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PPRROOGGRRAAMMAA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMM GGEENNÉÉTTIICCAA UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOO
CCEENNTTRROO DDEE CCIIÊÊNNCCIIAASS BBIIOOLLÓÓGGIICCAASS DDEEPPAARRTTAAMMEENNTTOO DDEE GGEENNÉÉTTIICCAA
“Análise da expressão de fatores
envolvidos na síntese de proteínas durante o ciclo de vida de Leishmania sp.”
PPOOLLLLYYAANNNNAA DDEE OOLLIIVVEEIIRRAA RROOCCHHAA
Recife, PE Setembro, 2006
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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PPOOLLLLYYAANNNNAA DDEE OOLLIIVVEEIIRRAA RROOCCHHAA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Genética da
Universidade Federal de
Pernambuco, como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do grau de
Mestre em Genética.
Orientador: Dr Osvaldo Pompílio de
Melo Neto
Recife, PE
Setembro, 2006
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOO PPRROOGGRRAAMMAA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMM GGEENNÉÉTTIICCAA
PARECER DA COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DE
PPOOLLLLYYAANNNNAA DDEE OOLLIIVVEEIIRRAA RROOCCHHAA
“Análise da expressão de fatores protéicos envolvidos na síntese de proteínas durante o ciclo de vida de Leishmania sp.”
Área de Concentração: BIOLOGIA MOLECULAR
Recife, Setembro de 2006
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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SSUUMMÁÁRRIIOO
Página
Lista de Figuras 7
Lista de abreviações 8
Resumo 9
1. Introdução 10
2. Objetivos 13
2.1 Geral 13
2.2. Específicos 13
3. Revisão Bibliográfica: 14
3.1- Leishmaniose 14 3.1.1- Distribuição 14
3.2.2- Prevenção e controle 15
3.2.3- Sintomas 16
3.1.4- Leishmaniose Cutânea e Cutâneo-mucosa 17
3.1.4.1- Espectro clínico 17
3.1.4.2- Diagnóstico 17
3.1.5- Leishmaniose Visceral 18
3.1.5.1- Espectro clínico 18
3.1.5.2- Diagnóstico 19
3.1.6- A Leishmamia 19
3.1.6.1- Promastigota – Promastigota 19
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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Metacíclico – Amastigota
3.1.6.2- Cultivo 21
3.1.7- Transmissão 22
3.2- Controle da Expressão Gênica em Leishmania 24
3.3- Iniciação da Síntese Protéica em Eucariotos 27
3.3.1 - Complexo eIF4F 28
3.3.2 - Proteínas Ribossomais 31
3.3.2.1 - A Proteína P0 31
3.3.3 - Iniciação da tradução em tripanossomatídeos
34
3.4- Proteínas de Expressão Estágio-Específica em Leishmania
36
3.4.1 - Proteína META1 37
3.4.2 - A família A2 38
3.5- Diferenciação Celular em Leishmania e
Regulação da Tradução 40
4. Referências Bibliográficas 42
5. Manuscrito de Artigo Científico 51
6. Abstract 88
7. Conclusões 89
8. Anexos 90
8.1 Instruções para Autores 91
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8
Lista de Figuras
Figura Página
Revisão Bibliográfica
Figura 1. Mapas ilustrando a distribuição geográfica das Leishmanioses cutânea e visceral.
14
Figura 2. Fotos mostrando as formas amastigota, encontradas parasitando os macrófagos do hospedeiro vertebrado, e promastigota, encontradas no tubo digestivo do hospedeiro invertebrado.
20
Figura 3. Ciclo evolutivo da Leishmania demonstrando as formas encontradas nos hospedeiros invertebrados (promastigota) e vertebrados (amastigota).
23
Figura 4. Esquema ilustrando o processamento do mRNA através dos mecanismos de “cis-splicing” ou splicing convencional e de “trans-splicing”.
26
Figura 5. Esquema da estrutura dos ribossomos. 33
Manuscrito
Figura 1: Alinhamento múltiplo dos aminoácidos da proteína ribossomal P0 65
Figura 2: Comassie da proteína P0, Western-blot e quantificação da proteína P0 69
Figura 3: Curvas de crescimento de L. chagasi e L. amazonensis (promastigota, promastigota metacíclica e amastigota) e imagens dos três estágios de desenvolvimento da L. amazonensis.
72
Figura 4: Imagens dos três estágios do desenvolvimento da L. amazonensis. 73
Figura 5: Western-blot mostrando o reconhecimento dos anticorpos contra suas respectivas proteínas recombinantes: Proteína A2 e Proteína META1.
75
Figura 6: Análise da expressão das proteínas META1 (A) e LmP0 (B) em curvas de L. chagasi e L. amazonensis.
78
Figura 7: Análise da expressão dos homóligos LmEIF4G1(A) e LmEIF4G3(B) em curva de crescimento de L. chagasi. 80
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LISTA DE ABREVIATURAS
bp Pares de Bases cDNA DNA complementar DNA Desoxiribonucleic Acid
Ácido Desoxirribonucléico IPTG isopropil-beta-D-thiogalactopiranosida kb kilo bases (mil pares de bases) KDa Kilo Dalton NCBI Nacional Center for Biotechnology Information
Centro Nacional para Informação em Biotecnologia OMS Organização Mundial de Saúde PCR Polymerase Chain Reaction
Reação em Cadeia da Polimerase RNA Ácido Ribonucléico UFPE Universidade Federal de Pernambuco
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RESUMO
Em eucariotos, a etapa crítica de iniciação da síntese de proteínas é aquela
mais sujeita a mecanismos de regulação. Esta etapa requer a participação de um
conjunto de fatores de iniciação da tradução (eIFs), além das subunidades
ribossomais. Entre os eIFs se destaca o complexo eIF4F, composto pelas subunidades
eIF4A, eIF4E e eIF4G. Em Leishmania, o controle da síntese de proteínas é essencial
para a regulação da expressão gênica, mas tem sido pouco estudado. Neste
patógeno, múltiplos homólogos para as subunidades do complexo eIF4F foram
identificados e tiveram sua expressão quantificada na forma promastigota (Pm) do
seu ciclo de vida. Neste trabalho, iniciou-se o estudo em Leishmania de um homólogo
da proteína ribosomal P0, componente da subunidade 60S. A partir da clonagem do
seu gene, expressão em Escherichia coli e produção de soro policlonal específico
partiu-se para a quantificação dos seus níveis intracelulares na forma promastigota,
que se mostraram elevados (~6,6x105 moléculas/célula) e superiores aos observados
para os homólogos de eIF4F. Em seguida, visando analisar a sua expressão durante o
ciclo de vida do parasita, otimizou-se as condições de crescimento de espécies
representativas de Leishmania nas suas formas promastigota metacíclica (PmMt) e
amastigota (Am). Buscou-se então a detecção de proteínas de expressão estágio
específico (A2 – Am; META1 - PmMt) para validar as curvas de crescimento, mas
apenas a expressão da META1 foi confirmada, embora a forma Am tenha sido
observada por microscopia. A expressão da proteína P0 se mostrou constante nessas
várias formas celulares. Em comparação, a expressão de um homólogo da proteína
eIF4G, LmEIF4G3, também se mostrou constante, enquanto que um segundo
homólogo, LmEIF4G1 só foi detectado nas formas Pm e Am do parasita. Ensaios com
outros homólogos de eIF4F estão sendo realizados, esperando-se caracterizar melhor
os processos que envolvem a iniciação da tradução em Leishmania e o controle da
sua diferenciação celular.
Palavras-chave: Tripanossomatídeos, Iniciação da Tradução, Ciclo de vida da
Leishmania, Expressão Estágio Específica e Proteína Ribossomal.
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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1- INTRODUÇÃO
A ordem Kinetoplastida contém importantes patógenos de animais,
humanos e plantas. Esses organismos unicelulares representam um nó
primário da árvore evolutiva dos eucariotos e possuem uma variedade de
características bioquímicas, genéticas e morfológicas que são tanto
singulares ao grupo como aquelas observadas em um grande número de
outros organismos. Dentro dos kinetoplastídeos são identificadas três
famílias distintas, entre elas a família Trypanosomatidae. Os parasitas
protozoários pertencentes a esta família incluem um número importante de
patógenos responsáveis por doenças de impacto mundial tais como Doença
do sono (Trypanosoma brucei), Doença de Chagas (T. cruzi) e várias formas
de Leishmanioses (Leishmania sp.).
O gênero Leishmania é responsável pela zoonose endêmica
Leishmaniose em cerca de 88 países. Cerca de 400 mil casos novos são
confirmados anualmente em todo o mundo, onde aproximadamente 350
milhões de pessoas encontram-se em áreas de risco. O quadro preocupante
gerado por essa parasitose vem despertando o interesse de pesquisas mais
aprofundadas sobre estes parasitas, tanto ao nível celular como molecular.
Em eucariotos, a síntese protéica, também chamada de tradução, é
um processo complexo que requer uma diversidade de macromoléculas
incluindo RNAs e proteínas. Sua regulação é essencial para a capacidade dos
organismos de se adaptarem as variações nas condições do seu ciclo de
vida. Embora o ribossomo desempenhe um papel central nesse processo de
tradução, ainda há muito a ser estudado no que se refere ao papel das
proteínas ribossomais na montagem do ribossomo e no processo de
tradução propriamente dito. A complexidade dessa organela, em eucariotos
é uma indicação da sua importância para a sobrevivência dos organismos.
Na tradução, o ponto crítico de iniciação requer, além das subunidades
ribossomais, um número de fatores de iniciação da tradução (eIFs, de
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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“eukariotic initiation factors”) cuja atividade pode ser altamente regulada.
Acima de todos esses fatores está o complexo eIF4F, o qual é necessário
para o recrutamento da subunidade menor ribossomal para a extremidade 5’
do RNA mensageiro. O complexo eIF4F é composto pela RNA helicase eIF4A,
pela proteína de ligação ao cap eIF4E e pela grande proteína central eIF4G,
responsável pela mediação da interação entre o eIF4F e outros fatores da
tradução assim como a subunidade menor ribossomal.
Com o início do seqüenciamento genômico de tripanossomatídeos,
foram identificados pelo nosso grupo de trabalho múltiplos homólogos
potenciais para os três componentes do eIF4F em L. major (4 homólogos ao
eIF4E – LmEIF4E1-4; 2 homólogos ao eIF4A - LmEIF4A1-2; e 5 homólogos
ao eIF4G - LmEIF4G1-5) e também em T.cruzi e T. brucei. Esses homólogos
apresentam uma alta conservação dentro das espécies, mas parecem variar
em diferentes aspectos tais como afinidade de ligação ao cap dos eIF4Es,
níveis de expressão e interação com outros componentes do eIF4F. Os
resultados sugerem um alto grau de complexidade na iniciação da tradução
desses parasitas, o qual pode refletir uma adaptação ao seu complexo ciclo
de vida.
Esse projeto teve origem na identificação das seqüências, clonagem,
expressão e produção de anticorpos específicos contra possíveis homólogos
das subunidades do complexo eIF4F de Leishmania major visando uma
posterior análise, de forma quantitativa, da sua expressão ao longo do ciclo
de vida desta e de outras espécies de Leishmania. Dados preliminares
obtidos foram restritos à fase promastigosta de espécies de Leishmania, mas
mostraram diferenças significativas nos níveis de expressão de diferentes
homólogos de uma mesma subunidade, como no caso dos homólogos de
eIF4E. De forma a verificar o significado funcional dos resultados obtidos,
entretanto, faz-se necessário comparar esses níveis de expressão com o das
unidades básicas de síntese de proteínas, os ribossomos. Assim, em um
primeiro momento, partiu-se para clonar, expressar e produzir anticorpo
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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policlonal contra a proteína ácida ribossomal P0, componente da subunidade
maior ribossomal e cujo padrão de expressão e quantidade de moléculas são
indicativos do total de ribossomos presentes em um dado organismo. Em
seguida partiu-se para analisar como os níveis de homólogos selecionados
de subunidades de eIF4F, e da proteína ribossomal P0, se mantém em
formas representativas do ciclo de vida de espécies distintas de Leishmania.
Sendo assim, tornou-se necessário otimizar as condições de diferenciação
desse parasita em cultura, verificando-se ao mesmo tempo o padrão de
expressão de proteínas estágio específicas destes protozoários, tais como a
proteína A2, específica da forma amastigota, e a proteína META 1, expressa
na fase promastigota metacíclica da Leishmania, tidas como marcadores de
diferenciação do parasita.
Nesse trabalho, pudemos estabelecer condições de diferenciação
celular de espécies representativas de Leishmania, o que nos possibilitou,
como primeiro passo, analisar a expressão da proteína ribossomal P0 e, em
seguida, investigar a expressão de proteínas do complexo eIF4F, através de
ensaios de Western-blot, em curvas de crescimento onde os três principais
estágios da Leishmania foram obtidos. O número de moléculas de proteína
ribossomal por célula também foi estimado, gerando dados que podem ser
comparados com os já descritos na literatura para outros organismos mais
bem estudados. Os resultados obtidos constituem um passo importante na
compreensão do processo de síntese protéica em tripanosomatídeos e de
como este se assemelha ou difere em relação ao que se sabe em outros
eucariotos.
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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2- OBJETIVOS
2.1- Objetivos Gerais
Analisar a expressão de proteína ribosomal, proteínas de expressão estágio
específica e homólogos de subunidades do complexo eIF4F de iniciação da
tradução durante o ciclo de vida de espécies representativas de Leishmania
sp.
2.2- Objetivos Específicos
1. Quantificar a expressão da proteína ribosomal P0 de Leishmania major
em extratos da forma promastigota de espécies representativas de
Leishmania, utilizando soro policlonal específico. Estimar o número de
ribosomas presentes nestas células.
2. Monitorar a diferenciação celular de espécies de Leishmania em cultura,
visando obter extratos das suas três principais formas de vida:
Promastigota, Promastigota Metacíclica e Amastigota.
3. Validar os extratos obtidos das formas de vida de Leishmania, através da
análise de expressão de proteínas sabidamente estágio específicas, no
caso as proteínas Meta1 (expressa na forma Promastigota Metacíclica) e
A2 (expressa em Amastigota).
4. Comparar a expressão da proteína ribosomal P0 de Leishmania, indicativa
dos níveis intracelulares dos ribosomos, com a expressão de homólogos
selecionados de subunidades do complexo eIF4F de iniciação da tradução,
nas três fases de desenvolvimento desse parasita.
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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3- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1- Leishmaniose
3.1.1- Distribuição
A Leishmaniose é encontrada em cerca de 88 países com uma
população total sujeita a infecção estimada em 350 milhões de pessoas. A
maioria dos países afetados estão em áreas tropicais e subtropicais, se
estendendo desde a América Central e do Sul até os países mediterrâneos,
África, Ásia central, Índia e China (figura 1). A leishmaniose é considerada a
segunda principal doença causada por protozoário no mundo, perdendo em
incidência apenas para a Malária (www.vet.uga.edu).
a) b)
Figura 1: Mapas ilustrando a distribuição geográfica das Leishmanioses cutânea (a) e
visceral (b). Podemos observar que o Brasil possui as duas principais formas de
Leishmaniose e em grande parte dos estados. Fonte: www.vet.uga.edu.
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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3.1.2- Prevenção e controle
Noventa por cento (90%) das infecções de leishmaniose cutânea se
desenvolvem no Afeganistão, Paquistão, Síria, Arábia Saudita, Algéria, Irã,
Brasil e Peru; 90% das infecções de leishmaniose visceral ocorrem na Índia,
Bangladesh, Nepal, Sudão e Brasil. Com poucas perspectivas para retorno
financeiro, o desenvolvimento de drogas anti-leishmaniose continua adiado
(Muray HW et al., 2005).
Nos últimos cinco anos, porém, progressos concretos foram
observados no que concerne ao diagnóstico e tratamento da leishmaniose e
ao controle do vetor transmissor. Novos estudos têm aumentado a
compreensão da susceptibilidade à doença e a relação parasito-hospedeiro;
a imunidade anti-leishmaniose tem sido mais precisamente esclarecida e
diferentes opções de vacina estão sendo desenvolvidas. A seqüência do
genoma da Leishmania major foi completada recentemente e a do inseto
vetor Lutzomya longipalpis encontra-se em andamento. Estes avanços irão
claramente gerar oportunidades para um maior entendimento dos aspectos
básicos da biologia do parasita, transmissão e patogênese e poderá levar a
identificação de candidatos ou alvos para ensaios diagnósticos, drogas ou
vacinas (Muray HW et al., 2005).
Evidências clínicas e experimentais abundantes indicam que a
leishmaniose deve ser prevenida por vacinação. Entretanto, o único agente
de vacina provado em seres humanos é a L. major viva, agora em desuso
por causa de lesões inaceitáveis em alguns pacientes. Parasitas mortos
utilizados como vacina geraram resultados encorajadores no Brasil na
década de 70. Experimentos com células de L. major autoclavadas também
foram realizados, porém não demonstraram muita eficiência. Recentemente,
alguns esforços têm sido feitos por laboratórios tendo como foco novos
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
17
antígenos e adjuvantes, vacinas vivo-atenuadas, proteínas recombinantes
purificadas e subunidades protéicas, “naked DNA” e bactérias expressando
antígenos de Leishmania (Muray HW et al., 2005). A vacina ideal seria uma
vacina “pan- Leishmania” incluindo várias moléculas, preferencialmente
conservadas entre diferentes espécies. A esse respeito, é válido mencionar
estudos recentes mostrando que vacinas de coquetéis e multicomponentes
de DNA induzem uma proteção sólida contra ambas formas de leishmanioses
cutânea e visceral (Iborra S et al., 2003).
3.1.3- Sintomas
A Leishmaniose tem várias manifestações clínicas: lesões
ulcerativas de pele, inflamações destrutivas da mucosa e infecção
disseminada visceral (Kalazar). A epidemiologia, a imunopatologia e as
conseqüências são igualmente diversas, desde que a infecção ocorre em
múltiplas regiões endêmicas, tanto em crianças quanto em adultos e é
causada por, aproximadamente, duas dúzias de espécies de Leishmania
diferentes.
Mesmo assim, todas as formas dessa protozoose compartilham de
três características patogênicas: macrófagos residentes no tecido são os
alvos e mantém a multiplicação intracelular do parasita; a resposta
imunoinflamatória do hospedeiro regula a expressão e as conseqüências da
doença; e a infecção persistente no tecido é característica (Muray HW et al.,
2005).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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3.1.4- Leishmaniose Cutânea e Cutâneo-mucosa
3.1.4.1- Espectro clínico
Múltiplas espécies causam leishmaniose cutânea em crianças e
adultos, primariamente L. major, L. (L) tropica e L. (L) aethiopica
(leishmaniose cutânea do Velho Mundo) e L. (L) mexicana, L. (L)
amazonensis, L. (V) braziliensis, L. (V) panamensis, L. (V) peruviana e L. (V)
guyanensis (leishmaniose cutânea do Novo Mundo). Uma pápula tipicamente
começa com a picada do inseto, aumenta para um nódulo e ulcera entre um
e três meses (Dowlati Y, 1996; Machado P et al., 2002; Magil AJ, 2005). Na
leishmaniose do Velho Mundo, a maioria das lesões são pápulas, nódulos ou
nódulo-úlcera (Dowlati Y, 1996), enquanto lesões ulcerativas são mais
comuns em leishmaniose cutânea do Novo Mundo (Palacios R et al., 2001).
Lesões disseminadas e linfoadenopatia localizada precedendo úlceras na pele
ocorrem no Brasil (Barral A et al., 1995). A associação de leishmaniose
cutânea com HIV (vírus da imunodeficiência humana) tem sido algo não
muito freqüente até o momento (Couppie P et al., 2004; Rabello A et al.,
1990).
3.1.4.2- Diagnóstico
O diagnóstico, na prática, é feito pela identificação de amastigotas
em biópsias, fragmentos e esfregaços. Combinação de microscopia e cultura
aumenta a sensibilidade do diagnóstico para mais de 85% (Blum J et al.,
2004; Ramirez JR et al., 2000) e cultura (ou análise de DNA) permite
identificação da espécie (Vega-Lopez F, 2003; Weina PJ et al., 2004).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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3.1.5- Leishmaniose Visceral
3.1.5.1- Espectro clínico
A leishmaniose visceral é causada pela L. donovani no
subcontinente indiano, Ásia e África (em adultos e crianças), e pela L.
infantum ou L. chagasi na região do Mediterrâneo, sudeste e centro da Ásia
e América do Sul (primariamente em crianças); outras espécies (por
exemplo, L. tropica no Oriente Médio, L. amazonensis na América do Sul)
são ocasionalmente viscerotrópicas (Desjeux P, 2004; Desjeux P, 2001;
Guerin PJ et al., 2002). A expressão da infecção recentemente adquirida
varia de nenhuma (infecção subclínica), à oligossintomática e à totalmente
estabelecida (Kalazar). Na leishmaniose visceral sintomática, febre,
fraqueza, anorexia e perda de peso são comuns e progridem de semanas a
meses (Collin S et al., 2004; Osman OS et al., 2000; Davidson RN, 1998).
Crianças podem desenvolver diarréia e retardo no crescimento e, no Brasil,
podem mostrar uma infecção oligossintimática incompleta, a qual
geralmente apresenta cura espontânea em um período variável de tempo,
mas pode também progredir para o kalazar (Badaro R et al., 1986; Gama
MEA et al., 2004). Febre, definhamento, hepatomegalia e frequentemente
esplenomegalia são típicos na leishmaniose visceral. Escurecimento da pele
(Kala azar significa febre negra em Hindu) não é freqüente. Anemia,
leucopenia ou trombocitopenia e hipergamaglobulinemia são característicos.
Com o tempo, a doença não tratada em qualquer faixa etária pode produzir
caquexia profunda, doença multi-sistêmica, sangramento pela
trombocitopenia, susceptibilidade a infecções secundárias e morte (Collin S
et al., 2004; Osman OS et al., 2000; Davidson RN, 1998).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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3.1.5.2- Diagnóstico
Visualização direta de amastigotas em espécimes clínicas é o
diagnóstico padrão ouro em regiões onde aspiração do tecido é viável e
microscopia e perícia técnica são disponíveis. Testes de urina para antígenos
ou anticorpos de leishmania são uma nova abordagem (Sundar S et al.,
2005; Islam MZ et al., 2004). Num laboratório central, amostras clínicas
podem ser cultivadas para isolamento do parasita (Herdwaldt BL, 2004;
Osman OS et al., 2000; Boelaert M et al., 2004) e DNA de leishmania é
prontamente detectável por testes de PCR, incluindo em sangue periférico e
soro (Guerin PJ et al., 2002; Osman OS et al., 2000; Gatti S et al., 2004;
Fissore C et al., 2004).
3.1.6- A Leishmania
3.1.6.1 -Promastigota – Promastigota Metacíclico – Amastigota
Os protozoários do gênero Leishmania apresentam duas formas
morfológicas e três formas fisiológicas. A forma promastigota (figura 2A),
flagelada, infecta o inseto vetor, enquanto que a forma não flagelada
amastigota (figura 2B) reside no interior dos fagolisossomos de macrófagos
de mamíferos. Ambos estados morfológicos são responsáveis pela patologia
em seus respectivos hospedeiros. Uma terceira forma, que aparece como
uma subfase da forma promastigota, é a promastigota metacíclica, cujos
aspectos morfológicos são extremamente parecidos com os da promastigota,
apresentando uma morfologia mais alongada que esta. Esta subfase é tida
como a fase infectante da Leishmania, embora as formas promastigota e
amastigota sejam capazes de infectar o hospedeiro (Teixeira MCA et al.,
2002).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
21
A morfologia das formas evolutivas dos parasitas do gênero
guarda, de certa forma, semelhança entre as diferentes espécies. Os limites
micrométricos das formas amastigostas são de aproximadamente 1,5 a 3,0
x 3,0 a 6,5 µm. Já as promastigotas apresentam uma maior variabilidade
nas suas dimensões, de 10,0 a 40,0 x 1,5 a 3,0 µm (Neves DP, 2000). Estes
estágios de desenvolvimento mostram características morfológicas e
metabólicas diferentes consistentes com um alto nível de regulação da
expressão diferencial de proteínas (Campbell DA et al., 2003).
a) b)
Figura 2: Fotos mostrando as formas amastigota (a), encontradas parasitando os
macrófagos do hospedeiro vertebrado, e promastigota (b), encontradas no tubo digestivo
do hospedeiro invertebrado. Fonte: www.med-chem.com.
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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3.1.6.2 -Cultivo
As formas promastigotas podem ser facilmente cultivadas em
diferentes tipos de meio e são freqüentemente usadas em estudos
científicos. Em contraste, a dificuldade de obter grande número de
amastigotas, livres de contaminantes de células do hospedeiro, tem
impedido a investigação das suas propriedades metabólicas, bioquímicas e
biológicas (Chang KP, 1980; Hart DT et al., 1981). A primeira propagação
com sucesso de formas amastigotas de uma espécie de Leishmania,
denominada Leishmania pifanoi, em um meio livre de células foi relatado por
Pan (1984). Desde então, tentativas em cultivar amastigotas em meio livre
de células têm sido realizadas por vários autores (revisado em Bates 1993;
Pan AA et al. 1993). Alguns trabalhos têm focado na transformação in vitro
de promastigotas em formas amastigotas em resposta à elevação da
temperatura (Hendricks LD, 1978; Hunter KW et al. 1982; Leon LL et al.
1995), enquanto que poucos autores têm descrito cultivo axênico serial do
estágio intracelular. O cultivo axênico de amastigotas de Leishmania
mexicana tem sido mais efetivo que de outras espécies de Leishmania
(Bates PA, 1993). Alguns autores têm relatado transformação de
amastigotas de Leishmania donovani em culturas axênicas (Al-Bashir NT et
al. 1992; Saar Y et al. 1998). Apesar desses relatos sobre cultivo axênico de
amastigotas de Leishmania, ainda restam controvérsias sobre a
reprodutibilidade e/ou o tempo certo da transformação do parasita. (Teixeira
MCA et al. 2002). Por isso, uma observação importante ao que se refere ao
cultivo e diferenciação de Leishmania é que, aparentemente, cada espécie
requer condições especiais relacionadas com temperatura, pH e nutrientes
para a transformação de promastigotas para formas amastigotas. Isto
requer uma optimização cuidadosa das condições da cultura de amastigotas
de cada espécie ou cepa de Leishmania (Somanna A et al., 2002).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
23
3.1.7- Transmissão
As formas promastigotas, inoculadas pelas fêmeas dos insetos
vetores durante o repasto sanguíneo, utilizam-se de mecanismos que lhes
permitem resistir à ação de elementos dos soros, principalmente do
complemento. Um dos mecanismos sugeridos seria, após a ativação do
complemento, a inserção na membrana do parasito de moléculas do
hospedeiro, como C3, C3b e C3bi, as quais, através de receptores existentes
na membrana do macrófago, facilitariam a sua interiorização. Por outro lado,
moléculas da superfície dos promastigotas, como a GP-63 (glicoproteína de
63 KD) e LPG (um complexo glicofosforoglicano), são também indicadas
como importantes na adesão do parasito e na sua endocitose pelo
macrófago (Neves DP, 2000).
Após a interiorização, o macrófago promove a fusão dos lisossomos
com o fagossomo e o parasito, para sua adaptação às condições do novo
ambiente, sofre a transformação para a forma amastigota, intracelular
obrigatória, capaz de desenvolver-se e multiplicar-se no meio ácido
encontrado no vacúolo digestivo (Neves DP, 2000) (figura 3). O pH
desempenha um papel central na transformação de promastigotas em
amastigotas, e as formas amastigotas apresentam uma maior atividade
metabólica estando em ambiente ácido, embora o citoplasma da amastigota
seja regulado para se manter em um pH próximo do neutro através de
processos ativos que ocorrem na célula do parasita (Burchmore RJS and
Barrett MP, 2001).
A multiplicação, por divisão binária simples, é iniciada pela
duplicação do cinetoplasto, um dos quais mantém o flagelo remanescente,
enquanto o outro promove a reprodução da estrutura flagelar. A seguir, o
núcleo se divide e, em seguida, o corpo do parasito se fende, no sentido
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
24
antero-posterior. Após sucessivas multiplicações, na ausência do controle
parasitário pela célula hospedeira, esta se rompe e os amastigotas liberados
serão fagocitados por outros macrófagos (Neves DP, 2000).
Figura 3: Ciclo evolutivo da Leishmania demonstrando as formas encontradas nos
hospedeiros invertebrados (promastigota) e vertebrados (amastigota), assim como sua
localização nos mesmos. Fonte: www.dpd.cdc.gov
* Estágios nohospedeiro invertebrado
* Estágios nohospedeiro vertebrado
O inseto realiza o repasto sangüíneoe injeta formas promastigotas na pele As formas promastigotas
são fagocitadas pelos macrófagos
Promastigotas se transformam em amastigotas dentro
dos macrófagos
As amastigotas se multiplicam nas células(incluindo macrófagos)de vários tecidos
O inseto realiza o repasto sangüíneoe ingere macrófagos infectados comamastigotas
Ingestão de célulasparasitadas
Amastigotas se transformam empromastigotas na parte média do tubodigestivo do inseto
Promastigotas se dividem emigram do intestino para a probóscide
Estágio infectivo
Estágio de diagnóstico
* Estágios nohospedeiro invertebrado
* Estágios nohospedeiro vertebrado
O inseto realiza o repasto sangüíneoe injeta formas promastigotas na pele As formas promastigotas
são fagocitadas pelos macrófagos
Promastigotas se transformam em amastigotas dentro
dos macrófagos
As amastigotas se multiplicam nas células(incluindo macrófagos)de vários tecidos
O inseto realiza o repasto sangüíneoe ingere macrófagos infectados comamastigotas
Ingestão de célulasparasitadas
Amastigotas se transformam empromastigotas na parte média do tubodigestivo do inseto
Promastigotas se dividem emigram do intestino para a probóscide
Estágio infectivo
Estágio de diagnóstico
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
25
3.2- Controle da Expressão Gênica em Leishmania
Os tripanossomatídeos são protozoários eucariotos que divergiram
precocemente da linhagem principal dos eucariotos. A Leishmania, como
outros tripanossomatídeos, exibe uma combinação não usual de mecanismos
de expressão gênica. Os protozoários tripanossomatídeos usam uma
abordagem transcricional policistrônica, na qual pré-RNAs sintetizados ao
longo de centenas de Kilobases produzem RNAs monocistrônicos após
reações acopladas de “Trans-splincing” e a “Poliadenilação”. Assim, a
dependência de mecanismos de regulação da iniciação da transcrição
baseados em um promotor para o controle do nível de mRNA é muito
reduzida; talvez como resultado, grande ênfase pode estar presente nos
mecanismos de regulação pós-trancricional da expressão gênica, tais como
estabilidade e tradução do mRNA e o “turn over” de proteínas (Akopyants
NS et al, 2004).
O processo de “trans-splicing” se dá através de uma trans-
esterificação de dois passos, análogo ao “cis-splicing”, mas formando uma
estrutura em “Y” em lugar do laço intermediário (Liang X et al., 2003). Essa
reação envolve a adição de um “spliced leader” - SL, uma seqüência de RNA
de 39 nucleotídeos, a extremidade 5’ do mRNA (Zick A et al., 2005). A fonte
da seqüência SL é um outro RNA, pequeno, contendo a estrutura cap na sua
extremidade 5’. Assim, a adição da seqüência SL serve para dois propósitos:
funcionar junto com a poliadenilação na dissociação dos transcritos
policistrônicos e prover a estrutura cap aos mRNAs (Liang X et al., 2003)
(figura 4). Diferente da estrutura cap (7-metil guanosina) universalmente
conservada, a qual é ligada ao primeiro nucleotídeo através de uma ligação
5’ – 5’ – trisfosfato, os primeiros quatro nucleotídeos da seqüência SL são
todos modificados por metilação. Este não usual cap modificado, conhecido
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
26
como estrutura cap-4, é a estrutura cap com maior número de modificações
entre as células eucarióticas (Gao H et al., 2005).
O processamento das extremidades 5’ dos mRNAs da unidade
policistrônica, por “trans-splicing”, gera monocístrons com extremidades 3’
passíveis de degradação por nucleases. Desta forma, a poli-adenilação,
visando à proteção destas extremidades, parece ser um evento dependente
do processo de “trans-splicing” e ambos ocorrem dentro de cada região
intergênica. A ausência da seqüência SL ou da cauda poli-A, pode identificar
transcritos para a degradação (LeBowtiz JH et al., 1993). Nenhuma região
específica clássica, tais como os sinais de poliadenilação (AAUAAA) em
eucariotos superiores, parece estar presente nos RNAs mensageiros dos
tripanossomatídeos (Liang XH et al., 2003), embora já se saiba que uma
seqüência de poli-pirimidinas nos mRNAs precursores possa funcionar como
um sinal para indicar tanto o sítio de “trans-splicing” como o de
poliadenilação em tripanossomatídeos.
A funcionalidade desses mRNAs construídos especialmente em
Tripanossomatídeos e a razão para a ocorrência deles em apenas poucos
organismos são ainda desconhecidas. Contando com o importante papel da
extremidade 5’ do mRNA durante a iniciação da tradução em eucariotos, a
seqüência SL e sua estrutura cap associada são esperadas para
desempenhar um papel significante na iniciação da tradução, e
possivelmente estarem envolvidas num mecanismo de iniciação singular
(Gao H et al., 2005).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
27
a)
b)
Figura 4: Esquema ilustrando o processamento do mRNA através dos mecanismos de “cis-
splicing” ou “splicing” convencional (a) e de “trans-splicing” (b).
Promotor
Exons
Introns
Regiões intergênicas
DNA1 2 3 41 2 3
Transcrição e adição do Cap
RNA
Cap
Poliadenilação
AAAAAAAAA
AAAAAAAAA
Cis -splicing
AAAAAAAAA
Transporte Núcleo/Citoplasma
Tradução
Ribossomos
TRANSCRIÇÃO E CIS-SPLICING EM EUCARIOTOS
RNA 2 RNA 3 RNA 4
DNAGene 1 Gene 2 Gene 3 Gene 4
Transporte Núcleo/Citoplasma
AAAAAAAAA
Tradução
TRANSCRIÇÃO E TRANS-SPLICING EMTRIPANOSSOMATÍDEOS.
Transcrição
adição do Cap
Trans –splicing
Poliadenilação
RNA 1
Promotor
Regiões intergênicas
Cap
Ribossomos
SL
Cauda poli-A
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
28
3.3- Iniciação da Síntese Protéica em Eucariotos
Um dos mecanismos usados pelos eucariotos para regular a
expressão gênica é o controle das taxas de tradução. A regulação da
tradução desempenha um papel crítico no crescimento, na proliferação e no
desenvolvimento celular. Vantagens no controle da tradução incluem
resposta rápida e um modo de atingir o nível de um produto gênico na
ausência de transcrição. As taxas de tradução podem ser controladas em
cada um dos seus três estágios: iniciação, elongação e terminação. Contudo,
a regulação ocorre predominantemente na iniciação, onde o ribossomo é
recrutado para um mRNA e posicionado no códon de iniciação (Gingras A-C
et al., 1999).
A tradução do mRNA em proteínas se inicia após a montagem do
ribossomo 80S através da interação entre tRNA iniciador (tRNAi), mRNA e as
subunidades 40S e 60S. O complexo processo de iniciação que leva a
formação do ribossomo 80S consiste em vários estágios relacionados que
são mediados pelos fatores de iniciação eucarióticos (eIFs) (Pestova TV et
al., 2001). Estes estágios são:
1- Seleção do RNA transportador inicial (tRNAi) a partir do “pool” de
tRNAs pelo fator de iniciação eIF2 e ligação de um complexo ternário
(eIF2 / GTP / tRNAi) e outros eIFs a subunidade 40S para formar o
complexo de pré-iniciação 43S.
2- Ligação do complexo 43S ao mRNA, o que na maioria das vezes
ocorre por um mecanismo que envolve o reconhecimento inicial do
cap na extremidade 5' do mRNA pela subunidade eIF4E (cap-binding-
protein) do complexo eIF4F.
3- Movimento do complexo ribossomal ligado ao mRNA ao longo da
região 5' não traduzida (5' UTR) a partir do sítio inicial de ligação até
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
29
o códon de iniciação para formar o complexo 48S no qual este códon
tem suas bases pareadas com as bases do anticódon do tRNAi.
4- Desligamento dos fatores de iniciação do complexo 48S e junção da
subunidade 60S para formar o ribossomo 80S, deixando o tRNAi no
sítio P ribossomal.
3.3.1 – Complexo eIF4F
Os fatores de iniciação do complexo eIF4F são responsáveis pelo
recrutamento do mRNA para o ribossomo. O eIF4F é um complexo composto
por 3 polipeptídeos: (a) eIF4A, uma ATPase RNA-dependente e RNA
helicase; (b) eIF4E, a proteína de ligação ao cap, de 24 KDa; e (c) eIF4G,
uma proteína grande contendo sítios de ligação para eIF4E, eIF4A, eIF3 e
PABP (Proteína de ligação à cauda Poli-A). O eIF4F interage tanto com o cap
(através do eIF4E) quanto com o eIF3 associado ao ribossomo (através do
eIF4G). Assim, o eIF4F exerce uma função essencial na ligação entre o
mRNA e o ribossomo (Gingras A-C et al., 1999).
O fator eIF4A é um polipeptídeo de 46KDa que exibe atividades
ATPase dependente de RNA e RNA helicase bidirecional. Essa proteína age
removendo regiões de estrutura secundária dentro da região 5' não
traduzida (5' UTR) do mRNA para facilitar a ligação do ribossomo e sua
migração até o códon de iniciação da tradução (Li W et al., 2001). Há três
isoformas em mamíferos: eIF4AI, eIF4AII e eIF4AIII. O eIF4AII humano
apresenta alta homologia com o eIF4AI (89% de identidade) e é
funcionalmente equivalente. Em contraste, o fator eIF4AIII (com 66% de
identidade ao eIF4AI em humanos) não pode substituir o eIF4AI em ensaios
de ligação a ribossomos. Resultados recentes indicam que a localização do
eIF4AIII é no núcleo (Holzmann K et al., 2000) e que ele pode agir como um
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
30
fator ancorador para o complexo de junção de exon (“EJC” de Exon Junction
Complex) (Chan CC et al., 2004) e é essencial para o decaimento de mRNAs
com mutações “non-sense” em mamíferos (Palácios IM et al., 2004). A
atividade helicase do eIF4A é fortemente estimulada pelo eIF4B. Embora o
eIF4A e o eIF4B interajam bioquimicamente e geneticamente, não há
nenhuma evidência que essas proteínas interagem fisicamente de uma
maneira estável (Gingras A-C et al., 1999). Recentemente, foi encontrado
um homólogo necessário para reconstituir a tradução em E. coli, fator W2,
que é codificado pelo gene “deaD” o qual apresenta 87% de similaridade na
seqüência de aminoácidos ao fator eucariótico eIF4A. Anticorpos contra o
eIF4A eucariótico apresentam reação cruzada com a proteína em E. coli.
Este fator procariótico se mostrou capaz de promover a tradução em ensaios
onde os mRNAs apresentavam estrutura secundária, mas não naqueles onde
o mRNA não possuía essa característica (Lu J et al., 1999).
O fator eIF4E foi identificado por sua habilidade de se ligar ao cap e
foi subseqüentemente purificado por cromatografia de afinidade numa
matriz contendo cap sintético imobilizado. O eIF4E é responsável pelo
reconhecimento do cap na iniciação e é essencial para a tradução cap-
dependente. A depleção do eIF4E (e proteínas associadas) de extratos
celulares reduz drasticamente a tradução de mRNAs com cap na sua
extremidade 5’; sua atividade total é restaurada pela adição de eIF4E
expressos em bactérias ou eIF4E nativos purificados (Gingras A-C et al.,
1999). Esse fator desempenha uma importante papel no processo de
tradução pela sua ligação ao cap na extremidade 5' do mRNA, recrutamento
dos demais fatores de iniciação e também da subunidade 40S para o mRNA.
O eIF4E é implicado no controle do crescimento e da sobrevivência celulares
(Proud CG, 2002). Altos níveis de expressão desse fator podem desfazer o
controle do crescimento celular e estão relacionados com cânceres humanos
(Scheper GC and Proud CG, 2002). Em experimentos controle onde o eIF4E
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
31
foi omitido (estava ausente), o complexo ribossomal 48S foi formado na
posição correta, contudo com muito menos eficiência (Morino S et al.,
2000). Estudos recentes utilizando formas mutantes de eIF4E revelaram que
esse fator, assim como o eIF4G, pode recrutar ribossomos independente de
uma ligação física com a extremidade 5' do mRNA ou com o cap (De
Gregorio E et al., 2001). O eIF4E interage com o eIF4G, para a formação do
complexo eIF4F, através de um sítio pelo qual também interage com
proteínas inibitórias chamadas 4E-BPs (“4E-binding-protein”). A associação
do eIF4E com as 4E-BPs o impede de formar um complexo de iniciação
produtivo com o eIF4G; as 4E-BPs, assim, agem como inibidores de
tradução cap-dependente. Esses inibidores, quando sofrem fosforilação, se
desligam do eIF4E. Aminoácidos, insulina e fatores de crescimento estão
entre os numerosos estímulos conhecidos para aumentar a fosforilação das
4E-BPs e assim promovem a formação do complexo eIF4F (Scheper GC and
Proud CG, 2002).
Há duas isoformas de eIF4G em mamíferos, eIF4GI e eIF4GII, que
apresentam 46% de identidade e têm massas moleculares de 171 kDa e 176
kDa, respectivamente. O eIF4G possui sítios de ligação para o eIF4E, eIF4A,
eIF3 e PABP e atua como uma ponte entre o ribossomo e o mRNA (Gingras
A-C et al., 1999). O eIF4GI de mamífero pode ser dividido em três regiões
aproximadamente iguais; uma região amino-terminal que contém sítios de
ligação para a PABP e para o eIF4E; uma região central que liga o eIF4A e o
eIF3; e uma região carboxi-terminal que possui um segundo sítio de ligação
ao eIF4A. Relatos anteriores demonstraram que a região central do eIF4GI é
suficiente para uma tradução cap-independente. Uma seqüência de 540
aminoácidos contendo o sítio de ligação ao eIF4E e a região central do
eIF4GI, é a seqüência mínima requerida para a tradução cap-dependente.
De acordo com isso, um ponto de mutação no eIF4GI que abole a ligação ao
eIF4A na região central inibiu completamente a ligação ao cap. Quando o
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
32
sítio de ligação na região C-terminal do eIF4GI foi mutado, a ligação ao
ribossomo foi diminuída em 3-4 vezes. Esses dados indicam que a interação
do eIF4A com a região central do eIF4GI é necessária para a tradução,
enquanto que a interação do eIF4A com a região C-terminal desempenha um
papel de modulação (Morino S et al., 2000). Um outro dado encontrado foi
que a região central do eIF4G se liga ao eIF4A com uma afinidade 20 vezes
maior do que a região C-terminal. O eIF4G se associa com o eIF4AI ou
eIF4AII, mas não com ambos simultaneamente, sugerindo uma razão de 1:1
em lugar de 1:2 (Li W et al., 2001).
3.3.2- Proteínas Ribossomais
3.3.2.1- Proteína P0
Ensaios recentes de cristalografia ribossomal revelaram a estrutura
detalhada do ribossomo, a organela celular universal para a tradução do
código genético em proteínas (Gindulyte A et al., 2006). Enquanto a
estrutura primária das proteínas ribossomais de eucariotos é conhecida, um
grande avanço também tem sido feito em relação ao entendimento da
estrutura terciária do ribossomo de várias espécies, entre elas, espécies da
família Tripanosomatidae. Recentemente, a estrutura do ribossomo 80S do
Trypanosoma cruzi foi elucidada. Em comparação com as estruturas
ribossomais de outras espécies, o ribossomo do T. cruzi mostrou a presença
de componentes estruturais não usuais, relacionados a grandes segmentos
na estrutura secundária do rRNA (Figura 5). Acredita-se que esses
componentes ribossomais diferenciados estejam envolvidos no mecanismo
único de iniciação da tradução nos tripanossomatídeos (Gao H et al., 2005).
Apesar disso, ainda falta o conhecimento sobre o papel de proteínas
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
33
ribossomais na montagem do ribossomo e no processo de tradução
(Tchórzewski M et al., 2003).
Como exemplo, uma família de proteínas cujo comportamento e
função na célula ainda são vagos são as proteínas ácidas ribossomais P.
Estas proteínas formam uma protuberância lateral, chamada de estrutura
em haste (“stalk”) que é localizada na parte ativa do ribossomo, onde
interações entre mRNAs, tRNAs e fatores de tradução acontecem durante o
curso da síntese protéica (Tchórzewski M et al., 2003).
As proteínas P constituem uma família de proteínas ácidas
ribossomais em um ambiente onde a maioria das proteínas é básica e se
localizam dentro da subununidade ribossomal 60S. Em eucariotos, a família
de proteínas P é formada por três membros, P0, P1 e P2, os quais formam
um complexo pentamérico no qual os homodímeros P1/P2 são anexados a
uma única proteína P0 através de suas extremidades NH2-terminal (Skeiky
YAW et al., 1994).
Para entender o mecanismo de biogênese do ribossomo e a função
das proteínas ribossomais, cada proteína ribossomal deve ser estudada
individualmente. Estudos feitos com essas proteínas mostraram a localização
subcelular das proteínas ácidas ribossomais P, as proteínas P1, P2 e P0,
usando abordagens in vivo assim como in vitro. Nesses estudos, foram
mostradas evidências de que essas proteínas não são transportadas
ativamente para dentro do núcleo, mostrando um comportamento único de
proteínas ribossomais o qual não tinha sido descrito até o momento
(Tchórzewski M et al., 2003).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
34
Figura 5: Esquema da estrutura dos ribossomos. Figura ilustrativa mostrando as
subunidades em dois pontos de vista do ribossomo de três organismos distintos. Como
observado, o ribossomo 80S do T. cruzi mostra uma maior complexidade entre os demais.
Fonte: Gao H et al., 2005.
Ribossomos de Tripanossomatídeos
Ribossomos de Leveduras
Ribossomos de Bactérias
Ribossomos de Tripanossomatídeos
Ribossomos de Leveduras
Ribossomos de Bactérias
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
35
3.3.3- Iniciação da tradução em tripanossomatídeos
A iniciação da tradução em tripanossomatídeos é um processo que
vem sendo estudado intensamente por pesquisadores do Departamento de
Microbiologia do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM). A
identificação de homólogos de fatores de iniciação da tradução de L. major
foi possível através de análise do genoma completo deste parasita, cujas
seqüências estão disponíveis no GenBank e em bancos de dados de acesso
livre. Neste projeto genoma foram seqüenciados 36 cromossomos com um
total de 32.8 megabases, onde foram encontrados 911 genes de RNA, 39
pseudogenes e 8272 genes que codificam proteínas, e para apenas 36%
destes genes pode ser atribuída uma função putativa (Ivens et al., 2005).
Os resultados previamente obtidos pelo grupo do CPqAM serviram
de base para análise da expressão dos fatores de iniciação da tradução e
suas interações dentro do parasita L. major. Assim, a análise das funções
dos diferentes homólogos identificados teve início com a amplificação e
clonagem das seqüências codificando para os homólogos aos eIF4E, eIF4A e
eIF4G de L. major (LmEIF4E1-4, LmEIF4A1-2 e LmEIF4G1-5,
respectivamente). Essas seqüências foram utilizadas para a expressão das
diferentes proteínas em Escherichia coli e produção de soro policlonal
específico. Os resultados tiveram início com a caracterização preliminar dos
LmEIF4E1-3, LmEIF4A1-2, LmEIF4G3. No começo, foi realizada a
quantificação da expressão dessas proteínas em promastigotas de L. major
por Western-blot usando anticorpos específicos. Os LmEIF4A1 e LmEIF4E3
são muito abundantes (> 5 x 104 moléculas/célula). O LmEIF4G3 é
moderadamente abundante (5x103-104 moléculas/célula) e os LmEIF4E1 /
LmEIF4E2 / LmEIF4A2 são raros ou não detectados (< 5 x 103
moléculas/célula). Depois, foi investigada a atividade de ligação ao cap dos
homólogos ao eIF4E onde foi encontrado que apenas o LmEIF4E1 foi capaz
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
36
de se ligar a resina 7-metil-GTP-Sefarose com uma afinidade similar àquela
do eIF4E de Xenopus. A modelagem molecular confirmou que o LmEIF4E1
tem todas as características estruturais de uma proteína de ligação ao cap.
Ensaios de “pull-down” foram usados para investigar a interação potencial
entre eIF4A (LmEIF4A1/ LmEIF4A2) e os homólogos do eIF4G (LmEIF4G1-
3). Apenas o LmEIF4G3, através do domínio HEAT, se ligou especificamente
tanto ao homólogo do parasita LmEIF4A1 quanto ao fator humano eIF4A.
Assim, para cada fator, uma das formas encontradas em L. major parece
realizar em parte, pelo menos, as funções esperadas de um fator de
iniciação da tradução. Estes resultados são consistentes com as funções
esperadas para estes fatores na tradução do mRNA do parasita (Dhalia R et
al., 2005).
Paralelamente, alguns estudos têm sido realizados com a proteína
P0 de algumas espécies de tripanossomatídeos, como por exemplo, a LcP0,
a proteína P0 de Leishmania chagasi, a qual é reconhecida durante infecções
humanas com esse parasita. A proteína é homóloga às proteínas ribossomais
de Trypanosoma cruzi e de humano TcP0 e HuP0, respectivamente. O
domínio ácido C-terminal altamente carregado da LcP0 contém um resíduo
de serina tipicamente encontrado na maioria dos eucariotos, mas ausente
em todas as proteínas P de T. cruzi caracterizadas até o momento.
Indivíduos infectados com L.chagasi, assim como aqueles com T.cruzi têm
anticorpos que apresentam reação cruzada com as LcP0 e TcP0
recombinantes e também com a HuP0. Contudo, as propriedades dos
anticorpos anti-P0 em soros de infecções por T.cruzi e L.chagasi são um
tanto diferentes. Através do uso de peptídeos sintéticos, foi mostrado que
enquanto os anti-TcP0 em infecções com T. cruzi são exclusivamente
dirigidos conta a região C-terminal do TcP0, soros de infecção com L.
chagasi contêm anticorpos que reagem com epitopos diferentes da
seqüência C-terminal do TcP0 (Skeiky YAW et al., 1994). Outros resultados
também demonstram que enquanto o domínio de ligação ao RNA da proteína
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
37
P0 é funcionalmente conservado em eucariotos, as regiões envolvidas nas
interações proteína-proteína com outras proteínas da haste ou fatores de
elongação da tradução têm evoluído notavelmente (Rodriguez-Gabriel MA et
al., 2000). Uma característica também examinada da proteína ribossomal P0
foi sua propriedade imunogênica onde se observou que, em camundongos
imunizados com a construção plasmidial pcDNA3-LiP0 (proteína P0 de L.
infantum), uma proteção notável contra infecção com L. major foi atingida,
como determinada tanto pelo desenvolvimento da lesão quanto pela carga
parasitária (Iborra S et al., 2003).
3.4- Proteínas de Expressão Estágio-Específica em Leishmania
A identificação de genes cujos produtos mostram uma forte
expressão estágio-específica é um ponto muito relevante na patogênese
microbiana para a identificação de importantes caminhos essenciais para a
sobrevivência do parasita. O entendimento de como a Leishmania
desempenha as transições em seu desenvolvimento e dos mecanismos que
ela emprega para sobreviver dentro de cada hospedeiro é crítico para o
desenvolvimento de tratamentos efetivos e cura dessa parasitose
(Akopyants NS et al., 2004). Infelizmente, poucos exemplos de proteínas de
expressão estágio específica bem caracterizadas em Leishmania são
conhecidos. Duas proteínas com resultados relevantes na literatura são as
proteínas META1, específica da fase promastigota metacíclica de Leishmania,
e A2, expressa na fase amastigota de algumas espécies de Leishmania.
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
38
3.4.1- Proteína META1
Em Leishmania e em outros tripanossomatídeos, genes expressos
de forma específica no estágio infectivo do ciclo de vida do parasita são tidos
como candidatos para o desenvolvimento de novos profiláticos (Uliana SRB
et al., 1999). Entre os genes estágio-específicos identificados em L. major, o
gene meta 1 está presente e conservado em seqüência em todas as espécies
de Leishmania analisadas até o momento (Ramos CS et al., 2004). O gene
meta 1, originalmente identificado em biblioteca de cDNA (Coulson RMR and
Smith DF, 1990), é expresso pela L. major no estágio encontrado no inseto,
predominantemente na fase infectiva e resistente ao complemento,
chamada de promastigota metacíclica, a qual é preparada para
sobrevivência no hospedeiro. A expressão do gene meta 1, em níveis basais
de RNA, é baixa em promastigotas procíclicas e amastigotas comparada com
os altos níveis encontrados em promastigotas metacíclicas. Esse padrão de
expressão pode indicar um papel funcional para a proteína META 1 nesse
estágio infectivo do parasita. Alguns experimentos mostraram que não é
possível gerar um mutante duplamente nulo para o lócus do gene meta1,
sugerindo uma função essencial para este gene. Quando teve sua expressão
aumentada, foi demonstrada uma co-relação entre a expressão do gene
meta1 e virulência in vivo (Uliana SRB et al., 1999). O mRNA meta 1 é
expresso em altos níveis em promastigotas metacíclicas e codifica uma
proteína citoplasmática de aproximadamente 12 kDa que é concentrada em
vacúolos ao redor da bolsa flagelar. A proteína META1 também se comporta
como um forte indutor de resposta imune tipo Th2 em hospedeiros
mamíferos (Ramos CS et al., 2004). Tanto a proteína META1 recombinante
quanto plasmídeos carregando o gene meta1 foram testados quanto a sua
antigenicidade e potencial em induzir imunidade protetora em camundongos.
A vacinação com a proteína recombinante induziu uma resposta
predominante do tipo Th2 e não resultou em proteção ao término do desafio
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
39
com parasitas vivos. Surpreendentemente, a mudança esperada para uma
resposta do tipo Th1-CD4+ ao término da imunização genética por via
intramuscular não foi observada. Em lugar disso, a vacinação com o gene
meta 1 ou com o gene fusionado a uma proteína induziu uma resposta do
tipo Th2 que se correlacionou com a ausência de proteção contra a infecção
(Serezani CHC et al., 2002).
Em estudos onde a região ao redor do gene meta 1 foi
caracterizada com respeito ao seu conteúdo gênico e padrão de expressão,
em L. amazonensis, visando primariamente uma comparação entre as
regiões homólogas em L. major, Trypanosoma brucei e T. cruzi, foi
encontrado um gene relacionado ao meta 1, chamado de meta 2. Sua região
C-terminal é similar a de proteínas encontradas em Leishmania e
Trypanosoma, cuja função em células animais está relacionada com
processos celulares como remodelagem das junções
citoesqueleto/membrana, vias de transdução de sinais e apoptose. Essa
putativa proteína META 2 contém três cópias do domínio META, sugerindo
uma relação funcional desta com a proteína META 1. Uma futura
determinação do papel da proteína META 2 em Leishmania, assim como
possíveis interações entre as diferentes proteínas META, podem gerar
subsídios para uma elucidação dos mecanismos de virulência em Leishmania
(Ramos CS et al., 2004).
3.4.2- A família A2
Uma família de proteínas de expressão estágio específica de
amastigotas de Leishmania já bem caracterizada é a que compreende as
proteínas A2. Há, pelo menos, sete membros da família de genes A2 que
codificam proteínas entre 45 e 100 Kda que são constituídas principalmente
de uma seqüência repetitiva de aminoácidos e se localizam principalmente
no citoplasma (Zhang WW et al., 1996). Os genes que codificam para as
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
40
proteínas A2 em L. donovani foram previamente descritos como expressos
no estágio de desenvolvimento amastigota, mas também podem ser
induzidos experimentalmente em promastigotas pela combinação de
mudanças de pH e temperatura, condições que mimetizam o compartimento
fagolisossomal do macrófago. Os genes A2, contudo, não estão presentes
em todas as espécies de Leishmania e estão ausentes em L. major (Ghedin
et al., 1997).
Considerando a importância das formas amastigotas na infecção
humana, tentou-se entender os mecanismos associados a expressão
diferencial das proteínas A2 em amastigotas. Os resultados mostraram
evidências de que a expressão da proteína A2 durante a citodiferenciação de
promastigota para amastigota é mediada através do controle da estabilidade
do seu mRNA e envolve a sua região 3’ não traduzida (Charest H et al.,
1996).
Em trabalhos que tinham o objetivo de definir a base molecular da
sobrevivência da amastigota de Leishmania donovani no hospedeiro
mamífero, a família de proteínas A2 foi utilizada. Sua expressão, assim como
os mRNAs codificando para as proteínas A2, foi inibida em amastigotas
utilizando RNA anti-senso. O resultado mostrou que as amastigotas
deficientes das proteínas A2 foram severamente comprometidas com
respeito à virulência em camundongos. As amastigotas que chegaram a
sobreviver nos camundongos tinham recuperado a expressão das proteínas
A2. Esses dados demonstraram que as proteínas A2 são requeridas para a
sobrevivência da L. donovani no hospedeiro mamífero e isto representa o
primeiro fator de virulência específico de amastigotas identificado em
Leishmania. Já em experimentos realizados em culturas de amastigotas ou
promastigotas in vitro não houve nenhuma alteração significante na taxa de
crescimento ou morfologia do parasita, sugerindo que as proteínas A2 não
são requeridas para a proliferação do parasita in vitro (Zhang WW and
Matlashewski G, 1997).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
41
Outros estudos demonstraram que a proteína A2 pode ser um
antígeno utilizado para diagnóstico sorológico da leishmaniose visceral
(Ghedin E et al., 1997) e uma das outras funções sugeridas para a proteína
A2 é seu envolvimento na visceralização da Leishmaniose associada a L.
donovani (Zhang WW and Matlashewski G, 2001).
3.5- Diferenciação Celular em Leishmania e Regulação da Tradução
Como visto, em tripanossomatídeos, assim como em todos os
eucariotos, a síntese de proteínas depende das atividades dos fatores de
iniciação da tradução, tanto facilitando como controlando o acesso dos
ribossomos aos mRNAs. A quase total ausência de mecanismos de controle
da síntese de mRNAs nos tripanosomatídeos torna de grande importância
um estudo detalhado sobre como é regulada a sua tradução, principalmente
quando se leva em conta os vários estágios de diferenciação celular pelos
quais estes organismos passam ao longo do seu ciclo de vida. Em eucariotos
de uma forma geral, o conhecimento que se tem até o momento sobre os
princípios cinéticos que estão envolvidos no controle da tradução é muito
limitado, assim como detalhes sobre concentrações relevantes dos fatores
são escassos (Von der Haar T and McCarthy JEG, 2002). Gerar informações
sobre os níveis intracelulares dos eIFs nos organismos de estudo, para
investigar de que forma as concentrações de fatores específicos se
relacionam com o alcance de ótimas taxas de tradução, é um objetivo muito
importante a ser atingido.
Os dados de expressão dos homólogos de eIF4F já analisados de
Leishmania se restringem apenas ao estágio promastigota do seu ciclo de
vida (Dhalia R et al., 2005). Tendo em vista as diferenças significativas
observadas nos níveis de eIF4E, como exemplo, é importante verificar se
essas diferenças são mantidas ao longo de todas as formas de vida do
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
42
parasita. Dados da literatura sugerem que o homólogo LmEIF4E1 pode ter
uma expressão preferencial no estágio amastigota (Boucher N et al., 2002).
Desta forma, este trabalho se iniciou com o objetivo de comparar os níveis
desses fatores com o de proteínas comprovadamente envolvidas na
atividade de síntese da cadeia polipeptídica, em tripanossomatídeos. Como
exemplo, temos as próprias proteínas componentes das subunidades
ribossomais. Um exemplo é a proteína ácida ribossomal P0, já descrita. Esse
estudo comparativo visa encontrar, por exemplo, a razão fator/ribossomo, o
que pode nos mostrar se os nossos fatores são limitantes para a síntese
protéica ou se apresentam outro papel na regulação deste processo. Por
outro lado, buscou-se otimizar as condições de crescimento das três
principais formas do ciclo de vida de espécies selecionadas de Leishmania e
analisar a expressão nestas formas da proteína P0 em comparação com
homólogos selecionados das subunidades do complexo eIF4F de Leishmania.
Sendo assim, tornou-se necessário confirmar a obtenção das formas
celulares diferenciadas pela visualização da síntese de proteínas estágio
específicas destes protozoários, tais como a proteína A2 (fase amastigota) e
a proteína META 1 (fase promastigota metacíclica), tidas como indicadoras
de diferenciação do parasita. Com este estudo espera-se poder contribuir no
entendimento dos processos de diferenciação celular em Leishmania, assim
como da importância de mecanismos de regulação pós-transcricional, agindo
ao nível de tradução, no controle desta diferenciação. Estas informações
poderão servir de base para novas estratégias de combate à infecção, como
por exemplo, a confecção de quimioterápicos eficazes utilizados na inibição
específica da síntese de proteínas desses parasitas.
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
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Análise da expressão de fatores protéicos envolvidos na síntese de proteínas durante o ciclo de vida de Leishmania sp.
Pollyanna O. Rochaa,b, Mariana L. Palmab, Osvaldo P. de Melo Netoa,b
aDepartamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Avenida Professor Moraes Rego s/n,
Cidade Universitária, Recife 50732-970, PE, Brasil bCentro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Avenida Professor Moraes Rego s/n,
Cidade Universitária, Recife 50670-420, PE, Brasil
Manuscrito a ser encaminhado à revista
MMoolleeccuullaarr aanndd BBiioocchheemmiiccaall PPaarraassiittoollooggyy
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
54
RESUMO
Em eucariotos, a síntese de proteínas é um processo complexo cuja etapa
crítica, a iniciação, requer um número de fatores de iniciação da tradução (eIFs),
entre eles o complexo eIF4F, composto por três subunidades: eIF4A, eIF4E e eIF4G.
Em Leishmania major e outros tripanossomatídeos patogênicos pouco se conhece
sobre a iniciação de sua tradução, entretanto múltiplos homólogos foram identificados
para cada uma das subunidades de eIF4F (LmEIF4E1-4, LmEIF4A1-2 e LmEIF4G1-5).
Em estudos prévios, essas proteínas tiveram sua expressão quantificada na fase
promastigota do ciclo de vida de L. major, revelando uma grande variação nos seus
níveis intracelulares. Neste trabalho partiu-se para comparar a expressão de algumas
destas proteínas com a de uma proteína ribossomal (P0), cujos níveis intracelulares
são indicativos do número de ribossomos presentes no organismo. Foram analisadas
os três principais estágios do ciclo de vida de L. chagasi e L. amazonensis,
promastigota (Pm), promastigota metacíclico (PmMt) e amastigota (Am). Estas
espécies foram selecionadas por ser possível sua diferenciação em cultura. Anticorpos
contra proteínas de expressão estágio-específica, as proteínas A2 (expressa em Am)
e META1 (PmMt), foram produzidos e utilizados para monitorar esta diferenciação,
embora só a proteína META1 tenha se mostrado útil nesta análise. Formas
semelhantes à amastigota foram observadas por microscopia. Foram detectados altos
níveis da proteína ribossomal P0 (~6,6x105 moléculas/célula na forma Pm) com
pouca variação entre os três estágios analisados. Em comparação, a expressão do
homólogo de eIF4G, LmEIF4G3, também se mostrou constante, enquanto que o
homólogo LmEIF4G1 só foi detectado nas formas Pm e Am do parasita. Ensaios com
outros homólogos de eIF4F estão sendo realizados, esperando-se caracterizar melhor
os processos que envolvem a iniciação da tradução em Leishmania e o controle da
sua diferenciação celular.
Palavras-chave: Trypanossomatídeos, Iniciação da Tradução, Ciclo de vida da
Leishmania, Expressão estágio específico e Proteína ribossomal.
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
55
1.Introdução
O gênero Leishmania (Ross, 1903) agrupa espécies de
protozoários unicelulares, heteroxenos, parasitos pertencentes à ordem
Kinetoplastida e à família Trypanosomatidae, encontrados na forma
flagelada promastigota, no trato digestivo dos hospedeiros invertebrados,
e amastigota, sem flagelo livre, parasita intracelular obrigatório das
células do sistema fagocítico mononuclear dos hospedeiros vertebrados
[1]. Este gênero é responsável pela zoonose endêmica Leishmaniose em
cerca de 88 países. Cerca de 400 mil casos novos são confirmados
anualmente em todo o mundo, onde aproximadamente 350 milhões de
pessoas encontram-se em áreas de risco [2].
Os tripanossomatídeos são protozoários eucariotos que
divergiram precocemente da linhagem principal dos eucariotos. A
Leishmania, como outros tripanossomatídeos, exibe uma combinação não
usual de mecanismos de expressão gênica. Os protozoários
tripanossomatídeos usam uma abordagem transcricional policistrônica, na
qual pré-RNAs sintetizados ao longo de centenas de Kilobases produzem
RNAs monocistrônicos após reações acopladas de “Trans-splincing” e
“Poliadenilação”. Assim, a dependência de mecanismos de iniciação da
transcrição baseados em um promotor para o controle do nível de mRNA
é muito reduzida; talvez como resultado, grande ênfase pode estar
presente nos mecanismos de regulação pós-trancricional, tais como
estabilidade e tradução do mRNA e o “turn over” de proteínas [3].
Em eucariotos, a tradução é um processo complexo que requer
uma diversidade de macromoléculas incluindo RNAs e proteínas. Neste
processo, o ponto crítico de iniciação requer um número de fatores de
iniciação da tradução (eIFs, de “eukariotic initiation factors”) cuja
atividade pode ser altamente regulada. Acima de todos esses fatores está
o complexo eIF4F, o qual é necessário para o recrutamento da
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
56
subunidade menor ribossomal para a extremidade 5’ do RNA mensageiro.
O complexo eIF4F é composto pela RNA helicase eIF4A, pela proteína de
ligação ao cap eIF4E e pela grande proteína central eIF4G, responsável
pela mediação da interação entre o eIF4F e outros fatores da tradução
assim como a subunidade menor ribossomal [4].
Alguns fatores de iniciação da tradução de tripanossomatídeos
já caracterizados incluem subunidades de fatores de elongação tais como
eEF2 e eEF3 [5] e a proteína de ligação à cauda Poli-A, PABP, de T. cruzi,
T. brucei and Leishmania major [6, 7, 8]. Múltiplos homólogos potenciais
para os três componentes do eIF4F foram identificados recentemente e
caracterizados em L. major (LmEIF4E1-4, LmEIF4A1-2 e LmEIF4G1-5).
Os homólogos que tiveram suas características analisadas até o momento
parecem variar em diferentes aspectos tais como afinidade de ligação ao
cap dos eIF4Es, níveis de expressão e interação com outros componentes
do eIF4F. Os resultados sugerem um alto grau de complexidade na
iniciação da tradução desses parasitas, o qual pode refletir uma
adaptação ao seu complexo ciclo de vida. Até o momento, contudo, os
dados de expressão dos homólogos analisados se restringem apenas ao
estágio promastigota do ciclo de vida da Leishmania. Os LmEIF4A1 e
LmEIF4E3 se mostraram muito abundantes, o LmEIF4G3 moderadamente
abundante e os LmEIF4E1 / LmEIF4E2 / LmEIF4A2 raros ou não
detectáveis [9]. Um ponto importante para se entender melhor a função
desses vários homólogos então é verificar a sua expressão ao longo do
ciclo de vida de espécies de Leishmania.
Morfologicamente, a Leishmania apresenta duas formas
distintas, enquanto que fisiologicamente são observadas três formas: A
forma promastigota, encontrada no inseto vetor, a forma promastigota
metacíclica, a forma infectante do parasita, e a forma amastigota, forma
parasita do sistema fagocítico monocuclear do hospedeiro vertebrado
[10]. As formas promastigotas podem ser facilmente cultivadas em
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
57
diferentes tipos de meio. Em contraste, a dificuldade de obter grande
número de amastigotas, livres de contaminantes de células do
hospedeiro, tem impedido a investigação das propriedades metabólicas,
bioquímicas e biológicas [11]. Além dos empecilhos encontrados na
manutenção das amastigotas, um ponto muito importante, e também
difícil, é a confirmação de cada estágio em que a célula se encontra. Para
isso pode-se fazer uso de proteínas sabidamente de expressão estágio-
específico. Exemplos de proteínas de Leishmania já caracterizadas que se
enquadram nessa situação são a proteína META1, cuja expressão é vista
na fase promastigota metacíclica, e a proteína A2, específica da fase
amastigota de algumas espécies de Leishmania.
O gene meta 1, originalmente identificado em biblioteca de
cDNA), é expresso pela L. major no estágio encontrado no inseto,
predominantemente na fase infectiva e resistente ao complemento,
chamada de promastigota metacíclica. A expressão do gene meta 1, em
níveis basais de RNA, é baixa em promastigotas procíclicas e amastigotas
comparada com os altos níveis encontrados em promastigotas
metacíclicas [12]. Em estudos onde as regiões que flanqueiam o gene
meta 1 foram caracterizadas com respeito ao seu conteúdo gênico e
padrão de expressão, em L. amazonensis, visando primariamente uma
comparação entre as regiões homólogas em L. major, Trypanosoma
brucei e T. cruzi, foi encontrado um gene relacionado ao meta 1,
chamado de meta 2, cuja expressão também parece ser estágio
específica [13]. A família de proteínas A2 compreende um grupo de
proteínas das mais estudadas cuja expressão se restringe ao estágio de
amastigota de Leishmania [14]. Há, pelo menos, sete membros da família
de genes A2 que codificam proteínas entre 45 e 100 KDa que são
constituídas principalmente de uma seqüência repetitiva de aminoácidos
e se localizam principalmente no citoplasma [15]. Em trabalhos que
tinham o objetivo de definir a base molecular da sobrevivência da
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
58
amastigota de Leishmania donovani no hospedeiro mamífero observou-se
que as amastigotas deficientes das proteínas A2 foram severamente
comprometidas com respeito à virulência em camundongos [16].
O conhecimento sobre o balanço de atividades dos fatores de
iniciação da tradução de eucariotos (eIFs) é crucial para o entendimento
dos mecanismos envolvidos no controle da tradução. Com base nisso,
trabalhos recentes estimaram os níveis intracelulares dos eIFs de células
da levedura Saccharomyces cerevisiae na fase logarítmica de
crescimento, o que gerou dados importantes para a base do
desenvolvimento de um modelo quantitativo da maquinaria envolvida na
tradução dos eucariotos [17]. Como visto, os níveis de expressão dos
eIF4Fs de tripanosomatideos variam significativamente em termos
quantitativos. Entretanto o significado real dessa variação não pode ser
totalmente compreendido, em especial quando se leva em conta o pouco
se conhece sobre a síntese protéica nestes organismos. Até mesmo os
níveis intracelulares dos ribossomos destes organismos não foram
devidamente estimados. Recentemente a estrutura do ribossomo de T.
cruzi foi elucidada, embora não se conheça os detalhes do
posicionamento de suas várias subunidades protéica [18] e pouco tenha
se estudado sobre essa organela nos tripanosomatideos. Um grupo de
proteínas ribossomais, cujo comportamento e função na célula eucariótica
ainda são vagos, mas que já foram estudadas em um certo nível nos
tripanosomatideos, são as proteínas ácidas ribossomais P. Estas proteínas
formam uma protuberância lateral, chamada de estrutura em haste
(“stalk”) que é localizada na parte ativa do ribossomo, onde interações
entre mRNAs, tRNAs e fatores de tradução acontecem durante o curso da
síntese protéica. A estrutura em haste é formada por dois heterodímeros
(P1/P2)2, com P1 como uma âncora para o núcleo da proteína ribossomal
P0, a qual é subsequentemente presa ao RNA 28S [19]. Alguns estudos
foram realizados com a proteína P0 de algumas espécies de
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
59
tripanossomatídeos, como por exemplo, a LcP0, a proteína P0 de
Leishmania chagasi, a qual é reconhecida durante infecções humanas
com esse parasita. [20].
Nesse trabalho, pudemos observar e monitorar a diferenciação
celular de duas espécies representativas do gênero Leishmania, através
da análise da expressão de proteínas estágio específicas e/ou da
microscopia confocal. Em seguida, analisamos a expressão da proteína
ribossomal P0 durante todo o ciclo de vida da Leishmania, assim como
também obtivemos sua quantificação (n° de moléculas por célula). Uma
análise preliminar da expressão de homólogos do fator de iniciação da
tradução eIF4G também foi realizada. Com base nesses resultados,
pretende-se seguir adiante na análise da expressão dos fatores de
iniciação da tradução em espécies do gênero Leishmania, fazendo uso da
metodologia já estabelecida para a diferenciação celular, o que servirá de
base para estudos posteriores sobre esses homólogos e análises
comparativas de padrões de expressão com outros organismos mais bem
estudados.
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
60
2.Materiais e Métodos
2.1- Crescimento e manutenção em cultura das formas
promastigotas, promastigotas metacíclicas e amastigotas de
Leishmania amazonensis e L. chagasi.
Culturas da forma promastigota de Leishmania amazonensis
LTB0016 (cedida pela Dra. L. Cysne-Finkelstein) e L. chagasi (cepa
Merivaldo – cedida pelo Dr. G. Oliveira) foram estabelecidas a partir de
alíquotas previamente congeladas. A manutenção das culturas foi
realizada em meio LIT (Liver Infusion Triptose) modificado, composto por
Infusão de fígado, Triptose e Sacarose, suplementado com 20% de soro
fetal bovino (SFB), antibióticos (Estreptomicina/Penicilina 0,1%) e
Hemina, 0,1%, em volumes de aproximadamente 3 ml, a 26°C, e
repassados para novo meio a cada 3-4 dias. As culturas de promastigotas
também foram cultivadas em meio M-199 com SFB 10% e
complementado com Glutamina 200 mM, Ácido Fólico 10 mg/ml e
mantidas a 26°C com repiques a intervalos de 3 a 4 dias. A expansão das
culturas foi realizada repassando alíquotas de manutenção para volumes
de cultura de 50 ml do respectivo meio de cultura. Para a indução da
diferenciação de promastigotas em amastigotas foi utilizada a
metodologia descrita em Doyle PS, 1991, com algumas adaptações, onde
os parasitas de ambas as espécies, mantidos em M-199, eram
transferidos para o meio RPMI com SFB a 20% e pH 5,5 a 37°C por até 5
dias.
Alternativamente, para manutenção das culturas de
promastigotas de L. amazonensis e diferenciação em amastigotas, foi
utilizado o protocolo descrito por Cysne-Finkelstein, 1998. Amastigotas
isoladas de lesão de pata de camundongos eram inicialmente cultivadas
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
61
em meio Schneider com pH 7,2 e temperatura de 26°C, suplementado
com SFB 10%, antibióticos (Estreptomicina/Penicilina 0,1%) e L-
glutamina 1mM até sua diferenciação em promastigotas (3 dias). Para
diferenciação em formas promatigotas metacíclicas, estas culturas eram
mantidas no mesmo meio por, no mínimo, outros 5 dias. Para
diferenciação em amastigotas as células metacíclicas foram reincubadas
no mesmo meio, agora com pH 5,5, a 32°C, resultando após cerca de
duas semanas em amastigotas axênicas viáveis para manutenção e para
re-infecção. Das diferentes culturas, seja promastigota, promastigota
metacíclica ou amastigotas, as células foram coletadas por centrifugação
(1000 g/5 minutos/4°C) e o sedimento ressuspendido em tampão de
proteína SDS-desnaturante (Laemmli 2X). Os extratos protéicos foram
fracionados em gel SDS-PAGE 15% para análise de concentração e
integridade das amostras, assim como para a padronização de
concentração de extratos protéicos de diferentes parasitas.
2.2- Isolamento de Amastigotas de lesão
O procedimento utilizado está de acordo com o descrito por
Bates (1992) com algumas adaptações. A lesão foi retirada
assepticamente e colocada em placa de Petri contendo malha de aço
estéril e meio de cultura (meio Schneider pH 7,2). O tecido foi macerado
com êmbolo de seringa estéril e o homogeneizado foi centrifugado (1000
g/ 3’/ 4°C) para obtenção do sobrenadante contendo amastigotas e
outras células. O sobrenadante foi centrifugado (2000 g/ 3’/ 4°C) para
obtenção de um sedimento contendo apenas as amastigotas e livre de
contaminação das células do hospedeiro. Estas foram ressuspendidas
numa concentração final de 5x105 células/ml do meio Schneider pH 7,2,
SFB 10%. A cultura foi mantida a 26°C por 3 dias e novamente contada
para a mesma concentração final, apenas mudando o pH do meio para
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
62
5,5 e sua concentração de SFB para 20%. Seis dias depois, a cultura foi
novamente contada e repassada para o mesmo meio ácido com SFB
20%, e mantida a uma temperatura de 32°C. Após 7 dias, a cultura foi
repassada para o meio ácido com a mesma concentração de SFB e a
mesma temperatura. A partir desse 16° dia desde o isolamento da lesão,
as amastigotas foram repicadas rotineiramente a cada 10-14 dias
utilizando o mesmo meio Schneider pH 5,5, SFB 20%.
2.3- Amplificação e clonagem do gene que codifica a
proteína ribosomal P0 de Leishmania major.
A seqüência que codifica para a proteína ribossomal P0 foi
utilizada para desenhar oligonucleotídeos que permitiram amplificar por
PCR, a partir de DNA total de L. major (cepa Friedlin), a seqüência
codificadora para essa proteína. Inicialmente, foram utilizados 2 primers
(3’ - GCG CAC CAC AAG GAG GCT AAG AGA - e 5’ - TGC GCC CAA CAC
CTA CAA CAT ACG) externos à seqüência do gene P0 para a amplificação
do fragmento. Em seguida, utilizou-se um par de primers internos
contendo os sítios de restrição para as enzimas XhoI e BamHI (3’ - TG
CTC GAG GAA GAG ACC GCC CAT GCC GAA G - e 5’ - CTA GGA TCC ATG
CCG TCT ATC ACC ACT GCC, respectivamente). O produto de PCR foi
então clonado em vetor plasmidial de expressão pET21a (série pET da
Novagen) visando a produção da respectiva proteína em E. coli fusionada
a uma seqüência de poli-histidinas.
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
63
2.4- Expressão em Escherichia coli das proteínas A2,
META1 e P0 de Leishmania major e purificação das respectivas
proteínas recombinantes.
Os plasmídeos contendo os genes codificando para as proteínas
de expressão estágio- específico A2 (Matlashewski G, 1996 [15]), e
META1 (Uliana e cols., 1999 [12]), respectivamente nos vetores pET16b e
pQE-30, foram cedidos para utilização em nosso trabalho. As construções
plasmidias contendo as seqüências codificantes para as proteínas A2,
META1 e P0, foram inseridas em E. coli, cepa Bl21, por choque térmico
(A2 e META1), ou por eletroporação (P0). Após a produção dessas
proteínas (A2 e META1, ambas contendo suas respectivas caudas de
Histidina na região N-terminal, e P0, com a cauda de histidinas na
extremidade C-terminal), utilizando o IPTG, por 4 horas a 30°C, estas
foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina de Ni-NTA
Agarose (Qiagen) segundo o protocolo do fabricante. As proteínas foram
eluídas na presença de concentrações variadas de Imidazol (de 50 a 200
mM) e então utilizadas para imunização de coelhos para produção de soro
policlonal. A proteína P0 ainda apresentou uma etapa posterior de
solubilização, a qual foi realizada com tampão de Uréia.
2.5– Produção de soros policlonais específicos e análise
da expressão dos homólogos aos fatores de iniciação da tradução
de tripanossomatídeos por “Western-Blot”.
A obtenção de soro foi realizada pela imunização de coelhos
adultos com as proteínas recombinantes embebidas em gel (200 µg de
cada proteína, 4 pulsos de imunização, a cada 15 dias), no Laboratório de
Microbiologia do CPqAm. Os soros produzidos contra as proteínas A2,
META1 e P0 foram utilizados em ensaios de “Western-Blot” com os
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
64
extratos celulares das formas promastigota, promastigota metacíclica e
amastigota de L. chagasi e L. amazonensis. Para tal, alíquotas das
diferentes culturas de parasitas foram fracionadas em SDS-PAGE 15% e
então transferidas para membrana PVDF (“Polyvinylidene Difluoride
Membrane”-Immobilon-P – Millipore®) para a realização de ensaios de
detecção por anticorpo (“Western-Blot”). A primeira incubação foi
realizada em solução de TBS 1x, leite 1% e Tween-20 a 0,05% com seus
respectivos soros policlonais específicos dos diferentes homólogos, na
diluição necessária. A segunda incubação foi realizada com o anticorpo
(anti-IgG de coelho) conjugado a peroxidase na diluição de 1:3000. O
“Western-blot” foi revelado por quimioluminescência (técnica ECL –
“Enhanced Chemioluminecency”).
2.5- Purificação dos anticorpos específicos contra os
homólogos por Imunoadsorcão
A proteína recombinante P0, utilizada na produção do soro
policlonal específico, foi fracionada por eletroforese em gel SDS-PAGE
15% para posterior transferência para membrana PVDF. Em seguida, a
membrana foi corada com 0,2% Rouge Ponceau /1% TCA para
visualização da banda referente à proteína em questão. A saturação da
membrana foi realizada com leite 1% em PBS 1x e Tween-20 a 0,05%
durante 30 minutos a 4°C. A membrana foi incubada com o soro
policlonal produzido contra a proteína P0 (1:1 soro/PBS 1x) a 4°C, sob
agitação, durante a noite. A eluição apenas dos anticorpos específicos foi
realizada por tratamento da membrana com solução de Glicina ácida
0,1M (pH 2,5), temperatura ambiente, seguida de neutralização da
solução resultante com 1/10 de volume de Tris-HCl 1M pH 8,0 e igual
volume (soma dos volumes da Glicina e do Tris-HCl) de PBS 2x.
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
65
3.Resultados
3.1 Alinhamento múltiplo das seqüências de
aminoácidos da proteína ribossomal P0.
Enquanto a estrutura primária das proteínas ribossomais de
eucariotos é conhecida, e um grande avanço tem sido feito em relação
ao entendimento da estrutura terciária do ribossomo de várias espécies,
pouco se sabe sobre o papel de proteínas ribossomais na montagem do
ribossomo e no processo de tradução. Como exemplo, uma família de
proteínas cujo comportamento e função na célula ainda são vagos são
as proteínas ácidas ribossomais P (P0, P1 e P2). Estas proteínas
participam em várias interações com mRNAs, tRNAs e fatores de
tradução durante o curso da síntese protéica e são representativas de
proteínas constituintes da subunidade maior ribosomal.
Buscando analisar a conservação de seqüência de proteínas
ribosomais em tripanosomatídeo e utilizando-se a proteína P0 como
modelo, iniciou-se este trabalho, comparando a seqüência de
aminoácidos da proteína ácida ribossomal P0 de L. major, identificada
em banco de dados do NCBI, com as seqüências desta proteína de
outros tripanossomatídeos e eucariotos (Trypanosoma cruzi,
Trypanosoma brucei, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisae e
Homo sapiens). O alinhamento múltiplo foi realizado utilizando o
algorítimo Clustal. A figura foi feita no programa Bioedit e o limiar para
o sombreamento utilizado foi de 60% de similaridade. Através desse
alinhamento observamos uma alta conservação dessa proteína
ribossomal entre essas variadas espécies (figura 1).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
66
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
L.major 1 --MPSITTAK REYEERLVDC LTKYSCVLFV GMDNVRSQQV HDVRRALRGK AEFMMGKKTL QAKIVEKRAQ AKDASAEAKH FNDQCEEYNL
T.cruzi 1 --MPSVSEAK REYEERFNGC LTKYGRVLFC LMDNVRSQQV HDVRRDLRGL GELVMGKKTL QKKIVERRAE DKKASAYDKL LYNTCIEKKL
T.brucei 1 --MPSVSQEK RDYEDRLNGC LTKYSRVLFC LMDNVRSQQV HGVRRDLRGK GELVMGKKTL QKKIVEKRAE GNKATDADKL FHQVCTDKQL
A.thaliana 1 MVKATKAEKK IAYDTKLCQL IDEYTQILVV AADNVGSTQL QNIRKGLRGD SVVLMGKNTM MKRSVRIHSE NTGNTAILNL LP-------L
S.cerevisae 1 --MGGIREKK AEYFAKLREY LEEYKSLFVV GVDNVSSQQM HEVRKELRGR AVVLMGKNTM VRRAIRGFLS D--LPDFEKL LP-------F
H.sapiens 1 MPREDRATWK SNYFLKIIQL LDDYPKCFIV GADNVGSKQM QQIRMSLRGK AVVLMGRNTM MRKAIRGHLE N--NPALEKL LP-------H
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
L.major 89 LSGNTGLIFT NNAVQEITSV LDAHRVKAPA RVGAISPCDV IVPAGSTGME PTQTSFFQAL NIATKIAKGM VEIVTEKKVL SVGDKVDNST
T.cruzi 89 LCGNTALIFT NEEIPVITAV LDKHRVQAPA RVGAIAPCDV IVPAGNTGME PKATSFFQAL NIATKIAKGT VEIVSDKKVL SVGDRVDNST
T.brucei 89 LCGNTSMIFT NSEVSDITSV LDSHRVQAPA RVGAIAPCDV IVPAGNTGME PKATAFFQAL NIATKISKGT VEIVSDKKVL STGDKVDNST
A.thaliana 84 LQGNVGLIFT KGDLKEVSEE VAKYKVGAPA RVGLVAPIDV VVQPGNTGLD PSQTSFFQVL NIPTKINKGT VEIITPVELI KQGDKVGSSE
S.cerevisae 80 VKGNVGFVFT NEPLTEIKNV IVSNRVAAPA RAGAVAPEDI WVRAVNTGME PGKTSFFQAL GVPTKIARGT IEIVSDVKVV DAGNKVGQSE
H.sapiens 82 IRGNVGFVFT KEDLTEIRDM LLANKVPAAA RAGAIAPCEV TVPAQNTGLG PEKTSFFQAL GITTKISRGT IEILSDVQLI KTGDKVGASE
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
L.major 179 ATLLQKLNIS PFYYQVNVLS VWDRGVLFTR EDLMMTEDMV EKMLMDGLSN VAAMALGAGI PTPSTIGPML VDAFKNLLAV SVATSYEFEE
T.cruzi 179 ATLLQKLDIS PFYYQVEVQS VWDRGMLFLR EDLSITDDVV EKYLLEGISN VAALSLGAGI PTAATLPHMI MDAFKTLLGA SVATEYEFDE
T.brucei 179 ATLLQKLDIS PFYYQVEVQS VWDRGVLFTR EDLSVTDAVV EKYLLEGISN ISAMSLGAGI PTAATLPHMI VDAFKTLLGA SVATNYEFEE
A.thaliana 174 AALLAKLGIR PFSYGLVVQS VYDNGSVFSP EVLDLTEDQL VEKFASGISM VTSLALAVSY PTLAAAPHMF INAYKNALAI AVATEYTFPQ
S.cerevisae 170 ASLLNLLNIS PFTFGLTVVQ VYDNGQVFPS SILDITDEEL VSHFVSAVST IASISLAIGY PTLPSVGHTL INNYKDLLAV AIAASYHYPE
H.sapiens 172 ATLLNMLNIS PFSFGLVIQQ VFDNGSIYNP EVLDITEETL HSRFLEGVRN VASVCLQIGY PTVASVPHSI INGYKRVLAL SVETDYTFPL
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
L.major 269 HNGKELREAA INGLLAGS-- CSAAAEPAAA APAAPSAAAK EEPEESDEDD FGMGGLF--- 323
T.cruzi 269 FDGKNLRKAA LEGNLGGG-V ADAAAAADTG AAAAPAAAAE PE-EEDDDDD FGMGALF--- 323
T.brucei 269 YDGKNLRTAA LEGKLGGGEA AAPAAAAAAA APAAAPAAAA AE-EEEDDDD FGMGALF--- 324
A.thaliana 264 AEKVKEYLKD PSKFAVAS-V AAVSADAGGG APAAAKVEEK EE-SDEEDYG GDFG-LFDEE 320
S.cerevisae 260 IEDLVDRIEN PEKYAAAA-- -PAATSAASG DAAPAEEAAA EE-EEESDDD MGFG-LFD-- 312
H.sapiens 262 AEKVKAFLAD PSAFVAAAPV AAATTAAPAA AAAPAKVEAK EE-SEESDED MGFG-LFD-- 317
Figura 1: Alinhamento múltiplo das seqüências de aminoácidos da proteína ribossomal P0. As seqüências de aminoácidos da proteína P0 de L. major foi alinhada com as de outros tripanossomatídeos e eucaritos, onde foi observada uma alta conservação de seqüência.
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
67
3.2 Quantificação da proteína ácida ribossomal P0 em extratos
protéicos de L. chagasi e L. amazonensis.
Assim que a seqüência codificante para a proteína ribossomal P0
foi encontrada, foram desenhados oligonucleotídeos específicos visando
amplificação e posterior clonagem desse fragmento em vetor que
possibilitasse a expressão da proteína recombinante. Após a clonagem do
fragmento, flanqueado pelos sítios de restrição das enzimas BamHI e XhoI,
no vetor pET21a, foi realizado a etapa de seqüenciamento para a
certificação sobre o fragmento clonado. Uma vez confirmada a clonagem, o
próximo passo se deu com a expressão da proteína e posterior purificação
(Figura 2A), segundo descrito na metodologia.
Uma vez purificada a proteína recombinante, esta foi utilizada
para a produção de soro policlonal específico, o qual seria utilizado em
ensaios de Western-blot. Após a obtenção do soro, este foi purificado por
imunoadsorção e testado quanto a sua especificidade. O soro foi testado
contra extrato total protéico de E. coli, contra a proteína P0 e contra outra
proteína ribossomal recombinante, a proteína L19, e se mostrou específico
contra a proteína P0 (figura 2B).
Visando uma análise comparativa entre o número de moléculas de
proteínas importantes na síntese protéica e dos fatores de iniciação da
tradução quantificados até o momento em algumas espécies de
Leishmania, foi realizada a quantificação da proteína ácida ribossomal P0
(número de moléculas/célula) em extrato total do parasita, através de
ensaios de Western-blot. Primeiramente, a proteína recombinante, corada
com Comassie Blue, foi quantificada através da comparação com uma
curva previamente quantificada de BSA (Albumina Sérica Bovina). O valor
obtido em µg de proteína foi então convertido para número de moles. Em
seguida, essas proteínas foram utilizadas em ensaios de Western-blot,
juntamente com as proteínas do extrato total do parasita. A quantificação
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
68
da proteína P0 se deu pela comparação da intensidade das bandas da
proteína recombinante, diluída seqüencialmente com um fator de diluição
½ (25 ng, 12,5 ng, 6,25 ng e 3,125 ng), e a intensidade da banda
equivalente ao extrato das curvas de crescimento de L. chagasi e L.
amazonensis (106 células). A partir dessa comparação obteve-se o número
de moles de proteínas presentes em 106 células. Utilizando-se o número de
Avogrado pôde-se então chegar a um número aproximado de moléculas de
proteína P0 por 106 células do parasita e então calcular o número de
moléculas por célula individual. Estima-se que o número aproximado de
moléculas da proteína P0 por Leishmania seja de 6,6x105 (figura 2D), o que
se mostrou condizente com o número de ribossomos observado na
levedura Saccharomyces cerevisiae (2x105 por célula).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
69
A) B)
SDS-PAGE Western-blott
Ext
rato tot
al de E. coli
P0 (em
ext
rato
tot
al de E. coli)
P0 (so
lubi
liza
da em
tam
pão de
uré
ia)
L19
(em
ext
rato
total de E. coli)
L19
(pu
rifica
da)
Ext
rato tot
al de E. coli
P0 (em
ext
rato
tot
al de E. coli)
P0 (so
lubi
liza
da em
tam
pão de
uré
ia)
L19
(em
ext
rato
total de E. coli)
L19
(pu
rifica
da)
Ext
rato
total d
e E. coli
P0 (em
ext
rato
total
de E. coli)
P0 (solub
ilizad
a
em ta
mpã
o de
uré
ia)
Ext
rato
total d
e E. coli
P0 (em
ext
rato
total
de E. coli)
P0 (solub
ilizad
a
em ta
mpã
o de
uré
ia)
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
70
C)
SDS-PAGE D)
Western-blott
Figura 2: Comassie da proteína P0, Western-blot e quantificação da proteína P0. Extrato total de E. coli e alíquotas das proteínas recombinantes P0 (não purificadas) foram fracionados em gel SDS-PAGE 15% (A) e transferidos para membrana de nitrocelulose para reação de “Western-blot” (B), visando testar a especificidade do anticorpo purificado. Tendo em mãos a proteína P0 recombinante purificada e quantificada (C), foi realizada uma estimativa da quantidade de proteína P0 por Leishmania, onde uma curva de diluição da proteína recombinante e alíquotas das curvas de crescimento das espécies L. chagasi e L. amazonensis foram comparadas, em ensaios de Western-blot (D).
LM
W
2 µg 1
µg
0,5
µg
0,25
µg
0,12
5 µg
Curva de BSACurva de diluição da proteína P0
(fator de d ilu ição ½)
45 KDa
66 KDa
LM
W
2 µg 1
µg
0,5
µg
0,25
µg
0,12
5 µg
Curva de BSA
LM
W
2 µg 1
µg
0,5
µg
0,25
µg
0,12
5 µg
Curva de BSACurva de diluição da proteína P0
(fator de d ilu ição ½)
Curva de diluição da proteína P0
(fator de d ilu ição ½)
45 KDa
66 KDa
45 KDa
66 KDa
50 ng
25 ng
12,5 ng
6,25
ng
3,12
5 ng
Curva de diluição da proteína P0
Amos
tra da
cur
va de L.chagasi,
106cé
lulas
Amos
tra da
cur
va de L.amazonensis
106cé
lulas
50 ng
25 ng
12,5 ng
6,25
ng
3,12
5 ng
Curva de diluição da proteína P0
50 ng
25 ng
12,5 ng
6,25
ng
3,12
5 ng
50 ng
25 ng
12,5 ng
6,25
ng
3,12
5 ng
Curva de diluição da proteína P0
Amos
tra da
cur
va de L.chagasi,
106cé
lulas
Amos
tra da
cur
va de L.amazonensis
106cé
lulas
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
71
3.3 Curvas de crescimento das espécies L. chagasi e L.
amazonensis
Com o intuito de analisar a expressão de fatores de tradução
selecionados nas diferentes formas de vida de L. chagasi e L.
amazonensis, foi necessário padronizar condições de crescimento destes
parasitas de forma a otimizar sua diferenciação in vitro. Duas diferentes
metodologias de crescimento celular foram estabelecidas. Na primeira
delas, buscou-se monitorar a diferenciação de formas promastigotas em
promastigotas metacíclicos. Já na segunda o objetivo foi induzir a
diferenciação de promastigota em formas amastigotas, em condições de
cultura axênicas, um procedimento que não funciona com todas as
espécies de Leishmania e pode ser de difícil padronização.
Visando monitorar a diferenciação de formas promastigotas em
promastigotas metacíclicos, culturas de promastigotas de L. chagasi e L.
amazonensis, mantidas em meio M-199 (a 26ºC e pH 7.2), foram
repicadas para uma concentração final de 106 células/ml e tiveram seu
crescimento e morfologia monitorados a cada 24 horas. Nos mesmos
intervalos alíquotas eram retiradas, sedimentadas por centrifugação e
ressuspendidas em tampão de amostra para SDS-PAGE. Nos primeiros
três dias desta curva (figura 3A), as células se encontravam na fase
logarítmica de crescimento (crescimento exponencial) e a morfologia
observada foi de uma típica promastigota nessa fase (figura 4A). A
partir do terceiro dia, as células começaram a entrar na fase
estacionária. Embora a cultura ainda apresentasse algum crescimento,
as células mostravam-se mais alongadas e entrando na fase
estacionária da curva. No quinto dia, as células mostravam uma
morfologia tipicamente de fase estacionária (promastigotas metacíclicas)
(figura 4B). A partir do nono dia, as células entraram em fase de
declínio, caracterizando o final da curva. Apesar das culturas de cada
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
72
espécie, nas fases promastigota e promastigota metacíclica, terem se
comportado, em geral, de forma equivalente, a cultura de L.
amazonensis apresentou um crescimento mais acentuado a partir do 3º
e 4º dias, o qual teve continuidade até o fim da curva (figura 3A).
Embora esse crescimento diferenciado da L. amazonensis tenha sido
notório ao longo da curva, ele não interferiu na morfologia, nem nas
análises posteriores onde amostras das curvas foram utilizadas.
A curva das amastigotas axênicas iniciou-se com a
transferência de células mantidas em meio M-199, em estágio
promastigota, para o meio RPMI-1640, a uma temperatura de 37ºC e
um pH de 5,5. Assim como a curva de promastigotas, a de amastigota
começou a uma concentração final de 106 células/ml e teve uma
amostra retirada a cada 24 horas. Em especial, nesse caso, foi colhida
uma amostra após 6 horas de transferência de meio e temperatura,
visando uma alíquota que representasse as células em choque térmico,
porém sem morfologia característica de uma amastigota (figura 3B). A
cultura apresentou crescimento até a 48ª hora, a partir da qual as
células começaram a entrar em fase estacionária. A morfologia
característica de amastigota só foi observada a partir do terceiro dia da
curva (48 horas) (figura 4C). Diferentemente das curvas de
promastigota e promastigota metacíclica, as curvas de amastigota das
duas espécies mostraram um crescimento homogêneo ao longo do
experimento (figura 3B).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
73
A B Figura 3: Curvas de crescimento de L. chagasi e L. amazonensis. A) Curva de crescimento das células nos estágios promastigota e promastigota metacíclica. B) Curva de crescimento das células no estágio amastigota.
Curva de crescimento - Promastigota e
Promastigota Metacíclica
0
5
10
1520
25
30
35
40
dia
1
dia
2
dia
3
dia
4
dia
5
dia
6
dia
7
dia
8
dia
9
dia
10
dias da cultura
quantidade de células x
106 células
L. amazonensis
L. chagasi
Curva de crescimento - Amastigota Axênica
0
5
10
15
20
25
6 horas 24 horas 48 horas 72 horas
horas de coleta das amostras
Quantidade de células x
106 células
L. amazonensis
L. chagasi
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
74
Figura 4: Imagens dos três estágios de desenvolvimento da L. amazonensis. A) Fase promastigota (correspondente ao dia 1 da curva de promastigota). B) Fase promastigota metacíclica (correspondente ao dia 5 da curva de promastigota). C) Fase amastigota (correspondente a 48 horas da curva de amastigota). Amostras das culturas foram colhidas nas três fases do ciclo de vida da Leishmania e observadas com o auxílio de um microscópio confocal.
A B CA B C
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
75
3.4 Reconhecimento das proteínas de expressão estágio
específica pelos seus respectivos anticorpos em ensaios de
Western-blot.
Proteínas cuja expressão é sabidamente estágio específica são
de grande importância quando se trabalha com análise de expressão de
outras proteínas ao longo do ciclo de vida de um organismo, uma vez
que se torna necessária a confirmação do estágio da célula que está
sendo utilizado para tal análise. Em nosso trabalho, as proteínas
escolhidas para essa observação da diferenciação dos estágios do ciclo
de vida de espécies de Leishmania foram as proteínas A2 (Matlashewski
G, 1996), para a fase amastigota, e META1 (Uliana SR, 1999), para a
fase promastigota metacíclica. Assim, com os plasmídeos contendo os
fragmentos codificantes para as respectivas proteínas (pET16b-A2 e
pQE-30-META1), foi realizada a expressão em E. coli das mesmas e
posterior purificação. Essas proteínas foram utilizadas para a imunização
de coelhos convencionais e posterior obtenção de soro policlonal
específico, como descrito na metodologia. Os anticorpos foram obtidos
para serem utilizados em ensaios de Western-blot e, uma vez
reconhecendo suas respectivas proteínas, visando validar os protocolos
de diferenciação das células de Leishmania nas curvas de crescimento
estabelecidas.
Esses anticorpos foram inicialmente testados contra as proteínas
recombinantes (A2 e META1 fusionadas a uma cauda de Histidinas)
(figura 5A e 5B) utilizadas para sua produção. Nos ensaios de Western-
blot, os anticorpos reconheceram especificamente suas proteínas,
servindo para a utilização em etapas posteriores do trabalho (figura 5C
e 5D).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
76
A B SDS-PAGE SDS-PAGE C D Western-blott Western-blott Figura 5: Proteínas de expressão estágio específica. Curva de diluição das proteínas recombinantes marcadoras celulares A2 (A) e META1 (B) e Western-blot mostrando o reconhecimento dos anticorpos contra suas respectivas proteínas recombinantes (C e D). Alíquotas das proteínas recombinantes A2 e META1 foram fracionadas em gel SDS-PAGE 15% e 20%, respectivamente. Uma vez quantificadas, as proteínas foram utilizadas em ensaios de Western-blott, como descrito na metodologia.
100 ng 50 ng200 ng 100 ng 50 ng200 ng 200 ng 100ng 50 ng200 ng 100ng 50 ng200 ng 100ng 50 ng
20 µg 10 µg 5 µg20 µg 10 µg 5 µg 20 µg 10 µg20 µg 10 µg
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
77
3.5 Análise da expressão das proteínas META1 e P0 nas curvas
de crescimento de L. chagasi e L. amazonensis através de
ensaios de Western-blot.
Após os ensaios onde o reconhecimento das proteínas A2 e
META1 pelos seus respectivos anticorpos foi observado, partiu-se para a
análise da expressão das mesmas ao longo das curvas de crescimento
de L. chagasi e L. amazonensis, com o intuito de validar essas curvas.
Alíquotas representativas de ambas as curvas foram utilizadas para a
realização dos ensaios de Western-blot. No caso da curva de L.
amazonensis, foi adicionado um ponto correspondente a um extrato
obtido a partir de uma cultura mais recente e cultivada em meio
Schneider (utilizando a metodologia de Cysne, 1998), buscando uma
comparação preliminar entre as duas metodologias. Uma comparação
mais detalhada entre as metodologias de cultivo de células abordadas
em nosso laboratório vem sendo realizada na obtenção de novas curvas.
No caso da análise da expressão da proteína META1, esta se
mostrou expressa na fase promastigota metacíclica nas duas espécies
de Leishmania analisadas (Figura 6A). Outras duas proteínas distintas
foram reconhecidas nessa análise. Uma delas se mostrou constante
durante toda a curva, tanto em L. chagasi quanto em L. amazonensis
(Figura 6B). A outra proteína, embora tenha se mostrado presente
durante ambas as curvas, apresentou uma maior intensidade que pôde
ser observada do dia 5 da curva de promastigota ao último dia da curva
de amastigota (72 horas), em L. chagasi, e, no caso da L. amazonensis,
mostrou maior intensidade a partir do 9º dia da curva de promastigota,
que se estendeu a 72ª hora da curva de amastigota (Figura 6B). Em
paralelo, ensaios visando a análise da expressão da proteína A2 ao
longo das curvas de crescimento também foram realizados. Embora a
proteína não tenha sido detectada nas alíquotas das curvas equivalentes
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
78
à fase amastigota, a diferenciação celular foi observada através de
microscopia confocal como mostrado na figura 5C.
Sendo o conhecimento do padrão de expressão de proteínas
essenciais para a tradução um ponto importante para o entendimento
do processo de síntese protéica como um todo, uma vez confirmadas as
diferenciações celulares nas curvas de ambas as espécies trabalhadas,
partiu-se para a análise da expressão da proteína ácida ribossomal P0.
Utilizando-se os mesmos pontos representativos das curvas que foram
utilizados para as proteínas de expressão estágio específico, pudemos
observar uma expressão constante ao longo de ambas as curvas
(L.chagasi e L. amazonensis - figura 6B).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
79
A
B
Figura 6: Análise da expressão das proteínas META1 (A) e LmP0 (B) em curvas de L. chagasi e L. amazonensis. Extratos totais do parasita, previamente quantificados, foram fracionados em gel SDS-PAGE 20%, para a proteína META1, e 15%, para a proteína LmP0, e analisados por ensaios de Western-blot com seus respectivos soros. As setas sem peso molecular, mostradas na figura 6B, indicam mais dois padrões de expressão na análise da proteína META1 (A).
META1
(12 Kda)
dia 1
dia 3
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
72 horas
Curva de crescimento L. chagasi
106 células por poço
Curva de crescimento L. amazonensis
106 células por poço
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
72 horas
dia 3
dia 1
recém-is
olad
a
META1
(12 Kda)
dia 1
dia 3
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
72 horas
Curva de crescimento L. chagasi
106 células por poço
dia 1
dia 3
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
72 horas
Curva de crescimento L. chagasi
106 células por poço
dia 1
dia 3
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
72 horas
dia 1
dia 3
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
72 horas
Curva de crescimento L. chagasi
106 células por poço
Curva de crescimento L. chagasi
106 células por poço
Curva de crescimento L. amazonensis
106 células por poço
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
72 horas
dia 3
dia 1
recém-is
olad
a
Curva de crescimento L. amazonensis
106 células por poço
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
72 horas
dia 3
dia 1
recém-is
olad
a
Curva de crescimento L. amazonensis
106 células por poço
Curva de crescimento L. amazonensis
106 células por poço
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
72 horas
dia 3
dia 1
recém-is
olad
a
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
72 horas
dia 3
dia 1
recém-is
olad
a
P0
(45 Kda)
P0
(45 Kda)
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
80
3.6 Análise da expressão de homólogos de fatores de iniciação
da tradução em diferentes formas de vida de L. chagasi .
Uma vez que a análise da expressão de alguns homólogos aos
fatores de iniciação da tradução, na fase logarítmica da curva de
crescimento de espécies de Leishmania, já tinha sido realizada por
trabalhos anteriores do nosso grupo [11], partiu-se para a análise da
expressão destes ao longo de toda a curva de crescimento, incluindo as
fases promastigotas metacíclicas e amastigotas, de L. chagasi e L.
amazonensis. Embora os resultados mostrados aqui se restrinjam à
espécie L. chagasi, alíquotas da curva de L. amazonensis vêm sendo
utilizadas para ensaios onde a expressão de proteínas diretamente
envolvidas na iniciação da tradução pode ser observada.
Os homólogos aos fatores de iniciação da tradução, cuja
expressão foi analisada ao logo da curva de L. chagasi, relatados aqui
neste trabalho, foram os LmEIF4G1 e LmEIF4G3. O LmEIF4G1 teve sua
expressão observada no início da curva, correspondente a fase
promastigota, uma ausência na fase promastigota metacíclica e
novamente sua expressão na fase amastigota (figura 7A). Já o
homólogo LmEIF4G3 (figura 7B) se mostrou constante durante toda a
curva, sugerindo ser uma proteína essencial para a síntese, embora uma
discreta diminuição da expressão possa ser observada no último dia da
fase promastigota metacíclica (dia 9 – figura 7B).
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
81
A
B
Figura 7: Análise da expressão dos homóligos LmEIF4G1(A) e LmEIF4G3(B) em curva de crescimento de L. chagasi. Extratos totais do parasita, previamente quantificados, foram fracionados em SDS-PAGE 15% e analisados por ensaios de Western-blot com seus respectivos soros. O reconhecimento dos homólogos nos extratos totais do parasita geraram padrões que puderam ser analisados e comparados com os obtidos, ateriormente, na fase promastigota de Leishmania e em outros organismos.
72 horas
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
dia 3
dia 1
114 KDa
72 horas
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
dia 3
dia 1
72 horas
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
dia 3
dia 1
72 horas
dia 5
dia 7
dia 9
24 horas
48 horas
dia 3
dia 1
114 KDa114 KDa
71,2 KDa71,2 KDa71,2 KDa
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
82
4. Discussão
O conhecimento do balanço de atividades dos fatores de
iniciação da tradução de eucariotos (eIFs) é um ponto crítico para o
entendimento dos mecanismos envolvidos no controle da tradução [17].
As subunidades do complexo de iniciação da tradução eIF4F são
bastante estudadas em eucariotos (unicelulares e pluricelulares) e se
mostram bastante peculiares ao que se refere à espécie em observação.
No caso dos tripanossomatídeos, organismos protozoários unicelulares,
as múltiplas isoformas do eIF4F podem ser associadas com os diferentes
estágios de vida desse parasita ou serem requeridos para a tradução de
diferentes classes de mRNAs [9]. Uma prévia quantificação dessas
isoformas em L. major, na fase promastigota de crescimento, mostrou
que os níveis dos homólogos aos fatores pertencentes ao eIF4F são
bastante variáveis. Como exemplo, temos o LmEIF4E1, com suas
estimadas 3,2 x 103 moléculas por célula. Enquanto uma outra isoforma,
o LmEIF4E3, mostra-se bem mais abundante, com 7,1 x 104 moléculas
por Leishmania. As outras isoformas quantificadas, incluindo os
LmEIF4A1 e LmEIF4G1-3, também mostraram suas variações, sendo o
homólogo ao eIF4A detectado em altos níveis (3,6 x 105 moléculas por
célula) e o LmEIF4G3 estimado em 6,4 x 103 moléculas por célula [9].
Comparando-se os níveis desses homólogos encontrados em Leishmania
com os níveis encontrados em outro eucarioto unicelular, como exemplo
em Levedura, percebe-se uma correlação do número de moléculas. O
homólogo ao eIF4A da Levedura Sccharomyces cerevisiae foi estimado
em 7-9 x 105 moléculas por célula (o mais abundante entre os fatores
de iniciação da tradução nesse organismo), enquanto que o homólogo
ao eIF4E encontra-se entre 3,2-3,6 x 105 moléculas por célula. Nessa
espécie de levedura, o menos abundante fator de iniciação da tradução
foi o homólogo de eIF4G, com suas 1,5-2,0 x 104 moléculas por célula
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
83
[17]. Em Leishmania, uma análise da expressão desses homólogos
durante todo o ciclo de vida do parasita se torna importante para um
maior entendimento desse ponto crítico da síntese protéica que é a
iniciação da tradução. O que pudemos observar em nossos resultados
foi uma expressão constitutiva, no caso do homólogo LmEIF4G3 e uma
expressão diferenciada de acordo com o estágio da célula para o
LmEIF4G1, o qual foi encontrado nas fases promastigota e amastigota,
mas não na fase promastigota metacíclica. Uma análise da expressão
dos outros componentes do complexo eIF4F, seguida de uma estimativa
do número de moléculas, em espécies de Leishmania é foco de trabalhos
posteriores do nosso grupo. Uma análise da expressão de isoformas de
outra proteína relacionada à iniciação da tradução em espécies de
Leishmania, a proteína de ligação à cauda Poli-A, PABP, vem também
sendo realizada pelo nosso grupo. Essa proteína se mostrou bastante
variável nos ensaios realizados até o momento, nas curvas de
crescimento de L. chagasi e L. amazonensis (dado não mostrado).
A quantificação de uma proteína diretamente relacionada à
síntese protéica durante curva de crescimento de espécies de
Leishmania e uma posterior quantificação de seus níveis se torna um
dado importante no entendimento desse processo. A proteína escolhida
por nosso grupo de trabalho foi a proteína ácida ribossomal P0. Sua
expressão constitutiva e seus altos níveis celulares, mostrados aqui,
indicam sua importância no processo de tradução. Seus estimados 6,6 x
105 moléculas por célula, acima dos níveis encontrados para os fatores
do complexo eIF4F em Leishmania, sugerem que essa proteína
desempenha um papel essencial na biossíntese protéica. Em levedura,
por exemplo, os níveis de moléculas de ribossomo por célula gira em
torno de 2 x 105 [17]. Dados na literatura sugerem que a proteína
ribossomal P0 se liga numa relação 1:1 com o ribossomo [21]. Sendo
assim, estima-se uma concentração de 6,6 x 105 ribossomos por
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
84
Leishmania. A relação entre fator de iniciação da tradução/ribossomo
também pode ser calculada e comparada usando-se os dados dos
trabalhos anteriores tanto de Leishmania quanto de Levedura, o que
pode acrescentar bastante ao pouco que se sabe sobre o complexo
processo de síntese protéica em tripanossomatídeos.
O cultivo das espécies de L. chagasi e L. amazonensis se
mostrou de acordo com outros trabalhos realizados até o momento [22,
23]. As formas obtidas nesse trabalho condizem com as observadas e
utilizadas em outro trabalho onde a diferenciação foi a base para os
resultados [14]. À curva de L. amazonensis foi adicionada uma alíquota
de amastigotas recém isoladas de lesão, a qual seria uma representante
mais fidedigna das condições encontradas no parasita in vivo. Embora
não tenha havido diferença morfológica significativa entre as
amastigotas obtidas pela metodologia sugerida em Doyle PS et al
(1991) e as recém isoladas de lesão (de acordo com Cysne-Finkelstein L
et al., 1998), estudos mais detalhados visando a análise do padrão de
expressão das proteínas analisadas nesse trabalho ainda será alvo de
nossos estudos. A utilização de proteínas de expressão estágio
específico para a diferenciação das três fases estudadas, visando uma
correlação com a morfologia observada, atendeu às expectativas apenas
ao que se refere à proteína META1. Embora outras duas proteínas
tenham sido reconhecidas pelo anti-META1, uma delas podendo ser a
proteína relacionada META2 recentemente encontrada [13], a expressão
da proteína META1 durante os dias onde a morfologia se apresentava
mais alongada, o que caracteriza a metaciclogênese, foi de acordo com
o esperado. Já a proteína marcadora celular A2 não apresentou dados
suficientes para uma correlação com a morfologia do parasita. Sua
expressão durante curva de crescimento das espécies utilizadas nesse
trabalho (dado não mostrado) não foi satisfatória para ser utilizada
como marcadora de diferenciação celular. Outra proteína expressa
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
85
exclusivamente na fase amastigota deve ser escolhida como marcadora
de diferenciação para nossos próximos estudos.
Dado o exposto, podemos perceber a quantidade de variáveis
que devem ser abordadas para um estudo de expressão protéica
relacionada a diferenciação celular desses protozoários de biologia
molecular tão peculiar. Pretende-se dar mais ênfase a alguns pontos
desse trabalho, tanto ao que se refere à quantificação de alguns fatores
quanto à diferenciação dos parasitas. Assim, espera-se contribuir para a
elucidação dos mecanismos envolvidos nessa que parece ser a fase
crítica do controle da expressão gênica dos tripanossomatídeos.
Rocha, P.O. 2006 Análise da expressão...
86
5. Referências Bibliográficas
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9th ed. Atheneu (São Paulo) 2000;34-81.
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genomic DNA microarrays identifies differentially expressed genes
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parasite Leishmania major. Mol Biochem Parasitol 2004; 136: 71-
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translation. Annu. Rev. Biochem 1999;68:913-963.
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6. Abstract
In eukaryotes, the critical initiation stage of protein synthesis is mostly
associated with regulatory mechanisms. Besides the ribosomal subunits, this
stage requires the action of a number of translation initiation factors (eIFs).
Paramount within those is the eIF4F complex, which is composed by the
subunits eIF4A, eIF4E and eIF4G. In Leishmania, translation control is essential
to achieve regulation of gene expression, but so far it has been little studied. In
this pathogen, multiple homologues to the subunits of the eIF4F complex have
been identified and had their expression quantified in the promastigote (Pm)
stage of its life cycle. Here we have begun the study of a Leishmania
homologue of the ribosomal protein P0, a component of the 60S subunit.
Through the cloning of its gene, expression in Escherichia coli and production of
specific polyclonal serum, its intracellular levels have been quantified (~6,6x105
molecules/cell) and found to be superior to those observed for the eIF4F
homologues. To analyze its expression during the parasite life cycle, the
conditions for the growth of representative species of Leishmania and their
differentiation into the metacyclic promastigote (MtPm) and amastigote (Am)
life stages were first optimized. The detection of proteins whose expression are
stage specific (A2- Am; META1 – MtPm) was attempted to validate these
growth curves, but only the META1 protein was found, although amastigote
cells were observed through the microscope. The expression of P0 was found to
be constant within these various life forms. In comparison, the expression of a
homologue of the eIF4G protein, LmEIF4G3, also was found to be constant,
whilst the LmEIF4G1 homologue was only detected at the Pm and Am stages.
Assays with other eIF4F homologues are currently being performed so as to
better characterize the processes involved in translation initiation in Leishmania
and the control of its cellular differentiation.
Keywords: Trypanosomatids, Translation initiation, Leishmania life cycle,
Stage specific expression and Ribossomal protein.
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7. CONCLUSÕES
• A diferenciação de espécies de Leishmania nos três estágios
fisiológicos encontrados nos hospedeiros é reprodutível e tem
correlação direta com a morfologia esperada.
• A proteína marcadora celular da fase promastigota metacíclica
META1 serve como parâmetro de padrão de expressão de
proteínas estágio específicas.
• A proteína ácida ribossomal P0 é essencial para a síntese protéica
e é encontrada em altos níveis nas espécies L. chagasi e L.
amazonensis.
• Os níveis de ribossomo encontrada uma Leishmania é em torno de
6,6 x 105 moléculas.
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8. AANNEEXXOOSS
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8.1. Anexo 1 IINNSSTTRRUUÇÇÕÕEESS PPAARRAA AAUUTTOORREESS
Revista MMOOLLEECCUULLAARR AANNDD BBIIOOCCHHEEMMIICCAALL PPAARRAASSIITTOOLLOOGGYY
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Protein and Nucleic Acid Sequences. Novel nucleotide or protein sequence data must be deposited in the GenBank™, EMBL or DDBJ databases and an accession number obtained before the paper can be accepted for publication. Submission to any one of the collaborating databanks is sufficient to ensure entry in all. The accession number should be included as a footnote on the title page of the manuscript: 'Note: Nucleotide sequence data reported in this paper are available in the GenBank™, EMBL and DDBJ databases under the accession number(s)----'. If
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requested the database will withhold release of data until publication. The usual method for submitting sequence data is by World Wide Web to either GenBank™ (via Banklt: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BankIt/), EMBL (via Webln: http://www.ebi.ac.uk/subs/allsubs.html) or to DDBJ (via SAKURA: http://sakura.ddbj.nig.ac.jp/). Special types of submissions such, as genomes, bulk submissions, segmented sets, and population/phylogenetic/mutation studies, can be more easily prepared with the Sequin programme (available from the above Web sites). Files generated by the Sequin programme may be sent via e-mail to GenBank™ (submissions: e-mail:gb-sub@ncbi.nlm.nih.gov; enquiries: e-mail: info@ncbi.nlm.nih.gov, EMBL (submissions: e-mail: datasubs@ebi.ac.uk; enquiries: e-mail: datalib@ebi.ac.uk) or DDBJ (submissions: e-mail: ddbjsub@ddbj.nig.ac.jp; enquiries: e-mail: sakura-admin@ddbj.nig.jp). Submitters without Web or e-mail access should write to one of the following addresses to obtain a hard copy submission form (GenBank Submissions, National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Building 38A, Room 8N-805, Bethesda, MD 20894, USA. EMBL Nucleotide Sequence Submissions, European Bioinformatics Institute, Hinxton Hall, Hinxton, Cambridge, CB10 1SD, UK. DNA Data Bank of Japan, Center for Information Biology, National Institute of Genetics, Mishima, Shizuoka 411-8540, Japan). Authors are encouraged by the databases to update their entries as the need arises.
DNA sequences and GenBank Accession numbers
Many Elsevier journals cite "gene accession numbers" in their running text and footnotes. Gene accession numbers refer to genes or DNA sequences about which further information can be found in the databases at the National Center for Biotechnical Information (NCBI) at the National Library of Medicine. Elsevier authors wishing to enable other scientists to use the accession numbers cited in their papers via links to these sources, should type this information in the following manner:
For each and every accession number cited in an article, authors should type the accession number in bold, underlined text. Letters in the accession number should always be capitalised. (See Example 1 below). This combination of letters and format will enable Elsevier's typesetters to recognize the relevant texts as accession numbers and add the required link to GenBank's sequences.
Example 1: "Note:GenBank accession nos. AI631510, AI631511, AI632198, and BF223228), a B-cell tumor from a chronic lymphatic leukemia (GenBank accession no. BE675048), and a T-cell lymphoma (GenBank accession no.AA361117)".
Authors are encouraged to check accession numbers used very carefully. An error in a letter or number can result in a dead link.
In the final version of the printed article, the accession number text will not appear bold or underlined (see Example 2 below).
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Example 2: "Note:GenBank accession nos. AI631510, AI631511, AI632198, and BF223228), a B-cell tumor from a chronic lymphatic leukemia (GenBank accession no. BE675048), and a T-cell lymphoma (GenBank accession no. AA361117)".
In the final version of the electronic copy, the accession number text will be linked to the appropriate source in the NCBI databases enabling readers to go directly to that source from the article (see Example 3 below).
Example 3: "GenBank accession nos. AI631510, AI631511, AI632198, and BF223228), a B-cell tumor from a chronic lymphatic leukemia (GenBank accession no. BE675048), and a T-cell lymphoma (GenBank accession no. AA361117)".
Manuscripts Manuscripts should be in English on numbered pages with double-spaced typing throughout (including tables, legends and reference lists) on one side of the paper only with margins of a least 3cm all round. They should be divided into: (1)title page - include a succinct title (which should not normally exceed 100 characters and should not contain any subtitles or abbreviations), the names of all authors, including a given name for each, the institutions with city, state and country where the work was performed, the name and complete address (including telephone, telefax and e-mail) of the corresponding author, a list of abbreviations and a list of addresses of authors who have moved from the institutions where the work was performed. (2) abstract - maximum 250 words, (3) keywords (3-6 indexing terms), (4) introduction, (5) materials and methods, (6) results, (7) discussion, (8)acknowledgements (grant support and technical support to be listed here), (9) references, (10) tables and (11) figure legends. A recent issue of the journal should be consulted for details. In the interests of clarity and brevity, it may sometimes be advantageous to combine the results and discussion into a single section. Everyone makes minor modifications to standard methods. Do not describe standard materials and methods or modifications unless they have significant and demonstrable utility. Do not duplicate descriptions of methodology in the figure legends. Generic and species names should be typed out in full the first time mentioned - in the title, the summary and the text - and thereafter the generic name should be abbreviated. Words or letters to be printed in italics should either be in italics or underlined. The metric system should be used throughout.
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Abbreviations of journal titles should conform to those adopted by the List of Serial Title Word abbreviations, ISDS International Centre, 20, rue Bachaumont, 75002 Paris, France (ISBN 2-904938-02-8).
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Tables Each table should be typed double-spaced on a separate sheet and have a short descriptive title. A legend may be placed under table. Footnotes should be identified in the table by a,b, c, etc.
Figures Figures must be in a form and condition suitable for high quality reproduction. Lettering should be clear and of adequate size to be legible after reduction. Consider the printed page and column proportions when preparing figures. If figures are not to be reduced their format should not exceed 16 x 20 cm. Multiple panels of a single figure must be mounted together. Each DNA sequence figure must fit on a single sheet of paper. Place numbering at one end of each line, not on separate lines, and avoid excessive line spacing. Consider placing nucleotide and protein data in separate panels, using single-letter amino acid abbreviations for the protein sequence and grouping nucleotides either continuously or in blocks of ten separated by one space (90 to 120 nt per line). Over 10 000 bp can legibly fit on each journal page in this format (see, e.g., Mol. Biochem. Parasitol. 95:141-146). Preferably use a sans-serif font. Upper case is standard, except that introns or other features can be usefully distinguished by lower case. Provide sharp laser-printer or imagesetter copy. Nucleotide sequences of long coding regions, where the amino acid sequence is the primary feature, and long DNA sequences, may, at the editor's discretion, be omitted from the printed paper. They can be obtained from electronic databases or from the authors. Half-tone illustrations may be included. They should be submitted as black-and-white prints on glossy paper and have as much contrast as possible. A scale should appear on photomicrographs. Colour plates will be published free of charge if colour contributes to the understanding of the information. In all other cases, the author should be prepared to pay the extra costs of 635 EUR for the first page and 318 EUR for following pages of colour. Figures legends should be typed double spaced at the end of the text, not on the figures. Figures should be checked extremely carefully, particularly after revisions. No changes to figures will be possible after acceptance of the manuscript.
Detailed instructions Abbreviations, symbols, chemical and biochemical nomenclature, etc., should follow the recommendations given in the Journal of Biological Chemistry (Vol. 272, pp. 28165-28170; http://www.jbc.org). Avoid abbreviations which are not in common use across the field of molecular and biochemical parasitology. Those used should be defined in the text on first usage and listed as a footnote on the title page. Do not introduce abbreviations unless they are used at least 4 times.
Genetic nomenclature for Trypanosoma and Leishmania should follow the guidelines proposed by Clayton et al (1998), Mol Biochem Parasitol 1998;97:221-224 (http://www.elsevier.nl/cas/tree/store/molbio/free/1998/97/1-2/3178.pdf).
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P.T. LoVerde, Southwest Foundation for Biomedical Research, PO BOX 760549, USA; e-mail: ploverde@sfbr.org
B. Ullman Department of Biochemistry, Oregon Health Science University, 3181 SW Sam Jackson Park Road, Portland OR 97201, USA Tel: +1 503 494 8437 Fax: +1 503 494 8393 E-mail:ullmanb@ohsu.edu
Reviews Editor
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