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AGROTÓXICOS: TÉCNICA DE PREPARO DE AMOSTRAS, DETERMINAÇÃO E ESTUDO
Laboratório de Pesquisas em Cromatografia Líquida
AMOSTRAS, DETERMINAÇÃO E ESTUDO DE CASO DA ÁREA DE RECARGA DO
AQUÍFERO GUARANI
Profa. Dra. Isabel Cristina Sales Fontes Jardim
BENEFÍCIOS• Produção de alimentos de qualidade
• Atender à demanda crescente por alimentos
AGROTÓXICOSAGROTÓXICOS
MALEFÍCIOS• Contaminação do meio ambiente e
dos alimentos
• Efeitos adversos à saúde dos consumidores e dos produtores rurais
Toxicidade dos Agrotóxicos
- Cancerígenos - Mutagênicos
- Teratogênicos
- Mimetizadores de hormônios
Origem da Contaminação do Solo e do Origem da Contaminação do Solo e do Ambiente Aquático pelos AgrotóxicosAmbiente Aquático pelos Agrotóxicos
Pulverização Transporte de vapor e de poeiraPrecipitação
Escoamento
Aplicação no solo ou na plantação
Lavagem de materiais usados na aplicação
Efluentes industriais
Aplicação direta ou mobilização a partir de seu uso na agricultura
fotólise
agrotóxico dessorvido
agrotóxico adsorvido
decomposição química ou física
biodegradação
Água Superficial
Esgotos municipais
Água subterrânea
industriaisvolatilização
Lixiviação
Solo
dissolvidoassociado ao
sedimento
decomposição química ou
física
biodegradação
Etapas da determinação de multirresíduosEtapas da determinação de multirresíduos
AmostragemAmostragem
Preparo da amostraPreparo da amostra
Extração do analito da matrizEliminação de interferentes (clean-up)
Concentração dos analitosConcentração dos analitos
Separação, identificação e determinação dos Separação, identificação e determinação dos analitosanalitos
Técnicas cromatográficas
Validação do métodoValidação do método
MATRIZ
estado físico(sólido, líquido
ou gasoso)
tamanho da amostra
conteúdo de matéria orgânica
conteúdo de gordura,
pigmentos, proteínas,
etc.
pH
ANALITOANALITO
propriedades físicas
propriedades químicas
massa molar
carga
polaridade
volatilidade
pKa
propriedades que permitam a
detecção
absorção UV-vis
fluorescência
eletroatividade
concentração
CARACTERÍSTICAS DESEJADAS DO CARACTERÍSTICAS DESEJADAS DO MÉTODO DE PREPARO DE AMOSTRAMÉTODO DE PREPARO DE AMOSTRA
número mínimo
de etapas
rápidoalto fator
de concentração
seletivo
alta eficiência
consumo mínimo de
automação e baixo custo da
análise de traços e
ultra traços
reduz errosdetecção de
concentrações mais baixas
eficiência mínimo de solventes e reagentes
química verde
baixo custo da instrumentação
EXTRAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM SOLOEXTRAÇÃO DE AGROTÓXICOS EM SOLO
• Extração por Soxhlet
• Agitação Mecânica
• Banho Ultrassônico
Técnicas convencionaisTécnicas convencionais
• Extração por fluido
Técnicas alternativasTécnicas alternativas
• Extração por fluido supercrítico
• Líquido pressurizado ou acelerada por solvente
• Assistida por microAssistida por micro--ondasondas
• QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe)
Extração por Agitação MecânicaExtração por Agitação MecânicaExtração por Banho Extração por Banho UltrassônicoUltrassônico
• Promovem contato efetivo entre o solvente e a matriz da amostra durante a extração
• Podem ser feita à temperatura ambiente, o que permite a análise de compostos termolábeiscompostos termolábeis
• Possibilidade de realizar mais de 20 extrações simultaneamente
• Fácil acesso e baixo custo dos equipamentos
• Podem consumir muito tempo• Uso de solventes orgânicos
Extração por Fluido SupercríticoExtração por Fluido Supercrítico
Fluidos supercrítico:• elevado poder de solvatação• elevada difusivilidade
CO2 solvente mais utilizado em SFE. É considerado “solvente verde” por não trazer problemas ao meio ambiente.
VANTAGENS:• baixa toxicidade • facilidade de ser produzido e purificado• condições relativamente brandas para atingir o estado crítico (Tc=
43 oC e P = 73 bar)
DESVANTAGEM:• baixa polaridade, o que dificulta a extração de solutos de média
polaridade e polares.
Extração por Fluido SupercríticoExtração por Fluido Supercrítico
• A extração com fluido supercrítico é amplamente empregada nas áreas de alimentos, combustíveis, saúde e meio ambiente.
• VANTAGEM → facilidade com a qual pode ser acoplada em linha com as técnicas cromatográficas (GC, HPLC, CE).
• DESVANTAGEM → elevado custo dos equipamentos disponíveis comercialmente.
Extração por Líquido Pressurizado ou Extração por Líquido Pressurizado ou Acelerada por SolventeAcelerada por Solvente
• Cartuchos similares aos utilizados em extração em fase sólida.
• Solvente ou mistura de solventes em estado líquido sob pressão e temperatura relativamente altas.
• Acetona, metanol ou mistura de água e metanol como solventes extratores (volumes baixos)
• Sistema automatizado (possibilidade de realizar mais de 20 extrações simultaneamente)
Extração Assistida Por MicroExtração Assistida Por Micro--ondasondas
• Vantagens
Aquecimento de amostras, que contenham analitos dipolares, pela incidência de radiação micro-ondas, que aquece a amostra de dentro para fora, de forma rápida e uniforme.
Recomendada pela Agência de Proteção ao Meio Ambiente dos Estados Unidos (USEPA) para análise de amostras sólidas.
Vantagens
– Aumento da velocidade de extração
– Extração de múltiplas amostras, inclusive analitos termicamente instáveis
– Redução no consumo de solventes
– Uso de micro-ondas caseiro
• Desvantagens– Dificuldade de automação
– Cuidado quanto à segurança ao usar o micro-ondas caseiro.
QuEChERSQuEChERS(“quick, easy, cheap, effective, rugged and safe”)(“quick, easy, cheap, effective, rugged and safe”)
• Minimiza as etapas de preparo das amostras: 2 etapas– partição com acetonitrila, utilizando uma mistura de sais (MgSO4, NaCl e tampão citrato)– limpeza do extrato por EFS dispersiva, utilizando um sorvente composto por aminas primárias e
secundárias (PSA)
• MgSO4 – remove o excesso de água
• PSA – remove açúcares, ácidos graxos, ácidos orgânicos e pigmentos
• NaCl – ajuste da força iônica
• tampão citrato – ajuste do pH ~ 5
• Capaz de extrair agrotóxicos:– altamente polares– de elevada acidez ou basicidade
• Utiliza pequenas quantidades de solvente
• Relativamente mais rápido e robusto
MODIFICADO
*acetato de etila ou acetona
*C18 – remove interferentes não polares
*Carbono – remove pigmentos esteróides e interferentes apolares
TÉCNICAS DE DETERMINAÇÃO DE TÉCNICAS DE DETERMINAÇÃO DE AGROTÓXICOSAGROTÓXICOS
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) eCromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UPLC):determinação de compostos não voláteis, termicamenteinstáveis e de alta polaridade.
• Detectores:• Detectores:
- Arranjo de diodos (DAD)
- Espectrômetro de massas (MS):
- LC-MS/MS: técnica recomendada por agências reguladoras
Desenvolvimento e Validação de Métodos para a Determinação de Agrotóxicos em Solo das Áreas de Recarga do Aquífero Guarani, na Região das
Nascentes do Rio Araguaia, GO/MT
ESTUDO DE CASOESTUDO DE CASO
• Desenvolvimento e validação de métodos para determinação dosagrotóxicos imazetapir, nicossulfurom, imazaquim, carbofuram,atrazina, linurom, clorimurom-etil e diflubenzurom em solo utilizandoHPLC-DAD e a LC-ESI-MS/MS.
• Determinação dos agrotóxicos em amostras de solo das áreas derecarga do Aquífero Guarani, situadas na divisa entre MT e GO.
Águas Subterrâneas no BrasilÁguas Subterrâneas no Brasil
Sistema Aquífero GuaraniSistema Aquífero Guarani
• 45 % do volume total.
• Apresenta diversos pontos de recarga ou
• 61% da população• 80% SP, MA e PI
Abastecem:
Mapa Esquemático do Aquífero Guarani
SP
MG
GO
MT
MS
PR
Local estudado (Áreas de recarga do
Aquífero Guarani, nascentes do Rio
Araguaia)
• Apresenta diversos pontos de recarga ou afloramento.
• Exibe alta vulnerabilidade à contaminação por agrotóxicos decorrente de atividades agrícolas.
• Avaliação do nível de contaminação.
• Avaliação da sorção no solo.
• Foco principal deste trabalho.
Áreas de afloramento
Áreas de confinamento
PR
SC
RS
• Aumento no cultivo de grãos (soja e milho) na região que compreende os
estados de Goiás, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul
• Cultivo de lavouras na região: 100 % de aumento entre 1995 a 2006
• Região Centro-Oeste: 2a maior produtora de grãos
O Cultivo de Soja e Milho na Região Centro-Oeste do Brasil e Situação Atual do Sistema Aquífero Guarani na
Região das Nascentes do Rio Araguaia
• Mato-Grosso: maior produtor nacional de grãos (2009)
• Alto consumo e utilização indiscriminada de agrotóxicos
• Região abriga uma área considerável de recarga do Aquífero Guarani, situada
nas nascentes do Rio Araguaia.
• Solo: Neossolo quartzarênico (arenosos, com baixos teores de matéria
orgânica e de minerais) → favorecem a lixiviação dos agrotóxicos para as
águas subterrâneas.
Procedimentos de Extração e Determinação dos Procedimentos de Extração e Determinação dos Agrotóxicos em SoloAgrotóxicos em Solo
• Extração por agitação mecânica (MEC), extração por banhoultrassônico (BUS) e extração assistida por micro-ondas caseiro (MIC).
• Variáveis otimizadas: solventes, pH da solução aquosa, tempo de extraçãoe potência do micro-ondas.
Condições Otimizadas
VariáveisMEC/HPLC-
DADBUS/HPLC-
DADMIC/HPLC-
DADMIC/LC-ESI-
MS/MS
Acetato de etila (mL)
10 5 10 10
Água, pH 2,5 (mL)
1 2 1 1
Acetona (mL) --- 5 --- ---
Tempo (min) 120 60 2 2
Potência (W) --- --- 200 200
SeletividadeSeletividade: análise de pureza dos picos e comparação entrecromatogramas de brancos da matriz e de brancos da matrizfortificados.
LimitesLimites dede DetecçãoDetecção ee dede QuantificaçãoQuantificação dodo InstrumentoInstrumento (LDI(LDI eeLQILQI)): concentração dos analitos que resultou em um sinal igual a 3 e 10
Validação dos Métodos de Determinação Validação dos Métodos de Determinação dos Agrotóxicos em Solodos Agrotóxicos em Solo
LQILQI)): concentração dos analitos que resultou em um sinal igual a 3 e 10vezes o ruído da linha de base, respectivamente.
LimiteLimite dede QuantificaçãoQuantificação dodo MétodoMétodo (LQM)(LQM): a menor concentraçãodos analitos na amostra que produziu um sinal igual ao LQI após osprocedimentos de extração.
CurvaCurva AnalíticaAnalítica: seis pontos com valores de concentrações em funçãodo LQM.
LinearidadeLinearidade: determinada através da regressão linear das curvas eavaliada através dos gráficos de resíduos.
ExatidãoExatidão: determinada através da porcentagem de agrotóxicosrecuperada (R) em três níveis de fortificação: 1x, 2x e 10x, o LQM.
Validação dos Métodos de Determinação Validação dos Métodos de Determinação dos Agrotóxicos em Solodos Agrotóxicos em Solo
PrecisãoPrecisão::
a)a) RepetitividadeRepetitividade: determinada em um mesmo dia, com três séries detrês replicatas dos níveis de concentração (1x, 2x e 10x, o LQM).
b)b) PrecisãoPrecisão IntermediáriaIntermediária: determinada em três dias diferentes, comtrês replicatas dos níveis de concentração (1x, 2x e 10x, o LQM).
Validação dos Métodos de Determinação dos Validação dos Métodos de Determinação dos Agrotóxicos em Solo Empregando Agrotóxicos em Solo Empregando HPLCHPLC--DADDAD
SeletividadeSeletividade
Res
post
a do
det
ecto
r
Res
post
a do
det
ecto
r
(6)
(5)(4)
(3)
Res
post
a do
det
ecto
r
(3)
MEC/HPLC-DAD BUS/HPLC-DAD MIC/HPLC-DAD
� Brancos do solo � Brancos do solo fortificados
Agrotóxicos: (1) Imazetapir, (2) Nicossulfurom, (3) Imazaquim, (4) Carbofuram, (5) Atrazina, (6)Linurom, (7) Clorimurom-etil, (8) Diflubenzurom. Condições cromatográficas: coluna analítica de150 x 3,9 mm e coluna de guarda de 2,0 x 3,9 mm, C18, 4 µm, NovaPak, Waters. Vazão: 0,8 mLmin-1, eluição por gradiente com FM acetonitrila:H2O pH=3 (H3PO4) ; volume de injeção: 10 µL;detecção: UV, 220 nm.
0 5 10 15 20 25 30
(1)
Res
post
a do
det
ecto
r
t (min)
(8)(7)(6)
(5)(4)
(3)
(2)
0 5 10 15 20 25 30
Res
post
a do
det
ecto
r
t (min)
(8)(7)
(5)(2)
(1)
0 5 10 15 20 25 30
Res
post
a do
det
ecto
r
t (min)
(8)(7)
(6)(5)(4)
(3)
(2)(1)
Limites de Detecção e de Quantificação do Limites de Detecção e de Quantificação do Instrumento (LDI e LQI) e do Método (LDM e LQM)Instrumento (LDI e LQI) e do Método (LDM e LQM)
AgrotóxicoLDI
(ng mL-1)LQI
(ng mL-1)LDM
(ng g-1)LQM
(ng g-1)Conc. d.a.
(ng g-1)
Imazetapir 57 200 5,7 20 31
Nicossulfurom 35 100 3,5 10 16,1
Imazaquim 12 36 1,2 3,6 41
Determinação dos agrotóxicos em solo empregando Determinação dos agrotóxicos em solo empregando MEC, USB e MEC, USB e MIC/HPLCMIC/HPLC--DADDAD
Imazaquim 12 36 1,2 3,6 41
Carbofuram 35 150 3,5 15 438
Atrazina 6 30 0,6 3 659
Linurom 8 40 0,8 4 322
Clorimurom 38 100 3,8 10 15
Diflubenzurom 41 100 4,1 10 13,2
• Extrações: 5 g →→→→ 500 µL (fator de concentração = 10)
• LQM < Concentração da dose de aplicação (d.a.)
CurvasCurvas AnalíticasAnalíticas ee LinearidadeLinearidade
AgrotóxicoCurva Analítica Intervalo de
Linearidade(ng mL-1)
a (intercepto)
b (inclinação)
r
Imazetapir -569 24,7 0,9992 160 - 2400
Nicossulfurom 243 18,9 0,9993 80 - 1200
Imazaquim -732 83 0,9997 28 - 420
Determinação dos agrotóxicos em Determinação dos agrotóxicos em solosolo empregando empregando MEC, USB e MEC, USB e MIC/HPLCMIC/HPLC--DADDAD
Imazaquim -732 83 0,9997 28 - 420
Carbofuram -878 23,4 0,9996 120 - 1800
Atrazina -504 101 0,9997 24 - 360
Linurom -160 49,7 0,9993 32 - 480
Clorimurom -719 32,1 0,9997 80 - 1200
Diflubenzurom -172 28 0,9997 80 - 1200
• r > 0,999 = < a dispersão do conjunto de pontos experimentais e< a incerteza dos coeficientes de regressão estimados.
• ANVISA = r > 0,99.• Gráficos de resíduos não apresentaram tendência ou padrão.
Exatidão (Recuperação) e Precisão Exatidão (Recuperação) e Precisão (repetitividade e intermediária) (repetitividade e intermediária)
• Recuperação na faixa aceitável de 70 a 120 % com as três técnicas de extração. Recuperações obtidas em um mesmo dia variaram na faixa de 76 a 112 % e as obtidas em dias diferentes variaram de 77 a 111 %.
• Com apenas 2 min de extração assistida por micro-ondas • Com apenas 2 min de extração assistida por micro-ondas caseiro foram obtidas recuperações de 83 a 112 %.
• Precisão (repetitividade) para os três tipos de extração, os valores de CV (0,2 - 10,2 %) ficaram abaixo do limite recomendado de 15 %.
• Precisão (intermediária)os valores de CV variaram de 0,3 a 11,7 %, mostrando-se adequados.
Validação do Método de Determinação dos Validação do Método de Determinação dos Agrotóxicos em Solo Empregando Agrotóxicos em Solo Empregando MIC/LCMIC/LC--ESIESI--MS/MSMS/MS
1) NICO
2) IMZA
411,3>182,2 ES+
312,4>199,2 ES+
5) ATRAZ
6) CLOR
216,2>174,2 ES+
415,2>186,2 ES+
4) CARBO
3) IMZE289,3>177,2 ES+
222,3>122,8 ES+
Cromatogramas obtidos para o branco do solo fortificado com os agrotóxicos após a extração por MIC,empregando LC-ESI-MS/MS. Condições cromatográficas: coluna analítica de 150 x 3,9 mm e coluna deguarda de 2,0 x 3,9 mm, C18, 4 µm, Waters. Vazão: 0,7 mL min-1, eluição por gradiente com FMacetonitrila:H2O, 1 % de ácido acético; volume de injeção: 10 µL.
7) LINU
8) DIFLU
249,1>160,2 ES+
309,3>156,1 ES-
LDI (ng mL-1) LQI (ng mL-1) LDM (ng mL-1) LQM (ng mL-1)
3 10 0,3 1
Curva Analítica Intervalo de
CurvasCurvas AnalíticasAnalíticas ee LinearidadeLinearidade
Limites de Detecção e de Quantificação do Limites de Detecção e de Quantificação do Instrumento (LDI e LQI) e do Método (LDM e LQM)Instrumento (LDI e LQI) e do Método (LDM e LQM)
Extrações: 5 g → 500 µL (fator de concentração = 10)
Determinação dos agrotóxicos em Determinação dos agrotóxicos em solosolo empregando empregando MIC/LCMIC/LC--ESIESI--MS/MSMS/MS
AgrotóxicoCurva Analítica Intervalo de
Linearidade(ng mL-1)a (intercepto) b (inclinação) r
Nicossulfurom 10,78 11,8 0,9995 5 - 120
Imazaquim 6,76 10,3 0,9998 5 - 120
Imazetapir -0,28 2,05 0,9996 5 - 120
Carbofuram -5,44 7,94 0,9998 5 - 120
Atrazina -13,5 31,95 0,9995 5 - 120
Clorimurom -3,39 9,6 0,9998 5 - 120
Linurom -4,78 5,85 0,9998 5 - 120
Diflubenzurom -1,18 5,98 0,9997 5 - 120
MEC/ HPLC-DAD
USB/ HPLC-DAD
MIC/ HPLC-DAD
MIC/ LC-ESI-MS/MS
Recuperação a (%) 76 - 112 82 - 111 83 - 112 81 - 110
Recuperação b (%) 77 - 107 82 - 111 86 - 111 83 - 108
Repetitividade CV
Exatidão, Precisão em termos de Repetitividade e Exatidão, Precisão em termos de Repetitividade e Precisão Intermediária Precisão Intermediária
Repetitividade CV (%)
0,3 - 9,9 1,5 - 10,2 0,2 - 5 1 - 10,7
Precisão intermediária CV (%)
1,2 - 11,7 0,4 - 8,1 0,3 - 4,9 1,2 - 12,1
SANCO: 70 < R < 120 %
AOAC International: CV < 15 %
a Intervalos das recuperações obtidas em um mesmo diab Intervalos das recuperações obtidas em três dias diferentes
Aplicação do Método Validado
• Locais das coletas de solo.
Fazenda Município Tipo de Cultura
Latitude Longitude
Chitolina Mineiros/GO 17.89.083 53.11.917
Levi Goiânia/GO Soja e Milho
16.67.888 49.25.388
Resultado: nenhum dos agrotóxicos estudado foi detectado
Métodos de Determinação dos Agrotóxicos em Métodos de Determinação dos Agrotóxicos em Solo Empregando MEC, BUS e MIC/HPLCSolo Empregando MEC, BUS e MIC/HPLC--DAD e DAD e
MIC/LCMIC/LC--ESIESI--MS/MSMS/MS
• A validação dos métodos empregando as três técnicas de
extração resultou em valores aceitáveis na literatura.
• MIC/LC-ESI-MS/MS: resultou em LQM menores.
• Extração assistida por micro-ondas: rápida (2 min), simples e
o equipamento empregado é de baixo custo e de fácil acesso.
• Alternativa às outras técnicas de extração, as quais
consumiram no mínimo uma hora de extração.
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