acetilcolina transferasa recombinante humana (CHaT)

Dos métodos para la purificación a gran escala de la colina acetiltransferasa recombinante humana

Colina AcetiltransferasaCataliza la

transferencia de un grupo acetilo desde el acetil-CoA hacia la colina para formar el neurotransmisor Acetilcolina

Deficiencia de ChAT

Desordenes neurológicos y psiquiátricos:

Alzheimer Esquizofrenia Otros desordenes

neuromusculares.

Expresión Génica del Chat

Transcripción 6mARN 1Chat Sitio adicional M-Chat Proteína 83 kDa

70 kDa Traducción S-Chat Proteína 74 kDa

¿Por qué obtener ChAT?La baja abundancia natural de ChAT en

tejidos y las dificultades en la obtención de la ChAT pura estable han disminuyendo el progreso en su caracterización biofísica.

Dificultades de obtencion del ChatLa ChAT Humana fue purificada en un

principio de placenta y cerebro , utilizando cromatografía de intercambio iónico y de afinidad con una producción final de menos de 1 mg. , estos valores no permitieron el progreso en el análisis estructural donde grandes cantidades de proteína altamente purificada son necesarias.

Primeros Trabajos Se ha utilizado cromatografía de inmuno

afinidad para purificar ChAT nativa. Se ha expresado también ChAT humana marcada con His-6 tanto en E. coli como en células high-5, lamentablemente la cantidad purificada de la forma anterior no fue suficiente para cristalización y estudios estructurales.

La sobre expresión de la proteína unida al marcador afin his-6 facilita la purificación de ChAT , con actividad enzimática comparable con la de la enzima nativa purificada desde el tejido, sin embargo el marcador de afinidad con la enzima a través de un ligando flexible y puede interferir con la cristalización y la remoción del marcador es problemática dada la sensibilidad de ChAT a la proteólisis.

Experimentos previos usando enteroquinasas para el clivaje de un marcador His6 desde la ChAT resulta en una gran degradación de la proteína. Por tanto un sistema de expresión para la ChAT humana debería, idealmente usar proteasa no exógena para remoción el marcador de afinidad o una proteasa muy especifica.

Dos Métodos El Chat es fusionado a un dominio ligador de

quitina vía un enlazador auto-empalmante que permite la liberación de Chat sin el empleo de proteasas.

El Chat es fusionada a una hexahistidina (His6) marcada en el extremo N-terminal con un enlazador que incorpora un sitio de clivaje para la proteasa TEV

Materiales y Métodos

Construcción de los vectores pTYB12-ChAT, pProEX-ChAT, y pProEX- ∆ 615ChAT

El sistema IMPACT-CN fue usado para fusionar ChAT de 70 KDa a un dominio ligador de quitina (CBD) con un elemento modificado de inteina auto-empalmante.

pTYB12-ChATcADN

Sitios de Restricción NdeI y XhoI

PCR con primers P1 y P2

Purificado en Gel y ligado a pTYB12

E. Coli XL1 Blue

Secuenciación

Producto FinalSecuencia Terminal ala – gly - his

pProEX-ChATel sistema de expresión procariótico pProEX-

HT fue usado para fusionar ChAT de 70 Kda a un His6-tag con un sitio de clivaje para la proteasa TEV para un clivaje eficiente y especifico.

pProEX-ChATcADN

Sitios de Restricción EheI y NdeI

PCR con primers P3 y P4

Celulas XL1 - Blue

Secuenciación

Clonó con pProEX-HT

Producto FinalSecuencia Terminal gly

pProEX- ∆ 615ChATEl pPreoEX-Chat fue usado como molde para

la construccion de ChAT ∆ 615

pProEX- ChATPCR con primers P3 y P5

Producto ligado a pCR- BLUNT II-TOPO

Transformadas en células competentes

PCR

Producto fue sacado por los sitiosEheI y BamHI, purificación en gel

Ligado con vector pProEX-HT

Plásmido resultante fue transformado en celulasDH5- α y fué secuenciado