AISLAMIENTO DE UN cDNA DE PAPAYA CHILENA QUE...

DOCTORADO EN DOCTORADO EN CIENCIAS MENCICIENCIAS MENCIÓÓN N

INGENIERINGENIERÍÍA GENA GENÉÉTICA TICA VEGETALVEGETAL

AISLAMIENTO DE UN cDNA DE PAPAYA AISLAMIENTO DE UN cDNA DE PAPAYA CHILENA QUE MUESTRA UNA ALTACHILENA QUE MUESTRA UNA ALTA

HOMOLOGÍA CON EXPANSINASHOMOLOGÍA CON EXPANSINAS

Carlos GaeteCarlos Gaete--Eastman, Cristian Eastman, Cristian BalbontínBalbontín, , Raúl Herrera & M. Alejandra MoyaRaúl Herrera & M. Alejandra Moya--LeónLeón

Calidad de los frutosCalidad de los frutos

•• Buen colorBuen color

•• Buena texturaBuena textura

•• Sin dañosSin daños

•• Sin infeccionesSin infecciones

•• Buen aromaBuen aroma

•• Buen saborBuen sabor

Durante Durante la maduracila maduracióón de los frutos se produce n de los frutos se produce un descenso de la firmezaun descenso de la firmeza

IntensoIntenso y/o ry/o ráápidopido ablandamientoablandamiento

corta vida de almacenajecorta vida de almacenaje productos elaborados productos elaborados de calidad deficientede calidad deficiente

EEl factor mas importante l factor mas importante que contribuye al ablandamiento que contribuye al ablandamiento lo constituyen las modificaciones en la estructura de la lo constituyen las modificaciones en la estructura de la

pared celular (Gray pared celular (Gray et al,et al, 1992)1992)

¿ ¿ CómoCómo eses la pared la pared celularcelular de un de un frutofruto??

La pared La pared celularcelular estáestá compuestacompuesta porpor dos dos redesredescoco--extensivasextensivas de de polisacáridospolisacáridos

(Buchanan (Buchanan et al,et al, 20002000))

EEl factor mas importante l factor mas importante que contribuye al ablandamiento que contribuye al ablandamiento lo constituyen las modificaciones en la estructura de la lo constituyen las modificaciones en la estructura de la

pared celular (Gray pared celular (Gray et al,et al, 1992)1992)

¿¿CuCuááles cambios?les cambios?

•• SolubilizaciSolubilizacióónn y y depolimerizacidepolimerizacióónn de pectinasde pectinas•• DepolimerizaciDepolimerizacióónn de de hemicelulosashemicelulosas•• PPéérdida de azrdida de azúúcares neutrascares neutras

¿¿CuCuááles enzimas?les enzimas?

•• poligalacturonasapoligalacturonasa•• pectina metilesterasapectina metilesterasa•• pectato liasapectato liasa

•• endo (1endo (1--4) 4) ββ--DD--glucanasaglucanasa•• xiloglucanoxiloglucano endoendo--transglicosidasatransglicosidasa•• expansinaexpansina

((Giovannoni, 2001Giovannoni, 2001))

ExpansinasExpansinas

••Son proteSon proteíínas de entre 25nas de entre 25--28 28 kDkD

••IInducnducee relajacirelajacióón de la pared celular no hidroln de la pared celular no hidrolííticaticamente, mente, permitiendo su extensibilidad y una expansipermitiendo su extensibilidad y una expansióón celular.n celular.

(Cosgrove, 2000)

• Existen 2 familias de expansinas (Existen 2 familias de expansinas (αα y y ββ), con una ), con una limitada homología de secuencia. limitada homología de secuencia.

•• Se han identificado un grupo de expansinas Se han identificado un grupo de expansinas asociadas a la maduración de diferentes frutosasociadas a la maduración de diferentes frutos.

La papaya cultivada en Chile (La papaya cultivada en Chile (Vasconcellea pubescensVasconcellea pubescens) ) con centro de origen en Colombia y Ecuador con centro de origen en Colombia y Ecuador

•• AAntitusivo y cicatrizantentitusivo y cicatrizante•• AAgradable saborgradable sabor yy aromaaroma•• AAlto contenido de vitaminas (A, B y C)lto contenido de vitaminas (A, B y C)•• AAntioxidantesntioxidantes•• GGran cantidad de proteasasran cantidad de proteasas•• 2n =182n =18

Determinación del descenso de firmeza de la papayaDeterminación del descenso de firmeza de la papaya

Tiempo (Días)

0 2 4 6 8 10 12 14

Firm

eza

(Kg)

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

PenetrómetroPenetrómetro

Determinación del descenso de firmeza de la papayaDeterminación del descenso de firmeza de la papaya

Tiempo (Días)

0 2 4 6 8 10 12 14

Firm

eza

(Kg)

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

PenetrómetroPenetrómetro

Metodología destructivaMetodología destructiva

Alta dispersión de los datosAlta dispersión de los datos

Colaboración Colaboración DrDr PerPer BroBro

PreguntasPreguntas

¿Existen expansinas en ¿Existen expansinas en Vasconcellea pubescensVasconcellea pubescensasociadas al proceso de maduración?asociadas al proceso de maduración?

Si es así, ¿son homólogas a las expansinas aisladas en Si es así, ¿son homólogas a las expansinas aisladas en otras especies?otras especies?

MétodosMétodos

• Se colectaron las muestras de papaya Se colectaron las muestras de papaya durante Marzo del 2004, en huertos durante Marzo del 2004, en huertos comerciales en la localidad de comerciales en la localidad de LipimávidaLipimávida(VII Región).(VII Región).

•• Las muestras fueron almacenadas en una Las muestras fueron almacenadas en una cámara a 20 °C.cámara a 20 °C.

• A partir de frutas maduras, se extrajo RNA total según A partir de frutas maduras, se extrajo RNA total según ChangChang et alet al., 1993., 1993

•• Luego se sintetizó cDNA de doble cadena utilizando el Luego se sintetizó cDNA de doble cadena utilizando el kitkit SMART (BD SMART (BD BioscienceBioscience))

•• Se aisló la Se aisló la expansinaexpansina de papaya mediante PCR, utilizando los siguientes partidores:de papaya mediante PCR, utilizando los siguientes partidores:

EXPPEXPP––F 5’F 5’--ATGATG--GGIGGI--GGIGGI--GCNGCN--TGYTGY--GGNGGN--TAYTAY--GG--3’3’EXPPEXPP--R 5’R 5’--YTGYTG--CCACCA--RTTRTT--YTGYTG--NCCNCC--CCACCA--RTTRTT--3’3’

•• El fragmento amplificado fue aislado y purificado utilizando elEl fragmento amplificado fue aislado y purificado utilizando el sistema sistema GelGel ExtractionExtractionKitKit (Omega (Omega BioBio--TekTek), clonado mediante el sistema TOPO TA ), clonado mediante el sistema TOPO TA CloningCloning ((InvitrogenInvitrogen) ) y finalmente secuenciado en un y finalmente secuenciado en un secuenciadorsecuenciador ALFexpressALFexpress II (II (AmershamAmersham). ).

PapayaPapaya samplesample

RNARNAIsolationIsolation

Total RNATotal RNA

cDNASynthesis

cDNAcDNASynthesisSynthesis RTRT--PCRPCR

PCR product amplified using PCR product amplified using primers EXPPprimers EXPP--F y RF y R

SequenciationSequenciation

ResultadosResultados

Como resultado de la secuenciación, obtuvimos un fragmento de 49Como resultado de la secuenciación, obtuvimos un fragmento de 496 6 pbpb

ATGGGGGGGGCCTGTGGTTACGGAAATCTGTACAGCCAAGGTTATGGGACAAACACTGCTGCACTAAGCACTGCTCTATTCAATAATGGGCTTGCTTGTGGAGCCTGTTTTGAAATTAAATGTGTGAATGATGGTAGGTGGTGTCTACCAGGATCTATCATGGTCACAGCAACAAATTTCTGCCCTCCAAACAATGCTCTTGCAAGCAATGCAGGAGGATGGTGTAACCCTCCTCTGCGTCATCTCGATCTCTCTCAGCCTGTTTTCCAGCACATAGCTCACTACAAAGCAGGAATCGTACCTGTCCAATACAGAAGGGTTAGTTGCAGGAAGAGTGCTGGGATTAGGTTCACCATAAACGGACACTCATACTTCAATCTKGTGCBAATAAGCAATGTTGGAGGAGCTGGCGATGTTGTGTCYGTATCCATCAAAGGTTYTAGGACTGGCTGGCAAGCCATGTYYCATAACTGGGGGTCAGAACTGGCAG

Análisis Análisis BLASTnBLASTn

% E% EIdentIdent. Value. Value

gi|29421117|dbj|AB104442gi|29421117|dbj|AB104442.1| .1| VitisVitis labruscalabrusca x x VitisVitis viniferavinifera expexp 1 84 9e1 84 9e--24 24 gi|14718274|gb|AF226701gi|14718274|gb|AF226701.1| .1| FragariaFragaria x x ananassaananassa expexp 4 83 7e4 83 7e--1717gi|16923360|gb|AF319473gi|16923360|gb|AF319473.1| .1| CucumisCucumis sativussativus expexp 7 83 3e7 83 3e--16 16 gi|16305104|gb|AF367459gi|16305104|gb|AF367459.1| .1| PrunusPrunus persicapersica expexp 1 83 2e1 83 2e--1414

Análisis Análisis BLASTxBLASTx

gi|29421118|dbj|BAC66694gi|29421118|dbj|BAC66694.1| .1| VitisVitis labruscalabrusca x x VitisVitis viniferavinifera expexp 1 83 1e1 83 1e--80 80 gi|14718275|gb|AAK72875gi|14718275|gb|AAK72875.1| .1| FragariaFragaria x x ananassaananassa expexp 4 83 1e4 83 1e--79 79 gi|17484121|gb|AAL40354gi|17484121|gb|AAL40354.1| .1| PrunusPrunus cerasuscerasus expexp 5 83 1e5 83 1e--79 79 gi|10180019|gb|AAG13983gi|10180019|gb|AAG13983.1| .1| PrunusPrunus aviumavium expexp 2 83 1e2 83 1e--7979

ORF 1ORF 1A L Met G G A A L Met G G A CC G Y G N L Y S Q G Y G T N T A A L S T A L F N N G L A G Y G N L Y S Q G Y G T N T A A L S T A L F N N G L A CC G A G A CC F E I K F E I K CC V N D G R W V N D G R W CC L P G S I Met V T A T N F L P G S I Met V T A T N F CC P P N N A P P N N A L A S N A G G W L A S N A G G W CC N P P L R N P P L R H L D LH L D L S Q P V F Q H I A H Y K A G I V P S Q P V F Q H I A H Y K A G I V P V Q Y R R V S V Q Y R R V S CC R K S A G I R F T I N G H S Y F N X V X I S N V G G A R K S A G I R F T I N G H S Y F N X V X I S N V G G A G D V V X V S I K G D V V X V S I K GG X R T X R T GG WW Q A Met X H N Q A Met X H N WW GG S E L A E S E L A E GG X X X X PP A A H H WW GG

El resultado de la traducción de la secuencia El resultado de la traducción de la secuencia obtenida arroja un ORF de 174 obtenida arroja un ORF de 174 aasaas..

prfprf: EXPANSIN_EG45: EXPANSIN_EG45 pos. 4 pos. 4 -- 116116 EE--valuevalue = 2,1e= 2,1e--23 23

pfampfam: POLLEN_ALLERG_1: POLLEN_ALLERG_1 pos. 117 pos. 117 -- 174174 EE--value= 2,8evalue= 2,8e--1212

Resultado del análisis de motivos estructurales por Resultado del análisis de motivos estructurales por MotifScanMotifScan::

Se observa un alto grado Se observa un alto grado de homología entre la de homología entre la

secuencia de papaya y secuencia de papaya y las presentes en otras las presentes en otras

especies.especies.

Se pueden identificar Se pueden identificar algunos de los residuos algunos de los residuos críticos para la función críticos para la función biológica propuesta.biológica propuesta.

Se observan los dos Se observan los dos dominios estructurales dominios estructurales

descritos para las descritos para las expansinas.expansinas.

Se observa un alto grado Se observa un alto grado de homología entre la de homología entre la

secuencia de papaya y secuencia de papaya y las presentes en otras las presentes en otras

especies.especies.

Se pueden identificar Se pueden identificar algunos de los residuos algunos de los residuos críticos para la función críticos para la función biológica propuesta.biológica propuesta.

Se observan los dos Se observan los dos dominios estructurales dominios estructurales

descritos para las descritos para las expansinas.expansinas.

79

55100

93

70100

72

8593

77

70

7467

65

100

80

96

100

51

CC

DD

BB

AA

Análisis filogenético de genesAnálisis filogenético de genesde expansinasde expansinas

A partir del alineamiento de las A partir del alineamiento de las secuencias secuencias aminoacídicasaminoacídicas

deducidas de 39 secuencias deducidas de 39 secuencias de expansinas.de expansinas.

Mediante Mediante ClustalClustal V y PAUP V y PAUP v4.0, utilizando MP y análisis v4.0, utilizando MP y análisis

bootstrapbootstrap (1000 (1000 reprep.).)

ConclusionesConclusiones

•• Se aislSe aislóó un fragmento de un cDNA con alta homologun fragmento de un cDNA con alta homologíía con a con expansinas.expansinas.

•• El fragmento posee los dos dominios propuestos para las El fragmento posee los dos dominios propuestos para las expansinas, con sus residuos expansinas, con sus residuos aminoacaminoacíídicosdicos caractercaracteríísticos.sticos.

•• El anEl anáálisis filogenlisis filogenéético sittico sitúúa a la a a la expansinaexpansina de papaya de papaya como miembro del subgrupo C, junto a otras como miembro del subgrupo C, junto a otras αα--expansinas expansinas asociadas a maduraciasociadas a maduracióónn ..

•• Aislar y secuenciar el extremo 3’ de la expansina de papaya.Aislar y secuenciar el extremo 3’ de la expansina de papaya.

•• Analizar el patrón de expresión de la Analizar el patrón de expresión de la expansinaexpansina de papaya.de papaya.

•• Correlacionar dicho patrón con cambios en la composición Correlacionar dicho patrón con cambios en la composición de de hemicelulosashemicelulosas durante el ablandamiento de la papaya. durante el ablandamiento de la papaya.

•• Construir el modelo de la estructura tridimensional de la Construir el modelo de la estructura tridimensional de la expansinaexpansina de papaya (Colaboración de papaya (Colaboración DrDr DaniloDanilo González)González)

PerspectivasPerspectivas

Dominio1Dominio1

Dominio 2Dominio 2

¿Parecidos?¿Parecidos?

Bolsillo catalítico

Puentes disulfuro

Residuos aromáticos

Hendidura Del CBD

AgradecimientosAgradecimientos

•• Proyecto Fundación Andes CProyecto Fundación Andes C--13855/12. 13855/12.

•• Proyecto Proyecto MecesupMecesup TALTAL--105.105.

•• Centro Regional en BiotecnologíaCentro Regional en Biotecnología

Colaboradores:Colaboradores:

•• Dr. Claudio RamírezDr. Claudio Ramírez•• Lic. Mario MoyaLic. Mario Moya•• Lic. Carlos FigueroaLic. Carlos Figueroa•• Lic. Rubén Lic. Rubén AlmadaAlmada

Financiamiento:Financiamiento:

Análisis fisiológico del proceso de maduración de la papayaAnálisis fisiológico del proceso de maduración de la papaya

ControlMedición etileno

Medición firmeza1-MCP