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ANDRÉ LUÍS SOARES DOS SANTOS
Efeito da circulação extracorpórea na expressão
da conexina 43 no miocárdio
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Cirúrgica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para a obtenção do Título de Doutor em Ciências Departamento: Cirurgia Área de Concentração: Clínica Cirúrgica Veterinária Orientador: Prof. Dr. Angelo João Stopiglia
São Paulo
2015
Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
T.3102 Santos, Andre Luís Soares dos FMVZ Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocário / André Luís
Soarea dos Santos. -- 2015. 96 f. :il.
Tese (Doutorado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Cirurgia, São Paulo, 2015.
Programa de Pós-Graduação: Clínica Cirúrgica Veterinária. Área de concentração: Clínica Cirúrgica Veterinária. Orientador: Prof. Dr. Angelo João Stopiglia.
1. Coração. 2. Circulação extracorpórea. 3. Conexinas. 4. Canulação aórtica. I. Título.
ERRATA
SANTOS, A. L. S. dos. Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.
Página Parágrafo Onde se lê Leia-se
Ficha
catalográfica
2º parágrafo miocário miocárdio
ERRATA
SANTOS, A. L. S. dos. Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.
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2º parágrafo miocário miocárdio
ERRATA
SANTOS, A. L. S. dos. Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.
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2º parágrafo miocário miocárdio
ERRATA
SANTOS, A. L. S. dos. Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.
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2º parágrafo miocário miocárdio
ERRATA
SANTOS, A. L. S. dos. Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.
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catalográfica
2º parágrafo miocário miocárdio
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Autor: SANTOS, André Luís Soares dos
Título: Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no
miocárdio
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Clínica Cirúrgica Veterinária
da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo
para a obtenção do título de Doutor em
Ciências
Data: ______ / ______ / ______
Banca Examinadora
Prof. Dr.: ___________________________________________________________
Instituição: ________________________ Julgamento: ______________________
Prof. Dr.: ___________________________________________________________
Instituição: ________________________ Julgamento: ______________________
Prof. Dr.: ___________________________________________________________
Instituição: ________________________ Julgamento: ______________________
Prof. Dr.: ___________________________________________________________
Instituição: ________________________ Julgamento: ______________________
Prof. Dr.: ___________________________________________________________
Instituição: ________________________ Julgamento: ______________________
“Seja você quem for, seja qual for a posição social que você
tenha na vida, a mais alta ou a mais baixa, tenha sempre como meta
muita força, muita determinação e sempre faça tudo com muito amor e
com muita fé em Deus, que um dia você chega lá. De alguma maneira
você chega lá."
Ayrton Senna
À meus pais, Inez e José. Estiveram e estão
sempre presentes. Esforçaram-se para me
possibilitar um ambiente familiar com muita
riqueza: amor, carinho, educação, princípios
e valores importantes para minha formação.
Ensinaram-me a nunca desistir do objetivo
desejado. Não teria conseguido nada sem o
seu apoio incondicional.
Obrigado, simplesmente por tudo!
Amo vocês.
“Quando encontrar alguém e esse alguém fizer seu coração
parar de funcionar por alguns segundos, preste atenção: pode ser a
pessoa mais importante da sua vida. Se os olhares se cruzarem e, neste
momento, houver o mesmo brilho intenso entre eles, fique alerta: pode
ser a pessoa que você está esperando desde o dia em que nasceu. Se
o toque dos lábios for intenso, se o beijo for apaixonante, e os olhos se
encherem d’água neste momento, perceba: existe algo mágico entre
vocês. Se o primeiro e o último pensamento do seu dia for essa pessoa,
se a vontade de ficar juntos chegar a apertar o coração, agradeça: Deus
te mandou um presente: O Amor. Por isso, preste atenção nos sinais -
não deixe que as loucuras do dia-a-dia o deixem cego para a melhor
coisa da vida: O AMOR.”
Carlos Drummond de Andrade
À minha esposa Alessandra. Meu porto
seguro para todos os momentos, inclusive os
mais difíceis. Pela compreensão, paciência e
incentivo, ajuda, carinho.
Amo você!
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Angelo João Stopiglia, pela orientação, amizade e
convivência ao longo destes anos. Pela atenção e disponibilidade em ajudar quando
solicitado, sempre atento em explicar tudo nos mínimos detalhes. Por me ensinar a
ter uma visão crítica sobre a academia e sobre a nossa profissão.
A Profª Drª Maria Lúcia Zaidan Dagli, por permitir meu ingresso no
Laboratório de Oncologia Experimental do Departamento de Patologia da
FMVZ/USP para realização das técnicas de biologia molecular. Obrigado pela
atenção e por todo auxílio nos momentos de dificuldade.
Ao Dr. Fábio Antonio Gaiotto, médico e exímio cirurgião cardiovascular.
Pela dedicação, paciência e orientação durante as intervenções cirúrgicas e
principalmente por compartilhar seus conhecimentos. Esta tese não seria possível
sem a sua colaboração. Muito obrigado!
A Mestre Karina Lacava Kwasnicka, médica veterinária e perfusionista.
Seus conhecimentos, sua ajuda e principalmente a sua competência foram decisivos
para a realização deste estudo. Muito obrigado pela sua ajuda!
A Profª Drª Denise Tabbachi Fantoni e a equipe de anestesistas Drª
Márcia Aparecida Portela Kahvegian, Drª Larissa Borges Cardozo, Tatiana Ribeiro
de Castro Carvalho, Maria Fernanda Cerniawsky Innocencio Rizzo, Amadeu Batista
da Silva Neto pela realização dos procedimentos anestésicos durante as
intervenções cirúrgicas.
Ao Dr. Daniel Soares Sanches, médico veterinário com experiência em
patologia animal. Pelo auxílio no delineamento deste estudo, na explicação das
técnicas de biologia molecular e também pela realização da análise histopatológica e
documentação fotográfica da mesma.
Aos médicos veterinários Eduardo Lipparelli Fernandez e ao Dr Kaleizu
Teodoro Rosa pela realização dos exames ecocardiográficos.
Ao médico veterinário e pós-graduando Caio Sabino de Oliveira pela
amizade e por todo auxílio no decorrer deste estudo.
Ao Dr. Lucas Martins Chaible e a Drª Ivone Izabel Mackowiak da Fonseca
pelo auxílio na realização das técnicas de biologia molecular e também pela ajuda
na interpretação dos resultados. Certamente aprendi muito com vocês! Obrigado.
Ao Prof. Dr. Bruno Cogliati pela amizade e a equipe de seu laboratório,
que também sempre estiveram dispostos para ajudar no que foi preciso.
Ao Prof. Dr. José Henrique de Hildebrand e Grisi Filho pela atenção e
orientação referente à estatística do estudo. Agradeço também a Mestre Renata
Santos Silva pelo auxílio na realização da densitometria do western blot e ao médico
veterinário mestrando Marcelo Vannucci Tedardi pela ajuda na realização e
interpretação da análise estatística da referida técnica.
Ao médico veterinário residente Danilo Marin Rodrigues pelo auxílio na
orientação da realização das fotomicrografias referente à imunofluorescência.
Ao secretário do Departamento de Cirurgia da FMVZ-USP Belarmino Ney
Pereira e à secretária do Programa de Pós-graduação em Clínica Cirúrgica do
mesmo departamento Livia dos Santos Gimenes, pela amizade sincera, pelos
momentos agradáveis e por sempre estarem disponíveis para ajudar.
A todos os colaboradores do Departamento de Cirurgia da FMVZ-USP,
pela amizade e por sempre estarem dispostos para ajudar.
A todos os colaboradores do Departamento de Patologia da FMVZ-USP,
colegas e amigos que proporcionaram bons dias. Agradeço à técnica Marguiti Izaura
Soares Silva, pelo auxílio e orientação na realização da imunofluorescência.
Agradeço também a graduanda Ana Paula Dias pela colaboração.
Aos colaboradores da biblioteca da FMVZ-USP, pela amizade, atenção e
ajuda. Agradeço a Elza Maria Rosa B. Faquim, pelo auxílio na normalização da tese
para que estivesse em conformidade com as normas exigidas pelo programa de
pós-graduação em Clínica Cirúrgica Veterinária.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),
pelo auxílio financeiro para viabilizar a realização desta pesquisa.
Agradeço a FMVZ/USP pela minha formação acadêmica (graduação e
pós-graduação). Tenho muito orgulho de fazer parte da história desta casa.
“Só sei que nada sei; o fato de saber isso me coloca
em vantagem sobre aqueles que acham saberem
alguma coisa.”
Sócrates
RESUMO
SANTOS, A. L. S. dos. Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio. [Effect of cardiopulmonary bypass on myocardial connexin 43]. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.
As conexinas são proteínas essenciais e estão diretamente relacionadas à
propagação do impulso elétrico no coração, à velocidade de condução bem como à
gênese de muitas afecções cardíacas. Em face da circulação extracorpórea (CEC)
ainda ser utilizada de forma inconsistente na medicina veterinária e devido aos
poucos estudos observados na literatura sobre os efeitos provocados pelo emprego
da CEC na expressão da conexina 43 (Cx43) no miocárdio, objetivou-se avaliá-la em
15 animais da espécie canina, distribuidos em três grupos (C, CEC-1 e CEC -2)
sendo, respectivamente, antes de realizada a CEC, com 60 minutos após esta e 60
minutos de CEC seguida de 30 minutos de restauração da perfusão espontânea.
Avaliou-se a Cx43 pelas técnicas de imunofluorescência, western blot e RT-PCR em
tempo real no tecido muscular cardíaco de regiões correspondentes aos átrios
direito (AD) e esquerdo (AE), ventrículos direito (VD) e esquerdo (VE) e septo
transverso. Os resultados indicaram a presença da Cx43 em todas as regiões do
miocárdio nos grupos C, CEC-1 e CEC-2. A expressão da Cx43 variou
significativamente em CEC-2 no AE e VD em relação ao grupo C (p<0,05). A
expressão gênica de Gja1 (gene da Cx43) não apresentou diferença significativa
entre os grupos estudados. Em CEC-2 identificou-se a presença de vacuolização na
túnica média de artérias de pequeno calibre do miocárdio. Concluiu-se também que
a canulação da aorta bem como a instalação do circuito de CEC no modo aorto-
bicaval constitui técnica exequível.
Palavras-chave: Coração. Circulação extracorpórea. Conexinas. Canulação aórtica.
ABSTRACT
SANTOS, A. L. S. dos. Effect of cardiopulmonary bypass on myocardial connexin 43. [Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio]. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.
Connexins are essential proteins that are directly associated with electrical impulse
propagation and speed of propagation in the heart. They also play a major role in
numerous heart conditions. The use of cardiopulmonary bypass (CPB) in veterinary
medicine is inconsistent and few studies describe the effect of cardiopulmonary
bypass on the expression of connexin 43 (Cx43) in the myocardium. The objective of
this study was to evaluate myocardial expression of Cx43. Connexin 43 of 15 dogs
was assessed at 3 moments: prior to CPB (Group C); 60 minutes after CPB (Group
CPB1); and 60 minutes after CPB followed by 30 minutes of spontaneous perfusion
(Group CPB2). Assessment of Cx43 included immunofluorescence, western blot and
RT-PCR real time of heart tissue samples from the right atrium (RA), left atrium (LA),
right ventricle (LV), right ventricle (RV) and transverse septum. Our results showed
the presence of Cx43 in all 5 areas of the myocardium in groups C, CPB1 and CPB2.
A significant variation on the expression of Cx43 was observed when CPB2 LA and
CPB2 RV were compared to group C (p<0,05). Expression of Gja1 (gene for Cx43)
did not vary significantly among the study groups. Group CBP2 presented
vacuolation of the tunica media of small myocardial arteries. We conclude that
cannulation of the aorta and aorto-bicaval setup of the CPB circuit is feasible
technique.
Key words: Heart. Cardiopulmonary bypass. Connexins. Aortic cannulation.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Modelo de organização da placa juncional desenvolvido a partir de estudos de microscopia eletrônica e de difração de raios-X de junções comunicantes do tipo gap de fígado de camundongos ............. 30
Figura 2 - Família multigênica das conexinas derivadas de um provável ancestral comum .................................................................................... 31
Figura 3 - Esquerma relativo à topologia membranal de uma conexina ................. 32
Figura 4 - Esquerma do coração humano ilustrando a propagação do impulso e os padrões de expressão das conexinas de acordo com a região. ........ 34
Figura 5 - Imagem fotográfica do acesso cirúrgico ao nível do 4º espaço intercostal direito .................................................................................... 40
Figura 6 - Imagem fotográfica referente à sutura em bolsa de tabaco dom fio polipropilene 4.0 ou 5.0 realizada na artéria aorta e na veia cava cranial ..................................................................................................... 41
Figura 7 - Imagens fotográficas referente à cânula arterial sendo referenciada com fio algodão ...................................................................................... 42
Figura 8 - Imagens fotográficas referente à cânula venosa sendo referenciada com fio algodão ...................................................................................... 42
Figura 9 - Imagem fotográfica referente à canulação arterial imediatamente antes da incisão da artéria aorta com bisturi para posterior introdução da cânula arterial .................................................................. 43
Figura 10 - Imagem fotográfica referente à canulação arterial seguida de fixação .. 43
Figura 11 - Imagem fotográfica referente à canulação da veia cava cranial imediatamente após a introdução da cânula venosa e antes da fixação da cânula com fio de polipropilene 4.0 ou 5.0. Em ca de cânula arterial proveniente da artéria aorta ............................................ 44
Figura 12 - Imagem fotográfica referente à canulação da artéria aorta e das veias cavas cranial e caudal e fixação com fio de polipropilene 4.0 ou 5.0 .......................................................................................................... 45
Figura 13 - Imagem fotográfica referente à máquina de CEC Modelo ECO 01 - Braile Biomédica .................................................................................... 45
Figura 14 - Imagem fotográfica referente à eletroforese em gel das proteínas ........ 52
Figura 15 - Esquema indicando a colocação das amostras nos poços do gel Bolt® ...................................................................................................... 53
Figura 16 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (átrio direito) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos ............................ 60
Figura 17 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (ventrículo direito) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos .......... 60
Figura 18 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (átrio esquerdo) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos ....................... 61
Figura 19 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (ventrículo esquerdo) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos .......... 61
Figura 20 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (septo) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos ............................ 62
Figura 21 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal do grupo Controle ....................................................................... 62
Figura 22 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal do grupo controle ........................................................................ 63
Figura 23 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) discreta ............................................................ 63
Figura 24 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) discreta ............................................................ 64
Figura 25 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) moderada ........................................................ 64
Figura 26 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) moderada ........................................................ 65
Figura 27 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) intensa ............................................................. 65
Figura 28 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) intensa ............................................................. 66
Figura 29 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (átrio direito) de animal do grupo Controle ............................. 68
Figura 30 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo Controle .................... 68
Figura 31 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (átrio esquerdo) de animal do grupo Controle ....................... 69
Figura 32 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo esquerdo) de animal do grupo Controle ............... 69
Figura 33 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (septo transverso) de animal do grupo Controle .................... 70
Figura 34 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (átrio direito) de animal do grupo CEC-1 ............................... 70
Figura 35 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo CEC-1 ....................... 71
Figura 36 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo CEC-2 ....................... 71
Figura 37 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo esquerdo) de animal do grupo CEC-2 .................. 72
Figura 38 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (septo transverso) de animal do grupo CEC-2 ....................... 72
Figura 39 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência (controle negativo da reação) de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo Controle ........................................................................................ 73
Figura 40 - Esquema referente à membrana (região septo transverso) após revelação ................................................................................................ 74
Figura 41 - Boxplots referente à análise densitométrica da expressão da Cx43 ...... 75
Figura 42 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no átrio direito.............................................................................................. 76
Figura 43 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no ventrículo direito ..................................................................................... 77
Figura 44 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no átrio esquerdo ........................................................................................ 77
Figura 45 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no ventrículo esquerdo ................................................................................ 78
Figura 46 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no septo interventricular .............................................................................. 78
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
cDNA fita de ácido desoxirribonucleico complementar a ácido ribonucleico que contém a mensagem que codifica para determinada proteína.
CEC Circulação extracorpórea cAMP Monofosfato de adenosina cíclico cGMP Monofosfato de guanosina cíclico Cx Conexina Cxs Conexinas Cx26 Conexina 26 Cx30.2 Conexina 30.2 Cx31.9 Conexina 31.9 Cx37 Conexina 37 Cx40 Conexina 40 Cx43 Conexina 43 Cx45 Conexina 45 Cx46 Conexina 46 Cx50 Conexina 50 DNA Ácido desoxirribonucleico. Gap Fenda GAPDH proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase Gja1 Gene da conexina 43 H&E Hematoxilina e Eosina IM Intramuscular IP3 Trifosfato de inositol IV Intravenoso
MPM Marcador de peso molecular mRNA Ácido ribonucleico cuja informação que codifica para uma determinada
proteína estão contidos pH Concentração do íon hidrogênio RNA Ácido ribonucleico Rpm Rotações por minuto RT-PCR Reação de polimerização em cadeia a partir de ácido ribonucleico,
utilizando a enzima transcriptase reversa.
LISTA DE SÍMBOLOS
Ca+ Símbolo referente ao elemento químico cálcio G Gaus K+ Símbolo referente ao elemento químico potássio kDa Kilodalton mg/kg Miligramas por quilograma de peso mL/kg/h Mililitros por quilograma de peso por hora mL/kg/min Mililitros por quilograma de peso por minuto mmHg Milímetros de mercúrio Na+ Símbolo referente ao elemento químico sódio nm Nanômetros UI/kg Unidade internacional por quilograma de peso V Volts µg/kg Micrograma por quilo de peso µm Micrômetro µL Microlitro ºC Graus Celsius
LISTA DE TERMOS EM INGLÊS
Bradford Reagente utilizado para se determinar a concentração de
proteínas numa solução
GJIC Comunicação intercelular através de junções tipo gap.
Knockout Animal geneticamente manipulado em que determinado(s)
gene(s) é (são) suprimidos
RT-PCR Reação de polimerização em cadeia a partir de ácido
ribonucleico, utilizando a enzima transcriptase reversa
Primer É uma sequência de geralmente 20bp que é o ponto inicial de
reconhecimento pela polimerase na duplicação do DNA sense
Probe Nome dado a sequência de oligonucleotídeos (20bp) que
contém os fluoróforos utilizados no RT-PCR em tempo real. O
produto de amplificação do RT-PCR em tempo real é
proporcional à intensidade luminosa do fluoróforo
Taqman Nome dado ao conjunto de primers e probe fluorescente
utilizados no RT-PCR em tempo real
Western Blot Método utilizado para identificação de proteínas, baseado em
extração, eletroforese, transferência e identificação através de
anticorpos e sistema de revelação.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 21
2 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 23
3 OBJETIVO GERAL ........................................................................................ 37
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 37
4 MATERIAL E MÉTODO ................................................................................. 38
4.1 PRODECIMENTO ANESTÉSICO .................................................................. 38
4.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO .................................................................... 40
4.3 MOMENTOS DA AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS ..................................... 47
4.4 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS ................................................................. 47
4.4.1 Histopatogia do tecido muscular cardíaco ...................................................... 48
4.4.2 Imunofluorescência para a conexina 43 ......................................................... 49
4.4.3 Western blot para a conexina 43 .................................................................... 50
4.4.4 Determinação da expressão do mRNA correspondente ao Gja1 (gene da
conexina 43) utilizando a técnica de RT-PCR em tempo real ......................... 55
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................. 58
5 RESULTADOS ............................................................................................... 59
5.1 AVALIAÇÃO DA CANULAÇÃO DA AORTA E INSTALAÇÃO DO CIRCUITO
DE CEC NO MODO AORTO-BICAVAL .......................................................... 59
5.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO TECIDO MUSCULAR CARDÍACO ... 59
5.3 IMUNO-LOCALIZAÇÃO DA CONEXINA 43 (IMUNOFLUORESCÊNCIA) ..... 66
5.4 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA CONEXINA 43 (WESTERN BLOT) .......... 73
5.5 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO mRNA DA CONEXINA 43 (RT-PCR EM
TEMPO REAL) ............................................................................................... 76
6 DISCUSSÃO .................................................................................................. 79
7 CONCLUSÃO ................................................................................................. 88
REFERÊNCIAS...............................................................................................90
21
1 INTRODUÇÃO
Considerada como um dos mais importantes avanços na medicina do
século XX, a cirurgia cardíaca a céu aberto teve o seu início em 1952 no Hospital da
Universidade de Minnesota (Estados Unidos) quando F. John Lewis corrigiu uma
comunicação interatrial de dois cm de diâmetro, sob visão direta, com interrupção do
fluxo nas cavas e hipotermia corporal moderada (26º C), em uma menina de cinco
anos de idade. Reconhecida como o berço da cirurgia cardíaca mundial, a referida
universidade foi responsável pela formação de muitos pioneiros na cirurgia torácica
e cardiovascular de outros países. Estas complexas cirurgias tornaram-se possíveis
devido ao advento da circulação extracorpórea (CEC), pois ao mesmo tempo que
assegurou a oxigenação dos tecidos e a eliminação dos seus produtos finais,
permitiu ao cirurgião acessar o interior do coração por período de tempo superior
àquele estabelecido pela parada circulatória total (BRAILE; GODOY, 2012; HESSEL,
2014).
Na medicina veterinária, a CEC tem sido utilizada de forma inconsistente
desde o final da década de 1960 para o tratamento de doenças cardíacas
congênitas e adquiridas, tais como defeitos do septo ventricular, dupla via de saída
do ventrículo, tetralogia de Fallot e doença valvar mitral (BORENSTEIN et al., 2004;
PELOSI et al., 2013). Em animais, tanto a máquina quanto os materiais descartáveis
empregados na implantação da CEC são idênticos aos da espécie humana, sem
qualquer modificação (HOLMBERG, 1998).
Porém, a grande variedade no tamanho dos animais domésticos dificulta
a padronização de técnicas de canulação, dos oxigenadores, volumes do perfusato
e das soluções utilizadas. Além disso, os altos custos envolvidos na aplicação da
técnica e a exigência de uma equipe especialmente treinada para se garantir
resultados satisfatórios ainda são responsáveis pela limitação no seu uso
(KWASNICKA, 2003; HUNT, 2005; PELOSI et al., 2013).
Fatores como o tempo de CEC e o clampeamento aórtico estão
diretamente relacionados com a incidência de complicações, entre as quais
destacam-se arritmias, fibrilação ventricular, hipotensão, alterações hematológicas e
bioquímicas, hemorragia proveniente da canulação da aorta, hipóxia e inflamação
sistêmica (PELOSI et al., 2013).
22
Para uma melhor compreensão da fisiopatologia destes processos
existem muitos temas que necessitam ser pesquisados, com o objetivo de
solucionar, amenizar e até mesmo prevenir as alterações decorrentes da CEC.
Neste contexto, destaca-se o estudo das junções intercelulares do tipo gap, as quais
são compostas de uma família de proteínas chamadas conexinas. Tais junções
permitem a comunicação entre as células cardíacas.
As conexinas são essenciais para a propagação do impulso elétrico pelo
coração e determinantes para a velocidade de condução. Sua disfunção constitui um
importante fator na gênese do ritmo cardíaco anormal, além de ser extremamente
relevante na patogênese de uma grande variedade de doenças cardíacas. A
conexina 43 (Cx43) é a principal isoforma presente no miocárdio, e está diretamente
envolvida no controle da homeostasia tecidual, crescimento e proliferação celular
(JANSEN et al., 2010; LAMBIASE1; TINKER, 2014).
Deste modo, aventou-se a hipótese do estudo da referida proteína
presente no miocárdio, avaliando-se os possíveis efeitos da CEC sobre a localização
e expressão da Cx43 e sobre a expressão gênica de Gja1 (gene da Cx43).
1 LAMBIASE, P. D.; TINKER, A. Connexins in the heart. Cell and Tissue Research, 31 out. 2014. No prelo.
23
2 REVISÃO DE LITERATURA
A doença cardíaca pode ser considerada como a principal afecção no
mundo. Nos dias atuais, a cirurgia torácica e cardiovascular é comumente utilizada
para revascularização na doença arterial coronariana, reparo e/ou substituição de
valva cardíaca e transplantes cardíaco e cardiopulmonar. Tais cirurgias destinam-se
ao tratamento de doenças cardíacas congênitas ou adquiridas (PUNJABI; TAYLOR,
2013). Tais evoluções na cirurgia cardiotorácica somente foram viabilizadas a partir
do desenvolvimento da circulação extracorpórea (CEC), técnica considerada como
um dos avanços clínicos mais importantes na medicina durante a segunda metade
do século XX (HESSEL, 2014).
Pode-se, admitir que a história da CEC tenha tido o seu início nos idos de
1628, confundindo-se com a descrição da circulação do sangue publicada por
William Harvey, em seu livro intitulado “De Motu Cordis” (“Sobre o Movimento do
Coração e do Sangue”). Decorridos 175 anos após a descrição da circulação,
Lavoisier desenvolveu seus estudos colaborando para à compreensão da fisiologia
respiratória (SOUZA; ELIAS, 2006). O conceito de que o coração poderia ser
substituído por uma CEC foi sugerido pela primeira vez por Le Gallois em 1813. Dois
anos mais tarde, Frey e Gruber construíram um sistema de oxigenação sanguínea
extracorpórea (HESSEL, 2014). Posteriormente, Ludwig Rehn, em 1896, obteve
êxito ao suturar um ferimento de ventrículo direito (BRAILE; GODOY, 2012).
As primeiras ideias sobre a circulação cruzada em animais originaram-se
das pesquisas de Fredericq (1890) e de Hedon (1910), enquanto que as primeiras
aplicações em seres humanos datam de 1940 e 1948, e foram realizadas por
Duncan e Vecchietti, e tinham como objetivo depurar o sangue de pacientes
portadores de insuficiência hepática e renal (SOUZA; ELIAS, 2006).
Southworth e Pierce (1952) avaliaram o emprego da circulação cruzada
em cirurgia cardíaca. Em seu estudo, detalharam o método e estabeleceram os
princípios para a canulação do sistema. Em humanos, o sistema foi abandonado
devido às sérias reações imunológicas. No entanto, existe estudo em cães indicando
a viabilidade da circulação cruzada como método de CEC, desde que o cão doador
seja de porte grande e o cão receptor de porte médio (HUNT et al., 1993).
24
Muitas descobertas científicas e novas técnicas tiveram de ser
desenvolvidas antes de se proceder à instituição da CEC. A descoberta da heparina
e da protamina tornaram a CEC cirurgicamente possível (HESSEL, 2014).
A primeira cirurgia cardíaca a céu aberto, com sistema coração-pulmão
artificial, foi realizada com sucesso em seis de maio de 1953 pelo médico John
Gibbon e sua equipe em uma paciente de 18 anos que apresentava comunicação
interatrial. Gibbon desenvolveu com sua esposa o sistema, para conseguir acesso
ao interior do coração. A duração total da CEC foi de 45 minutos (BORDLEY;
HARVEY, 1976; SOUZA, ELIAS, 2006; HESSEL, 2014).
Após este marco histórico, inúmeros estudos na medicina têm sido
conduzidos até os dias atuais com o intuito de se aprimorar cada vez mais as
técnicas da circulação extracorpórea.
Na medicina veterinária, tanto a cirurgia torácica em geral quanto a
cardiovascular, mais especificamente, vem se tornando cada vez mais uma
realidade em hospitais veterinários de universidades desde as décadas finais do
século XX, principalmente devido aos avanços tecnológicos. No Brasil, os estudos
iniciais sobre cirurgias cardíacas datam do final da década de 1990 e direcionaram-
se ao estudo das técnicas de toracotomias e parada circulatória temporária (PINTO
et al., 2000; KWASNICKA et al., 2000; STOPIGLIA et al., 2001, GARCIA et al., 2005;
ANDRADE et al., 2006; MINGRONE et al., 2006, GARCIA et al., 2009).
Intervenções cirúrgicas visando à correção de bradiarritmias (FREITAS et
al., 2002), correção cirúrgica paliativa da tetralogia de Fallot (FREITAS et al., 2003),
correção da persistência do ducto arterioso (STOPIGLIA et al., 2004) e correção da
comunicação inter-atrial (FREITAS et al., 2005) foram realizadas em cães doentes
com resultados promissores.
Ao mesmo tempo que pesquisadores confirmaram a viabilidade da
pneumonectomia (IRINO et al., 2004; SIMÕES et al., 2005; BINOKI et al., 2007;
SIMÕES et al., 2007), outros estudos se direcionaram a uma melhor compreensão
sobre o funcionamento da máquina de circulação extracorpórea e as variações das
técnicas de perfusão (KWASNICKA, 2003) além da avaliação das alterações
clínicas, laboratoriais e anátomo-histopatológicas ocasionadas pela CEC, em cães
(FREITAS, 2004).
A CEC vem sendo utilizada na medicina veterinária de forma pouco
sistematizada desde o final da década de 1960 para o tratamento de doenças
25
cardíacas congênitas e adquiridas, tais como defeitos do septo ventricular, dupla via
de saída do ventrículo, tetralogia de Fallot e doença valvar mitral. Em cães e gatos,
a variação anatômica da cavidade torácica, os diferentes tipos de canulação, a
variabilidade considerável no tamanho e conformação do corpo, o limitado volume
sanguíneo em pacientes menores, as diferenças relacionadas à coagulação e
hemostasia quando comparado aos pacientes humanos, da disponibilidade limitada
de hemocomponentes e os custos associados à sua utilização são importantes
fatores relacionados a CEC que devem ser considerados (PELOSI et al., 2013).
As doenças cardíacas congênitas cujo tratamento cirúrgico é considerado
rotina incluem a persistência do ducto arterioso e a persistência do quarto arco
aórtico direito (HUNT, 2005). No entanto, para a correção cirúrgica de outras
doenças como defeitos do septo atrial e ventricular, estenoses pulmonar e aórtica,
defeito no canal atrioventricular, tetralogia de Fallot e doenças valvulares também se
faz necessário a utilização da técnica de circulação extracorpórea (KLEMENT et al.,
1987).
Segundo o hospital veterinário da Universidade da Califórnia (Davis -
Estados Unidos), cerca de 17% dos cães e 5% dos gatos avaliados pelo serviço de
cardiologia da referida instituição ao longo de um período de 10 anos foram
diagnosticados com doença cardíaca congênita. As cardiopatias congênitas mais
comuns em cães foram a estenose sub-aórtica e a persistência do ducto arterioso.
Os gatos foram mais acometidos por displasia da valva tricúspide e defeito no septo
ventricular (MACDONALD, 2006).
Em animais, tanto a máquina quanto os materiais descartáveis
empregados na implantação da CEC são idênticos aos da espécie humana, sem
qualquer modificação (HOLMBERG, 1998).
A CEC constitui-se em sistema artificial por meio do qual o sangue é total
ou parcialmente transportado para fora do organismo temporariamente onde é
oxigenado em máquina apropriada, filtrado, retornando à circulação (SANT’ANA;
LUCCHESE, 1994). Pode também ser denominado de sistema coração-pulmão
artificial (KURUSZ, 2003).
O aparelho de CEC possui duas partes principais: a parte motora (que
possui a função do coração propriamente dita) e a parte oxigenadora. Considera-se
ideal que a parte motora produza mínimo trauma nos elementos sanguíneos,
permitindo o controle de fluxo de acordo com a necessidade do paciente, sendo
26
capaz de impulsionar o sangue (GOMES, 1985). A parte oxigenadora constitui-se de
dispositivo mecânico que torna possível as trocas de oxigênio, dióxido de carbono,
vapor de água e gases anestésicos entre o sangue do paciente e a atmosfera
adjacente (SANT’ANA; LUCCHESE, 1994).
Estudos têm sido conduzidos na tentativa de viabilizar a técnica de CEC
em medicina veterinária (KWASNICKA, 2003; FREITAS, 2004). Entretanto, a grande
variedade no tamanho dos animais domésticos dificulta a padronização de técnicas
de canulação, dos oxigenadores, volumes do perfusato e das soluções utilizadas.
Além disso, os altos custos envolvidos na aplicação da técnica e a exigência de uma
equipe especialmente treinada para se garantir resultados satisfatórios ainda são
responsáveis pela limitação no seu uso (KWASNICKA, 2003; HUNT, 2005; PELOSI
et al., 2013). No mínimo, a equipe para realização de cirurgias cardíacas consiste do
cirurgião principal, cirurgião assistente, instrumentador, enfermeiro, anestesista,
perfusionista além dos membros da unidade de terapia intensiva (GRIFFITHS,
2010).
A incidência de complicações está diretamente relacionada com fatores
como o tempo de CEC e o clampeamento aórtico. Entre as principais complicações
destacam-se arritmias, fibrilação ventricular, hipotensão, alterações hematológicas e
bioquímicas, hemorragia proveniente da canulação da aorta, hipóxia e inflamação
sistêmica (PELOSI et al., 2013).
Diversos trabalhos discorrem as alterações ocasionadas pela CEC, entre
as quais citam-se as alterações hematológicas como hemólise e oclusão
microvascular (SANT’ANA; LUCCHESE, 1994; MARQUES et al., 1995), agregação
plaquetária e trombocitopenia, além de alterações hidroeletrolíticas como a
hipocalemia (HOLMBERG, 1998). Em estudos de microscopia eletrônica no coração
Kawai et al. (1992) observaram aumento das mitocôndrias, laceração das miofibrilas,
edema intracelular. Já, Freitas (2004), observou edema perinuclear, hemorragia,
miocardite aguda, necrose, pericardite neutrofílica no miocárdio e enfisema, áreas
focais com hemorragia, derrame de fibrina, infiltrado inflamatório misto e atelectasia
pulmonar em cães.
Entre as principais causas de arritmias nos períodos trans e pós-
operatórios em cães submetidos à CEC, destacam-se hipotermia, hipóxia,
hipoventilação e depressão cardiovascular (CAYWOOD, 1996). Já Yoshida et al. em
1984, afirmam que a CEC pode ser responsável por anormalidades nos movimentos
27
do septo no período pós-operatório. A hipotermia foi indicada como a causa mais
frequente de bradicardia, podendo promover a ocorrência de fibrilação atrial durante
a anestesia (MAGILLIGAN, 1985).
Existem publicações que indicam a utilização da hipotermina durante a
execução da CEC (LEW et al., 1997; KANEMOTO et al., 2010). Por outro lado, em
um estudo comparativo entre hipotermia e normotermia em CEC foi postulado que a
normotermia é mais indicada para intervenções cirúrgicas a céu aberto de curta
duração, enquanto que a hipotermia é mais indicada para cirurgias a céu aberto de
maior duração. Entretanto, conclui que se o circuito de CEC puder ser aperfeiçoado
para uso em pequenos animais, a CEC normotérmica pode eventualmente promover
menor injúria ao paciente, tornando-se um procedimento de escolha (SHIBAZAKI et
al., 1999).
Com relação à canulação arterial, um estudo sobre circulação cruzada em
cães procedeu ao acesso das artérias ilíaca externa (doador) e aorta (receptor) com
êxito (HUNT; PEARSON; BELLENGER, 1993). Por outro lado, existem publicações
que referem uma possível fragilidade da artéria aorta em cães, fato este relacionado
a complicações decorrentes da canulação do referido vaso sanguíneo (KLEMENT et
al., 1987a; ORTON, 1994; GRIFFITHS, 2010; PELOSI et al., 2013).
Assim, os pesquisadores recomendam para a canulação arterial a artéria
axilar (HEDAYATI et al., 2004), artéria femoral esquerda (DALLAN et al., 1987;
(PETERS et al., 1997; BEHR et al., 2007; GRIFFITHS, 2010; PELOSI et al., 2013).
ou artéria carótida esquerda (KANEMOTO et al., 2010; UECHI, 2012; FUJIWARA et
al., 2012; GRIFFITHS, 2010; PELOSI et al., 2013).
Em publicação recente foi mencionada a necessidade de realização de
um estudo para se comprovar de fato a exequibilidade da canulação da aorta em
cães para instituição da CEC (PELOSI et al., 2013).
Com relação ao perfusato (volume necessário para preencher todo o
circuito de CEC impedindo a entrada de ar no leito vascular do paciente no momento
da perfusão), pode-se utilizar o cristaloide ou o sanguíneo (KWASNICKA, 2003). Há
relatos em medicina veterinária de que o uso do perfusato sanguíneo não promoveu
nenhum efeito colateral, auxiliando a atenuar a diminuição no hematócrito
(KANEMOTO et al., 2010). Entretanto, a literatura veterinária sugere que o perfusato
cristalóide é usado mais frequentemente em relação ao sanguíneo (PELOSI et al.,
2013).
28
Poucos são os casos em que se realizou cirurgia cardíaca com o coração
em movimento (BEHR et al., 2007; SODA et al., 2009), pois há um grande risco da
ocorrência de embolia, o que seria fatal para o paciente. O uso de cardioplegia tem
como finalidade além da parada do coração, para que o cirurgião possa realizar o
procedimento, a proteção do miocárdio durante o período de isquemia
(KWASNICKA, 2003).
O uso de soluções cardioprotetoras promove um maior grau de
complexidade ao procedimento, e isso reflete diretamente no planejamento
estratégico durante a cirurgia (PELOSI et al., 2013). A cardioplegia promove uma
despolarização na membrana celular, evitando a condução do potencial de ação e
resultando em parada cardíaca diastólica (CHAMBERS; FALLOUH, 2010).
Atualmente, estudos tem sido conduzidos no intuito de desenvolver novos
mecanismos terapêuticos para proteção do miocárdio contra a lesão por isquemia-
reperfusão (SLUIJTER et al., 2014).
O anticoagulante usado durante a CEC é a heparina administrada por via
intravenosa (IV). Ao término da CEC, o fármaco utilizado para reverter o efeito
anticoagulante é a protamina. Na literatura veterinária as doses utilizadas são
bastante variáveis (HUNT; PEARSON; BELLENGER, 1993; LEW et al., 1997;
KWASNICKA, 2003; FREITAS, 2004; BEHR et al., 2007; SODA et al., 2009;
GRIFFITHS, 2010; KANEMOTO et al., 2010; PELOSI et al., 2013).
Apesar das intercorrências relacionadas com a instituição da CEC, alguns
estudos apontam a técnica de circulação extracorpórea como técnica viável de ser
aplicada em medicina veterinária (KLEMENT et al., 1987a; ORTON, 1994; ORTON
et al., 2001; BROURMAN, 2003; KWASNICKA, 2003; FREITAS, 2004; BEHR et al.,
2007; SEREDA et al., 2009; SODA et al., 2009; TANAKA et al., 2009; KANEMOTO
et al., 2010; GRIFFITHS, 2010; UECHI et al., 2011; FUJIWARA et al., 2012; UECHI,
2012; UECHI et al., 2012; MIZUNO; MIZUKOSHI; UECHI, 2013)
Brourman (2003) descreve, em seu estudo referente à utilização da CEC
em seis felinos, sucesso, indicando ser possível realizar perfusão nesta espécie
durante 90 minutos. Outros pesquisadores relataram êxito na correção cirúrgica de
defeito de septo atrial em um animal da mesma espécie (UECHI et al., 2011).
Para uma melhor compreensão da fisiopatologia destes processos, e
objetivando-se solucionar, amenizar e até mesmo prevenir as alterações decorrentes
da CEC, existem muitos temas que necessitam ser pesquisados. Neste contexto,
29
destaca-se o estudo das junções intercelulares do tipo gap, as quais são compostas
de uma família de proteínas chamadas conexinas.
Junções intercelulares são estruturas especializadas que se encontram
na membrana plasmática das células que compõem os tecidos de um organismo
vivo e são classificadas de acordo com a principal função que desempenham
(ALBERTS et al., 1994). As junções de ancoramento promovem a adesão de uma
célula à outra ou a elementos da matriz celular enquanto que as junções de oclusão
restringem a passagem de substâncias pelo espaço entre as células. Já as junções
comunicantes do tipo gap (GJIC), promovem a comunicação entre as células
(YAMASAKI, 1990; YAMASAKI; NAUS, 1996).
As GJIC estão presentes nos tecidos multicelulares de diversas espécies
animais. Constituem exceções as células sanguíneas, musculares esqueléticas e
nervosas. (YAMASAKI; NAUS, 1999). Quando observadas por microscopia
eletrônica, as junções gap apresentam estrutura pentalaminar característica,
constituindo verdadeiras placas juncionais nesta região (KOVAL, 2006).
No final da década de 1970, foi proposto um modelo de organização da
placa juncional desenvolvido a partir de estudos de microscopia eletrônica e de
difração de raios-X de junções gap de fígado de camundongos (Figura 1). Segundo
o referido modelo, cada placa é constituída por vários canais intercelulares formados
pela associação, face a face, de estruturas hexaméricas de 7 nm de diâmetro
denominadas conexons. Cada conexon é composto por seis subunidades de
proteínas transmembranas, conhecidas como conexinas (Cxs) e que oligomerizadas
formam um poro central hidrofílico com cerca de 2nm de diâmetro (MAKOWSKI et
al., 1977) O tamanho e o número de placas juncionais variam de acordo com o tipo
celular e dependem frequentemente do estado de atividade dos tecidos (UNWIN;
ZAMPIGHI, 1980; BEYER, 1993; VELDEN et al., 2002; KREUZBERG; WILLECKE;
BUKAUSKAS, 2006; GOODENOUGH; PAUL, 2009; CARETTE et al., 2014;
LAMBIASE; TINKER, 2014).
As conexinas são filogeneticamente conservadas (GOODENOUGH et al.,
1996), classificadas de acordo com seus pesos moleculares e estão inseridas na
membrana plasmática (YAMASAKI; NAUS, 1996; VELDEN et al., 2002;
KREUZBERG; WILLECKE; BUKAUSKAS, 2006; GOODENOUGH; PAUL, 2009;
CARETTE et al., 2014; LAMBIASE; TINKER, 2014). A associação de dois conexons
forma um canal intercelular que conecta o citoplasma de duas células adjacentes,
30
permitindo a passagem direta de moléculas com peso molecular inferior a 1kDa,
incluindo precursores metabólicos, nutrientes e fatores de sinalização celular, tais
como trifosfato de inositol (IP3), monofosfato de adenosina cíclico (cAMP),
monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) e íons, enquanto que moléculas maiores,
como proteínas, polissacáridos e lipídeos complexos ficam retidos no interior do
citoplasma (CARETTE et al., 2014).
Figura 1- Modelo de organização da placa juncional desenvolvido a partir de estudos de microscopia eletrônica e de difração de raios-X de junções comunicantes do tipo gap de fígado de camundongos
Fonte: (MAKOWWSKI et al., 1977. Adaptado por SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: Em detalhe: Cx: uma conexina (indicada na figura pelo quadrilátero vermelho). Cada
conexon (círculo azul) é composto por seis subunidades de conexinas, as quais oligomerizadas formam um poro central hidrofílico com cerca de 2nm de diâmetro (círculo amarelo) e que está associado a outro conexon na membrana adjacente (quadrilátero verde). A associação de dois conexons forma um canal intercelular que interliga diretamente o citoplasma de duas células adjacentes (célula 1 e célula 2) e permite a passagem direta de moléculas com peso molecular de até 1kDa (representada pela linha em marrom com setas em sentidos opostos).
31
Tal comunicação é reconhecida como essencial em diversas funções
fisiológicas e fisiopatológicas, tais como crescimento celular, proliferação e
diferenciação, homeostase do tecido, cicatrização de feridas, entre outras (EVANS;
MARTIN, 2002).
A nomenclatura utilizada atualmente refere-se ao tamanho da proteína
predita a partir da sequência do cDNA considerado (em kDa) precedida do termo
genérico Cx (BEYER et al., 1987; BEYER, 1993). Em 1991, Bennett et al.
propuseram que os genes das conexinas originaram-se de uma sequência, ainda
indeterminada, que poderia ter sofrido ao menos uma duplicação no início ou
imediatamente antes da evolução dos vertebrados, originando as subclasses α, β, γ.
Dessa forma, divide-se as conexinas em três subclasses, de acordo com a estrutura
do gene que as codificam (Figura 2).
Com o advento do sequenciamento genômico, 21 conexinas já foram
identificadas em mamíferos (GOODENOUGH; PAUL, 2009). Sabe-se que a família
das Cxs compreende 20 membros no camundongo e 21 membros no genoma
humano (SÖHL; WILLECKE, 2004).
Figura 2 - Família multigênica das conexinas derivadas de um provável ancestral comum
Fonte: (MESNIL; YAMASAKI, 1990) Legenda: Em detalhe: as conexinas são divididas em três subclasses (α, β e γ) de acordo com a
estrutura do gene que as codificam.
32
As conexinas são proteínas transmembranas não glicosiladas de massa
molecular aparentemente variando de 21 a 70 kDa. Suas estruturas moleculares
foram determinadas por técnicas bioquímicas realizadas a partir de frações
subcelulares ricas em junções gap. (GOODENOUGH; STOECKENIUS, 1972;
NICHOLSON et al., 1981; BEYER et al, 1987; GOODENOUGH; PAUL, 2009).
Compartilhando uma homologia comum, as Cxs são constituídas por
quatro domínios hidrofóbicos muito conservados representando cada um deles, um
segmento de membrana: M1, M2, M3 e M4, duas alças extracelulares E1 e E2 de
cerca de 20 a 30 aminoácidos, contendo cada uma três resíduos de cisteínas
invariáveis em uma sequência conservada, as extremidades amino-terminal
(aproximadamente 20 aminoácidos) e carboxi-terminal bem como as hélices que
ligam M1 a M3 (aproximadamente 40 a 60 aminoácidos), as quais são
citoplasmáticas (Figura 3).
Figura 1 - Esquerma relativo à topologia membranal de uma conexina
Fonte: (BEYER, 1993) Legenda: Em detalhe: as regiões referentes à membrana, domínio extracelular, citoplasma, porção
amino-terminal (H2N), porção carboxi-terminal (COOH), os domínios transmembrana (M1, M2, M3 e M4) e as alças extracelulares representam as sequências mais conservadas entre as diferentes conexinas. Cada alça extracelular contém três cisteínas (C) - indicadas em vermelho - que são conservadas em todas as conexinas. O domínio M3 (verde claro) tem uma característica anfipática que está diretamente relacionado com o movimento de fechamento do gap. Já os domínios citoplasmáticos (azul) correspondem às porções única em cada conexina, sendo portanto, específicas.
33
Dependendo da oligomerização das conexinas, um conexon pode ser
composto por um único tipo de conexina (homomérico) ou por diferentes tipos de
conexinas (heteromérico). Enquanto que o alinhamento de dois conexons idênticos
promove a formação de um canal intercelular homotípico, o alinhamento de dois
conexons diferentes leva à formação de um canal heterotípico. Esta diversidade tem
relevância uma vez que canais intercelulares compostos de diferentes Cxs têm
diferentes propriedades fisiológicas, incluindo estado de condutância único ou
múltiplo (GOODENOUGH; PAUL, 2009).
As conexinas são essenciais para a propagação do impulso elétrico pelo
coração e determinantes para a velocidade de condução. Sua disfunção constitui um
importante fator na gênese do ritmo cardíaco anormal, além de ser extremamente
relevante na patogênese de uma grande variedade de doenças cardíacas (JANSEN
et al., 2010; LAMBIASE; TINKER, 2014). Os miócitos cardíacos dos mamíferos
estão entre as células mais fortemente interligadas na natureza, presumivelmente
refletindo a evolução de amplas conexões intercelulares de baixa resistência para
garantir a eficiente e segura ativação elétrica do coração (SAFFITZ, 2006). No
miocárdio, as Cxs estão envolvidas na propagação do potencial de ação para
promover a contração de milhões de células em alguns décimos de segundo
(GOLDBERG et al., 2003; LIN et al., 2007).
No coração de mamíferos já foram identificadas as seguintes conexinas:
Cx26, Cx30.2, Cx31.9, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45, Cx46 e Cx50 (VELDEN et al.,
2002; SÖHL; WILLECKE, 2004; SAFFITZ, 2006; JANSEN et al., 2010; LAMBIASE;
TINKER, 2014).
A propagação do estímulo em diferentes partes do coração é determinada
pela geometria do tecido, excitabilidade das células, e extensão de Cxs. Como
apresentado na Figura 4, o padrão de expressão das Cxs se modifica ao longo do
percurso em que o feixe de Hiss se ramifica em ramos direito e esquerdo e fibras de
Purkinje. A Cx40 é expressa ao longo desta via, ao passo que a expressão de
Cx30.2 e Cx45 diminui gradualmente. Já a Cx43 parece ser expressa nas fibras de
Purkinje. A partir das fibras de Purkinje, o estímulo é transferido para os miócitos do
músculo ventricular presumivelmente por meio de canais intercelulares homotípicos
de Cx43 (KREUZBERG; WILLECKE; BUKAUSKAS, 2006).
34
Figura 2 - Esquema do coração humano ilustrando a propagação do impulso e os padrões de expressão das conexinas de acordo com a região.
Fonte: (KREUZBERG; WILLECKE; BUKAUSKAS; 2006. Tradução: SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: Em detalhe, indica-se na figura as diferentes regiões do coração e suas respectivas
velocidades de condução (expressas em m/s) e as conexinas (Cx) expressas. SA node: Nó sinusal. Atria: Átrios. AV node: Nó átrio-ventricular. AV bundle: Feixe de His. Bundle branches: Ramos do feixe de Hiss. Purkinge fibers: Fibras de Purkinge. Working myocardium: Músculo ventricular.
A conexina 43 (Cx43) destaca-se como a principal isoforma presente no
miocárdio, e está diretamente envolvida no controle da homeostasia tecidual,
crescimento, proliferação celular, diferenciação e apoptose (JANSEN et al., 2010;
CARETTE et al., 2014; LAMBIASE; TINKER, 2014). A meia vida da Cx43 varia entre
duas a cinco horas e dessa forma a comunicação intercelular depende de muitos
fatores de controle sobre a dinâmica de síntese e degradação destas proteínas
(OLORIS, 2005).
Novas oportunidades para o estudo, investigação e compreensão destas
Cxs foram possíveis devido à utilização de camundongos transgênicos, ou seja,
animais knockout para determinada conexina (SEVERS et al., 2003).
35
O estudo de animais knockout para a Cx43 demonstrou que embora a
ausência da referida conexina fosse compatível com a vida, os animais vinham a
óbito após o nascimento (REAUME et al., 1995). Posteriormente, em 2001, Gutstein
et al. fizeram importantes descobertas ao observar a redução na velocidade de
condução ventricular bem como o desenvolvimento letal de arritmia ventricular aos
dois meses de idade, indicando que esta conexina é essencial para a função de
maturação do ventrículo. Camundongos knockout para a Cx45 resultaram em morte
embrionária ao décimo dia, demonstrando assim que a expressão dessa conexina é
vital para o desenvolvimento (TAMADDON et al., 2000). Já os animais knockout para
a Cx40, entretanto, são compatíveis com a vida, uma vez que a habilidade residual
do sistema Hiss-Purkinje em suportar a condução na ausência da Cx40 é atribuída à
presença da Cx45, cuja distribuição se dá do início ao fim do sistema (COOPEN et
al., 1999).
Embora não existam estudos em animais da espécie canina que
relacionam diretamente os efeitos da CEC na expressão da Cx43 no miocárdio,
outras publicações demonstram que a Cx43 presente no tecido muscular cardíaco
pode sofrer alterações significativas. Yeh et al. (2002) investigaram a expressão nas
conexinas de cardiomiócitos durante a instituição da CEC, ou seja, antes da
restauração da perfusão espontânea. Avaliando amostras do átrio direito de 21
pacientes humanos submetidos à CEC ele concluiu que a expressão das Cxs
diminuiu durante a circulação extracorpórea. Em estudo semelhante em 16
pacientes humanos submetidos à cirurgia cardíaca, avaliou-se a expressão das
Cx40 e Cx43 em amostras de átrio direito em dois momentos distintos, quais sejam
após o início e imediatamente após o término da CEC. Os resultados indicaram que
a CEC apresenta uma significativa influência sobre a expressão da Cx43
(PAVLOVIC et al., 2006).
Outras publicações relacionado a expressão das Cxs nas doenças
cardíacas foram conduzidas. Biópsias de tecido correspondente à região ventricular
esquerda de pacientes portadores de cardiomiopatia dilatada indicaram uma
diminuição da expressão da Cx43 associada a uma grade perda da Cx na região de
disco intercalado. Na presença de cardiomiopatia hipertrófica pode ocorrer aumento
ou redução na expressão da Cx43 (FONTES et al., 2012).
Mais especificamente na espécie canina, em pacientes portadores de
cardiomiopatia dilatada verificou-se diminuição da expressão da Cx43 e com relação
36
à distribuição da Cx houve lateralização (AKAR et al., 2004; AKAR et al., 2007).
Outros pesquisadores avaliaram a cardiomiopatia isquêmica em cães e também
identificaram diminuição da expressão da Cx43 (LUKE; SAFFITZ, 1991; HUANG;
SANDUSKY; ZIPES, 1999). Em estudo semelhante, determinou-se que após uma
hora de isquemia, a expressão da Cx43 encontra-se reduzida nas áreas
correspondentes ao disco intercalar (HUANG; SANDUSKY; ZIPES, 1999).
Em publicação recente foi postulado que as Cxs são capazes de controlar
a apoptose celular por meio de três diferentes processos. Primeiro, mediando a
transferência de sinais apoptóticos entre os canais intercelulares de células
adjacentes. A segunda função é mediada pela membrana plasmática e/ou
hemicanais mitocondriais. Já o terceiro processo, mais recentemente caracterizado,
diz respeito a própria Cx. As conexinas são capazes de controlar a via apoptótica
direta e principalmente quanto associada à localização nuclear de uma proteína
aberrante, ou por meio de interações com fatores de regulação da apoptose
(CARETTE et al., 2014). Outro importante avanço no estudo das Cxs foi a
comprovação de que a introdução de Cx43, em mioblastos humanos, utilizando um
vetor não-viral altamente seguro teve um efeito positivo sobre a função do coração
pós-infarto (KOLANOWSKI et al., 2014). Outra pesquisa recente discorre sobre o
efeito epigenético na disfunção e regeneração cardíaca (CHATURVEDI; TYAGI,
2014).
Em face da importância ímpar atribuída à comunicação intercelular na
modulação dos processos patológicos e uma vez que inexistem estudos na literatura
perquirida especificando o efeito da circulação extracorpórea na expressão da Cx43
no miocárdio de cães, aventou-se a hipótese do estudo da referida proteína como
escopo desta tese. O conhecimento mais amplo em relação às funções destas
proteínas durante a instituição da CEC poderá auxiliar na elucidação das alterações
no ritmo cardíaco observadas após a aplicação da mesma.
37
3 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho teve como objetivo verificar a possibilidade da
execução da técnica de circulação extracorpórea em cães no modo aorto-bicaval,
por um período de 60 minutos seguida de 30 minutos de restauração da perfusão
espontânea, realizar análise histopatológica dos fragmentos de tecido muscular
cardíaco, avaliar a localização, a expressão da conexina 43 e a expressão de Gja1
(gene da Cx43) no miocárdio dos animais submetidos à referida técnica cirúrgica.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar a viabilidade da instalação do circuito de circulação extracorpórea no
modo aorto-bicaval, por um período de 60 minutos seguida de restauração da
perfusão espontânea durante 30 minutos
Realizar avaliação histopatológica dos fragmentos do tecido muscular
cardíaco
Localizar e marcar a conexina 43 por imunofluorescência no miocárdio
Quantificar a expressão da conexina 43 pela técnica de western blot
Quantificar a expressão de Gja1 (gene da conexina 43) pela técnica de RT-
PCR em tempo real
38
4 MATERIAL E MÉTODO
Foram utilizados 15 cães, adultos, machos e fêmeas, com idades entre 1
e 3 anos, pesando entre 10 e 15 quilogramas. Os procedimentos cirúrgicos foram
realizados junto ao centro cirúrgico do Laboratório de Cirurgia Cardiotorácica do
Departamento de Cirurgia (VCI) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
da Universidade de São Paulo (FMVZ-USP). Os animais foram submetidos a
exames físico, hematológico e bioquímico previamente à realização do presente
estudo, previamente aprovado pela CEUA da FMVZ-USP sob nº 1814/2009.
4.1 PRODECIMENTO ANESTÉSICO
Após a avaliação pré-anestésica, os animais foram pré-medicados com
cloridrato de tramadol na dose de 2 mg/Kg por via intramuscular. Decorridos 20
minutos, durante a preparação do cão na sala de pré-operatório, foram puncionadas
as duas veias cefálicas utilizando-se cateter 20G para permitir a administração de
fluidoterapia e fármacos no período perioperatório.
A indução anestésica foi efetuada por meio da administração de cetamina
associada ao midazolam nas doses de 5 mg/Kg e 0,5 mg/Kg, respectivamente, pela
via intravenosa e, então, procedeu-se a intubação orotraqueal dos animais com
sonda de diâmetro apropriado à traqueia.
A manutenção anestésica foi realizada pelo fornecimento de sevofluorano na
concentração aproximada de 2,1V% conferida por meio de analisador de gases a fim
de manter os animais entre o 2º e 3o plano de anestesia do 3º estagio de Guedel
para a realização do procedimento cirúrgico e instalação da circulação
extracorpórea. Foi estabelecida a ventilação controlada no modo pressão controlada
com pressão e frequência respiratória requeridas para manutenção da EtCO2 entre
35 e 45 mmHg.
A analgesia complementar foi realizada no período transoperatório, antes do
início do procedimento cirúrgico, com administração de bolus seguido de infusão
39
contínua de citrato de fentanil, na dose de 0,3 mcg/Kg/min utilizando-se bomba de
infusão para seringas. A paralisia muscular foi obtida com a administração de
brometo de pancurônio na dose de 0,06 mg/Kg por via intravenosa. A reversão do
bloqueio neuromuscular, ao final do procedimento, ocorreu com a administração de
neostigmine na dose de 0,05 mg/kg, por via intravenosa associado a sulfato de
atropina na dose de 0,05 mg/kg.
Na artéria femoral direita foi introduzido cateter intravenoso 22G por meio de
punção direta permitindo a coleta de sangue para mensuração de parâmetros de
hemogasometria e mensuração da pressão arterial por meio de monitor
multiparamétrico.
Uma vez que os animais se encontravam em plano de anestesia, realizou-se
a introdução através da veia jugular direita de um cateter de artéria pulmonar 7,5F
acoplado ao monitor de débito cardíaco. Para isso, os animais foram posicionados
em decúbito dorsal e procedeu-se a introdução do mesmo. O cateter foi preenchido
com solução salina previamente heparinizada, sendo o transdutor de pressão
posicionado ao nível da linha axilar média e zerado à pressão atmosférica. Após
observação da curva característica de átrio direito, procedeu-se a insuflação do
balão com 1,5 mL de ar, continuando a introdução do cateter no ventrículo direito e
artéria pulmonar. O cateter foi fixado quando observou-se o “achatamento da curva”
e, portanto a pressão de oclusão da artéria pulmonar foi considerada.
No decorrer da intervenção operatória foi realizada infusão de fluido do
tipo Ringer com lactato na dose de 5 mL/kg/hora e, no desmame da circulação
extracorpórea, de acordo com a necessidade, de dopamina na dose de 5 a 10
mcg/Kg/min quando a pressão arterial sistólica ou média apresentassem valor
inferior a 90 mmHg ou 60 mmHg, respectivamente. A dopamina era iniciada na dose
mais baixa com incrementos de 2,5 mcg/Kg/min a cada 10 minutos em animais sem
resposta.
Os parâmetros referentes à pressão arterial foram acompanhados por
meio de monitor computadorizado, bem como a temperatura, o número de
movimentos respiratórios e o padrão eletrocardiográfico. Também foram realizados
testes para se determinar os níveis séricos de eletrólitos (Na+, K+ e Ca2+ ionizado),
pH, bicarbonato e gases sanguíneos em aparelho de gasometria e tempo de
coagulação ativada.
40
4.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
Os animais foram distribuídos aleatoriamente em três grupos de cinco
cães, em cada um deles, a fim de coleta de materiais para análise antes e após a
CEC, com ou sem perfusão posterior a esta, conforme descrito ao final do capítulo.
No período correspondente a 24 horas antes do procedimento cirúrgico foi realizada
raspagem dos pelos da parede torácica, membros torácicos e face medial de
membros pélvicos. Antes da intervenção cirúrgica, os animais foram submetidos a
jejum hídrico e alimentar de seis e 12 horas, respectivamente.
Os animais foram posicionados em decúbito látero-lateral esquerdo e
após a indução anestésica e intubação orotraqueal procedeu-se à colocação da
placa do eletrocautério na região do gradil costal esquerdo. Após a antissepsia e
colocação dos campos, o acesso cirúrgico à cavidade torácica foi realizado por meio
de toracotomia intercostal direita convencional ao nível do 4º espaço intercostal
(sempre considerando o mínimo uso do eletrocautério e trauma tecidual) com a
dissecção dos planos musculares até a exposição da pleura. Após a incisão desta,
foi visibilizado o coração, procedendo-se, então, a abertura longitudinal do
pericárdio, ventralmente ao nervo frênico, e posterior confecção de berço pericárdico
com fio de algodão 2-0 (Figura 5).
Figura 3 - Imagem fotográfica do acesso cirúrgico ao nível do 4º espaço intercostal direito
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: Acesso cirúrgico. 5A: em detalhe, região de pulmão direito (P) e região do coração (C).
5B: Ao se rebater o lobo caudal do pulmão direito (P), previamente à abertura longitudinal do pericárdio, foi possível a visualização da veia cava cranial (VCCr), nervo frênico (NFr) e do coração (C).
41
O circuito de CEC foi instalado no modo aorto-bicaval. A canulação
aórtica foi realizada com cânula arterial de tamanho 10 ou 12, com sutura em bolsa
de tabaco com fio polipropilene 4.0 ou 5.0, cânula esta que trouxe sangue oxigenado
da máquina de circulação extracorpórea de volta ao sistema arterial do animal. As
veias cava cranial e caudal foram canuladas com sutura em bolsa de polipropilene
4.0 ou 5.0, visando a prepará-las para receber cânula de drenagem de tamanho ¼
de polegada para a máquina de CEC (KWASNICKA, 2003) (Figura 6).
Figura 4 - Imagem fotográfica referente à sutura em bolsa de tabaco dom fio polipropilene 4.0 ou 5.0 realizada na artéria aorta e na veia cava cranial
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: As setas amarelas indicam a delimitação da sutura em bolsa de polipropilene 4.0 ou 5.0
na artéria aorta (Ao) enquanto que as setas brancas indicam a delimitação da sutura em bolsa de polipropilene na veia cava cranial (VCCr). É possível visualizar parte do pulmão direito (P). Nota-se que embora nesta imagem não tenha sido identificada a veia cava caudal, a bolsa de polipropilene foi feita do mesmo modo como descrito para a VCCr.
Previamente à realização das canulações, tanto a cânula arterial quanto
as cânulas venosas foram referenciadas com fio algodão visando ao posicionamento
preciso nos vasos no momento da fixação, sendo para a artéria aorta nunca superior
a 10mm (Figuras 7 e 8).
O anticoagulante utilizado foi a heparina sódica na dose de 200UI/kg
(meia dose) com posterior determinação de dose adicional, sendo administrado
diretamente em uma das veias cefálicas já previamente com cateter, de forma a se
manter o tempo de coagulação ativado acima de 480 segundos (KWASNICKA,
2003).
42
Figura 5 - Imagens fotográficas referente à cânula arterial sendo referenciada com fio algodão
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: Cânula arterial sendo referenciada: 7A: início do nó (ponto de referência) com fio
algodão. 7B: correto posicionamento do nó na ponteira da cânula. 7C: término do referenciamento. As setas indicam o local em que foi realizado o ponto de referência na cânula arterial.
Figura 6 - Imagens fotográficas referente à cânula venosa sendo referenciada com fio algodão
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: Cânula venosa sendo referenciada: 8A: início do nó (ponto de referência) com fio
algodão e correto posicionamento na ponteira da cânula. 8B: término do referenciamento. As setas indicam o local em que foi realizado o ponto de referência na cânula venosa.
Após a heparinização do animal procedeu-se à introdução e fixação da
cânula arterial na artéria aorta (Figuras 9 e 10).
43
Figura 7 - Imagem fotográfica referente à canulação arterial imediatamente antes da incisão da artéria aorta com bisturi para posterior introdução da cânula arterial
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: As setas indicam a delimitação da sutura em bolsa de polipropilene na artéria aorta (Ao),
local em que foi realizada a incisão (perpendicular ao vaso), seguida da introdução da cânula arterial até o ponto em que a mesma foi referenciada com fio algodão.
Figura 8 - Imagem fotográfica referente à canulação arterial seguida de fixação
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: As setas amarelas indicam o local em que foi realizada a incisão com bisturi e posterior
introdução da cânula arterial (ca) na artéria aorta (Ao). 10A: imediatamente após a introdução da cânula no vaso (até o ponto de referenciamento). 10B: início da fixação da cânula. 10C: término da fixação da cânula com fio de polipropilene 4.0 ou 5.0 (seta azul). Nota-se no corpo e extremidade distal da cânula a presença de sangue e ar uma vez que o tubo (linha arterial) ainda não havia sido conectado à cânula. Posteriormente o ar foi retirado para se evitar a entrada do mesmo no leito vascular do animal.
44
Após a canulação da artéria aorta o cirurgião conectou a linha arterial à
cânula arterial, manobra esta realizada em conjunto com o perfusionista, de modo a
impedir a entrada de ar no leito vascular. Neste momento, o perfusionista manteve
pressão positiva na linha arterial (KWASNICKA, 2003).
Conforme mencionado anteriormente, uma vez que o circuito de CEC foi
instalado no modo aorto-bicaval, para a canulação das veias cavas cranial e caudal
foram utilizadas duas cânulas venosas. Após a canulação das cavas, o cirurgião
cortou o tubo da linha das cavas no comprimento necessário para ficar o mais justo
possível e procedeu à conexão da linha venosa às cânulas (KWASNICKA, 2003).
A figura 11 indica o início da canulação venosa (introdução e fixação da
cânula venosa na veia cava cranial) enquanto que a figura 12 apresenta a artéria
aorta e as veias cavas cranial e caudal canuladas. Neste momento as cânulas já
estavam conectas às suas respectivas linhas e o sistema já estava pronto para a
entrada em CEC.
Figura 9 - Imagem fotográfica referente à canulação da veia cava cranial imediatamente após a introdução da cânula venosa e antes da fixação da cânula com fio de polipropilene 4.0 ou 5.0. Em ca de cânula arterial proveniente da artéria aorta
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: As setas brancas indicam a delimitação da sutura em bolsa de polipropilene 4.0 ou 5.0
na veia cava cranial (VCCr), local em que foi realizada a incisão com bisturi, seguida da introdução da cânula venosa (cv) até o ponto em que a mesma foi referenciada com fio algodão (seta azul). É possível ver na imagem a cânula arterial (ca) já canulada e fixada.
45
Figura 10 - Imagem fotográfica referente à canulação da artéria aorta e das veias cavas cranial e caudal e fixação com fio de polipropilene 4.0 ou 5.0
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: Em detalhe, artéria aorta (Ao), veia cava cranial (VCCr), veia cava caudal (VCCd),
coração (C). Tanto a cânula arterial (ca) quanto as cânulas venosas (cv) foram fixadas com fio de polipropilene 4.0 ou 5.0. Os lobos pulmonares foram afastados cuidadosamente com o auxílio de gaze para a realização da imagem fotográfica.
A CEC foi realizada por meio de um aparelho do tipo roller pump com
oxigenador de membranas2 (Figura 13).
Figura 11 - Imagem fotográfica referente à máquina de CEC Modelo ECO 01 - Braile Biomédica
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: Em detalhe, montagem e preparo da máquina de CEC.
2 Modelo ECO 01 - Braile Biomédica
®
46
O circuito da máquina de CEC foi preenchido com fluido do tipo ringer
com lactato. O fluxo inicial da bomba foi de 150 a 180mL/kg/minuto, ajustado, a
seguir, de modo a manter a pressão arterial média acima de 60mmHg, com os
animais mantidos, sempre que possível, em normotermia (38ºC) (KWASNICKA,
2003).
Objetivando a proteção miocárdica, realizou-se o clampeamento aórtico e
a solução cardioplégica cristalóide resfriada foi administrada por via anterógrada,
mediante a introdução de um cateter na raiz da aorta, para a infusão da solução. A
dose de indução foi de 20 mL/kg e posteriormente a cardioplegia foi repetida em
intervalos de 20 minutos, na dose de manutenção de 10 mL/kg.
Após 60 minutos de duração do procedimento de CEC, esta foi
interrompida. O volume residual existente no reservatório venoso da bomba de
circulação extracorpórea foi reinfundido no animal conforme se observava
hipotensão por baixa volemia. Após 30 minutos do desmame da circulação
extracorpórea, de acordo com princípios éticos e de bem estar animal a anestesia foi
aprofundada e imediatamente foi administrado cloreto de potássio intravenoso para
a eutanásia dos animais, não retornando os mesmos ao estado de consciência.
Após biópsia do tecido muscular cardíaco, o fragmento coletado foi
devidamente identificado de acordo com a região do coração (atrial, ventricular ou
septo) e o respectivo animal e grupo. Parte dos fragmentos coletados foi colocada
em solução de fixação em formalina a 10%, por 24 horas. Em seguida, os
fragmentos foram incluídos em parafina para a realização de análise histopatológica
e de imunofluorescência.
Para realização da análise por western blot e RT-PCR em tempo real, a
outra parte dos fragmentos coletados foi inserida no interior de tubos de
microcentrifuga de 1,5mL (devidamente identificados) e em seguida imediatamente
imersa em nitrogênio líquido para posterior acondicionamento em freezer a -80ºC.
Tal procedimento de coleta é fundamental para a manutenção tanto das proteínas
quanto do RNA presentes no tecido.
47
4.3 MOMENTOS DA AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS
As avaliações propostas foram feitas em três diferentes momentos:
Momento 0 (T0): no início da circulação extracorpórea, definido como
controle - GRUPO C
Momento 1 (T1): após 60 minutos de duração do procedimento de
circulação extracorpórea - GRUPO CEC-1
Momento 2 (T2): após 60 minutos de duração do procedimento de
circulação extracorpórea seguidos de 30 minutos de
restauração da perfusão espontânea - GRUPO CEC-2
4.4 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS
As técnicas de biologia molecular (imunofluorescência, western blot e RT-
PCR em tempo real) utilizadas para o estudo da imuno-localização, quantificação e
expressão da Cx43 no miocárdio foram desenvolvidas junto ao Laboratório de
Oncologia Experimental do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, sob responsabilidade da
Profª Drª Maria Lúcia Zaidan Dagli.
48
4.4.1 Histopatologia do tecido muscular cardíaco
Os fragmentos de tecido muscular cardíaco foram coletados nos
momentos da avaliação dos parâmetros indicados anteriormente no ítem 4.3, sendo
então colocados em recipientes individualizados contendo solução de fixação em
formalina a 10%, por 24 horas (todos os recipientes foram identificados de acordo
com a respectiva região a ser analisada).
Em seguida, procedeu-se ao processamento de inclusão em parafina, e
após o corte, confecção de lâminas histológicas e coloração de Hematoxilina e
Eosina (H&E).
As lâminas foram observadas ao microscópio óptico3 e analisadas por
médico veterinário experiente em patologia animal. Com o objetivo de se evitar viés
nesta avaliação histopatológica, um único profissional analisou individualmente
todas as lâminas, anotando a presença ou ausência de alterações e/ou lesões. O
referido profissional não foi informado sobre o grupo ao qual o animal pertencia,
tendo conhecimento apenas da identificação do animal e a região a qual
correspondia o fragmento do tecido muscular cardíaco utilizado para a confecção da
lâmina histológica (átrios direito ou esquerdo, ventrículos direito ou esquerdo e
septo).
Para documentação da análise histopatológica, procedeu-se à realização
de fotomicrografias.
As lesões nos vasos sanguíneos foram classificadas segundo a sua
importância em:
- discreta 01 a 30% da extensão total do corte transversal apresentava lesões
- moderada 30 a 70% da extensão total do corte transversal apresentava lesões
- intensa 70 a 100 % da extensão total do corte transversal apresentava
lesões
3 Nikon E-800
49
4.4.2 Imunofluorescência para a conexina 43
Os fragmentos de tecido muscular cardíaco foram coletados nos
momentos da avaliação dos parâmetros indicados anteriormente no ítem 4.3, sendo
então colocados em recipientes individualizados contendo solução de fixação em
formalina a 10%, por 24 horas (todos os recipientes foram identificados de acordo
com a respectiva região a ser analisada). Seguiu-se então com o processamento de
inclusão em parafina, e após o corte, confecção de lâminas silanizadas.
Inicialmente as seções foram desparafinizadas em xilol e hidratadas em
diferentes concentrações de etanol, quais sejam absoluto, 95% e 70% e em seguida
água destilada.
O desmascaramento antigênico foi realizado em tampão Tris-EDTA (pH
9,0) durante 20 minutos em forno de microondas na potência máxima, observando-
se a cada cinco minutos a eventual diminuição da solução por evaporação e, neste
caso, completando-se para o volume inicial. Após o completo resfriamento em
temperatura ambiente, as lâminas foram lavadas em solução de PBS 1X (acrescido
de 500 µl de tween 20) durante cinco minutos, por três vezes.
O bloqueio de reações inespecíficas foi realizado em solução de skin milk
5% durante uma hora. Em seguida, procedeu-se à incubação das lâminas com o
anticorpo primário.
Para a marcação da Cx43 foi utilizado o anticorpo primário4 Rabbit anti-
Connexin 43 diluído em PBS (concentração 1:500), sendo as lâminas incubadas em
câmara úmida, durante uma noite, a 4ºC (100 a 200 µl por lâmina).
Pela manhã, as lâminas foram lavadas em PBS 1X (acrescido de 500 µl
de tween 20) durante cinco minutos, por três vezes e em seguida incubadas com
anticorpo secundário5 policlonal Swine anti-Rabbit diluído em PBS (concentração
1:200), durante uma hora.
Após lavagem das lâminas em solução de PBS 1X (acrescido de 500 µl
de tween 20) durante cinco minutos, por três vezes, seguiu-se à incubação com
iodeto de propídeo diluído em PBS (concentração 1:1000) durante dez minutos em
4 Sigma
®
5 Dako
®
50
câmara escura, para marcação nuclear (100 a 200 µl por lâmina). Em seguida,
realizou-se novamente a lavagem das lâminas em solução de PBS 1X (acrescido de
500 µl de tween 20) durante cinco minutos, por três vezes.
As lâminas foram montadas com 10 µl por lâmina de Vectashield6 e
lamínula. Para se evitar o esgotamento da fluorescência, as lâminas foram vedadas
com esmalte e armazenadas no escuro e na geladeira.
Por fim, as lâminas foram analisadas e fotografadas em microscópio7
equipado com sistema de fluorescência e fotomicrografia.
4.4.3 Western blot para a conexina 43
A técnica de western blot consiste em um método para a detecção da
proteína de interesse baseado em extração, eletroforese, transferência e
identificação por meio de anticorpos específicos e sistema de revelação.
Inicialmente foi realizado a extração de proteínas. Os fragmentos de
tecido muscular cardíaco correspondentes às amostras dos animais, previamente
armazenados em freezer à -80C, foram separados em tubos de vidro estéreis e
autoclavados, devidamente identificados de acordo com o animal e a região do
coração correspondente à amostra de tecido. Adicionou-se 400 µL da solução 2x
Sample Buffer e inibidor de protease em cada tubo. Em seguida os tubos foram
colocados no gelo.
Colocou-se uma amostra de 50 mg de tecido muscular cardíaco em cada
tubo correspondente, não ultrapassando este peso. O tecido foi triturado com
sonicador8 na pulsação máxima, evitando que ocorresse aquecimento. Em seguida,
adicionou-se 400 µL de 1x working solution em cada amostra triturada, submetendo-
as novamente ao sonicador. Com o objetivo de se evitar contaminações, foram
utilizadas sondas individuais para cada amostra.
6 Vector Laboratories
7 Nikon E-800
8 TissueRuptor - Qiagen
®
51
Após a sonicação, os conteúdos referentes às amostras trituradas foram
transferidos para tubos9 de microcentrifuga de 1,5 mL devidamente identificados e
mantidos no gelo. As amostras foram centrifugadas durante 15 minutos, a 13.000
rpm e 4ºC. Por fim, os sobrenadantes foram transferidos para outros tubos de
microcentrifuga de 1,5 mL, devidamente identificados, e armazenados no freezer à
-80ºC.
Para a quantificação de proteínas, as amostras foram previamente
descongeladas sobre o gelo. Em seguida, procedeu-se a padronização da curva de
albumina, utilizando um tubo de microcentrifuga com 100 µl de albumina
previamente diluída acrescido de 900 µl de água destilada em tudo de
microcentrifuga de 1,5 ml, sendo mantido no gelo. As proteínas foram diluídas em
tubos de microcentrifuga de 0,2 mL, sendo 5 µl de cada amostra acrescidos de 95 µl
de água destilada (1:20) e mantidas no gelo. Foi realizada também a diluição de
1mL de Bradford em 4 ml de água destilada (1:5), sendo mantido no gelo.
Em seguida, colocou-se 990 µl de Bradford diluído (1:5) em todos os
tubos de vidro e acrescentou-se 10 µl de amostra de proteína diluída (1:20). As
amostras foram homogeneizadas cuidadosamente, evitando-se a formação de
bolhas.
A leitura (quantificação) foi realizada no espectrofotômetro10 a 595 nm,
utilizando-se uma cubeta de quartzo. A primeira etapa constituiu na realização da
curva de padronização com a albumina. Após higienização da cubeta com álcool,
procedeu-se à quantificação das amostras, anotando-se o valor da absorbância,
respectivamente para cada amostra. Por fim, determinaram-se os valores da diluição
de cada amostra, em µg/µl.
Antes de se proceder à corrida, as proteínas foram inicialmente diluídas
utilizando-se loading buffer (azul de bromofenol) e working solution. Posteriormente,
foram submetidas à desnaturação proteica, durante 10 minutos à 95ºC, no
termociclador11.
9 Eppendorf
®
10 BioPhotometer - Eppendorf
®
11 Mastercycler gradient - Eppendorf
®
52
Após a desnaturação, as proteínas submetidas à eletroforese num gel de
poliacrilamida (4 x 12% Bis Tris Plus)12 em recipiente de corrida13, contendo tampão
de corrida, num campo elétrico de 165 V, durante uma hora (Figura 14).
Figura 12 - Imagem fotográfica referente à eletroforese em gel das proteínas
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: A imagem refere-se à eletroforese num gel em recipiente de corrida Bolt Mini Gel Tank -
Life Technologies®, contendo tampão de corrida. As setas indicam a posição do
marcador de peso molecular em ambos os géis.
O marcador de peso molecular (MPM) utilizado foi o Plus2 Prestained
Standard14 (1X). O referido gel possuía 15 poços, sendo que o primeiro foi utilizado
para o MPM e os demais para as amostras referente aos grupos Controle, CEC-1 e
CEC-2.
O mesmo padrão foi mantido para todas as eletroforeses que foram
realizadas (Figura 15).
12
Bolt®
13 Bolt Mini Gel Tank - Life Technologies
®
14 See Blue
®
53
Figura 13 - Esquema indicando a colocação das amostras nos poços do gel Bolt®
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: No primeiro poço à esquerda foi colocado o marcador de peso molecular (MPM). Em
seguida, amostras dos respectivos grupos (Controle, CEC-1 e CEC-2)
Enquanto ocorria a eletroforese em gel foi preparada a transferência das
proteínas para membrana adsorvente, a qual foi realizada em aparelho específico15.
Para tanto, preparou-se duas cubas com água deionizada (MiliQ), uma cuba com
TTBS 1 e uma cuba com corante Comassie Blue.
Finalizada a eletroforese, o sistema foi desmontado e os géis foram
colocados em uma das cubas contendo água deionizada. A membrana16 foi
encaixada no interior da superfície de transferência e em seguida colocou-se os géis
sobre a membrana cuidadosamente para se evitar a formação de bolhas.
Posteriormente, o papel filtro17 foi umedecido na outra cuba contendo água
deionizada e após remoção do excesso de água, o mesmo foi colocado sobre os
géis. Por fim colocou-se a outra membrana18. Finalizada a montagem, o aparelho foi
ligado em corrente elétrica por um período correspondente a sete minutos.
Após a transferência o sistema foi desmontado, os géis foram colocados
na cuba contendo Comassie Blue e as membranas mergulhadas na cuba contendo
TTBS.
Em seguida, o bloqueio de reações inespecíficas nas membranas foi
realizado com solução de skin milk 5%, diluído em TTBS, durante uma hora em
temperatura ambiente e sob leve agitação. Os géis foram corados em solução de
15
iBlot DryBlotting Sustem - Invitrogen®
16 iBlot Anode Stack
17 iBlot Filter Paper
18 iBlot Cathode Stack
54
Comassie Blue durante 10 minutos sob agitação suave e constante e em seguida
descorados em solução de Destain solution por 50 minutos. Após a remoção desta
solução, os géis foram deixados em uma cuba com água destilada durante uma
noite.
Para a marcação da Cx43 foi utilizado anticorpo primário19 Rabbit anti-
Connexin 43 diluído em solução de TTBS contendo 5% de skin milk, na proporção
de 1:500. As membranas foram incubadas com o referido anticorpo durante uma
noite, a 4ºC, sob agitação suave, em recipiente vedado e refrigerado.
Pela manhã, após três lavagens seguidas com TTBS 1x as membranas
foram incubadas com anticorpo secundário20 Polyclonal Swine anti-Rabbit diluído em
PBS (concentração 1:1000), durante uma hora sob agitação suave e em
temperatura ambiente. As membranas foram submetidas a mais três lavagens
seguidas com TTBS 1x.
Para a revelação foi utilizado o Kit ECL de quimioluminescência21,
misturando na proporção (1:1) os dois reagentes de revelação em e colocando-o
sobre as membranas. Este procedimento foi realizado em câmera escura e com o
uso do programa ImageQuant.
Para normalização da técnica utilizou-se como controle endógeno a
proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Após revelação da Cx43
as membranas foram submetidas novamente três lavagens seguidas com TTBS 1x e
em seguida, o bloqueio de reações inespecíficas nas membranas foi realizado com
solução de skin milk 5%, diluído em TTBS, durante uma hora em temperatura
ambiente e sob leve agitação.
Para a marcação do GAPDH foi utilizado anticorpo primário22 monoclonal
Mouse anti-GAPDH diluído em solução de TTBS contendo 5% de skin milk, na
proporção de 1:2000. As membranas foram incubadas com o referido anticorpo
durante uma noite, a 4ºC, sob agitação suave, em recipiente vedado e refrigerado.
Pela manhã, após três lavagens seguidas com TTBS 1x as membranas
foram incubadas com anticorpo secundário23 Polyclonal anti-Mouse diluído em PBS
(concentração 1:10.000), durante uma hora sob agitação suave e em temperatura
19
Sigma®
20 Dako
®
21 GE Healthcare
®
22 Abcam
®
23 Abcam
®
55
ambiente. Em seguida as membranas foram submetidas a mais três lavagens
seguidas com TTBS 1x.
Para a revelação também foi utilizado o Kit ECL de quimioluminescência24
conforme descrito anteriormente. Este procedimento foi realizado em câmera escura
e com o uso do programa ImageQuant.
Após a realização do western blot procedeu-se à análise densitométrica
das bandas referentes à proteína de interesse (Cx43) e das bandas correspondentes
ao GAPDH com o objetivo de se analisar a expressão relativa da Cx43. Para a
análise densitométrica utilizou-se o programa ImageJ.
As membranas secaram sobre uma folha de papel sulfite e em seguida
foram escaneadas, juntamente com os géis, para posterior documentação.
4.4.4 Determinação da expressão do mRNA correspondente ao Gja1 (gene da
conexina 43) utilizando a técnica de RT-PCR em tempo real
A expressão do mRNA foi determinada pelo método semi-quantitativo (LI;
WANG, 2000) e o RNA celular total foi isolado de amostras de miocárdio utilizando-
se o reagente Trizol.
As amostras foram retiradas do freezer -80ºC e mantidas em recipiente
contendo nitrogênio líquido para que o RNA não fosse degradado. Foi colocado 70
mg de tecido de miocárdio de cada amostra analisada em tubos de microcentrifuga
de 1,5 mL RNase free e adicionou-se 500 µl de trizol em cada tubo, triturando-se o
tecido com o sonicador25 na pulsação máxima, com o devido cuidado para evitar que
ocorresse aquecimento, e mantendo no gelo. Após a trituração foi adicionado 500 µl
de trizol até completar o volume de 1mL para cada tudo e em seguida promoveu
suave homogeneização.
As amostras foram incubadas durante cinco minutos em temperatura
ambiente. Em seguida, os tubos foram centrifugados durante cinco minutos, a
13.000 rpm a quatro graus Celsius. Enquanto ocorria a centrifugação foram
24
GE Healthcare®
25 TissueRuptor - Qiagen
®
56
identificados outros tubos de microcentrifuga de 1,5 mL RNase free e adicionou-se
100 µl de clorofórmio em cada tubo.
Terminada a centrifugação, o conteúdo dos tubos foi transferido para os
tubos contendo clorofórmio, procedeu-se à suave homogeneização e em seguida à
incubação durante dois minutos em temperatura ambiente. Centrifugou-se durante
15 minutos a 13.000 rpm a 4ºC. Em seguida, o sobrenadante foi transferido para
novos tubos de microcentrifuga de 1,5 mL RNase free, devidamente identificados,
contendo 500 µl de isopropanol gelado.
Após suave homogeneização, procedeu-se à incubação por 15 minutos
em temperatura ambiente, e em seguida à centrifugação durante 10 minutos a
13.000 rpm a 4ºC e posteriormente o sobrenadante foi desprezado. Adicionou-se
500 µl de etanol 70% tratado com DEPC gelado. Após homogeneização dos tudos,
centrifugou-se durante cinco minutos a 12.000 rpm a 4ºC. Após a centrifugação, o
sobrenadante foi desprezado. Repetiu-se o processo de adição de 500 µl de etanol
70% tratado com DEPC gelado, homogeneização e centrifugação, desprezando-se
novamente o sobrenadante. Procedeu-se então à secagem do pelet, que em
seguida foi ressuspendido em 50 µl de água ultra-pura. Cada tubo foi suavemente
homogeneizado e em seguida submetido ao banho maria, à temperatura entre 55ºC
e 65ºC, por um período de dez minutos. Em seguida as amostras foram mantidas
em freezer -80ºC.
O RNA de cada amostra foi quantificado no aparelho Nanodrop. O
TaqMan probe utilizado foi o TaqMan® Fast Advanced Master Mix26. O TaqMan
probe é marcado com um corante fluorescente reporter, FAM (6-
carboxifluoresceína), na posição 5’ final e um corante fluorescente quencher TAMRA
(6-carboxi-tetrametil-rodamina) na posição 3’ final. A especificidade do primer foi
testada sobre condições de PCR normal no próprio termociclador do TaqMan PCR
quantitativo.
As reações de transcrição reversa foram realizadas para cada amostra de
RNA em tubos de reação MicroAmp utilizando o reagente TaqMan de transcrição
reversa.
Cada tubo de reação contém 3 g de RNA total num volume de 40 l
contendo tampão TaqMan RT 1X, MgCl2 5,5 mM, 500 M de cada dNTP, 2,5 M de
26
Applied Biosystems
57
oligo-d(T)16 primers, inibidor de RNAse 0,4 U/l e 1,25 U/l de MultiScribe Reverse
Transcriptase. A reação de RT foi realizada à 25C por 10 minutos, 48C por 30
minutos e 95C por 5 minutos. A mistura de reação para a RT foi mantida à 4C para
uso imediato da amplificação do PCR, ou estocada à -20C para uso posterior.
O princípio da detecção do TaqMan em tempo real é baseado na análise
da liberação do composto fluorogênico através da ação 5’ nuclease (LIVAK et al.,
1995; GIBSON et al., 1996; HELD et al., 1996). Uma DNA polimerase termoestável,
a AmpliTaq Gold, é utilizada para a amplificação do PCR em tempo real numa placa
com 96 poços. Cada poço contém 4l de cada produto de PCR (300ng de RNA
total), Tampão A TaqMan 1X, MgCL2 5,5 mM, 200 M de dATP/dCTP/dGTP, 400 M
dUTP, 200 nM dos primers (senso e antisenso), 100 nM dos probes TaqMan,
0,01U/ml de AmpErase e 0,025 U/l da DNA polimerase AmpliTaq Gold em um
volume total de 50 l.
Cada poço foi fechado com tampas MicroAmp Optical27, seguido da
completa mistura dos reagentes. Neste estudo as condições de amplificação
utilizadas são: 2 minutos a 50C, 10 minutos a 95C e corridos em 40 ciclos por 15
segundos a 95ºC e 60C por 1 minuto. Todas as reações foram realizadas em um
Gene Amp 7000 Sequence Detection System28 para as amostras analisadas, as
quais foram corridas em duplicata, utilizando um programa de detecção Sequence
Detector V 1.6. O Rn e Ct são médias de valores obtidos em cada reação. A curva
padrão foi construída plotando os Ct vs. a concentração de cDNA. O número
absoluto de cópias dos mRNA das conexinas em cada amostra, foi calculado com
base nos seus valores de Ct. O número absoluto de cópias do mRNA das conexinas
foi normalizado ao do 18S para minimizar a variabilidade nos resultados devido a
diferenças na eficiência do RT e na integridade do RNA entre as amostras testadas.
Os resultados foram calculados de acordo com os cálculos de quantificação relativa
utilizando o 2-CT (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001).
Para quantificação da expressão do gene da Cx43 utilizou-se o assay
cf02625164_g1 e para a normalização da reação utilizou-se o assay 18S
mm03928990_g1 como controle endógeno.
27
Applied Biosystems
28 Applied Biosystems
58
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados provenientes da análise pela técnica de western blot foram
analisados com o Software R versão 3.0.2 (The R Foundation for Statistical
Computing) com o teste estatístico de Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn para uma
significância de 5%.
Os dados provenientes da análise pela técnica de RT-PCR em tempo real
foram analisados com o programa MiniTab v.14 utilizando ANOVA. Diferenças
significativas foram consideradas a partir de p<0,05.
59
5 RESULTADOS
5.1 AVALIAÇÃO DA CANULAÇÃO DA AORTA E INSTALAÇÃO DO CIRCUITO DE
CEC NO MODO AORTO-BICAVAL
A canulação da aorta para instalação da linha arterial foi realizada sem
qualquer intercorrência relacionada à ruptura ou hemorragia durante a CEC.
Em relação à canulação venosa (veias cava cranial e caudal) também não
foi identificado qualquer intercorrência relacionada à ruptura ou hemorragia no local
de inserção da cânula.
Tanto a cânula arterial quanto as cânulas venosas utilizadas neste estudo
mostraram-se satisfatórias.
A documentação fotográfica foi apresentada anterioremente no ítem 4.2
PROCEDIMENTO CIRÚRGICO e descreve as etapas realizadas para a canulação,
tanto da aorta quanto das cavas cranial e caudal.
5.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO TECIDO MUSCULAR CARDÍACO
Realizada a avaliação histopatológica do tecido muscular cardíaco, nos
animais pertencentes ao grupo Controle não foram observadas lesões nos vasos
analisados, tanto na região dos átrios, como em ventrículos ou no septo analisados.
Nos animais do Grupo CEC-1, tampouco constatou-se modificações. Contudo,
observou-se que apenas os animais do grupo CEC-2, vale dizer, aqueles
submetidos à circulação extracorpórea de 60 minutos seguida de restauração da
perfusão espontânea por 30 minutos, apresentaram lesões compatíveis com
vacuolização na túnica média de artérias de pequeno calibre do miocárdio, de grau
discreto, moderado ou intenso (Figuras 16 a 28).
60
Figura 14 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (átrio direito) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos
Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Figura 15 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (ventrículo direito) de
animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos
Fonte: (SANCHES, D. S., 2013)
61
Figura 16 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (átrio esquerdo) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos
Fonte: (SANCHES, D. S., 2013)
Figura 17 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (ventrículo esquerdo) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos
Fonte: (SANCHES, D. S., 2013)
62
Figura 18 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (septo) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos
Fonte: (SANCHES, D. S., 2013)
Figura 19 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal do grupo Controle
Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: A seta indica o vaso sanguíneo sem alterações e a letra L indica o lúmen do vaso.
L
63
Figura 20 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal do grupo controle
Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: A seta indica o vaso sanguíneo sem alterações e a letra L indica o lúmen do vaso. Figura 21 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a
CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) discreta
Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda Considera-se discreto o aparecimento de vacúolos em 01 a 30% da extensão total do
corte histológico transversal do vaso.
L
L
64
Figura 22 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) discreta
Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: Considera-se discreto o aparecimento de vacúolos em aproximadamente 01 a 30% da
extensão total do corte histológico transversal do vaso. Figura 23 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a
CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) moderada
Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: Considera-se moderado o aparecimento de vacúolos em aproximadamente 30 a 70% da
extensão total do corte histológico transversal do vaso.
65
Figura 24 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) moderada
Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: Considera-se moderado o aparecimento de vacúolos em aproximadamente 30 a 70% da
extensão total do corte histológico transversal do vaso. Figura 25 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a
CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) intensa
Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: Considera-se intenso o aparecimento de vacúolos em aproximadamente 70 a 100% da
extensão total do corte histológico transversal do vaso.
66
Figura 26 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) intensa
Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: Considera-se intenso o aparecimento de vacúolos em aproximadamente 70 a 100% da
extensão total do corte histológico transversal do vaso.
5.3 IMUNO-LOCALIZAÇÃO DA CONEXINA 43 (IMUNOFLUORESCÊNCIA)
Observou-se que no miocárdio dos animais de todos os grupos a
conexina 43 esteve presente na membrana citoplasmática, pois esta proteína é
responsável pela composição das junções intercelulares do tipo gap. A marcação
em verde corresponde à positividade para a Cx43 enquanto que os núcleos das
células apresentam-se puntiformes e marcados em vermelho pelo iodeto de
propídeo.
As fotomicrografias foram obtidas em microscópio equipado com sistema
de fluorescência29.
Mediante a análise das fotomicrografias da imunofluorescência, apesar da
29
Nikon E-800
67
marcação da Cx43 ter sido identificada em todos as regiões dos três grupos,
verificou-se aparentemente que:
no miocárdio dos animais do grupo CEC-1 houve uma marcação menos
intensa da Cx43 em relação aos animais dos grupos Controle e CEC-2,
principalmente nas regiões correspondentes aos átrios direito e esquerdo.
no miocárdio dos animais do grupo CEC-2 houve uma marcação mais intensa
em relação aos animais do grupo CEC-1, principalmente nas regiões
correspondentes aos ventrículos direito e esquerdo e septo.
a marcação da Cx43 nos animais do grupo CEC-2 nas regiões de ventrículos
direito e esquerdo foi semelhante quando comparada à marcação da Cx43
nas correspondentes regiões dos animais do grupo Controle
a marcação da Cx43 nos animais do grupo CEC-2 na região de septo foi
discretamente mais intensa quando comparada à marcação da Cx43
observada nas correspondentes regiões dos animais do grupo Controle
A seguir apresenta-se fotomicrografias referentes à imunofluorescência
da Cx43 no tecido muscular cardíaco (Figuras 29 a 39).
68
Figura 27 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (átrio direito) de animal do grupo Controle
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos
estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.
Figura 28 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo Controle
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos
estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.
69
Figura 29 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (átrio esquerdo) de animal do grupo Controle
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos estão
marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.
Figura 30 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo esquerdo) de animal do grupo Controle
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos estão
marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.
70
Figura 31 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (septo transverso) de animal do grupo Controle
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos
estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.
Figura 32 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (átrio direito) de animal do grupo CEC-1
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos
estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 40X.
71
Figura 33 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo CEC-1
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos
estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.
Figura 34 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo CEC-2
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos
estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.
72
Figura 35 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo esquerdo) de animal do grupo CEC-2
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos
estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.
Figura 36 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (septo transverso) de animal do grupo CEC-2
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos
estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.
73
Figura 37 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência (controle negativo da reação) de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo Controle
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: Controle negativo da reação. Os núcleos estão marcados pelo iodeto de propídeo.
Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.
5.4 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA CONEXINA 43 (WESTERN BLOT)
A Cx43 apresentou marcação em todas as regiões analisadas de todos os
grupos, quais sejam átrios direito e esquerdo, ventrículo direito e esquerdo e septo
interventricular. A marcação foi identificada de acordo com a altura correspondente
ao marcador de peso molecular utilizado nas reações.
A seguir apresenta-se a membrana identificando as bandas
correspondentes à região de septo transverso dos animais analisados, tanto para a
Cx43 quanto para o GAPDH (Figura 40).
74
Figura 38 - Esquema referente à membrana (região septo transverso) após revelação
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: No primeiro poço à esquerda foi colocado o marcador de peso molecular (MPM). Em
seguida, amostras dos respectivos grupos (Controle, CEC-1 e CEC-2). Cx43: conexina 43. GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (controle endógeno).
Observou-se que houve diferença estatisticamente significante entre os
grupos no átrio esquerdo (p=0,0401) e no ventrículo direito (p=0,0459). O pós-teste
de Dunn identificou que os grupos que diferiam entre si, para ambas regiões, foram
os grupos Controles e os CEC-2 (átrio esquerdo, p= 0,0056; ventrículo direito. p=
0,0066).
Evidencia-se pelos boxplots (Figura 41) que há uma dispersão do valor
muito maior no grupo controle (diferença interquartis) do que no CEC-2, sendo que,
no átrio esquerdo os valores de CEC-2 foram muito maiores em relação ao Controle.
Já no ventrículo direito os valores de CEC-2 foram muito menores em relação ao
Controle.
75
Figura 39 - Boxplots referente à análise densitométrica da expressão da Cx43
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: Boxplots referente à análise densitométrica da expressão da Cx43. Cada letra
corresponde às amostras de uma região do miocárdio para os diferentes grupos (Controle, CEC-1 e CEC-2). A: átrio direito, B: ventrículo direito, C: átrio esquerdo, D: ventrículo esquerdo, E: septo interventricular. Houve diferença significativa entre os grupos Controle e CEC-2 nas regiões correspondentes ao ventrículo direito e ao átrio esquerdo. NOTA: os círculos representam os outliers.
76
5.5 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO mRNA DA CONEXINA 43 (RT-PCR EM
TEMPO REAL)
Na análise de variância (ANOVA) os dados referentes à expressão do
mRNA correspondente ao Gja1 nas diferentes regiões do miocárdio, quais sejam
átrios direito e esquerdo, ventrículo direito e esquerdo e septo interventricular não
apresentaram diferença significativa.
A distribuição entre os grupos pode ser observada nas figuras 41 a 45.
Figura 40 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no átrio direito
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014)
77
Figura 41 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no ventrículo direito
Fonte: (SANTOS, A. L. S. 2014)
Figura 42 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no átrio esquerdo
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014)
78
Figura 43 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no ventrículo esquerdo
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014)
Figura 44 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no septo interventricular
Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014)
79
6 DISCUSSÃO
Há pouco mais de seis décadas tinha início a história da cirurgia cardíaca.
Nos dias atuais, em meio à toda tecnologia presente em um mundo globalizado,
torna-se tarefa difícil imaginar que complexas técnicas cirúrgicas puderam ser
viabilizadas em espaço de tempo relativamente curto. A ousadia aceitável e
justificada em bases científicas de célebres pesquisadores visava ao
desenvolvimento de procedimentos para a cura de pacientes acometidos por
doenças cardíacas congênitas e adquiridas. Tendo em vista esta finalidade
precípua, consideramos o desenvolvimento da CEC, possibilitando as cirurgias a
céu aberto, um dos maiores avanços do século XX na área da medicina, opinião
também compartilhada por outros autores (BRAILE; GODOY, 2012; PUNJABI,
TAYLO, 2013; HESSEL, 2014).
A história da CEC originou-se na realização da pesquisa científica básica.
Foram os estudos relacionados à anatomia do sistema cardiovascular, à fisiologia
cardíaca e respiratória e à perfusão artificial que proporcionaram as bases para a
construção de um sistema de oxigenação sanguínea extracorpórea (SOUZA; ELIAS,
2006; BRAILE; GODOY, 2012; HESSEL, 2014). Neste contexto, julgamos
necessário e prudente que os projetos de pesquisa estejam fundamentados na
ciência básica, para que possam trazer contribuições relevantes à comunidade
científica e gerar aplicabilidade clínico-cirúrgica. Segundo Hessel (2014)
historicamente a CEC somente foi possível após a descoberta da heparina e da
protamina.
Anteriormente à CEC, embora alguns pesquisadores tenham concentrado
seus esforços no desenvolvimento e aperfeiçoamento da técnica de circulação
cruzada e sua aplicabilidade em cirurgias cardíacas, o uso da referida técnica em
humanos foi descontinuada pelas complicações inerentes às reações imunológicas e
também, muito provavelmente, pelo fato do procedimento ter uma potencial taxa de
mortalidade de 200% (tanto o doador quanto o paciente corriam risco de morte)
(HUNT et al., 1993; SOUZA; ELIAS, 2006). Neste contexto, concordamos com a
descontinuidade da referida técnica pelas intercorrências e principalmente pela alta
mortalidade associada a esta prática.
80
Apesar de estudo ter atestado a viabilidade da circulação cruzada para
cães (HUNT et al., 1995), em veterinária tal técnica não é aplicada rotineiramente,
pois além da possibilidade de reações imunológicas, a literatura recomenda a
instituição da CEC em detrimento da circulação cruzada.
Embora as pesquisas iniciais relacionadas à CEC e às técnicas de
cirurgias cardíacas tenham sido desenvolvidas em animais antes de sua aplicação
em medicina, a CEC na medicina veterinária ainda é utilizada de maneira
inconsistente. Verifica-se que a máquina e o todo o circuito empregado na instituição
da CEC são os mesmos utilizados na espécie humana (HOLMBERG, 1998; PELOSI
et al., 2013).
Embora tenhamos observado avanços na área da veterinária nos últimos
anos, no que concerne ao monitoramento intensivo, procedimentos anestésicos,
novas técnicas cirúrgicas, métodos de diagnósticos, exames laboratoriais e ao
desenvolvimento das especialidades, não verificamos o desenvolvimento de
equipamentos e materiais descartáveis específicos para o paciente canino e felino,
levando em consideração as particularidades destas espécies, não havendo material
espécie específico, corroborando com Kwasnika (2003), que afirmou em seu estudo
que as informações sobre a CEC são genéricas e esparsas.
A cirurgia cardiovascular em pequenos animais tem sido realizada
principalmente, em hospitais veterinários de universidades. Concordamos com
Kwasnicka (2003); Hunt (2005) e Pelosi et al. (2013) quando afirmam que tanto os
altos custos envolvidos quanto a necessidade de uma equipe altamente treinada
ainda constituem limitações ao emprego da CEC. Neste contexto, é fundamental que
a equipe tenha além do conhecimento da anatomia e fisiologia do sistema
cardiovascular, familiarização com a técnica de CEC e, é evidente, capacitação
cirúrgica.
De acordo com a casuística das doenças cardíacas congênitas
observadas por Macdonald (2006) entendemos ser fundamental a realização de
estudos direcionados ao aperfeiçoamento da máquina de CEC (partes motora e
oxigenadora), visando maior aplicabilidade da referida técnica na rotina clínica, indo
ao encontro do que fora relatado em outros estudos (GOMES, 1985; SANT’ANA;
LUCCHESE, 1994). Verificamos que a variedade no tamanho dos animais
domésticos pode dificultar a padronização das técnicas de canulação, dos
oxigenadores, volumes do perfusato e das soluções utilizadas, à semelhança do que
81
também foi observado por Kwasnicka (2003); Freitas (2004); Hunt (2005) e Pelosi et
al. (2013). Entretanto, não identificamos dificuldade na realização da canulação,
quer seja arterial ou venosa, ainda que o porte deste fosse bastante semelhante.
Além do treinamento, a composição da equipe é decisiva para o sucesso
das cirurgias cardíacas, de modo que concordamos com a afirmação de Griffiths
(2010) de que a equipe deve ser composta por cirurgião principal, cirurgião
assistente, instrumentador, enfermeiro, anestesista, perfusionista e membros da
unidade de terapia intensiva. No estudo em tela, observando-se o preceito,
utilizamos a mesma equipe cirúrgica, perfusionista e anestesista em todos os
procedimentos aplicados nos animais.
Pudemos verificar que, os cuidados observados no emprego do preparo
dos animais e dos procedimentos anestésicos, até a instituição da CEC,
apresentaram resultados positivos, em face dos resultados obtidos durante a
toracotomia intercostal, o acesso ao pericárdio, a canulação dos vasos sanguíneos.
No presente estudo, o acesso cirúrgico à cavidade torácica foi realizado
por meio de toracotomia intercostal direita (STOPIGLIA et al., 2001), considerada
preferencial em cães por promover adequada exposição cirúrgica das veias cavas
cranial e caudal, veia ázigos, aurícula direita, átrio direito, principal porção do
ventrículo direito e nervo frênico (ANDERSON, 1993; ORTON, 1994; EVANS;
DELAHUNTA, 2001). Verificamos também que este acesso possibilita adequada
exposição da artéria aorta para realização da canulação arterial.
Embora existam estudos que tenham utilizado a esternotomia mediana
(ORTON et al., 2001; HIRAO et al., 2003) à semelhança do que é feito no paciente
humano (COOLEY, 1984), optamos pela realização da toracotomia intercostal com
resultados satisfatórios.
No tocante à canulação arterial, ainda que Hunt (1993); Pearson (1993) e
Bellenger (1993) tenham indicado a aorta para canulação do cão receptor quando do
uso da circulação cruzada, alguns autores referem uma possível fragilidade da aorta
dos cães, sendo este fato relacionado a complicações decorrentes da canulação do
referido vaso sanguíneo (KLEMENT et al., 1987a; ORTON, 1994; GRIFFITHS, 2010)
e de possíveis hemorragias durante a realização da CEC (PELOSI et al., 2013).
Nossos resultados contrariam esta afirmação, uma vez que neste trabalho
procedemos à canulação da aorta para instalação da linha arterial sem qualquer
intercorrência relacionada à ruptura ou hemorragia durante a CEC. A documentação
82
fotográfica que realizamos demonstra passo a passo que a canulação aórtica bem
como a instalação da CEC no modo aorto-bicaval é realmente exequível em cães.
Uma vez que em publicação recente (PELOSI et al., 2013) indicou-se a necessidade
de se comprovar a factibilidade da canulação da aorta, nosso estudo contribuiu de
maneira decisiva para responder ao questionamento indicado pelos autores
supracitados. Por outro lado, enfatizamos que a experiência e o treinamento dos
cirurgiões são decisivos para o êxito da instalação da CEC no modo aorto-bicaval.
Outros autores, porém, recomendam para canulação arterial a artéria
axilar ou femoral esquerda ou carótida esquerda (DALLAN et al., 1987; PETERS et
al., 1997; HEDAYATI et al., 2004; BEHR et al., 2007; GRIFFITHS, 2010;
KANEMOTO et al., 2010; UECHI, 2012; FUJIWARA et al., 2012; PELOSI et al.,
2013). Face a necessidade de outras incisões cutâneas para acessar os referidos
vasos sanguíneos, acreditamos, baseado em nossos resultados, que deve-se
indicar, para cães o modo aorto-bicaval.
Em relação à canulação venosa (veias cava cranial e caudal) também não
identificamos qualquer intercorrência relacionada à ruptura ou hemorragia no local
de inserção da cânula. Tanto a cânula arterial quanto as cânulas venosas utilizadas
neste estudo mostraram-se satisfatórias. Não presenciamos a formação de êmbolos,
à semelhança do que foi relatado anteriormente por Freitas (2004).
A heparinização do paciente também foi realizada sem intercorrências.
Verificamos que a dose em literatura (tanto da heparina quanto da protamina) são
bastante variáveis (HUNT; PEARSON; BELLENGER, 1993; LEW et al., 1997;
KWASNICKA, 2003; FREITAS, 2004; BEHR et al., 2007; SODA et al., 2009;
GRIFFITHS, 2010; KANEMOTO et al., 2010; PELOSI et al., 2013). Por esse motivo,
nos valemos da utilização das doses postuladas por Kwasnicka (2003) em seu
estudo.
Concordamos com Magilligan et al. (1985), que afirmaram ser a
hipotermia uma das causas de bradicardia, podendo promover fibrilação atrial
durante a anestesia. Optou-se neste estudo pela realização dos procedimentos em
normotermia, e não observamos a ocorrência nem de bradicardia nem fibrilação
atrial.
Apesar de Kanemoto et al. (2010) relatarem o uso de perfusato sanguíneo
sem a ocorrência de efeitos colaterais, optou-se pela utilização de perfusato
cristaloide, do tipo Ringer com lactato (KWASNIKA, 2003), e não se verificou
83
inconvenientes, dado este que vai ao encontro do relatado pelos autores
(KWASNICKA, 2003; (PELOSI et al., 2013).
Apesar do grande risco associado à ocorrência de embolia, algumas
publicações (BEHR at al., 2007; SODA et al., 2009) indicam a realização de cirurgia
com o coração em movimento. Ainda que a escolha em se utilizar a cardioplegia
contribua para um maior grau de complexidade no procedimento (PELOSI et al.,
2013), observamos que sua utilização é necessária, tanto para a proteger o coração
(durante período isquêmico) quanto para promover a parada do órgão durante o ato
operatório, orientações estas também descritas em outros estudos (KWASNICKA,
2003; CHAMBERS; FALLOUH, 2010).
Com relação às complicações, Pelosi et al. (2013) afirmam que a
incidência destas está relacionada diretamente com o tempo de CEC e o
clampeamento aórtico. No presente estudo, ocorreu vacuolização em túnica média
de artérias de pequeno calibre apenas no miocárdio dos animais do grupo CEC-2,
ou seja, aqueles submetidos a 60 minutos de CEC seguida de 30 minutos de
restauração da perfusão espontânea. Uma vez que não houve indícios da existência
de outras complicações em nosso estudo, entendemos que estas vacuolizações, a
princípio caracterizadas como um processo reversível, foram em decorrência, muito
provavelmente, do período de isquemia do coração. Não encontramos na literatura
consultada estudos que relataram achados compatíveis com este tipo de lesão.
Concordamos com os autores que referem que a CEC é um procedimento
viável para pequenos animais (KLEMENT et al., 1987a; ORTON, 1994; ORTON et
al., 2001; BROURMAN, 2003; FREITAS, 2004; BEHR et al., 2007; SEREDA et al.,
2009; SODA et al., 2009; TANAKA et al., 2009; GRIFFITHS, 2010; KANEMOTO et
al., 2010; UECHI et al., 2011; FUJIWARA et al., 2012; UECHI, 2012; UECHI et al.,
2012; MIZUNO; MIZUKOSHI; UECHI, 2013). Entretanto, julgamos de suma
importância conduzir novas pesquisas que visem o desenvolvimento de mecanismos
terapêuticos para proteger o miocárdio durante o período de isquemia-reperfusão,
concordando com Sluijter et al. (2014) e, estabelecer períodos de tempo de CEC
seguros, que não promovam complicações nos sistemas corpóreos dos cães.
Neste contexto, insere-se o estudo das conexinas, proteínas essenciais
para a propagação do impulso elétrico pelo coração e determinantes para a
velocidade de condução. As Cxs estão relacionadas ao ritmo cardíaco e também
envolvidas diretamente na gênese de várias doenças cardíacas (JANSEN et al.,
84
2010) (LAMBIASE; TINKER, 2014). Dessa forma, reiteramos que a melhor
compreensão da fisiopatologia dos processos associados a estas proteínas poderá
contribuir para solucionar, amenizar ou mesmo prevenir as alterações decorrentes
da CEC.
O escopo desta tese concentrou-se em identificar o efeito da CEC na
expressão da Cx43, principal isoforma das Cxs presente no miocárdio. Sabe-se que
nas regiões do miocárdio de cães indenes há uma marcação da Cx43 mais intensa
nas regiões correspondentes aos ventrículos direito e esquerdo e septo transverso
quando comparadas aos átrios direito e esquerdo (SANTOS, 2008), relato este que
corrobora com os nossos achados relacionados à imuno-localização da referida
conexina. Segundo Severs et al. (2003) e Santos (2008) as Cxs não apresentam
uma variação randômica, sendo que no coração, as Cx40, Cx43 e Cx45 são
expressas em combinações características e quantidades relativas. Assim, em
nossa opinião, faz-se necessário o estudo das outras conexinas presentes no
coração e que são expressas juntamente com a proteína estudada por nós.
Os resultados de nosso estudo em relação à imuno-localização da Cx43
indicaram a marcação da referida conexina em todas as regiões analisadas (átrios,
ventrículos e septo transverso). Entretanto, observou-se uma marcação menos
intensa da Cx43, principalmente nas regiões correspondentes aos átrios, nos
animais submetidos a CEC sem restauração da perfusão espontânea. Este dado vai
ao encontro do observado por Yeh et al. (2002), que verificaram uma diminuição da
Cx43 acompanhada por uma redução das GJIC em cardiomiócitos presentes no
ventrículo direito de 21 pacientes submetidos à CEC. Estudo semelhante também
identificou diminuição da Cx43 atrial em 16 crianças submetidas à CEC (PAVLOVIC
et al., 2006).
Alguns autores já correlacionaram a diminuição das Cxs e a ocorrência de
fibrilação atrial (GEMEL et al., 2014) e de fibrilação ventricular (PELOSI et al., 2013).
Kato et al. (2012) comprovaram que a fibrilação atrial está associada à mudança no
número de Cxs e pode estar relacionada com a distribuição (lateralização) das Cxs.
Mediante estes dados, é bem provável que a redução da Cx43 nos átrios de cães
esteja relacionada com o desenvolvimento de complicações (fibrilação atrial) durante
a instituição da CEC.
Por outro lado, os animais submetidos a CEC por 60 minutos seguida de
restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentaram uma marcação
85
mais intensa nas regiões correspondentes aos ventrículos e septo transverso,
marcação esta que no caso do septo transverso foi discretamente mais intensa em
relação aos animais do grupo controle. Segundo Kreuzberg, Willecke e Bukauskas
(2006) no coração humano, as fibras de Purkinje e o músculo ventricular expressam
mais Cx43 que os átrios. Dessa forma, o fato da Cx43 ter uma maior expressão
nestas áreas nos leva a postular que muito provavelmente a CEC não tenha
proporcionado um efeito deletério sobre estas regiões. Mister se faz, porém, avaliar
os possíveis efeitos de lesão após a CEC, quando se dá a restauração da perfusão
espontânea.
Além disso, no miocárdio canino os ventrículos e septo transverso
expressam a Cx43 mais intensamente que nos átrios (SANTOS, 2008). Ao contrário
do postulado por Yeh et al. (2002) e por Pavlovic et al. (2006), parece que a Cx43
possui uma maior expressão após a CEC seguida da restauração da perfusão
espontânea, ainda que tenhamos observado uma menor expressão nos animais
submetidos a 60 minutos de CEC sem reperfusão.
Curiosamente, ao analisarmos o resultado do western blot, verificamos
que houve uma diferença estatística significante (p<0,05) entre os grupos controle e
CEC-2 nas regiões correspondentes ao átrio esquerdo e ventrículo direito. O grupo
controle em relação ao CEC-1 não apresentou diferença significativa. Entretanto,
devido à amostragem pequena (n=5), talvez não tenha sido possível evidenciarmos
diferença entre os grupos. Nas demais regiões, embora se observe que há uma
diferença descritiva relevante entre os grupos, provavelmente, a grande dispersão
do grupo controle e o baixo número amostral podem ter sido responsáveis por não
observamos diferença estatística. Devido à escassez de dados na literatura neste
sentido, julgamos necessário novas pesquisas para elucidação de tais
questionamentos.
Não observamos diferença significativa entre as amostras das regiões
correspondentes aos átrios, ventrículos e septo transverso ao analisarmos o
resultado do RT-PCR em tempo real. Apesar de todos os cuidados terem sido
estabelecidos durante a coleta, armazenamento e processamento das amostras,
uma possível degradação pode ter ocorrido. Levantamos uma outra hipótese,
corroborando com recente publicação documentada por (CHATURVEDI; TYAGI,
2014), o efeito epigenético. Os autores referem que pode haver uma relação entre
86
disfunção e regeneração cardíaca, entretanto o mecanismo ainda permanece
desconhecido.
Segundo Severs et al. (2003), a conexina não apresenta uma variação
randômica, sendo as Cxs do coração, principalmente Cx40, Cx43 e Cx45) expressas
em combinações características e quantidades relativas.
Por sua vez, outros estudos indicaram que em pacientes portadores de
cardiomiopatia dilatada ocorre uma diminuição da expressão da Cx43 associada a
uma grade perda da Cx na região de disco intercalado. Já em relação à
cardiomiopatia hipertrófica pode ocorrer tanto aumento quanto redução na
expressão da Cx43 (FONTES et al., 2012). E na insuficiência cardíaca congestiva
humana ocorrem alterações quantitativas na expressão da conexina bem como uma
redução dos níveis ventriculares da Cx43 (SEVERS et al., 2003).
Em estudo realizado por Lin et al. (2007), verificou-se alteração na
restauração e distribuição da Cx43 após a isquemia do miocárdio em animais da
espécie canina. Outros estudos também referem a alteração da Cx43 frente a
processos isquêmicos (LUKE; SAFFITZ, 1991; HUANG; SANDUSKY; ZIPES, 1999).
Tal alteração pode ter se estabelecido nos animais que foram submetidos à CEC e
restauração da perfusão espontânea. Infelizmente, nossos resultados não nos
permitiram afirmar se a vacuolização encontrada em túnica média de artérias de
pequeno calibre do miocárdio oi devido à circulação extracorpórea ou secundária ao
processo de isquemia / restauração da perfusão espontânea após retirado o
clampeamento da aorta, ainda que tenhamos utilizado a cardioplegia.
Em 2004, Freitas avaliou cães submetidos a CEC por período de duas
horas seguida de restauração da perfusão espontânea por uma hora, ou seja, o
dobro do tempo que utilizamos em nosso estudo, e verificou indícios de
degeneração de organelas. Segundo Laird (2004), este grau de injúria celular, pode
influenciar diretamente a síntese das conexinas (LAIRD, 2004). Além disso, foi
provado recentemente que as Cxs são capazes de controlar a apoptose mediando a
transferência de sinais apoptóticos entre os canais intercelulares de células
adjacentes, mediada pela membrana plasmática e/ou hemicanais mitocondriais ou
direta e principalmente quanto associada à localização nuclear de uma proteína
aberrante, ou através de interações com fatores de regulação da apoptose
(CARETTE et al., 2014).
Com este estudo verificamos que a conexina 43 desempenha importantes
87
funções fisiológicas como crescimento celular, proliferação e diferenciação,
homeostase do tecido, cicatrização de feridas, apoptose além de estar presente em
processos fisiopatológicos. Reiteramos que ainda há muito o que se pesquisar e
descobrir sobre esta grande família das conexinas. Entendemos que se trata de um
estudo incipiente, de modo que tal linha de investigação científica deva continuar,
não apenas relacionada unicamente à conexina 43, mas também direcionada às
outras isoformas de conexinas presentes no tecido muscular cardíaco.
Esperamos que as pesquisas futuras sobre este tema tragam mais
conhecimentos não apenas no tocante à melhoria da técnica de circulação
extracorpórea, mas também para a elucidação da relação das conexinas e seu
envolvimento nas doenças cardíacas congênitas e adquiridas, para que possamos
prover avanços na cirurgia torácica e cardiovascular aos cães e gatos.
88
7 CONCLUSÃO
O presente estudo possibilitou-nos concluir que:
- a conexina 43 foi identificada nas regiões estudadas do miocárdio, quais sejam
átrios direito e esquerdo, ventrículos direito e esquerdo e septo transverso: nos
grupos Controle (C), CEC-1 e CEC-2, nos tempos avaliados, antes da CEC, 60
minutos após a CEC e com 30 minutos de perfusão espontânea após 60 minutos
de CEC
- a expressão da conexina 43 variou significativamente em CEC-2 nas regiões
correspondentes ao átrio esquerdo e ventrículo direito em relação aos animais do
grupo controle
- a expressão gênica de Gja1 não apresentou diferença significativa entre os
grupos estudados
- a circulação extracorpórea com duração de 60 minutos seguida de restauração
espontânea de 30 minutos promoveu vacuolização na túnica média de artérias de
pequeno calibre do miocárdio
- a canulação da aorta para realização de circulação extracorpórea bem como a
instalação do circuito de CEC no modo aorto-bicaval constituiu técnica exequível
para o cão e não apresentou complicações durante o período transoperatório
89
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