riporter rendszerek, és a belőlük létrehozott
párhuzamos transzgenikus törzsek száma.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
81
A promóter-riporter rendeszer működésének embrióban történő vizsgálatában Batki
Júlia is közreműködött. Minden egyes törzsből hím egyedeket gyűjtöttünk, és vad típusú
W1118 szűz nőstényekkel kereszteztük. A keresztezésből származó embriókban ennek
köszönhetően nem kerül be anyai hatású β-galaktozidáz riporter fehérje. Az embriókat
összegyűjtöttük, és X-gal feséssel teszteltük a β-galaktozidáz aktivitást. Az embriók mellett
négyféle harmadik lárvastádiumú szövetet (CNS, szárny imaginális korong, középbél, here
primordium), felnőtt állatból ovárium és here szöveteket is gyűjtöttem és festettem. Az egy
konstrukcióhoz tartozó párhuzamos törzsekből 1-1 kiragadott vonalra jellemző festési
mintázat a 4.13. ábra látható. Az összes törzs szöveti festéseinek eredményeit összefoglalva a
4.14. ábra mutatja, ahol a promóter aktivitását indikáló szöveti festés erősségét is jelöltem.
4.13. ábra.
A dUTPáz promóter-β-galaktozidáz riporter rendszerek expressziós mintázata embrionális,
lárvális és felnőtt szövetekben. A β-galaktozidáz riporter fehérje aktivitását az X-gal
szubsztrát hidrolízisével járó kék elszíneződés indikálja. Az ábrán a párhuzamosan
létrehozott törzsek szöveteinek 1-1 reprezentatív festése lett bemutatva. Az összes törzs
szöveti festéseinek eredményei a 4.14. ábra láthatók.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
82
A promóter aktivitása a CNS, imaginális korong és a középbélben található ventriculus
imaginális gyűrű szövetekben DRE függőnek bizonyult, a DRE12 törzsekben elvétve fordul
4.14. ábra.
A dUTPáz promóter-β-galaktozidáz riporter rendszerek aktivitása embrionális, harmadik
lárva stádiumú CNS, imaginális korong, ventriculus, here primordium, kifejlett ovárium és
here szövetekben. Minden egyes sor külön törzset jelöl, melyek a teljes hosszú (dutP),
DRE motívumoktól 5’ irányban rövidített (dutP2) vagy mutáns DRE motívumokkal
rendelkező promóter-riporter konstrukciók párhuzamos törzsei. Az X-gal festés alapján
megfigyelt β-galaktozidáz aktivitás mértékét kék színskálával jelöltem, ahol a sötétebb kék
nagyobb aktivitást, azaz aktívabb promóterműködést jelent. A nem festődött szöveteket
szürke színnel jelöltem.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
83
elő festődés ezekben a szövetekben. A dutP2 törzsekben a dutP törzsekhez képest ritkábban
fordul elő festődés, és gyengébb, mint a teljes hosszú promóterrel rendelkező konstrukciók
esetén. Ez arra utalhat, hogy a DRE motívumoktól 5’ irányban található régió ezekben a
szövetekben magasabb promóter aktivitást tesz lehetővé. A CNS esetén a legintenzívebb
festődés az optikai lebenyben figyelhető meg, de a központi agy egyéb részein is
megfigyelhető promóter aktivitás (4.13. ábra).
A harmadik stádiumú lárvából izolált here primordiumok DRE és a DRE motívumoktól
5’ irányban található régióktól független promóter aktivitást mutatnak. Hasonló expressziós
mintázatot tapasztaltam az kifejlett állatok gonádjainak esetén is. Mindez arra utalhat, hogy a
a dUTPáz promótere gonádspecifikus reguláló régiókat is tartalmaz. A legegyszerűbb
feltételezés alapján ezek a régiók nem igénylik a DRE motívumokat, és azoktól 3’ irányban
találhatóak. Egy másik lehetőség, hogy a DRE motívumok, és a DRE motívumoktól 5’
irányban található régiók együttesen stimulálják ezekben a szövetekben a promóter
aktivitását. Ennek vizsgálatához létre kell hoznunk olyan promóter-riporter transzgén
törzsekrt, melyekben mind a DRE helyek, mind az azoktól 5’ irányban található régiók el
vannak távolítva. Mind a here primordium, mind a kifejlett állatokból izolált here az apikális
osztódási centrumokban mutatja a legintenzívebb festődést (4.13. ábra). Érdekes, hogy a
kifejlett állatokból izolált herék annak ellenére mutattak erős promóter aktivitást, hogy a
dUTPáz fehérje nem mutatható ki a szövetben. Vilmos Péter in situ hibridizációval kimutatta,
hogy a dUTPáz mRNS szinten sincs jelen a felnőtt állatok heréiben. A dUTPáz gén
feltehetően represszálódik ebben a szövetben, amiért az általam vizsgált 1048 bázispár hosszú
fragmentumon kívüli regulációs hely lehet felelős. Az a kifejlett állatok heréin kívül minden
más szövet a dUTPáz fehérje expressziós mintázatának megfeleltethető promóter aktivitást
mutat (lásd. 4.7. ábra.).
Bár az embrionális eredetű S2 sejtekben jól karakterizálható és DRE-függő módon
működött a vizsgált dUTPáz promóter szakasz, a promóter-riporter allélokat hordozó
transzgén állatok embrionális szöveteire ez nem mondható el. A létrehozott transzgén törzsek
jelentős része egyáltalán nem mutatott promóter aktivitást az embrionális stádiumokban (4.14.
ábra). A többi törzs látszólag a DRE és DRE motívumoktól 5’ irányban található régióktól
független módon kapcsolta be a riporter gént. A festődést mutató egyedek csupán gyenge
aktivitást mutatnak, ami a 13. embrionális stádiumtól jelenik meg. A festődés főleg az embrió
dorzális és anterior régióira korlátozódik, előbbiben szegmentáció is megfigyelhető (4.13.
ábra). A nem egyértelmű festődés és a nagymértékű variancia annak lehet a következménye,
hogy a különböző genomi környezet nagyobb mértékben befolyásolyásolja a riporter
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
84
expresszióját, mint a promóterben található regulációs helyek. Feltehető azonban, hogy az
embrió számára nem fontos a dUTPáz termelése, ugyanis mint ahogy Békési Angéla
kimutatta, az embrióba jelentős mennyiségű dUTPáz mRNS transzportálódik az anyai
hatásnak köszönhetően 215
.
4.3.3. A dUTPáz expressziós reguláció jelentősége
Láthattuk, hogy a dUTPázt expresszáló szövetek minimalizálják az dUMP beélpülését a
DNS-be. Tekintve azonban, hogy a dUTPázt nem expresszáló szövetek tolerálni képesek a
módosult bázisok felhalmozódását a genomjukban kérdéses, hogy a dUTPáz expressziós
mintázat milyen szerepet tölt be az egyed életciklusában. A kérdés megfordítva: van-e
valamilyen élettani jelentősége a DNS-ben megjelenő uracil bázisoknak. E kérdések
megválaszolására olyan muslicatörzsek vizsgálata alkalmas, melyekben a dUTPáz expressziót
megzavarjuk. Muha Villő és Békési Angéla a dUTPáz csendesített muslicák karakterizálása
során megfigyelték, hogy a dUTPáz expresszió teljes állatban történő korlátozása a korai báb,
de legkésőbb az 5. báb stádiumban letalitást okoz. Tehát a dUTPáznak legkésőbb a megfigyelt
letálfázis alatt fontos szerepe van feltehetően a genom uraciltartalmának alacsonyan
tartásában. Az expressziós mintázat megzavarása a csendesítés mellett a fehérje
túltermelésével is megvalósítható. Vizsgálni szerettem volna tehát, hogy a dUTPáz
kifejeződés bekapcsolása milyen hatással van az egyébként nem expresszáló szövetekre.
Erdélyi Miklós és Vilmos Péter segítségével olyan törzseket hoztunk létre, amelyekbe
az élesztő Gal4 transzkripciós faktorral meghajtható, UAS promóterrel rendelkező dUTPáz
allélt integráltuk. A bevitt gén a D. melanogaster dUTPáz nukleáris izoformájának cDNS-ét
foglalja magába. A konstrukció által kódolt fehérje C-terminálisához egy 3xFLAG epitóp tag-
et is fúzionáltunk, hogy expresszióját el tudjuk különíteni az endogén dUTPáz
kifejeződésétől. Két párhuzamos transzgenikus törzset kaptunk, melyekbe a transzgén a
véletlenszerű integrációnak köszönhetően eltérő genomi pozíciókba épült be (DmDut20 és
DmDut29, lásd. Anyagok és módszerek 3.2. táblázat). A dUTPáz túltermelés indukálásához a
törzseket Act-Gal4 vagy MS1096 törzsekkel kereszteztem. Előbbi aktin promóterének
köszönhetően az összes sejtben, utóbbi pedig a szárny diszkusz kifejlett szárny dorzális
felszínét kialakító régiójában és a nyálmirigyekben termeli a Gal4 transzkripciós faktort.
Elviekben tehát mindkét keresztezésből származó utód képes termelni a dUTPázt a
nyálmirigyben, amely alap esetben nem mutat expressziót.
Hogy ellenőrizzem, az indukált egyedek valóban termelik a transzgén fehérjét, a Gal4 és
a dUTPáz-3xFLAG allélokat egyszerre hordozó egyedekből harmadik stádiumú lárvákat
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
85
gyűjtöttem, melyekből nyálmirigyet izoláltam. A szöveteket immuncitokémiával dUTPáz és
FLAG elleni antitestekkel festettem. Míg a vad típusú nyálmirigy csupán az imaginális
gyűrűben mutat festődést, a bekapcsolt expressziójú transzgén állatokból izolált nyálmirigy
egyéb részei is festődnek (4.15. ábra).
Megállapítható tehát, hogy a dUTPáz fehérje valóban kifejeződik a nyálmirigyben, azaz
a termelődést nem befolyásolja érdemben egy esetleges poszttranszkripciós vagy
poszttranszlációs szabályozás.
A teljes állatban illetve a nyálmirigyben dUTPázt túltermelő állatokat megvizsgálva
nem tapasztaltunk a normális egyedektől eltérő fenotípust, sem egyedfejlődési defektust vagy
letalitást. Az állat szöveteinek morfológiája, beleértve a nyálmirigyet a vad típuséval
4.15. ábra.
A muslica dUTPáz-3xFLAG fúziós fehérje túltermelése harmadik stádiumú nyálmirigy
szövetekben. Az első sorban a vad típusú állatok endogén dUTPáz expressziója látható,
ami csupán az imaginális gyűrűre korlátozódik. A második és harmadik sorban az Act-
Gal4 illetve MS1096 driver konstrukciókkal meghajtott dUTPáz-3xFLAG termelődése
látható, ami a teljes nyálmirigy szövetre kiterjed.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
86
megegyező volt. Mindez arra utal, hogy a dUTPáz repressziónak nincs létfontosságú élettani
funkciója az érintett szövetekben.
4.4. A dUTPáz jelentőségének vizsgálata a genom integritásának
megőrzésében
Az irodalmi áttekintésben bemutatott E. coli, S. cerevisiae és C. elegans példák
demonstrálják, hogy a dUTPáz a DNS uraciltartalmának minimalizálásával fontos szerepet
játszik a genom integritásának megőrzésében (lásd. 1.4.1. fejezet). Ezekben az
organizmusokban az uracil-DNS fragmentálásáért és az ezzel járó letalitásért elsősorban az
UNG felelős. Ezzel szemben az emlős sejtek egyedi genom metabolizmusára utalhat az, hogy
életképességüket a dUTPáz csendesítés az eddigi megfigyelések alapján nem csökkenti. A
dUTPáz jelentősége ezekben a sejtekben abban nyilvánul meg, hogy védelmet nyújt a
genotoxikus TS gátló drogokkal szemben. Kérdés, hogy a muslica dUTPáz csendesítése
milyen módon vezet letalitáshoz a korai báb stádiumban, és a letalitás lehet-e az átalakulásban
lévő szövetek genom fragmentálódásának következménye, mint ahogy a többi dUTPáz
hiányos organizmusban is feltételezhető. Ebben az esetben a genom fragmentálódás nem
várható az UNG enzimtől, ugyanis az nincs jelen muslicában. Muha Villő kimutatta, hogy az
embrió szövetek és az embrionális eredetű S2 sejtek tolerálják a nagy mennyiségű uracilt
tartalmazó plazmidok jelenlétét sőt, a rajta kódolt géneket átírni is képesek, ami egybevág
azzal, amit az UNG hiányában várhatunk. Azonban a dUTPáz csendesítés esetén a báb
stádiumban tapasztalható letalitás arra utal, hogy az UNG hiánya ellenére is létezik uracil-
DNS intoleranciát kiváltó mechanizmus muslicában. Ennek az ellentmondásnak a feloldása
érdekében részletesen vizsgálni kívántam a dUTPáz csendesítés által okozott letalitás
molekuláris hátterét.
Ellentmondásosnak tűnik a TS gátló drogok citotoxicitása is abból a szempontból, hogy
milyen enzimek befolyásolják velük szemben a rezisztenciát. Az alapján, hogy a hibáspár
javítás hiánya rezisztenciát biztosít, a dNTP aránytalansát, az alapján pedig, hogy a dUTPáz
csendesítés érzékenyít, az uracil vagy 5FU DNS-be történő beépülését feltételezhetjük a
toxicitás kiváltójának. A két megfigyelés összeegyeztetése érdekében a dUTPáz TS gátló
drogokkal szemben mutatott védő hatását olyan humán sejtvonalakon kívántam vizsgálni,
melyekben a dNTP arányokat nukleozidok hozzáadásával is igyekeztem befolyásolni.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
87
4.4.1. A dUTPáz csendesítés hatása a muslica genom integritására
A dUTPáz csendesítésének hatásait muslicában szövetekre korlátozott és molekuláris
szinten kívántam vizsgálni. A szöveti szintű vizsgálatokhoz szükséges a közvetett hatások
kizárása, amelyre a teljes állatot érintő csendesítés nem ad lehetőséget. Molekuláris szinten
vizsgálni kívántam azt, hogy a csendesítés milyen hatással van a genom integritására valamint
azt, hogy a dUTPáz hiányában a DNS-ben megjelenő uracil milyen sejtválaszokat vált ki. A
vizsgálataim során kapott eredmények túlnyomó részét a PLoS Genetics folyóiratban
közöltük le, további része pedig a Fly folyóiratnál elbírálás alatt áll (lásd. Közlemények
listája).
4.4.1.1. A dUTPáz csendesítés sejtautonóm hatásának kimutatása
A csendesítés során megfigyelt letalitás a csendesítőallél teljes állatban történő
expressziójával volt kiváltható. Szándékomban állt azonban a csendesítés lokális, sejt
autonóm hatásának vizsgálata is. A dUTPáz csendesítőallélok szövet specifikus
expresszálásával kizárhatóak a közvetett és a komplex homeosztázist érintő hatások. A
szövetspecifikus csendesítés indukálásához a 21883 vagy 21884 dUTPáz csendesítőallélokkal
rendelkező törzseket engrailed-Gal4 vagy MS1096-Gal4 driver törzsekkel kereszteztem
(Anyagok és módszerek 3.2. táblázat). Az engrailed promóter a szárny diszkusz a kifejlett
szárny poszterior régióját kialakító részében, míg az MS1096 promóter a szárny diszkusz a
kifejlett szárny dorzális régióját kialakító részében indukálja a dUTPáz csendesítését (4.16.
ábra A). A keresztezésből kikelt kifejlett UAS-RNAi és engrailed-Gal4 allélokat hordozó
kifejlett állatok penetráns deformált szárny fenotípust okoztak. A deformált szárny csupán az
anterior régióban volt ép, a poszterior régió teljesen degradálódott (4.16. ábra B). Azok a
kifejlett egyedek, amelyek az UAS-RNAi és MS1096-Gal4 allélokat hordozzák szintén nagy
arányú szárny deformáltságot mutatnak. Ebben az esetben a szárny deformáltsága felfelé hajló
szárnyak formájában nyilvánult meg, továbbá a csendesített állatok egy kisebb részében
szárny hólyagosodás is megfigyelhető volt (4.16. ábra C). A felfelé hajló szárny a dorzális
szárnyfelszín csökkenésének eredménye lehet, melyet a differenciálódó szárny dorzális
régiójában bekövetkező degradáció okozhatott. A szárnyban megjelenő hólyagok a két
szárnyfelszínt létrehozó sejtrétegek közötti kapcsolódások defektusára utal.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
88
Elmondható tehát, hogy a dUTPáz csendesítés valóban sejt autonóm módon képes a
szövetek degradációját kiváltani. Vizsgálni kívántam, hogy a megfigyelt sejt autonóm
fenotípus menekíthető-e a dUTPáz túltermelésével. Ehhez Erdélyi Miklós és Vilmos Péter
olyan muslica törzseket hozott létre, melyekben a 21883 vagy 21884 csendesítőallélok a
DmDut20 vagy DmDut29 UAS-dUTPáz-3xFLAG allélokkal lettek kombinálva (Anyagok és
4.16. ábra.
(A.) A lárvális szárny diszkusz kifejlett szárnyat kialakító régiói. Az engrailed promóter a
poszterior, az MS1096 promóter a dorzális régióban indukál expressziót. (B.) A
csendesítőallélok (21883 és 21884) valamint a kontrollként használt fluoreszcens
MoeCherry engrailed specifikus expressziójának hatása a szárny fenotípusra. A deformált
szárny a poszterior régió degradálódásának köszönhető. (C.) A csendesítőallélok és azok
dUTPáz túltermelő allélokkal való kombinációinak indukálása MS1096 specifikus módon.
Az ábrán a megfigyelt szárnyfenotípusok előfordulási aránya látható. A deformált szárny
felfelé hajlását a dorzális szárnyfelszín degradációja okozhatta.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
89
módszerek 3.2. táblázat). Ezeket a törzseket az MS1096-Gal4 driver törzzsel kereszteztem. A
kapott utódokban az MS1096-Gal4 egyszerre indukálja a csendesítő és a dUTPáz-3xFLAG
transzgén expresszióját. Mint ahogy a 4.16. ábra C-panelén látható, a dUTPáz túltermelése
minden kombinációban megszüntette a csendesítésre jellemző fenotípust és maradéktalanul
helyreállította a normális szárny fenotípust.
4.4.1.2. A dUTPáz csendesítés okozta fenotípus molekuláris jellemzése
A degradált szárny fenotípus hátterében állhat fokozott sejthalál vagy csökkent
sejtosztódási ráta a fejlődő szárny primordiumban. Hogy ezeket a lehetséges okokat
vizsgálhassam aktin-Gal4 driverekkel indukált dUTPáz csendesített harmadik lárva
stádimumú állatok szöveteit TUNEL vagy BrdU próbával festettem. A TUNEL próba során a
sejtbeli DNS szabad 3’ végek jelölése történik, melyek nagy mennyiségen a genom
fragmentálódásának köszönhetően jelennek meg. Ez a módszer elterjedt az apoptózissal járó
DNS fragmentáció kimutatására. A BrdU próba során a frissen izolált szövetet BrdU-val
kiegészített médiumba helyezzük. A szövet S-fázisban lévő sejtjei a BrdU molekulákat
metabolizálják és beépítik a genomjukba. A DNS-be beépült bromo-uracil antitest festéssel
kimutatható. A módszer a szövetek S-fázisú, azaz aktív osztódást mutató sejtjeinek
kimutatására alkalmas.
Vad típusú és dUTPáz csendesített szárny diszkuszokat TUNEL próbával festettem.
Mint ahogy a 4.17. ábra A- és B-panelén látható, a csendesített imaginális prekurzor
szövetben jóval több TUNEL pozitív sejt mutatható ki. A festés tehát növekedett DNS
fragmentációra utal a dUTPáz hiányos szövetekben. Ezt kétféle mechanizmus
eredményezheti: egy potenciális uracil-DNS felismerő és hasító enzimrendszer, vagy az
apoptózis során a kaszpázok által aktivált DNS degradáció. Mivel a sejtenként detektált erős
festődést nem várnánk a DNS uraciltartalma alapján, inkább a közvetett mechanizmus által
kiváltott sejthalált feltételezhetünk. Utóbbi esettben elmondhatjuk, hogy a dUTPáz hiánya
képes apoptózist kiváltani Drosophila sejtekben.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
90
A sejtosztódási mintázat vizsgálatához vad típusú és dUTPáz csendesített állatok CNS,
szem és szárny imaginális szöveteit festettem BrdU próba segítségével. Mint ahogy a 4.18.
ábra látható, a csendesített és a vad típusú szövetek között nincs kimutatható különbség. Az
osztódási ráta tehát nem mutat csökkenést a dUTPáz csendesített harmadik lárvastádiumú
imaginális szövetekben.
4.17. ábra.
(A.) Vad típusú (W1118) és dUTPáz csendesített (RNAi, felhasznált csendesítőallél:
21883) harmadik stádiumú lárvák szárny diszkuszainak festése TUNEL próbával. A festés
a fragmentált genommal rendelkező sejteket mutatja ki. (B.) A TUNEL pozitív sejtek
átlagos száma vad típusú és dUTPáz csendesített szárny diszkuszokban.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
91
A DNS kettős száltörések vagy a sejtben hosszabb ideig exponált egyes szálú DNS a
DNS károsodás sejtválasz (DDR) ATM vagy ATR kinázait aktiválja. A sejtválasz során
mindkét kináz foszforilálni képes a DNS károsodás közelében található H2AX hisztont. A
foszfo-H2AX hiszton a sejtekben a DNS károsodás fókuszpontjait indikálja. Muslicában a
H2AX fehérjének a H2AV hiszton variáns felel meg. Hogy kimutassam, vajon a dUTPáz
csendesítés hatására aktiválódik-e a DNS károsodás sejtválasz, vad típusú és csendesített
harmadik lárva stádiumú lárvából izolált szárny imaginális korongokat immuncitokémiával,
foszfo-H2AX elleni antitesttel festettem. Míg a vad típusú szövetekben nem sikerült kimutatni
H2AV foszforilációt, a csendesített szövetekben számos foszfo-H2AV fókuszpontot
figyelhetünk meg (4.19. ábra).
4.18. ábra.
Vad típusú (W1118) és dUTPáz csendesített (RNAi, felhasznált csendesítőallél: 21883)
harmadik lárvastádiumú állatokból izolált központi idegrendszer (CNS) és imaginális
diszkuszok festése BrdU próbával. A próba az S-fázisú sejtek jelölésével a szövetek
sejtosztódási mintázatát mutatja ki. A csendesített szövetek nem mutatnak a vad típustól
eltérő osztódási mintázatot. Osztódási zóna figyelhető meg a CNS optikai lebenyében és a
szem imaginális korong morfogenetikus sávjában.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
92
Elmondható tehát, hogy a dUTPáz csendesítés a DDR aktiválódásához és a genom
fragmentálódásához vezet a harmadik lárvastádiumú imaginális szövetekben. Mint ahogy az
irodalmi áttekintésben bemutattam, a DDR sejthalált kiválthat (lásd. 1.5.3. fejezet).
Elképzelhető, hogy a megfigyelt fragmentációért is a DDR által kiváltott apotózis felelős. Bár
a DDR sejciklus leállást is kiválthat (lásd. 1.5.1. fejezet), sejtosztódási mintázatot érintő
változást nem sikerült kimutatni dUTPáz hiányában. Mivel a teljes állatot érintő dUTPáz
4.19. ábra.
Vad típusú (W1118) és dUTPáz csendesített (RNAi, felhasznált csendesítőallél: 21883)
harmadik lárvastádiumú állatokból izolált szárny imaginális diszkuszok festése anti-
foszfo-H2AX (pH2AX) antitesttel. A csendesített szövetekben a muslica H2AX homológ
hiszton variáns fókuszpontokban történő foszforilálódása látható. A felvételeken a szárny
diszkusz zseb (wing pouch) és kapocs (hinge) régiója látható kinagyítva. Az ábrán látható
skála 50 μm távolságot jelöl.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
93
csendesítés letálfázisa a korai báb állapotokat érinti, elképzelhető, hogy a festésekkel
kimutatott jelenségek ebben a stádiumban mutatkoznak meg legnagyobb mértékben.
Lehetséges tehát, hogy a sejtosztódási mintázat a báb állapot alatt már eltér a normálistól,
azaz az osztódás leállásának szerepe a csendesített szövetek degradációjában nem kizárható.
4.4.2. A dUTPáz hozzájárulása az 5-fluorodezoxiuridin toleranciához
A dUTPáz csendesítés hatását a TS gátlással összefüggésben is szerettem volna
vizsgálni. Ismert, hogy a dUTPáz védi a sejteket a TS gátló metabolitok, mint pl. az 5-fluoro-
dUTP genotoxikus hatásaitól (lásd. 1.4.2. fejezet). UNG kiütött E. coli és egér MEF és
sejtekben kimutattam, hogy az 5FdU kezelés a genom uraciltartalmának növekedéséhez vezet
(lásd. 4.1.2. fejezet), ami a TS gátlás következtében megnőtt dUTP készlet expanziójával
magyarázható. A sorba beilleszthető a Muha Villő által kimutatott, Drosophila S2 sejtek
drogkezelése esetén megfigyelhető genomi uracilfelhalmozódás is, ami szintén UNG enzim
hiányában történik. Míg az E. coli-ban, S. cerevisiae-ben és C. elegans-ban elsősorban az
UNG aktivitás, emlős sejtekben inkább a hibáspár javítás felelős a genotoxikus hatás
következtében tapasztalható DNS száltörések megjelenéséhez (lásd. 1.4.2. fejezet). A
hibáspár javítás részvétele arra utal, hogy a TS gátlás a dNTP komponensek arányainak
felborulásához vezet, az aránytalan készletek jelenlétében pedig gyakori hibát vétenek a DNS
polimerázok a replikáció során. Nem világos azonban, hogy a dUTPáz ezt a folyamatot
milyen módon mérsékli, enzimaktivitása során ugyanis az 5FdU metabolit 5-fluoro-dUTP
hidrolízisét katalizálja 5-fluoro-dUMP-vé, ami éppen a TS inhibitora. A hidrolízissel egyúttal
az 5-fluoro-dUMP DNS-be történő beépülését is megakadályozza. A kérdés tehát az, hogy a
módosult nukeotidok bepülése, vagy a dNTP koncentrációk TS gátlásnak köszönhetően
megborult aránya váltja-e ki az 5FdU toxicitást.
A kérdés tisztázásához dUTPáz csendesített humán sejtvonalakat kívántam felhasználni.
Ezekben a sejtvonalakban vizsgálni kívántam, hogy a dezoxiuridin (dU) képes-e menekíteni
az 5FdU toxicitását feltételezve azt, hogy vagy a dU metabolit dUMP kompetitív módon
kiszorítja az 5-fluoro-dUMP-t a TS aktív helyéről, vagy a dUTP kompetitív módon csökkenti
az 5-fluorouracil feldúsulását a DNS-ben. A dUTPáz csendesítés esetén a dU kezelés miatt
feltehetően feldúsult dUTP hatása vizsgálható, ami a TS gátlás esetén akár a dTTP hiányát is
mérsékelheti. A drogkezelések hatását a sejtek életképességének követésével kívántam
vizsgálni.
Mint ahogy a 4.20. ábra A-panelén látható, a vad típusú és a dUTPáz csendesített sejtek
eltérő érzékenységet mutatnak az 5FdU toxicitásra nézve. A dUTPáz csendesített sejtek két
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
94
nagyságrenddel érzékenyebbek a drogkezelésre. Ezzel szemben a dU kezelés semmilyen
kimutatható hatással nincs a sejtvonalak életképességére (4.20. ábra B). A két sejtvonalban
vizsgáltam a dU és dezoxitimidin (dT) hatását az 5FdU toxicitásra. A vad típusú és dUTPáz
csendesített sejteket a IC50 koncentrációban kezeltem 5FdU droggal. A drogkezelés hatását
különböző koncentrációjú dU vagy dT hozzáadásával próbáltam komplementálni. A
várakozásoknak megfelelően, a dT mérsékelte az 5FdU toxicitást. Ezzel szemben az 5FdU
kezelés dU-val történő kiegészítése a dUTPáz csendesítésétől független módon tovább
csökkentette a sejtek életképességét (4.20. ábra C és D).
4.20. ábra.
(A.) 5-fluoro-dezoxiuridin (5FdU) hatása vad típusú és dUTPáz csendesített HeLa sejtek
életképességére. (B.) Dezoxiuridin (dU) hatása vad típusú és dUTPáz csendesített HeLa
sejtek életképességére. (C.) Dezoxitimidin (dT) és dU hatása vad típusú, 200 μM 5FdU
jelenlétében növesztett HeLa sejtek életképességére. (D.) dT és dU hatása dUTPáz
csendesített, 2 μM 5FdU jelenlétében növesztett HeLa sejtek életképességére. Mindkét
sejtvonal esetén elmondható, hogy a dT mérsékli, a dU pedig fokozza az 5FdU toxikus
hatását.
EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA ÉS KIÉRTÉKELÉSE
95
Eredményeink alapján tehát elmondható, hogy a dU kezelés önmagában nem
genotoxikus még a dUTPáz csendesítése esetén sem, noha elképzelhető, hogy a csendesítés
nem elegendő a sejtbeli dUTPáz aktivitás teljes megszüntetéséhez, és a jelentősen
lecsökkentett enzimaktivitás elegendő védelmet biztosít az uracil DNS-beli
felhalmozódásával szemben. Ebben az esetben a dUTPáz funkcióvesztés csupán génkiütött
sejteken vizsgálható. Továbbá annak ellenére, hogy a dU timin analóg bázissal rendelkezik, a
dT-vel szemben nem mérsékli, hanem épp ellenkezőleg, fokozza az 5FdU toxicitását. A dU
tehát valószínűleg a továbbra is fennálló dNTP aránytalanság miatt a DNS-be hibáspárként
épülhetett be, ezáltal fokozva a hibáspár javítás által közvetített toxicitást.
Eredményeinket nem támasztja alá Pettersen és társai megfigyelése, akik hasonló
kísérletben a dU 5FdU toxicitást részlegesen mérséklő hatását mutatták ki 156
. Pettersenék
több sejtvonalat is vizsgáltak, de a mérséklő hatást csak az egyiken sikerült kimutatni, a másik
két sejtvonalon semmilyen hatás nem volt tapasztalható. A megfigyelések közötti eltérést
eredményezhetik a sejtvonalak közötti egyedi különbségek, melyek a drogok felvételét és
konverzióját érinthetik. Hozzá kell tenni, hogy Pettersenék sejtvonalaiban megfigyelhető
5FdU toxicitást más irodalmi adatokkal ellentétben a hibáspár javítás sem befolyásolta, és az
AP-helyek kijavításának és a PARP enzimek gátlása menekítette. Tehát ezekben a sejtekben a
DNS javítási profil is eltérő lehet, ami a kísérlet kimenetelét befolyásolhatta.
ÖSSZEFOGLALÁS, KONKLÚZIÓ
96
5. Összefoglalás, konklúzió
Az elsőként kitűzött cél a DNS-beli uracil kvantitatív kimutatása volt. Ezt az archea
eredetű Pfu DNS polimeráz qPCR-ben való felhasználásával sikerült megvalósítani.
Független módszerrel is ellenőriztem, hogy a módszer valós képet ad az uracil bázisok
előfordulási valószínűségéről DNS-ben (4.3. ábra). Kimutattam, hogy a qPCR-ben
felszaporított fragmentum méretének növelésével a módszer érzékenysége is növelhető (4.2.
ábra B), tehát a várt uraciltartalomnak megfelelően optimalizálható. Elmondható, hogy
fiziológiás mintákban is kimutatható a Pfu DNS polimerázzal detektált DNS összetételbeli
különbség dUTPáz, TS gátlás vagy UNG hiányának következtében. A mért változás minden
esetben magyarázható a génkiütés vagy az enzimgátlás következtében módosult genom
összetételének megváltozásával. A genomi DNS mintaelőkészítése több lépést igényel, mint a
rövid DNS fragmentumoké. Egyrészt szükséges a DNS bizonyos mértékű feldarabolása, a
genomi DNS oldatból történő közvetlen mérés ugyanis nehezen reprodukálható az oldat
inhomogenitása miatt. Másrészt a qPCR-ben vizsgálni kívánt fragmentumot fel kell dúsítani.
Ezzel a lépéssel részben megszabadulunk a nem templátként jelen lévő uracil-DNStől is, ami
gátolja a Pfu DNS polimerázt a PCR reakcióban. A qPCR-en alapuló módszer fontos
jellemzője, hogy az uracil bázisok előfordulási gyakoriságát nem a teljes genomra, hanem
csak primerekkel kijelölt régióra határozza meg. A mért adatok genomra való kiterjesztéséhez
azzal a feltételezéssel kell élnünk, hogy a teljes genomban is a vizsgált szakaszon megfigyelt
uracil előfordulás jellemző. Tekintetbe véve a genom heterogenitását, ez a feltételezés nem
minden esetben tartható. A módszer azonban ennek ellenére is alkalmas arra, hogy a genom
összetételét akár különböző módon befolyásoló hatásokat vizsgáljunk. A behatárolt genomi
régiókra tervezett mérésekkel éppen a genom heterogenitása vizsgálható az uracil előfordulási
gyakoriságára nézve, amennyiben több genomi szakaszon is elvégezzük a mérést. E módszer
publikálását követően mások is sikeresen alkalmazták a Pfu DNS polimerázt uracil-DNS
kimutatására: ezzel a megközelítéssel sikerült kimutatni az uracil bázisok feldúsulását
immnunsejtekben átíródott HIV reverz transzkriptumban 234
.
E. coli mellett a musclia példák alapján is elmondhatjuk, hogy túlnyomórészt a dUTPáz
felelős a DNS uraciltartalmának alacsonyan szinten való tartásában: mint ahogy az dUTPáz
hiánya E. coli-ban UNG mutáns háttéren nagy mértékű DNS-beli uracil felhalmozódást okoz
(4.4. ábra.), muslicában a szöveti dUTPáz expresszió (4.6. ábra.) illetve annak csendesítése
befolyásolja a genom uraciltartalmát (4.7. ábra.és 4.8. ábra.). Ez alátámasztja azt, hogy a
ÖSSZEFOGLALÁS, KONKLÚZIÓ
97
sejtbeli dTTP mellett jelentős mennyiségű dUTP is keletkezik, ami a dUTPáz hiányában nagy
eséllyel hasznosul a DNS szintézis során. Ezzel szemben az UNG hiányos organizmusok
genomi uraciltartamát a vad típussal összevetve (4.4. ábra. és 4.5. ábra.) elmondható, hogy az
UNG alapvetően nem befolyásolja a genom uraciltartalmát. Ez alól csupán az exponenciális
növekedést mutató E. coli volt kivétel. Mint ahogy a MEF sejtek esetén megfigyelhető, az
UNG hatása akkor nyilvánul meg, ha a timidilát metabolizmus zavart szenved, például TS
gátlás esetén (4.5. ábra). Mindezek alapján feltételezetjük, hogy az UNG egy olyan tényező,
amely alapvetően a DNS-beli uraciltartalom expanzióját akadályozza meg.
Mindenképpen ki kell emelni, hogy jelen ismereteink szerint az ecetmuslica az egyetlen
olyan eukarióta organizmus, amely uracil szubsztituált genomot tart fenn bizonyos
szöveteiben. Ugyan az imaginális szövetekben is lehetséges az uracil genomi feldúsítása a
dUTPáz csendesítésével (4.8. ábra.), azonban a letalitás alapján ez csak a báb állapotig
fenntartható. Bár Muha Villő kísérletei alapján tudjuk, hogy embrionális sejtek is képesek
tolerálni az uracil-DNS-t, a genomi uracil-szubsztitúció hatása az embrionális szöveti
fejlődésre egyelőre nem ismert. Az anyai hatásnak és a Gal4 - UAS rendszer korlátainak
köszönhetően ugyanis a dUTPáz embrionális szövetekben való jelenlétét nem sikerült
csökkenteni. Embrióban a dUTPáz genom védő szerepét ováriumban történő csendesítéssel
vagy kondicionális génkiütéssel lehetne vizsgálni a jövőben.
Az uracil-DNS mintázat és a dUTPáz expresszió összevetése alapján elmondhatjuk,
hogy a dUTP kizárása a replikációból elsősorban a nem differenciált sejtekben szükséges. Az
endoreplikációt mutató lárvális differenciált szövetek nem igénylik a dUTPáz jelenlétét.
Emlős differenciált sejtekre is jellemző a csökkent dUTPáz expresszió. Bizonyos DNS- és
retrovírusok melyek differenciált sejtekben replikálódnak vagy reverz transzkriptálódnak,
gyakran saját dUTPázt kódoló génnel rendelkeznek, amivel kompenzálni képesek a magas
sejtbeli dUTP koncentrációt. A szintén nem osztódó T-sejtekben és makrofágokban
replikálódó HIV ezzel szemben éppen a magas celluláris dUTP koncentrációban azaz
alacsony dUTPáz expresszióban érdekelt, ugyanis az ilyen körülmények között reverz
transzkriptált DNS kevésbé hajlamos autointegrációra. Mindez arra is utal, hogy a HIV
integrázra szintén jellemző az uracil-DNS diszkrimináció 234
.
A másik kiemelt célom az volt, hogy feltárjam, a muslica szövetek milyen
mechanizmussal regulálják a dUTPáz expresszióját. Embrió eredetű S2 sejtek és a lárva
imaginális szöveteiben vizsgálva a dUTPáz promóterét arra a következtetésre jutottam, hogy
két potenciális DRE motívum lehet felelős az osztódó sejtekre specifikus dUTPáz
ÖSSZEFOGLALÁS, KONKLÚZIÓ
98
kifejeződésért. Elmondhatjuk, hogy míg számos dNTP metabolizmusban részt vevő gén
sejtciklus függő regulációjáért az E2F transzkripciós faktor felelős (párhuzamba a humán
dUTPáz állítható), a muslica lárva imaginális szöveteiben és az embrió eredetű S2 sejtekben
ezt a feladatot a DREF veheti át. A CNS bár differenciált funkciókkal bír, mint ahogy a 4.18.
ábra mutatja, nagyszámú osztódásban lévő sejtet is tartalmaz, ami indokolja a dUTPáz
expresszió jelenlétét. A 4.13. ábraval való összevetés alapján elmondható, hogy az optikai
lebenyben legintenzívebb a sejtosztódás és a dUTPáz promóter aktivitása. Az S2 sejtekben
végzett kísérletek azt mutatták, hogy mindkét DRE motívum hozzájárul a promóter
aktivitásához, noha a két elem közvetlenül egymás mellett helyezkedik el, ami a két DREF
egyidejű kötését megakadályozhatja. Elképzelhető, hogy az egyszeres DRE motívumhoz
képest a kétszeres hely a DREF nagyobb frekvenciával történő dokkolását teszi lehetővé.
A DRE motívumok szerepét nem minden szövetben sikerült kimutatni. A lárvális és
imágó gonádok DRE független erős expressziót mutattak, ami arra utal, hogy ezekben a
szövetekben a dUTPáz promóter aktiválódását más, gonád specifikus mechanizmusok
stimulálják. Ez a megkülönböztetés érthető annak tükrében, hogy a csíravonalak genomi
DNS-ének több generáción keresztül kell stabilnak lennie. Ellentmondást tapasztaltam az
imágó here dUTPáz expresszió és a dUTPáz promóter aktivitása között: míg az endogén
dUTPáz termelődés nem kimutatható ebben a szövetben, az általam vizsgált promóter-riporter
rendszer bekapcsolódott. Ennek az ellentmondásnak az lehet az oka, hogy az általam
létrehozott promóter-riporter rendszer nem foglalt magába minden transzkripciót reguláló
elemet. Mindenesetre érdekes, hogy ugyan osztódási centrumok találhatók benne, a here
szövet nélkülözi a dUTPáz fehérjét. A jövőben talán érdemes lehet megvizsgálni ebben a
szövetben is az esetleges genomi uracil felhalmozódás mértékét. Elképzelhető, hogy a
megtermékenyített zigótában az anyai kromoszómák uracil-mentesek, míg az apai
kromoszómák uracil szubsztituáltak.
A gonádokon kívül az embrionális szövetekben sem sikerült kimutatni a DRE-függő
dUTPáz promóter aktivitást. Elképzelhető azonban, hogy a vizsgálat szöveti felbontása nem
volt megfelelő, és bizonyos sejttípusok DRE függő módon expresszálják a dUTPázt
embrióban, tekintve, hogy az S2 sejtekben is kimutatható volt ennek a motívumnak a
jelentősége. Az S2 sejtek végső stádiumú embrionális szövetből származnak. Elképzelhető,
hogy ilyen stádiumú embriók részletekbe menő vizsgálata több információt nyújtana DRE
szerepét illetően a dUTPáz embrionális transzkripciós szabályozásáról. A vizsgált promóter-
riporter rendszerek véletlenszerűen, feltehetően a genomi integrációtól főggő módon mutattak
aktivitást. Azok a törzsek, amelyekben a riporter gén aktivitása kimutatható volt, csupán a 13.
ÖSSZEFOGLALÁS, KONKLÚZIÓ
99
stádiumtól kezdtek mutatni többnyire gyenge expressziót. A gyenge vagy nem kimutatható
promóter aktivitásra az is magyarázatot adhat, hogy az embriónak nincs szüksége a dUTPáz
nagymértékű kifejezésére, hiszen hiszen elegendő mennyiségű dUTPáz géntermék anyai
hatásra is bejut az embrióba.
Kérdésként merült fel, hogy a dUTPáz differenciált szövetekben való repressziójának a
lárvális szövetekben van-e valamilyen élettani szerepe. Ez lehet például a metamorfózis során
megkülönböztetendő degradálódásra szánt szövetek kijelölése vagy egyéb, a differenciált
szövetek homeosztázisa szempontjából kedvező funkció. A dUTPáz ezekben a szövetekben
történő túltermelése azonban nem okozott semmilyen megfigyelhető fenotípust. Ez arra utal,
hogy az organizmus számára az expressziós mintázat differenciált kialakítása csupán a
fehérjetermelő erőforrások kímélése szempontjából előnyös, tekintettel a nem expresszáló
lárvális szövetek időszakos szerepére. A differenciált lárvális szövetek genomja feltehetően a
dNTP metabolizmus elhanyagolásával is képes feladatát ellátni. A kérdés részletesebb
megválaszolásához a továbbiakban még ki szeretnénk mutatni azt, hogy a dUTPáz
kifejeződés bekapcsolásával valóban sikerült-e csökkenteni a genom uraciltartalmát
nyálmirigyben. Érdekes lenne jövőben még azt is megvizsgálni, hogy vajon a muslica az
egyéb genom integritását őrző mechanizmusait is kikapcsolja-e ezekben a szöveteiben, pl.
megfigyelhető-e a DNS-beli uracil felhalmozódásához hasonlóan fokozott 8-oxoguanin
felhalmozódás vagy ribonukleotid beépülés. A sejtek öregedése gyakran összefüggésbe
hozható oxidált bázisok DNS-ben történő felhalmozódásával. Ebből a szempontból különösen
érintett lehet a mitokondriális genom, amely különösen kitett oxidatív hatásoknak. Érdekes
volna megvizsgálni, hogy vajon az öregedés folyamatához hozzájárulhat-e a DNS-beli uracil
felhalmozódása. A dUTPáz túltermelése differenciált sejtekben ilyen kérdésekre is választ
adhat a továbbiakban.
Mint ahogy az irodalmi áttekintésben bemutattam, a dNTP fluktuáció nélkülözhetetlen a
sejtciklus zavartalan lefolyásához. Számos dNTP metabolizmusban részt vevő enzim
expressziója lecsökken az S fázison kívül, ami a replikáció normális inicializálásához
szükséges S-fázis előtti dNTP koncentráció csökkenést eredményezi (lásd. 1.3.3. fejezet). A
dUTPáz expresszió sejtciklusfüggő fluktuációjáról nincs adat, azonban mivel a túltermelő
törzsek nem mutattak aberráns fenotípust, feltételezhető, hogy a dUTPáz nem járul hozzá
jelentős mértékben a dNTP fluktuációhoz. Nem kizárható azonban az sem, hogy a sejtbeli
dUTPáz aktivitás valamilyen poszttranszlációs mechanizmusnak köszönhetően mindezek
ellenére fluktuál a sejtciklus során.
ÖSSZEFOGLALÁS, KONKLÚZIÓ
100
Annak ismeretében, hogy a muslica nem rendelkezik UNG fehérjét kódoló génnel
rejtélyesnek tűnt, hogy a dUTPáz csendesítése és genomi uracil felhalmozódása az imaginális
prekurzor szövetekben miért nem indifferens az állat számára. A teljes állatban történő
dUTPáz csendesítés báb letalitást eredményező hatása nehezen értelmezhető az organizmus
komplexitásának köszönhetően. Ezért a letalitás megmagyarázása céljából szövetspecifikus
csendesítést alkalmaztam, mellyel kimutattam, hogy valóban sejtszintű intoleranciáról van
szó. Egyértelmű összefüggést állapíthatunk meg tehát a dUTPáz expresszió és a szöveti
degradáció között. Ez alapján az 5.1. ábra. A dUTPáz expressziós mintázat következményei
muslicában látható modellt állíthatjuk fel.
TUNEL próbával kimutattam, hogy az imaginális prekurzor szövetek sejtjei fokozott
mértékű DNS fragmentálódással reagálnak a dUTPáz csendesítésére (4.17. ábra). Az általunk
alkalmazott mikroszkópiás felbontás valószínűleg csupán az apoptózist kísérő kaszpáz
indukált DNáznak köszönhető DNS fragmentáció kimutatását tette lehetővé, azaz nem
mondható ki, hogy közvetlenül az uracil-DNS processzálódását figyeltük meg. Mindezek
mellett sikerült kimutatnunk a H2AV foszforilációt dUTPáz csendesített szövetekben (4.19.
ábra). A H2AV foszforiláció a DNS kettős száltörés aktivált ATM vagy a huzamosabb ideig
megjelnő egyes szálú DNS által aktivált ATR kinázoknak köszönhető (lásd. 1.5. fejezet).
Jelen esetben az ATR útvonal aktiválódása valószínűbb, tekintve, hogy a dNTP metabolizmus
zavara az érintett javítómechanizmusok ismeretében elsősorban egyes száltöréseket, esetleg
DNS polimeráz leállást eredményezhet. A dUTPáz csendesítés C. elegans-ban is az ATR
útvonalhoz tartozó Chk1 és Clk2 gének csendesítésével volt részben menekíthető 137
. A
gyakori egyes száltörések a DNS-ben azonban bizonyos valószínűséggel kettős száltörések
megjelenéséhez is vezethetnek, tehát kisebb valószínűséggel ugyan, de az ATM útvonal is
aktiválódhat dUTPáz hiányában. Jelen ismereteink szerint a C. elegans mellett a muslica az
egyetlen organizmus, amelyben a dUTPáz hiány következtében kiváltott DDR sejtválaszt
kimutatták.
ÖSSZEFOGLALÁS, KONKLÚZIÓ
101
Mint ahogy az irodalmi áttekintésben bemutatásra került, a DDR sejtciklus blokkot
képes kiváltani (lásd. 1.5.1. fejezet). Ennek ellenére nem sikerült a dUTPáz csendesített
imaginális szövetekben perturbált osztódási mintázatot kimutatni (4.18. ábra). Ha figyelembe
vesszük, hogy a harmadik lárva stádiumú szárny diszkuszban még csak kis számú foszfo-
5.1. ábra. A dUTPáz expressziós mintázat következményei muslicában
Az ábrán korábbi ismereteink és a dolgozat főbb eredményeinek összefoglalása látható. A
lárva stádiumok alatt a pirossal jelölt szövetek mutatnak dUTPáz expressziót. Ezek
többnyire nem differenciált imaginális prekurzor szövetek, a gén kifejeződése pedig
dolgozatban bemutatott eredmények alapján a gonádoktól eltekintve a DNS replikáció
kapcsolt elem (DRE) által szabályozott. Eredményeink alapján elmondható, hogy a
dUTPáz expressziót nem mutató differenciált vagy csendesített nem differenciált szövetek
uracilt halmoznak fel genomjukban. Emellett a dUTPáz kifejezése szükséges ahhoz, hogy
a nem differenciált szövetek a metamorfózis során a kifejlett állat szöveteit kialakítsák.
dUTPáz hiányban a szövetek degradálódnak, amiért az imaginális prekurzor szövetek
esetén feltehetően az uracil-DNS által kiváltott DNS károsodás sejtválasz (DDR) felelős.
A dUTPázt nem kifejező differenciált szövetek szintén degradálódnak, azonban ez a
folyamat a dUTPáztól független.
ÖSSZEFOGLALÁS, KONKLÚZIÓ
102
H2AV pozitív sejt volt jelen, elképzelhető, hogy ennyi sejt osztódásának leállása még nem
kimutatható a BrdU próbával. Akár a sejtciklus blokk, akár intenzív sejthalál áll a dUTPáz
csendesített imaginális szövetek degradálódása hátterében, azt a báb állapotban kellene
vizsgálni. Ez talán a csendesített szövetek metamorfózisának ex vivo vizsgálatával lesz
megvalósítható.
Továbbra sem ismert, hogy mi lehet az a mechanizmus, ami a dUTPáz csendesítés
letálfázisa (azaz a késői lárva illetve báb stádium) alatt vagy az imaginális korongokban az
uracil-DNS intoleranciáért felelős lehet. A BER enzimek közül a muslicában az egyedül jelen
lévő két uracil-DNS glikoziláz, a SMUG és a TDG homológ Thd1 lehet képes az uracil-DNS
processzálására. Utóbbi elsősorban hibáspárban lévő uracil bázisokat vág ki a DNS-ből, és
csak jóval kisebb aktivitással processzál A:U bázispárokat 96
. Amennyiben a dUTPáz hiánya
súlyos dNTP aránytalanságot is maga után von, a dUMP hibáspárként is beépülhet, ami a
Thd1 és a hibáspár javítás enzimeinek aktiválódására teheti érzékennyé a genom épségét. A
BER komponensként is funkcionáló WRN helikáz a BER során nem szükségszerűen
hasznosuló exonukleáz aktivitással is rendelkezik (lásd. 1.2.4.2 fejezet). A muslicában
található WRN exonukleáz aktivitását azonban gátolja a DNS-ben jelen lévő uracil 103
. Bár a
DDR sejtválasszal nehéz összefüggésbe hozni felmerülhet, hogy a helikáz ezen tulajdonsága
hozzájárulhat-e az uracil-DNS intoleranciához. Ezen kérdés megválaszolásához érdemes lehet
a dUTPáz és a WRN genetikai kölcsönhatását megvizsgálni csendesítő vagy mutáns allélok
felhasználásával.
Az 5FdU a timidilát bioszintétis jól ismert gátlószere, toxicitásának mechanizmusa
gerincesekben azonban vizsgálatra szorul. Emlős és csirke sejtekben kétféle komponens
befolyásolja az 5FdU szenzitivitást: a hibáspár javítás és a dUTPáz expresszió. A hibáspár
javítás kiütése esetén megfigyelhető rezisztencia a dNTP készlet aránytalanságának, a
dUTPáz csendesítés esetén megfigyelhető szenzitivitás pedig az 5-fluoro-dUMP beépülésének
köszönhető toxicitásra utal. A két mechanizmus azért látszik ellentmondásosnak, mert az
aránytalan dNTP készlet jelenlétében szintetizált DNS-be beépülő bármely nukleotid
hajlamos lehet hibáspárt kialakítani, nem egyértelmű tehát, hogy miért lenne kiemelt
jelentőségű ezek közül az 5-fluoro-dUMP. Amennyiben csupán az 5-fluoro-dUMP beépülése
toxikus, feltételezhető hogy dU kezelés a dUTP koncentráció növelésével csökkenteni képes a
toxicitást, mérsékelve a beépülés mértékét. Emellett a dU metabolit dUMP az 5-fluoro-
dUMP-vel versengve a TS gátlását is mérsékelheti, helyreállítva a normális dNTP arányokat.
ÖSSZEFOGLALÁS, KONKLÚZIÓ
103
A dU timin analógként is kompenzálhatja a dTTP hiányát. Az ilyen módon komplementált
rendszerben reméltük, hogy vizsgálható az uracil szubsztitúció hatása humán sejtekben is.
Ezekből a feltételezésekből kiindulva vizsgáltuk a dU vagy a dU és 5FdU kombinált kezelés
hatását. Kísérleteink során dUTPáz csendesített humán sejtvonalat is felhasználtunk,
feltételezve, ezekben a sejtekben a dUTPáz nem befolyásolja a dU és 5FdU metabolizmust.
Az 5FdU toxicitást a dU kezelés a várakozásokkal ellentétben nem mérsékelte, hanem
tovább növelte fügetenül a dUTPáz csendesítétől. Ez egyrészt arra utal, hogy a dUMP nem
volt képes a TS gátlást mérsékelni, noha a dUTPáz csendesített sejtek esetén három
nagyságrenddel több dU volt jelen a médiumban, mint 5FdU, és a TS hasonló nagyságrenddel
képes 5-fluoro-dUMP-t kötni, mint dUMP-t 235
. Másrészt, az eredmények arra is utalnak,
hogy az 5-fluoro-dUMP mellett a dUMP DNS-be történő beépülése is toxikus, amennyiben a
TS gátova van. A dU kezelés önmagában nem befolyásolta a sejtek életkésességét még a
dUTPáz csendesítés esetén sem. Elképzelhető, hogy a dUTPáz a csendesített sejtvonalban is
hatékonyan akadályozta meg az uracil falhalmozódását a DNS-ben. Ennek a tisztázásához a
kezelt sejtek genomi uraciltartalmának megmérése szükséges. Amennyiben bebizonyosodik,
hogy a dUMP beépülés önmagában nem veszélyezteti a sejt életképességét, kimondhatjuk,
hogy csak az aránytalan dNTP komponensek jelenlétében szintetizált uracil vagy 5FU-t
tartalmazó hibáspárok feldúsulása és kijavítása veszélyezteti a genom integritását humán
sejtekben. Az aránytalan dNTP készlet mellett a DNS polimeráz hajlamos lehet a
leggyakrabban előforduló dNTP komponenst hibáspárba beépíteni, TS gátlás esetén pedig ez
a komponens a dUTP vagy 5-fluoro dUTP lehet. A dUTPáz ebben az esetben az 5-fluoro-
dUTP vagy dUTP túlsúly mérséklésében játszhat fontos szerepet. Ez összeegyeztethető
azokkal a megfigyelésekkel, hogy a TS gátló antifolátok toxicitását is csökkenti a dUTPáz
túltermelése 22,147
. Ezekben az esetekben a TS gátlás következtében szintén kialakuló dNTP
aránytalanság mellett a dUTP hibáspárként történő beépülését akadályozhatja a dUTPáz. A
fluoropirimidinek által kiváltott genotoxicitás hatásmechanizmusára Meyers és társai
állítottek fel egy modellt, melyben a DNS-ben megjelenő hibáspár és annak javítása kap
kiemelt szerepet 33
. Ez a modell a fenti ismeretek tükrében az 5.2. ábrán látható módon
egészíthető ki azzal, hogy a felborult dNTP egyensúly a magas dUTP koncentráció mellett
eredményezi a toxikus hibáspárok megjelenését. A dUTPáz szerepe ebben a folyamatban
tehát a szubsztrátok távoltartása a DNS polimeráztól, ilyen körülmények között ugyanis csak
mutációkkal terhelt DNS szintézis lehetséges. Az, hogy a dU kezelés kapcsán
eredményeinkkel ellentondásos irodalmi adat is létezik 156
arra utal, hogy a fenti modell nem
általánosítható minden sejtvonalra, mivel egyéni eltérések előfordulhatnak a drogok
ÖSSZEFOGLALÁS, KONKLÚZIÓ
104
metabolizmusát és a DNS javítási profilt illetően. Szükséges tehát minél több sejtvonalon
elvégezni a kísérleteket, hogy teljes körű képet kapjunk. A különböző tumorok metabolikus és
DNS javító profilja alapján hatékonyabb stratégia dolgozható ki a terápiás kezelésre. Az a
megfigyelés, hogy a TS gátlás dU kiegészítésével a toxicitás szempontjából hatékonyabbá
tehető, szintén tanulságos lehet tumoros sejtek kemoterápiás kezelése kapcsán.
Mindent összefoglalva, eredményeim az irodalmi adatokkal összevetve azt mutatják,
hogy a dUTPáz létfontosságú osztódó sejtek genom integritásának megőrzésében. Ezen túl a
dUTPáz a normális dUTP/dTTP egyensúlyának beállítása mellett az aránytalan dNTP készlet
toxicitását is képes lehet mérsékelni. Ennek köszönhetően jelentősége potenciálisan
kapcsolatba hozható a karcinogenezis és a sejt öregedés folyamataival.
5.2. ábra. A timidilát szintáz gátlás által kiváltott genotoxicitás feltételezett
hatásmechanizmusa emlős sejtekben
Az ábrán az irodalmi adatok és a dolgozatban bemutatott emlős sejteken végzett kísérletek
eredményeinek összefoglalása látható. A timidilát szintáz gátlás során a hibáspárok DNS-
be történő nagy arányú beépüléséhez két tényező szükséges: a felborult dNTP egyenúly és
a magas dUTP (vagy 5-fluoro-dUTP) koncentráció. A dUTPáz szerepe az utóbbi tényező
minimalizálása, ezáltal csökkenti annak a lehetőségét, hogy a DNS polimeráz
szubsztráthoz férjen hozzá. Ezáltal a DNS polimeráz a felborult dNTP egyensúly mellett
kevesebb bázist tud a DNS-be hibásan beépíteni. A beépült hibáspárok főleg a hibáspár
javítómechanizmusnak köszönhetően jelentenek veszélyt a DNS épségére, de van irodalmi
példa a báziskivágó javítás által közvetített intoleranciára is (lásd. 1.4.2. fejezet). A
folyamat a DNS károsodás sejtválaszt váltja ki, ami sejtciklus leállást vagy sejthalált vált
ki. Az ábra a Meyers és társai által feltételezett modell kiegészítése 33
.
105
6. Összegzés
A pontos és stabil DNS szintézis a dNTP készlet precíz szabályozását igényi. A
szabályozás magába foglalja a sejtciklus vagy DNS javítás függő DNS szintézis dNTP
igényének kielégítését, a dNTP komponensek arányának fenntartását és a módosult
nukleotidok készletből történő eltávolítását. A szabályozás megzavarása DNS hibák
megjelenését eredményezi, melyek a genom épségét veszélyeztetik a báziskivágó javítás
(BER) vagy a hibáspár javítás mechanizmusoknak köszönhetően. A folyamat során
aktiválódik a DNS károsodás sejtválasz, ami a sejtciklus leállását vagy sejthalált képes
kiváltani. A dNTP metabolizmuson belül elkülöníthető a timidilát metabolizmus, mely
lehetővé teszi, hogy a DNS az RNS-el ellentétben uracil helyett timin bázisokkal kódolja a
genetikai információt. Ezt alapvetően három komponens teszi lehetővé: a timidilát szintáz a
dTTP szintézisben betöltött szerepével, a dUTPáz a dUTP készlet hidrolizálásával és a BER
enzim UNG a DNS uracil bázisainak eltávolításával. Többnyire az utóbbi komponens hiánya
teszi lehetővé, hogy uracil-DNS hosszabb távon is létezhessen a sejtekben.
Az e dolgozatban bemutatott, általam kifejlesztett archea replikatív polimerázok uracil-
DNA diszkrimináló tulajdonságán alapuló módszer alkalmasnak bizonyult a fenti
komponensek defektusai következtében a DNS-ben felhalmozódó uracil kimutatására.
Korábbi adataink alapján ismertük, hogy az ecetmuslica a három komponens közül az UNG
enzimmel nem rendelkezik és a dUTPáz csak bizonyos stádiumokban és szövetekben
expresszálódik. Kimutattuk, hogy ennek megfelelően a DNS uraciltartalma a dUTPáz
expressziótól függ. Vizsgáltam a dUTPáz expressziós mintázatáért felelős transzkripció
regulációs mechanizmust. Eredményeim arra utalnak, hogy a muslica dUTPáz promóterében
található DRE motívum felelős az osztódó sejtekre korlátozódó expresszióért, ugyanakkor
lehet egy ettől független gonádspecifikus szabályozás is.
Az eddig vizsgált organizmusokban a dUTPáz hiánya letálisnak bizonyul. Ez
elmondható az ecetmuslicáról is. Azonban míg a többi organizmusban a letalitásért az UNG
felelős, musclicában e mögött az UNG hiányának ismeretében más mechanizmus állhat.
Kimutattam, hogy a dUTPáz csendesítés sejtautonóm szöveti degradációhoz vezet a báb
állapot alatt. Ezen túl a csendesített osztódó szövetekben a genomi DNS uraciltartalmának
növekedését, DNS fragmentációt és a DNS károsodás sejtválasz aktiválódását is kimutattuk.
A dUTPáz genom integritását fenntartó funkcióját dUTPáz csendesített és timidilát
szintáz gátolt humán sejtvonalban is vizsgáltam. Az eredmények további lehetőségeket vetnek
fel a tumor sejtvonalakban kiváltható genotoxicitással kapcsolatban.
106
7. Summary
Accurate and stable DNA synthesis requires the precise regulation of dNTP pool. This
regulation involves i) meeting the requirements of cell cycle or DNA repair dependent DNA
synthesis, ii) the maintenance of the proper ratio of dNTP components, and iii) the elimination
of the modified nucleotides from the pool. Perturbed regulation results in the appearance of
DNA lesions compromising genome integrity mostly by base excision (BER) or mismatch
repair. Under perturbed conditions, DNA damage response is activated that induces cell cycle
arrest or cell death.
dNTP metabolism includes the thymidylate boisythesis pathway that, unlike in RNA,
allows the usage of urail bases instead of thymine in genetic information of DNA. Three
components have key functions in this regard: i) thymidylate synthase is involved in dTTP
synthesis, ii) dUTPase eliminates dUTP pool, and iii) the BER enzyme UNG excise uracil
bases from DNA. Knock out of the latter component usually allows persistent appearance of
uracil-DNA in cells.
In this study I introduce a novel method that allows detection of uracil accumulation in
DNA of organisms perturbed in the components above. This method is based on the uracil-
DNA discriminating feature of archea DNA polymerases. From previous observations we
learned that the fruit fly lacks UNG from the three components and possess only a statio-
temporal expression of dUTPase. We showed that the uracil content of DNA depends only on
dUTPase expression in this organism. I also examined the transcriptional regulatory
mechanism that forms dUTPase expression pattern. My results suggest that DRE motifs
located in dUTPase promoter may be responsible for expression in proliferating cell types, but
there might be a DRE independent gonad-specific regulation as well.
Defects of dUTPase have shown to be lethal in any organisms examined so far,
including fruit fly. While UNG was proven to be responsible for lethality in most of the
organisms, a different mechanism must be responsible for that in fruit fly, since they lack
UNG. I showed that dUTPase silencing causes cell autonomous tissue degradation during
pupal stages. Furthermore, we showed genomic uracil accumulation, DNA fragmentation and
DNA damage response activation in silenced proliferating tissues.
I examined the genome integrity protecting function of dUTPase in dUTPase silenced
and thymidylate synthase inhibited human cell line as well. Our results propose further
potentials to induce genotoxicity in tumor cell lines.
107
8. Irodalomjegyzék
1. Kolberg, M., Strand, K. R., Graff, P. & Andersson, K. K. Structure, function, and
mechanism of ribonucleotide reductases. Biochimica et biophysica acta 1699, 1–34
(2004).
2. Holmgren, A. & Sengupta, R. The use of thiols by ribonucleotide reductase. Free
radical biology & medicine 49, 1617–28 (2010).
3. Fairman, J. W. et al. Structural basis for allosteric regulation of human ribonucleotide
reductase by nucleotide-induced oligomerization. Nature structural & molecular
biology 18, 316–22 (2011).
4. Logan, D. T. Closing the circle on ribonucleotide reductases. Nature structural &
molecular biology 18, 251–3 (2011).
5. Hofer, A., Crona, M., Logan, D. T. & Sjöberg, B.-M. DNA building blocks: keeping
control of manufacture. Critical reviews in biochemistry and molecular biology 47, 50–
63 (2012).
6. Kumar, D., Viberg, J., Nilsson, A. K. & Chabes, A. Highly mutagenic and severely
imbalanced dNTP pools can escape detection by the S-phase checkpoint. Nucleic acids
research 38, 3975–83 (2010).
7. Lacombe, M. L., Milon, L., Munier, A., Mehus, J. G. & Lambeth, D. O. The human
Nm23/nucleoside diphosphate kinases. Journal of bioenergetics and biomembranes 32,
247–58 (2000).
8. Weiner, K. X., Weiner, R. S., Maley, F. & Maley, G. F. Primary structure of human
deoxycytidylate deaminase and overexpression of its functional protein in Escherichia
coli. The Journal of biological chemistry 268, 12983–9 (1993).
9. Ellims, P. H., Kao, A. Y. & Chabner, B. A. Deoxycytidylate deaminase. Purification
and some properties of the enzyme isolated from human spleen. The Journal of
biological chemistry 256, 6335–40 (1981).
10. Jackson, R. C. The regulation of thymidylate biosynthesis in Novikoff hepatoma cells
and the effects of amethopterin, 5-fluorodeoxyuridine, and 3-deazauridine. The Journal
of biological chemistry 253, 7440–6 (1978).
11. Bianchi, V., Pontis, E. & Reichard, P. Regulation of pyrimidine deoxyribonucleotide
metabolism by substrate cycles in dCMP deaminase-deficient V79 hamster cells.
Molecular and cellular biology 7, 4218–24 (1987).
12. Weinberg, G., Ullman, B. & Martin, D. W. Mutator phenotypes in mammalian cell
mutants with distinct biochemical defects and abnormal deoxyribonucleoside
triphosphate pools. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 78, 2447–51 (1981).
13. Darè, E., Zhang, L. H., Jenssen, D. & Bianchi, V. Molecular analysis of mutations in
the hprt gene of V79 hamster fibroblasts: effects of imbalances in the dCTP, dGTP and
dTTP pools. Journal of molecular biology 252, 514–21 (1995).
14. Moroz, O. V et al. Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of
all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential “house-cleaning” functions.
Journal of molecular biology 347, 243–55 (2005).
108
15. Nonaka, M., Tsuchimoto, D., Sakumi, K. & Nakabeppu, Y. Mouse RS21-C6 is a
mammalian 2’-deoxycytidine 5'-triphosphate pyrophosphohydrolase that prefers 5-
iodocytosine. The FEBS journal 276, 1654–66 (2009).
16. Siggaard, J. H. B. et al. Concerted bifunctionality of the dCTP deaminase-dUTPase
from Methanocaldococcus jannaschii: a structural and pre-steady state kinetic analysis.
Archives of biochemistry and biophysics 490, 42–9 (2009).
17. Helt, S. S. et al. Mechanism of dTTP inhibition of the bifunctional dCTP
deaminase:dUTPase encoded by Mycobacterium tuberculosis. Journal of molecular
biology 376, 554–69 (2008).
18. Johansson, E. et al. Structures of dCTP deaminase from Escherichia coli with bound
substrate and product: reaction mechanism and determinants of mono- and
bifunctionality for a family of enzymes. The Journal of biological chemistry 280,
3051–9 (2005).
19. Vértessy, B. G. & Tóth, J. Keeping uracil out of DNA: physiological role, structure and
catalytic mechanism of dUTPases. Accounts of chemical research 42, 97–106 (2009).
20. Baldo, A. M. & McClure, M. A. Evolution and horizontal transfer of dUTPase-
encoding genes in viruses and their hosts. Journal of virology 73, 7710–21 (1999).
21. Canman, C. E., Lawrence, T. S., Shewach, D. S., Tang, H. Y. & Maybaum, J.
Resistance to fluorodeoxyuridine-induced DNA damage and cytotoxicity correlates
with an elevation of deoxyuridine triphosphatase activity and failure to accumulate
deoxyuridine triphosphate. Cancer research 53, 5219–24 (1993).
22. Webley, S. D., Hardcastle, A., Ladner, R. D., Jackman, a L. & Aherne, G. W.
Deoxyuridine triphosphatase (dUTPase) expression and sensitivity to the thymidylate
synthase (TS) inhibitor ZD9331. British journal of cancer 83, 792–9 (2000).
23. Wilson, P. M., Labonte, M. J., Lenz, H.-J., Mack, P. C. & Ladner, R. D. Inhibition of
dUTPase Induces Synthetic Lethality with Thymidylate Synthase-Targeted Therapies
in Non-Small Cell Lung Cancer. Molecular cancer therapeutics 11, 616–28 (2012).
24. Studebaker, a W., Lafuse, W. P., Kloesel, R. & Williams, M. V Modulation of human
dUTPase using small interfering RNA. Biochemical and biophysical research
communications 327, 306–10 (2005).
25. Koehler, S. E. & Ladner, R. D. Small interfering RNA-mediated suppression of
dUTPase sensitizes cancer cell lines to thymidylate synthase inhibition. Molecular
pharmacology 66, 620–6 (2004).
26. Andersson, J., Westman, M., Hofer, A. & Sjoberg, B. M. Allosteric regulation of the
class III anaerobic ribonucleotide reductase from bacteriophage T4. The Journal of
biological chemistry 275, 19443–8 (2000).
27. Ivanetich, K. M. & Santi, D. V. Recent Studies on Thymidylate Synthase. Annals of the
New York Academy of Sciences 569, 201–210 (1989).
28. Escartin, F., Skouloubris, S., Liebl, U. & Myllykallio, H. Flavin-dependent thymidylate
synthase X limits chromosomal DNA replication. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 105, 9948–52 (2008).
29. MacFarlane, A. J. et al. Nuclear localization of de novo thymidylate biosynthesis
pathway is required to prevent uracil accumulation in DNA. The Journal of biological
chemistry 286, 44015–22 (2011).
109
30. Fenech, M. Folate (vitamin B9) and vitamin B12 and their function in the maintenance
of nuclear and mitochondrial genome integrity. Mutation research 1–13
(2011).doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.11.003
31. Anderson, D. D., Woeller, C. F., Chiang, E.-P., Shane, B. & Stover, P. J. Serine
hydroxymethyltransferase anchors de novo thymidylate synthesis pathway to nuclear
lamina for DNA synthesis. The Journal of biological chemistry 287, 7051–62 (2012).
32. Yoshioka, A. et al. Deoxyribonucleoside triphosphate imbalance. 5-
Fluorodeoxyuridine-induced DNA double strand breaks in mouse FM3A cells and the
mechanism of cell death. The Journal of biological chemistry 262, 8235–41 (1987).
33. Meyers, M. et al. A role for DNA mismatch repair in sensing and responding to
fluoropyrimidine damage. Oncogene 22, 7376–88 (2003).
34. Elstein, K. H. et al. Nucleoside-mediated mitigation of 5-fluorouracil-induced toxicity
in synchronized murine erythroleukemic cells. Toxicology and applied pharmacology
146, 29–39 (1997).
35. Grogan, B. C., Parker, J. B., Guminski, A. F. & Stivers, J. T. Effect of the thymidylate
synthase inhibitors on dUTP and TTP pool levels and the activities of DNA repair
glycosylases on uracil and 5-fluorouracil in DNA. Biochemistry 50, 618–27 (2011).
36. Wilson, P. M. et al. Novel opportunities for thymidylate metabolism as a therapeutic
target. Molecular cancer therapeutics 7, 3029–37 (2008).
37. Blount, B. C. & Ames, B. N. DNA damage in folate deficiency. Baillière’s clinical
haematology 8, 461–78 (1995).
38. Chen, V. J. et al. Preclinical cellular pharmacology of LY231514 (MTA): a
comparison with methotrexate, LY309887 and raltitrexed for their effects on
intracellular folate and nucleoside triphosphate pools in CCRF-CEM cells. British
journal of cancer 78 Suppl 3, 27–34 (1998).
39. Oliver, F. J., Collins, M. K. & López-Rivas, A. Overexpression of a heterologous
thymidine kinase delays apoptosis induced by factor deprivation and inhibitors of
deoxynucleotide metabolism. The Journal of biological chemistry 272, 10624–30
(1997).
40. Tinkelenberg, B. a, Hansbury, M. J. & Ladner, R. D. dUTPase and uracil-DNA
glycosylase are central modulators of antifolate toxicity in Saccharomyces cerevisiae.
Cancer research 62, 4909–15 (2002).
41. Curtin, N. J., Harris, a L. & Aherne, G. W. Mechanism of cell death following
thymidylate synthase inhibition: 2’-deoxyuridine-5'-triphosphate accumulation, DNA
damage, and growth inhibition following exposure to CB3717 and dipyridamole.
Cancer research 51, 2346–52 (1991).
42. Van Rompay, a R., Johansson, M. & Karlsson, A. Phosphorylation of nucleosides and
nucleoside analogs by mammalian nucleoside monophosphate kinases. Pharmacology
& therapeutics 87, 189–98 (2000).
43. Sandrini, M. P. B. & Piskur, J. Deoxyribonucleoside kinases: two enzyme families
catalyze the same reaction. Trends in biochemical sciences 30, 225–8 (2005).
44. Bouzon, M. & Marlière, P. Human deoxycytidine kinase as a conditional mutator in
Escherichia coli. Comptes rendus de l’Académie des sciences. Série III, Sciences de la
vie 320, 427–34 (1997).
110
45. Legent, K. et al. In vivo analysis of Drosophila deoxyribonucleoside kinase function in
cell cycle, cell survival and anti-cancer drugs resistance. Cell cycle (Georgetown, Tex.)
5, 740–9 (2006).
46. Meuth, M. Deoxycytidine kinase-deficient mutants of Chinese hamster ovary cells are
hypersensitive to DNA alkylating agents. Mutation research 110, 383–91 (1983).
47. Liou, J.-Y., Krishnan, P., Hsieh, C.-C., Dutschman, G. E. & Cheng, Y.-C. Assessment
of the effect of phosphorylated metabolites of anti-human immunodeficiency virus and
anti-hepatitis B virus pyrimidine analogs on the behavior of human deoxycytidylate
deaminase. Molecular pharmacology 63, 105–10 (2003).
48. Jansen, R. S., Rosing, H., Schellens, J. H. M. & Beijnen, J. H. Deoxyuridine analog
nucleotides in deoxycytidine analog treatment: secondary active metabolites?
Fundamental & clinical pharmacology 25, 172–85 (2011).
49. Mathews, C. K. DNA precursor metabolism and genomic stability. FASEB journal :
official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology
20, 1300–14 (2006).
50. Zhang, X. & Mathews, C. K. Natural DNA precursor pool asymmetry and base
sequence context as determinants of replication fidelity. The Journal of biological
chemistry 270, 8401–4 (1995).
51. Bebenek, K., Roberts, J. D. & Kunkel, T. a The effects of dNTP pool imbalances on
frameshift fidelity during DNA replication. The Journal of biological chemistry 267,
3589–96 (1992).
52. Lu, Q., Zhang, X., Almaula, N., Mathews, C. K. & Inouye, M. The gene for nucleoside
diphosphate kinase functions as a mutator gene in Escherichia coli. Journal of
molecular biology 254, 337–41 (1995).
53. Miller, J. H. et al. Escherichia coli strains (ndk) lacking nucleoside diphosphate kinase
are powerful mutators for base substitutions and frameshifts in mismatch-repair-
deficient strains. Genetics 162, 5–13 (2002).
54. Meyers, M. et al. DNA mismatch repair-dependent response to fluoropyrimidine-
generated damage. The Journal of biological chemistry 280, 5516–26 (2005).
55. Katafuchi, A. & Nohmi, T. DNA polymerases involved in the incorporation of
oxidized nucleotides into DNA: their efficiency and template base preference. Mutation
research 703, 24–31 (2010).
56. Purmal, A. A., Kow, Y. W. & Wallace, S. S. 5-Hydroxypyrimidine deoxynucleoside
triphosphates are more efficiently incorporated into DNA by exonuclease-free Klenow
fragment than 8-oxopurine deoxynucleoside triphosphates. Nucleic acids research 22,
3930–5 (1994).
57. Vilpo, J. A. & Vilpo, L. M. Metabolism, incorporation into DNA, and interactions with
1-beta-D-arabinofuranosylcytosine of 5-hydroxymethyl-2’-deoxyuridine in human
promyelocytic leukemia cells (HL-60). Cancer research 48, 3117–22 (1988).
58. Dunham, L. T. & Price, A. R. Mutants of Bacillus subtilis bacteriophage phi e
defective in dTTP-dUTP nucleotidohydrolase. Journal of virology 14, 709–12 (1974).
59. Wyatt, G. R. & Cohen, S. S. The bases of the nucleic acids of some bacterial and
animal viruses: the occurrence of 5-hydroxymethylcytosine. The Biochemical journal
55, 774–82 (1953).
111
60. Sedgwick, B., Bates, P. a, Paik, J., Jacobs, S. C. & Lindahl, T. Repair of alkylated
DNA: recent advances. DNA repair 6, 429–42 (2007).
61. Hizi, a, Kamath-Loeb, a S., Rose, K. D. & Loeb, L. a Mutagenesis by human
immunodeficiency virus reverse transcriptase: incorporation of O6-
methyldeoxyguanosine triphosphate. Mutation research 374, 41–50 (1997).
62. Preston, B. D., Singer, B. & Loeb, L. a Mutagenic potential of O4-methylthymine in
vivo determined by an enzymatic approach to site-specific mutagenesis. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America 83, 8501–5 (1986).
63. Bradshaw, J. S. & Kuzminov, A. RdgB acts to avoid chromosome fragmentation in
Escherichia coli. Molecular microbiology 48, 1711–25 (2003).
64. Longo, M. C., Berninger, M. S. & Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to
control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93, 125–8
(1990).
65. Kim, N. & Jinks-Robertson, S. dUTP incorporation into genomic DNA is linked to
transcription in yeast. Nature 459, 1150–3 (2009).
66. Kiljunen, S. et al. Yersiniophage phiR1-37 is a tailed bacteriophage having a 270 kb
DNA genome with thymidine replaced by deoxyuridine. Microbiology (Reading,
England) 151, 4093–102 (2005).
67. TAKAHASHI, I. & MARMUR, J. Replacement of thymidylic acid by deoxyuridylic
acid in the deoxyribonucleic acid of a transducing phage for Bacillus subtilis. Nature
197, 794–5 (1963).
68. Wardle, J. et al. Uracil recognition by replicative DNA polymerases is limited to the
archaea, not occurring with bacteria and eukarya. Nucleic acids research 36, 705–11
(2008).
69. Greagg, M. a et al. A read-ahead function in archaeal DNA polymerases detects
promutagenic template-strand uracil. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America 96, 9045–50 (1999).
70. Russell, H. J., Richardson, T. T., Emptage, K. & Connolly, B. a The 3’-5' proofreading
exonuclease of archaeal family-B DNA polymerase hinders the copying of template
strand deaminated bases. Nucleic acids research 37, 7603–11 (2009).
71. Fogg, M. J., Pearl, L. H. & Connolly, B. a Structural basis for uracil recognition by
archaeal family B DNA polymerases. Nature structural biology 9, 922–7 (2002).
72. Gill, S., O’Neill, R., Lewis, R. J. & Connolly, B. a Interaction of the family-B DNA
polymerase from the archaeon Pyrococcus furiosus with deaminated bases. Journal of
molecular biology 372, 855–63 (2007).
73. Zhang, W. et al. Analysis of deoxyribonucleotide pools in human cancer cell lines
using a liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry technique.
Biochemical pharmacology 82, 411–7 (2011).
74. Székvölgyi, L. et al. Ribonucleoprotein-masked nicks at 50-kbp intervals in the
eukaryotic genomic DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 104, 14964–9 (2007).
75. Nick McElhinny, S. A. et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation
into DNA. Nature chemical biology 6, 774–81 (2010).
112
76. Reijns, M. A. M. et al. Enzymatic Removal of Ribonucleotides from DNA Is Essential
for Mammalian Genome Integrity and Development. Cell
(2012).doi:10.1016/j.cell.2012.04.011
77. Li, L. S. et al. DNA mismatch repair (MMR)-dependent 5-fluorouracil cytotoxicity and
the potential for new therapeutic targets. British journal of pharmacology 158, 679–92
(2009).
78. Nakabeppu, Y., Oka, S., Sheng, Z., Tsuchimoto, D. & Sakumi, K. Programmed cell
death triggered by nucleotide pool damage and its prevention by MutT homolog-1
(MTH1) with oxidized purine nucleoside triphosphatase. Mutation research 703, 51–8
(2010).
79. Kamiya, H. Mutagenicity of oxidized DNA precursors in living cells: Roles of
nucleotide pool sanitization and DNA repair enzymes, and translesion synthesis DNA
polymerases. Mutation research 703, 32–6 (2010).
80. Lin, S. et al. Cloning, expression, and characterization of a human inosine triphosphate
pyrophosphatase encoded by the itpa gene. The Journal of biological chemistry 276,
18695–701 (2001).
81. Pang, B. et al. Defects in purine nucleotide metabolism lead to substantial
incorporation of xanthine and hypoxanthine into DNA and RNA. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 109, 2319–24 (2012).
82. Abolhassani, N. et al. NUDT16 and ITPA play a dual protective role in maintaining
chromosome stability and cell growth by eliminating dIDP/IDP and dITP/ITP from
nucleotide pools in mammals. Nucleic acids research 38, 2891–903 (2010).
83. Iyama, T., Abolhassani, N., Tsuchimoto, D., Nonaka, M. & Nakabeppu, Y. NUDT16 is
a (deoxy)inosine diphosphatase, and its deficiency induces accumulation of single-
strand breaks in nuclear DNA and growth arrest. Nucleic acids research 38, 4834–43
(2010).
84. Lari, S.-U., Chen, C.-Y., Vertéssy, B. G., Morré, J. & Bennett, S. E. Quantitative
determination of uracil residues in Escherichia coli DNA: Contribution of ung, dug,
and dut genes to uracil avoidance. DNA repair 5, 1407–20 (2006).
85. Guillet, M., Van Der Kemp, P. A. & Boiteux, S. dUTPase activity is critical to
maintain genetic stability in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic acids research 34,
2056–66 (2006).
86. Merényi, G. et al. Cellular response to efficient dUTPase RNAi silencing in stable
HeLa cell lines perturbs expression levels of genes involved in thymidylate
metabolism. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids 30, 369–90 (2011).
87. Hakem, R. DNA-damage repair; the good, the bad, and the ugly. The EMBO journal
27, 589–605 (2008).
88. Paz-Elizur, T. et al. DNA repair of oxidative DNA damage in human carcinogenesis:
potential application for cancer risk assessment and prevention. Cancer letters 266, 60–
72 (2008).
89. Hazra, T. K. et al. Oxidative DNA damage repair in mammalian cells: a new
perspective. DNA repair 6, 470–80 (2007).
90. Fromme, J. C., Banerjee, A. & Verdine, G. L. DNA glycosylase recognition and
catalysis. Current opinion in structural biology 14, 43–9 (2004).
113
91. Jacobs, A. L. & Schär, P. DNA glycosylases: in DNA repair and beyond. Chromosoma
121, 1–20 (2012).
92. Krokan, H. E., Nilsen, H., Skorpen, F., Otterlei, M. & Slupphaug, G. Base excision
repair of DNA in mammalian cells. FEBS letters 476, 73–7 (2000).
93. Lee, H.-W., Dominy, B. N. & Cao, W. New family of deamination repair enzymes in
uracil-DNA glycosylase superfamily. The Journal of biological chemistry 286, 31282–
7 (2011).
94. Wang, Z. & Mosbaugh, D. W. Uracil-DNA glycosylase inhibitor gene of bacteriophage
PBS2 encodes a binding protein specific for uracil-DNA glycosylase. The Journal of
biological chemistry 264, 1163–71 (1989).
95. Torseth, K. et al. The UNG2 Arg88Cys variant abrogates RPA-mediated recruitment of
UNG2 to single-stranded DNA. DNA repair 11, 559–69 (2012).
96. Hardeland, U., Bentele, M., Jiricny, J. & Schär, P. The versatile thymine DNA-
glycosylase: a comparative characterization of the human, Drosophila and fission yeast
orthologs. Nucleic acids research 31, 2261–71 (2003).
97. Cortellino, S. et al. Thymine DNA glycosylase is essential for active DNA
demethylation by linked deamination-base excision repair. Cell 146, 67–79 (2011).
98. Kavli, B. et al. hUNG2 is the major repair enzyme for removal of uracil from U:A
matches, U:G mismatches, and U in single-stranded DNA, with hSMUG1 as a broad
specificity backup. The Journal of biological chemistry 277, 39926–36 (2002).
99. Krokan, H. E., Drabløs, F. & Slupphaug, G. Uracil in DNA--occurrence, consequences
and repair. Oncogene 21, 8935–48 (2002).
100. Nemec, A. a, Wallace, S. S. & Sweasy, J. B. Variant base excision repair proteins:
contributors to genomic instability. Seminars in cancer biology 20, 320–8 (2010).
101. Harrigan, J. a et al. The Werner syndrome protein operates in base excision repair and
cooperates with DNA polymerase beta. Nucleic acids research 34, 745–54 (2006).
102. Bukowy, Z. et al. WRN Exonuclease activity is blocked by specific oxidatively
induced base lesions positioned in either DNA strand. Nucleic acids research 36,
4975–87 (2008).
103. Mason, P. a et al. The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease,
DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites :
Analysis of DmWRNexo activity in vitro. Age (Dordrecht, Netherlands)
(2012).doi:10.1007/s11357-012-9411-0
104. Nilsen, H. & Krokan, H. E. Base excision repair in a network of defence and tolerance.
Carcinogenesis 22, 987–98 (2001).
105. Horton, J. K. & Wilson, S. H. Hypersensitivity phenotypes associated with genetic and
synthetic inhibitor-induced base excision repair deficiency. DNA repair 6, 530–43
(2007).
106. Kow, Y. W. Repair of deaminated bases in DNA. Free radical biology & medicine 33,
886–93 (2002).
107. Moe, A. et al. Incision at hypoxanthine residues in DNA by a mammalian homologue
of the Escherichia coli antimutator enzyme endonuclease V. Nucleic acids research 31,
3893–900 (2003).
114
108. Cortázar, D. et al. Embryonic lethal phenotype reveals a function of TDG in
maintaining epigenetic stability. Nature 470, 419–23 (2011).
109. Germann, M. W., Johnson, C. N. & Spring, A. M. Recognition of damaged DNA:
structure and dynamic markers. Medicinal research reviews 32, 659–83 (2012).
110. Rai, P. Oxidation in the nucleotide pool, the DNA damage response and cellular
senescence: Defective bricks build a defective house. Mutation research 703, 71–81
(2010).
111. Li, G.-M. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell research 18, 85–
98 (2008).
112. Fousteri, M. & Mullenders, L. H. F. Transcription-coupled nucleotide excision repair in
mammalian cells: molecular mechanisms and biological effects. Cell research 18, 73–
84 (2008).
113. Niida, H., Shimada, M., Murakami, H. & Nakanishi, M. Mechanisms of dNTP supply
that play an essential role in maintaining genome integrity in eukaryotic cells. Cancer
science 101, 2505–9 (2010).
114. Herrick, J. & Sclavi, B. Ribonucleotide reductase and the regulation of DNA
replication: an old story and an ancient heritage. Molecular microbiology 63, 22–34
(2007).
115. Poznic, M. Retinoblastoma protein: a central processing unit. Journal of biosciences
34, 305–12 (2009).
116. Hallstrom, T. C. & Nevins, J. R. Balancing the decision of cell proliferation and cell
fate. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 8, 532–5 (2009).
117. Bester, A. C. et al. Nucleotide deficiency promotes genomic instability in early stages
of cancer development. Cell 145, 435–46 (2011).
118. Chabes, A. L., Björklund, S. & Thelander, L. S Phase-specific transcription of the
mouse ribonucleotide reductase R2 gene requires both a proximal repressive E2F-
binding site and an upstream promoter activating region. The Journal of biological
chemistry 279, 10796–807 (2004).
119. Cayirlioglu, P., Ward, W. O., Silver Key, S. C. & Duronio, R. J. Transcriptional
repressor functions of Drosophila E2F1 and E2F2 cooperate to inhibit genomic DNA
synthesis in ovarian follicle cells. Molecular and cellular biology 23, 2123–34 (2003).
120. Johnson, D. G., Schwarz, J. K., Cress, W. D. & Nevins, J. R. Expression of
transcription factor E2F1 induces quiescent cells to enter S phase. Nature 365, 349–52
(1993).
121. Wilson, P. M., Fazzone, W., LaBonte, M. J., Lenz, H.-J. & Ladner, R. D. Regulation of
human dUTPase gene expression and p53-mediated transcriptional repression in
response to oxaliplatin-induced DNA damage. Nucleic acids research 37, 78–95
(2009).
122. Aas, P. A., Peña-Diaz, J., Liabakk, N. B., Krokan, H. E. & Skorpen, F. Overexpression
of transcription factor AP-2 stimulates the PA promoter of the human uracil-DNA
glycosylase (UNG) gene through a mechanism involving derepression. DNA repair 8,
822–33 (2009).
123. Haug, T. et al. Regulation of expression of nuclear and mitochondrial forms of human
uracil-DNA glycosylase. Nucleic acids research 26, 1449–57 (1998).
115
124. Fischer, J. a, Muller-Weeks, S. & Caradonna, S. J. Fluorodeoxyuridine modulates
cellular expression of the DNA base excision repair enzyme uracil-DNA glycosylase.
Cancer research 66, 8829–37 (2006).
125. Dimova, D. K., Stevaux, O., Frolov, M. V & Dyson, N. J. Cell cycle-dependent and
cell cycle-independent control of transcription by the Drosophila E2F/RB pathway.
Genes & development 17, 2308–20 (2003).
126. Ash, J., Liao, W. C., Ke, Y. & Johnson, L. F. Regulation of mouse thymidylate
synthase gene expression in growth-stimulated cells: upstream S phase control
elements are indistinguishable from the essential promoter elements. Nucleic acids
research 23, 4649–56 (1995).
127. Huang, S. H. et al. Human dTMP kinase: gene expression and enzymatic activity
coinciding with cell cycle progression and cell growth. DNA and cell biology 13, 461–
71 (1994).
128. Boldogh, I. et al. hMYH cell cycle-dependent expression, subcellular localization and
association with replication foci: evidence suggesting replication-coupled repair of
adenine:8-oxoguanine mispairs. Nucleic acids research 29, 2802–9 (2001).
129. Ke, P., Kuo, Y., Hu, C. & Chang, Z. Control of dTTP pool size by anaphase promoting
complex/cyclosome is essential for the maintenance of genetic stability. Genes &
development 19, 1920–33 (2005).
130. Poon, P. P. & Storms, R. K. Thymidylate synthase is localized to the nuclear periphery
in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The Journal of biological chemistry 269, 8341–
7 (1994).
131. Muha, V., Zagyva, I., Venkei, Z., Szabad, J. & Vértessy, B. G. Nuclear localization
signal-dependent and -independent movements of Drosophila melanogaster dUTPase
isoforms during nuclear cleavage. Biochemical and biophysical research
communications 381, 271–5 (2009).
132. Chabes, A. & Stillman, B. Constitutively high dNTP concentration inhibits cell cycle
progression and the DNA damage checkpoint in yeast Saccharomyces cerevisiae.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104,
1183–8 (2007).
133. Koç, A., Wheeler, L. J., Mathews, C. K. & Merrill, G. F. Hydroxyurea arrests DNA
replication by a mechanism that preserves basal dNTP pools. The Journal of biological
chemistry 279, 223–30 (2004).
134. Rotman, E. & Kuzminov, A. The mutT defect does not elevate chromosomal
fragmentation in Escherichia coli because of the surprisingly low levels of
MutM/MutY-recognized DNA modifications. Journal of bacteriology 189, 6976–88
(2007).
135. Tye, B. K., Chien, J., Lehman, I. R., Duncan, B. K. & Warner, H. R. Uracil
incorporation: a source of pulse-labeled DNA fragments in the replication of the
Escherichia coli chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 75, 233–7 (1978).
136. Gadsden, M. H., McIntosh, E. M., Game, J. C., Wilson, P. J. & Haynes, R. H. dUTP
pyrophosphatase is an essential enzyme in Saccharomyces cerevisiae. The EMBO
journal 12, 4425–31 (1993).
116
137. Dengg, M. et al. Abrogation of the CLK-2 checkpoint leads to tolerance to base-
excision repair intermediates. EMBO reports 7, 1046–51 (2006).
138. Erdélyi, P. et al. Shared developmental roles and transcriptional control of autophagy
and apoptosis in Caenorhabditis elegans. Journal of cell science 124, 1510–8 (2011).
139. Castillo-Acosta, V. M., Estévez, A. M., Vidal, A. E., Ruiz-Perez, L. M. & González-
Pacanowska, D. Depletion of dimeric all-alpha dUTPase induces DNA strand breaks
and impairs cell cycle progression in Trypanosoma brucei. The international journal of
biochemistry & cell biology 40, 2901–13 (2008).
140. Dubois, E. et al. Homologous recombination is stimulated by a decrease in dUTPase in
Arabidopsis. PloS one 6, e18658 (2011).
141. el-Hajj, H. H., Zhang, H. & Weiss, B. Lethality of a dut (deoxyuridine triphosphatase)
mutation in Escherichia coli. Journal of bacteriology 170, 1069–75 (1988).
142. Warner, H. R., Duncan, B. K., Garrett, C. & Neuhard, J. Synthesis and metabolism of
uracil-containing deoxyribonucleic acid in Escherichia coli. Journal of bacteriology
145, 687–95 (1981).
143. Ladner, R. D. et al. dUTP nucleotidohydrolase isoform expression in normal and
neoplastic tissues: association with survival and response to 5-fluorouracil in colorectal
cancer. Cancer research 60, 3493–503 (2000).
144. Pugacheva, E. N. et al. Novel gain of function activity of p53 mutants: activation of the
dUTPase gene expression leading to resistance to 5-fluorouracil. Oncogene 21, 4595–
600 (2002).
145. Canman, C. E. et al. Induction of resistance to fluorodeoxyuridine cytotoxicity and
DNA damage in human tumor cells by expression of Escherichia coli
deoxyuridinetriphosphatase. Cancer research 54, 2296–8 (1994).
146. Hochhauser, S. J. & Weiss, B. Escherichia coli mutants deficient in deoxyuridine
triphosphatase. Journal of bacteriology 134, 157–66 (1978).
147. Parsels, L. A. et al. Mechanism and pharmacological specificity of dUTPase-mediated
protection from DNA damage and cytotoxicity in human tumor cells. Cancer
chemotherapy and pharmacology 42, 357–62 (1998).
148. Williams, D. et al. Evidence for a second messenger function of dUTP during Bax
mediated apoptosis of yeast and mammalian cells. Biochimica et biophysica acta 1813,
315–21 (2011).
149. Wang, Z. & Mosbaugh, D. W. Uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage
PBS2: cloning and effects of expression of the inhibitor gene in Escherichia coli.
Journal of bacteriology 170, 1082–91 (1988).
150. Chien, C.-Y., Chou, C.-K. & Su, J.-Y. Ung1p-mediated uracil-base excision repair in
mitochondria is responsible for the petite formation in thymidylate deficient yeast.
FEBS letters 583, 1499–504 (2009).
151. Seiple, L., Jaruga, P., Dizdaroglu, M. & Stivers, J. T. Linking uracil base excision
repair and 5-fluorouracil toxicity in yeast. Nucleic acids research 34, 140–51 (2006).
152. Kumar, S., Aninat, C., Michaux, G. & Morel, F. Anticancer drug 5-fluorouracil induces
reproductive and developmental defects in Caenorhabditis elegans. Reproductive
toxicology (Elmsford, N.Y.) 29, 415–20 (2010).
117
153. Andersen, S. et al. Incorporation of dUMP into DNA is a major source of spontaneous
DNA damage, while excision of uracil is not required for cytotoxicity of
fluoropyrimidines in mouse embryonic fibroblasts. Carcinogenesis 26, 547–55 (2005).
154. An, Q., Robins, P., Lindahl, T. & Barnes, D. E. 5-Fluorouracil incorporated into DNA
is excised by the Smug1 DNA glycosylase to reduce drug cytotoxicity. Cancer
research 67, 940–5 (2007).
155. Luo, Y., Walla, M. & Wyatt, M. D. Uracil incorporation into genomic DNA does not
predict toxicity caused by chemotherapeutic inhibition of thymidylate synthase. DNA
repair 7, 162–9 (2008).
156. Pettersen, H. S. et al. UNG-initiated base excision repair is the major repair route for 5-
fluorouracil in DNA, but 5-fluorouracil cytotoxicity depends mainly on RNA
incorporation. Nucleic acids research 39, 8430–44 (2011).
157. Kunz, C. et al. Base excision by thymine DNA glycosylase mediates DNA-directed
cytotoxicity of 5-fluorouracil. PLoS biology 7, e91 (2009).
158. Sansom, O. J. et al. MBD4 deficiency reduces the apoptotic response to DNA-
damaging agents in the murine small intestine. Oncogene 22, 7130–6 (2003).
159. McNeill, D. R., Lam, W., DeWeese, T. L., Cheng, Y.-C. & Wilson, D. M. Impairment
of APE1 function enhances cellular sensitivity to clinically relevant alkylators and
antimetabolites. Molecular cancer research : MCR 7, 897–906 (2009).
160. Liu, A., Yoshioka, K.-I., Salerno, V. & Hsieh, P. The mismatch repair-mediated cell
cycle checkpoint response to fluorodeoxyuridine. Journal of cellular biochemistry 105,
245–54 (2008).
161. Geng, L., Huehls, A. M., Wagner, J. M., Huntoon, C. J. & Karnitz, L. M. Checkpoint
signaling, base excision repair, and PARP promote survival of colon cancer cells
treated with 5-fluorodeoxyuridine but not 5-fluorouracil. PloS one 6, e28862 (2011).
162. Li, L., Connor, E. E., Berger, S. H. & Wyatt, M. D. Determination of apoptosis, uracil
incorporation, DNA strand breaks, and sister chromatid exchanges under conditions of
thymidylate deprivation in a model of BER deficiency. Biochemical pharmacology 70,
1458–68 (2005).
163. Wyatt, M. D. & Wilson, D. M. Participation of DNA repair in the response to 5-
fluorouracil. Cellular and molecular life sciences : CMLS 66, 788–99 (2009).
164. Cortellino, S. et al. The base excision repair enzyme MED1 mediates DNA damage
response to antitumor drugs and is associated with mismatch repair system integrity.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100,
15071–6 (2003).
165. Mi, L. J., Chaung, W., Horowitz, R., Teebor, G. W. & Boorstein, R. J. Excessive base
excision repair of 5-hydroxymethyluracil from DNA induces apoptosis in Chinese
hamster V79 cells containing mutant p53. Carcinogenesis 22, 179–86 (2001).
166. Boorstein, R. J. et al. Definitive identification of mammalian 5-hydroxymethyluracil
DNA N-glycosylase activity as SMUG1. The Journal of biological chemistry 276,
41991–7 (2001).
167. McNeill, D. R. & Wilson, D. M. A dominant-negative form of the major human abasic
endonuclease enhances cellular sensitivity to laboratory and clinical DNA-damaging
agents. Molecular cancer research : MCR 5, 61–70 (2007).
118
168. Pulukuri, S. M. K., Knost, J. A., Estes, N. & Rao, J. S. Small interfering RNA-directed
knockdown of uracil DNA glycosylase induces apoptosis and sensitizes human prostate
cancer cells to genotoxic stress. Molecular cancer research : MCR 7, 1285–93 (2009).
169. Horton, J. K., Joyce-Gray, D. F., Pachkowski, B. F., Swenberg, J. a & Wilson, S. H.
Hypersensitivity of DNA polymerase beta null mouse fibroblasts reflects accumulation
of cytotoxic repair intermediates from site-specific alkyl DNA lesions. DNA repair 2,
27–48 (2003).
170. Roos, W. P. & Kaina, B. DNA damage-induced cell death by apoptosis. Trends in
molecular medicine 12, 440–50 (2006).
171. Malzer, E. et al. Impaired tissue growth is mediated by checkpoint kinase 1 (CHK1) in
the integrated stress response. Journal of cell science 123, 2892–900 (2010).
172. Moldovan, G.-L. & D’Andrea, A. D. How the fanconi anemia pathway guards the
genome. Annual review of genetics 43, 223–49 (2009).
173. Collis, S. J. et al. HCLK2 is essential for the mammalian S-phase checkpoint and
impacts on Chk1 stability. Nature cell biology 9, 391–401 (2007).
174. Collis, S. J. et al. FANCM and FAAP24 function in ATR-mediated checkpoint
signaling independently of the Fanconi anemia core complex. Molecular cell 32, 313–
24 (2008).
175. Lukas, J., Lukas, C. & Bartek, J. More than just a focus: The chromatin response to
DNA damage and its role in genome integrity maintenance. Nature cell biology 13,
1161–9 (2011).
176. Smith, J., Tho, L. M., Xu, N. & Gillespie, D. a The ATM-Chk2 and ATR-Chk1
pathways in DNA damage signaling and cancer. Advances in cancer research 108, 73–
112 (2010).
177. Eimon, P. M. & Ashkenazi, A. The zebrafish as a model organism for the study of
apoptosis. Apoptosis : an international journal on programmed cell death 15, 331–49
(2010).
178. Stiff, T. et al. Nbs1 is required for ATR-dependent phosphorylation events. The EMBO
journal 24, 199–208 (2005).
179. Lee, S.-J., Gartner, A., Hyun, M., Ahn, B. & Koo, H.-S. The Caenorhabditis elegans
Werner syndrome protein functions upstream of ATR and ATM in response to DNA
replication inhibition and double-strand DNA breaks. PLoS genetics 6, e1000801
(2010).
180. Hahm, S.-H. et al. Knock-down of human MutY homolog (hMYH) decreases
phosphorylation of checkpoint kinase 1 (Chk1) induced by hydroxyurea and UV
treatment. BMB reports 44, 352–7 (2011).
181. Xiao, Z., Xue, J., Sowin, T. J., Rosenberg, S. H. & Zhang, H. A novel mechanism of
checkpoint abrogation conferred by Chk1 downregulation. Oncogene 24, 1403–11
(2005).
182. Robinson, H. M. R. et al. Chk1-dependent slowing of S-phase progression protects
DT40 B-lymphoma cells against killing by the nucleoside analogue 5-fluorouracil.
Oncogene 25, 5359–69 (2006).
119
183. Jardim, M. J. et al. Reduced ATR or Chk1 expression leads to chromosome instability
and chemosensitization of mismatch repair-deficient colorectal cancer cells. Molecular
biology of the cell 20, 3801–9 (2009).
184. Yang, Z., Waldman, A. S. & Wyatt, M. D. DNA damage and homologous
recombination signaling induced by thymidylate deprivation. Biochemical
pharmacology 76, 987–96 (2008).
185. Ravi, D. et al. A network of conserved damage survival pathways revealed by a
genomic RNAi screen. PLoS genetics 5, e1000527 (2009).
186. Liu, Y. et al. Interactions of human mismatch repair proteins MutSalpha and
MutLalpha with proteins of the ATR-Chk1 pathway. The Journal of biological
chemistry 285, 5974–82 (2010).
187. Das, K. C. & Dashnamoorthy, R. Hyperoxia activates the ATR-Chk1 pathway and
phosphorylates p53 at multiple sites. American journal of physiology. Lung cellular
and molecular physiology 286, L87–97 (2004).
188. Hernández-Vargas, H. et al. Transcriptional profiling of MCF7 breast cancer cells in
response to 5-Fluorouracil: relationship with cell cycle changes and apoptosis, and
identification of novel targets of p53. International journal of cancer. Journal
international du cancer 119, 1164–75 (2006).
189. Webley, S. D., Welsh, S. J., Jackman, a L. & Aherne, G. W. The ability to accumulate
deoxyuridine triphosphate and cellular response to thymidylate synthase (TS)
inhibition. British journal of cancer 85, 446–52 (2001).
190. Karnani, N. & Dutta, A. The effect of the intra-S-phase checkpoint on origins of
replication in human cells. Genes & development 25, 621–33 (2011).
191. Fasulo, B. et al. Chk1 and Wee1 kinases coordinate DNA replication, chromosome
condensation, and anaphase entry. Molecular biology of the cell 23, 1047–57 (2012).
192. Shirasaki, T. et al. Effects of small interfering RNA targeting thymidylate synthase on
survival of ACC3 cells from salivary adenoid cystic carcinoma. BMC cancer 8, 348
(2008).
193. Longley, D. B. et al. The role of thymidylate synthase induction in modulating p53-
regulated gene expression in response to 5-fluorouracil and antifolates. Cancer
research 62, 2644–9 (2002).
194. Yang, T.-Y. et al. Pemetrexed induces both intrinsic and extrinsic apoptosis through
ataxia telangiectasia mutated/p53-dependent and -independent signaling pathways.
Molecular carcinogenesis 1–12 (2011).doi:10.1002/mc.21842
195. Wagner, M. W. et al. Role of c-Abl kinase in DNA mismatch repair-dependent G2 cell
cycle checkpoint arrest responses. The Journal of biological chemistry 283, 21382–93
(2008).
196. Niida, H. et al. Essential role of Tip60-dependent recruitment of ribonucleotide
reductase at DNA damage sites in DNA repair during G1 phase. Genes & development
24, 333–8 (2010).
197. Yoon, J. et al. Characterization of the 3’ --> 5' exonuclease activity found in human
nucleoside diphosphate kinase 1 (NDK1) and several of its homologues. Biochemistry
44, 15774–86 (2005).
120
198. Batra, V., Kesavan, V. & Mishra, K. P. Modulation of enzymes involved in folate
dependent one-carbon metabolism by gamma-radiation stress in mice. Journal of
radiation research 45, 527–33 (2004).
199. Ligabue, A., Marverti, G., Liebl, U. & Myllykallio, H. Transcriptional activation and
cell cycle block are the keys for 5-Fluorouracil induced up-regulation of human
thymidylate synthase expression. PloS one 7, e47318 (2012).
200. Carcagno, A. L. et al. E2F1 transcription is induced by genotoxic stress through
ATM/ATR activation. IUBMB life 61, 537–43 (2009).
201. Biswas, A. K. & Johnson, D. G. Transcriptional and nontranscriptional functions of
E2F1 in response to DNA damage. Cancer research 72, 13–7 (2012).
202. Lankat-Buttgereit, B., Lenschen, B., Schmidt, H. & Göke, R. The action of Pdcd4 may
be cell type specific: evidence that reduction of dUTPase levels might contribute to its
tumor suppressor activity in Bon-1 cells. Apoptosis : an international journal on
programmed cell death 13, 157–64 (2008).
203. Wang, X. et al. A positive role for c-Abl in Atm and Atr activation in DNA damage
response. Cell death and differentiation 18, 5–15 (2011).
204. Zawacka-Pankau, J., Kostecka, A., Sznarkowska, A., Hedström, E. & Kawiak, A. p73
tumor suppressor protein: a close relative of p53 not only in structure but also in anti-
cancer approach? Cell cycle (Georgetown, Tex.) 9, 720–8 (2010).
205. Reinhardt, H. C., Aslanian, A. S., Lees, J. a & Yaffe, M. B. p53-deficient cells rely on
ATM- and ATR-mediated checkpoint signaling through the p38MAPK/MK2 pathway
for survival after DNA damage. Cancer cell 11, 175–89 (2007).
206. McDermott, U. et al. Effect of p53 status and STAT1 on chemotherapy-induced, Fas-
mediated apoptosis in colorectal cancer. Cancer research 65, 8951–60 (2005).
207. Reinhardt, H. C. & Yaffe, M. B. Kinases that control the cell cycle in response to DNA
damage: Chk1, Chk2, and MK2. Current opinion in cell biology 21, 245–55 (2009).
208. Sheikh, M. S. & Fornace, a J. Role of p53 family members in apoptosis. Journal of
cellular physiology 182, 171–81 (2000).
209. Kaeser, M. D., Pebernard, S. & Iggo, R. D. Regulation of p53 stability and function in
HCT116 colon cancer cells. The Journal of biological chemistry 279, 7598–605
(2004).
210. Longley, D. B. et al. The roles of thymidylate synthase and p53 in regulating Fas-
mediated apoptosis in response to antimetabolites. Clinical cancer research : an
official journal of the American Association for Cancer Research 10, 3562–71 (2004).
211. Muñoz-Pinedo, C., Oliver, F. J. & López-Rivas, A. Apoptosis of haematopoietic cells
upon thymidylate synthase inhibition is independent of p53 accumulation and CD95-
CD95 ligand interaction. The Biochemical journal 353, 101–108 (2001).
212. Geller, J. et al. Interferon-gamma-induced sensitization of colon carcinomas to ZD9331
targets caspases, downstream of Fas, independent of mitochondrial signaling and the
inhibitor of apoptosis survivin. Clinical cancer research : an official journal of the
American Association for Cancer Research 9, 6504–15 (2003).
213. Zhuang, S., Demirs, J. T. & Kochevar, I. E. P38 Mitogen-Activated Protein Kinase
Mediates Bid Cleavage, Mitochondrial Dysfunction, and Caspase-3 Activation During
121
Apoptosis Induced By Singlet Oxygen But Not By Hydrogen Peroxide. The Journal of
biological chemistry 275, 25939–48 (2000).
214. Tonzetich, J. Orcein staining and the identification of polytene chromosomes. Methods
in molecular biology (Clifton, N.J.) 247, 249–56 (2004).
215. Békési, A. et al. Developmental regulation of dUTPase in Drosophila melanogaster.
The Journal of biological chemistry 279, 22362–70 (2004).
216. Wickramasinghe, S. N. & Fida, S. Bone marrow cells from vitamin B12- and folate-
deficient patients misincorporate uracil into DNA. Blood 83, 1656–61 (1994).
217. Blount, B. C. et al. Folate deficiency causes uracil misincorporation into human DNA
and chromosome breakage: implications for cancer and neuronal damage. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America 94, 3290–5
(1997).
218. Ren, J., Ulvik, A., Refsum, H. & Ueland, P. M. Uracil in human DNA from subjects
with normal and impaired folate status as determined by high-performance liquid
chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical chemistry 74, 295–9 (2002).
219. Duthie, S. J. & McMillan, P. Uracil misincorporation in human DNA detected using
single cell gel electrophoresis. Carcinogenesis 18, 1709–14 (1997).
220. Lee, H.-W. et al. Monitoring repair of DNA damage in cell lines and human peripheral
blood mononuclear cells. Analytical biochemistry 365, 246–59 (2007).
221. Sikorsky, J. A., Primerano, D. A., Fenger, T. W. & Denvir, J. DNA damage reduces
Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency. Biochemical and
biophysical research communications 355, 431–7 (2007).
222. Laws, G. M., Skopek, T. R., Reddy, M. V, Storer, R. D. & Glaab, W. E. Detection of
DNA adducts using a quantitative long PCR technique and the fluorogenic 5’ nuclease
assay (TaqMan). Mutation research 484, 3–18 (2001).
223. Sikorsky, J. a, Primerano, D. a, Fenger, T. W. & Denvir, J. Effect of DNA damage on
PCR amplification efficiency with the relative threshold cycle method. Biochemical
and biophysical research communications 323, 823–30 (2004).
224. Rothfuss, O., Gasser, T. & Patenge, N. Analysis of differential DNA damage in the
mitochondrial genome employing a semi-long run real-time PCR approach. Nucleic
acids research 38, e24 (2010).
225. Meyer, J. N. QPCR: a tool for analysis of mitochondrial and nuclear DNA damage in
ecotoxicology. Ecotoxicology (London, England) 19, 804–11 (2010).
226. Hunter, S. E., Jung, D., Di Giulio, R. T. & Meyer, J. N. The QPCR assay for analysis
of mitochondrial DNA damage, repair, and relative copy number. Methods (San Diego,
Calif.) 51, 444–51 (2010).
227. Thomassin, H., Kress, C. & Grange, T. MethylQuant: a sensitive method for
quantifying methylation of specific cytosines within the genome. Nucleic acids
research 32, e168 (2004).
228. Nilsen, H. et al. Uracil-DNA glycosylase (UNG)-deficient mice reveal a primary role
of the enzyme during DNA replication. Molecular cell 5, 1059–65 (2000).
122
229. Kavli, B. et al. B cells from hyper-IgM patients carrying UNG mutations lack ability to
remove uracil from ssDNA and have elevated genomic uracil. The Journal of
experimental medicine 201, 2011–21 (2005).
230. Yamaguchi, M., Hayashi, Y., Nishimoto, Y., Hirose, F. & Matsukage, A. A nucleotide
sequence essential for the function of DRE, a common promoter element for
Drosophila DNa replication-related genes. The Journal of biological chemistry 270,
15808–14 (1995).
231. Katoh, K., Asimenos, G. & Toh, H. Multiple alignment of DNA sequences with
MAFFT. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 537, 39–64 (2009).
232. Ohno, K., Hirose, F., Sakaguchi, K., Nishida, Y. & Matsukage, A. Transcriptional
regulation of the Drosophila CycA gene by the DNA replication-related element (DRE)
and DRE binding factor (DREF). Nucleic acids research 24, 3942–6 (1996).
233. Matsukage, A., Hirose, F., Yoo, M.-A. & Yamaguchi, M. The DRE/DREF
transcriptional regulatory system: a master key for cell proliferation. Biochimica et
biophysica acta 1779, 81–9 (2008).
234. Yan, N., O’Day, E., Wheeler, L. A., Engelman, A. & Lieberman, J. HIV DNA is
heavily uracilated, which protects it from autointegration. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 108, 9244–9 (2011).
235. Weichsel, a, Montfort, W. R., Cieśla, J. & Maley, F. Promotion of purine nucleotide
binding to thymidylate synthase by a potent folate analogue inhibitor, 1843U89.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92,
3493–7 (1995).
123
9. Közlemények listája
9.1. Referált szakmai folyóiratban megjelent közlemények (megosztott első szerzők*)
1. Muha Villő*, Horváth András*, Békési Angéla, Pukáncsik Mária, Hodoscsek Barbara,
Merényi Gábor, Róna Gergely, Batki Júlia, Kiss István, Jankovics Ferenc, Vilmos Péter,
Erdélyi Miklós, Vértessy G. Beáta; Uracil-containing DNA in Drosophila: Stability, Stage-
specific Accumulation, and Developmental Involvement, PLoS Genetics 2012, 8(6):e1002738
2. Horváth András, Vértessy G. Beáta; A one-step method for quantitative determination of
uracil in DNA by real-time PCR, Nucleic Acids Research 2010, 38(21):e196
9.2. Referált szakmai folyóiratban közlés alatt álló publikációk
1. Horváth András, Békési Angéla, Muha Villő, Erdélyi Miklós, Vértessy G. Beáta;
Expending the Alphabet in the fruit fly: uracil enrichment in genomic DNA, Fly, elfogadva:
2012. december 10.
9.3. Konferencián tartott szóbeli előadások (Az előadó neve aláhúzva)
2012: Horváth András, Muha Villő, Békési Angéla, Batki Júlia, Vilmos Péter, Kiss István,
Erdélyi Miklós, Vértessy G. Beáta
Uracil szubsztituált DNS által kiváltott sejtválaszok muslicában
Magyar Biokémiai Egyesület Jelátviteli szakosztályának III. konferenciája, Esztergom
2012: Horváth András, Muha Villő, Békési Angéla, Batki Júlia, Hodoscsek Barbara,
Vilmos Péter, Jankovics Ferenc, Kiss István, Erdélyi Miklós, Vértessy G. Beáta
dUTPase is essential for genome stability and imaginal tissue development in Drosophila
FEBS 3+ Meeting, Opatija, Horvátország
2011: Vértessy G. Beáta, Muha Villő, Békési Angéla, Horváth András, Merényi Gábor,
Zagyva Imre, Tóth Judit, Leveles Ibolya
Uracil-DNS: javítás és jelátvitel
IX. Magyar Genetikai Kongresszus és XVI. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Siófok
2011: Muha Villő, Békési Angéla, Gudor Róbert, Horváth András, Zagyva Imre, Vértessy
G. Beáta
dUTPáz hatása a Drosophila melanogaster fejlődésére
IX. Magyar Genetikai Kongresszus és XVI. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Siófok
2011: Horváth András, Muha Villő, Vértessy G. Beáta
124
Deoxyuridine accumulation in organisms performing perturbed thymidylate metabolism
4th
European Conference on Chemistry for Life Sciences (ECCLS), Budapest
2010: Horváth András, Muha Villő, Békési Angéla, Tóth Judit, Szabó Judit Eszter, Leveles
Ibolya, Lopata Anna, Erdélyi Miklós, Jankovics Ferenc, Szabad János, Vértessy G. Beáta
The world of uracil-DNA
Straub Napok, Szegedi Biológiai Központ, Szeged
2008: Tombácz István, Schauer Tamás, Komornyi Orbán, Horváth András, Boros Imre
Az RNS polimeráz CTD foszfatáz FCP1 szerepe
Magyar Biokémiai Egyesület Vándorgyűlés, Szeged
9.4. Konferencián tartott poszter előadások (Az előadó neve aláhúzva)
2011: Horváth András, Muha Villő, Békési Angéla, Hodocsek Barbara, Kiss István,
Jankovics Ferenc, Erdélyi Miklós, Vértessy G. Beáta
Relation of factors influencing genomic uracil appearance and Drosophila development
3rd
EMBO Meeting, Bécs, Ausztria
2010: Horváth András, Muha Villő, Vértessy G. Beáta
Uracil accumulation in DNA of organisms performing perturbed thymidilate metabolism
Straub Napok, Szegedi Biológiai Központ, Szeged
2009: Horváth András, Vértessy G. Beáta
DNS-beli uracil kvantifikálása kvantitatív PCR segítségével
Magyar Biokémiai Egyesület Vándorgyűlés, Budapest
Recommended