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Antígenos Recombinantes e suas aplicações em Imunologia
Bióloga Mariana Monezi Borzi
Doutoranda em Microbiologia Agropecuária
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS – FCAV
CAMPUS DE JABOTICABAL
Novo Dogma Central
da Biologia Molecular
• Cópia das sequencias de nucleotídeos de uma molécula de DNAfd parental em duas moléculas filhas de DNAfd
• Semi-conservativa
Replicação
Fita molde
Fita nova
É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula
de DNA de fita dupla (gene)
Transcrição
Núcleo
Informação genética
Citoplasma
DNA mRNA
Consiste na transformação da mensagem contida no mRNA, via tRNA, na sequência de aminoácidos que
constituem a proteína
Tradução
Expressão gênica
Polímero de aminoácidos de massa molecular acima de 10 KDa, com cada aminoácido unido ao
seu vizinho por um tipo específico de ligação covalente.
Proteína
Sequencia linear dos
resíduos de aminoácidos
(Ligações peptídicas)
Padrões estruturais:
conformação helicoidal ou
lado a lado
(Pontes de hidrogênio)
Arranjo 3D
(Pontes de hidrogênio,
Forças de Van der Wall,
Interações iônicas)
Arranjo entre
cadeias/subunidades
(Ligações dissulfeto)
Produção em larga escala de proteínas heterólogas a partir da expressão de uma molécula de DNA recombinante em um
sistema de expressão adequado.
DNA recombinante: sequencia de DNA artificial que resulta da combinação
de diferentes sequencias de DNAs
Tecnologia do DNA recombinante
Estudos bioquímicos Análises estruturais
Dificuldades de obtenção Produção de Anticorpos
Imunodiagnóstico
Tecnologia do DNA recombinante
Clonagem gênica: isolamento,
amplificação e purificação de um ou
mais genes a partir do material genético
de um dado organismo.
• Antígenos: substâncias (moléculas) estranhas ao SI que são reconhecidas por receptores específicos em linfócitos B e T e também por anticorpos.
• Antígenos recombinantes: proteínas específicas do agente infeccioso, produzidas artificialmente a partir da clonagem gênica
Tecnologia do DNA recombinante
Células hospedeiras: Leveduras, Células de insetos, Células de mamíferos, Células bacterianas
Taxa de crescimento
celular;
Complexidade do meio de
cultura;
Custo do meio de cultura;
Nível de expressão;
Capacidade de expressão
extracelular.
Capacidade de produzir as
modificações pós-
traducionais:
- enrolamento correto;
- formação das pontes
dissulfeto;
- glicosilação;
- fosforilação;
- acetilação.
• Crescimento rápido
• Pouco espaço físico
• Genética bem compreendida
• Aceita material genético estranho
Escherichia coli
Vetor: molécula de DNA usada como um veículo para carregar sequências de DNA estrangeiras dentro de uma célula hospedeira.
Plasmídeos:
• Mais simples
• Circulares
• Independentes do cromossomo bacteriano
Vetores de expressão
Expressão de proteína recombinante em E. coli
Clonagem do gene em vetor de expressão
Vetor linearizado Preparo do inserto
Reação de ligação
Plasmídeo recombinante
Transformação de E. coli
competente
Plaqueamento e seleção
dos clones recombinantes
Extração do
DNAp e
Sequenciamento
Indução da expressão da proteína recombinante
Tampão
de lise
Sonicação Purificação
Análise da expressão da proteína recombinante
Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS PAGE)
• Separação de proteínas conforme o peso molecular, as quais migram pelos poros do gel de poliacrilamida
• Quanto menor for o peso molecular da proteína mais facilmente ela migrará em relação às outras proteínas
• Após a corrida das proteínas pelos poros do gel, estas poderão ser visualizadas com a aplicação do corante Coomassie Blue
Preparo da amostra: dodecil-sulfato de sódio e β-mercapto-etanol
Confere carga negativa Separa as cadeias
260 kDa
72 kDa
52 kDa
42 kDa
10 kDa
Caracterização por SDS-PAGE da Nucleoprotéina recombinante do
Vírus da Influenza Aviária expressa em E. coli.
Western blotting
• Técnica bioquímica utilizada para determinar a quantidade relativa e o peso molecular de uma proteína dentro de uma mistura de proteínas ou outras moléculas.
• Detecção de antígenos proteicos - uso de anticorpos específicos
Caracterização por Western Blotting da Proteína NP recombinante do VIA expressa
em E. coli após purificação em resina de níquel-agarose.
1 2 3
260 kDa
72 kDa
52 kDa
42 kDa
Análise (mapeamento) dos epítopos
Epítopo linear ou contínuo
Epítopo conformacional ou
descontínuo
Imunodiagnóstico
• Sorologia - detecção de Acs contra antígenos virais e bacterianos específicos
• Clonagem e expressão da NP do VIA
• Testes de ELISA
• 121 soros testados
• Positivos – Acs presentes no soro reagiam com a NP recombinante
• Negativos – não ocorria reação
ELISA indireto
OXIDAÇÃO DA PEROXIDASE
Peroxidase
Peroxidase
NaIO4
C C
20`
H O
H
H
H
Álcool Ácido
+ 0H -
Aldeído (não conjuga)
DIÁLISE EM PH ÁCIDO
(4.4)
• Apresentam sequencias do material genético do agente infeccioso que codificam antígenos
Vacinas de DNA
Clonagem e expressão do gene (propagação)
Administração ao indivíduo (transfecção)
Células produzem a própria proteína (antígeno)
Resposta imunológica com memória
• Indução da imunidade protetora em camundongos contra o câncer e algumas doenças auto imunes.
• Em humanos:
Vacinas de DNA
Pesquisas direcionadas contra a AIDS, malária, tuberculose,
dengue, hepatite, raiva, leptospirose, teníase etc.
• Seleção do gene alvo
• Construção do vetor de expressão
• Frequência e via de administração
• Idade, saúde e espécie
Vai depender...
• Produção em larga escala – menos custo
• Mais fácil o controle de qualidade
• Estáveis a Tº ambiente
• Podem ser liofilizadas
• Sem necessidade de refrigeração – fácil comercialização, transporte, distribuição em regiões de difícil acesso
Vantagens
OBRIGADA! mmborzi@gmail.com
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