Aula samonella

Pesquisa de Salmonella

spp. em alimentos

Professora Samira Mantilla

Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos

1 CARACTERÍSTICAS E TAXONOMIA DO MICRORGANISMO

TAXONOMIA Enterobacteriaceae Mais de 2463 sorotipos Algumas mudanças ocorreram na taxonomia da Salmonella. Todas as salmonelas foram agrupadas em duas espécies: S. enterica e S. bongori. E os sorovares (subdivisão das

espécies baseadas nas diferenças antigênicas) foram divididos em subespécies, muitas classificadas como S. enterica.

Então, a forma existente há muito tempo de tratar sorovares de Salmonella como espécies não é mais válida. Ex: S. typhimurium deve ser referenciada como S. enterica sorovar Typhimurium ou somente S. Typhymurium.

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CARACTERÍSTICAS

BGN – maioria é móvel (flagelos peritríquios), não produtores de esporos Anaeróbios facultativos Produzem gás a partir da glicose (menos S. Typhi) antígenos: somáticos = Otermoestáveispolissacarídeos–membrana flagelares = H termolábeisproteínas dos flagelos capsulares = K termoestáveispolissacarídeos-cápsulas

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Temperatura ideal: 35-37°C (mínima 5 e máxima 47°C)

pH ótimo pra multiplicação: 7,0 Não resiste a pH <4,0 e > que 9,0 Não toleram concentrações de sal

superiores a 9% O nitrito é inibitório

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Epidemiologicamente, as salmoinelas podem ser distribuídas em três grupos:

1- As que infectam somente os homens: S. Typhi, S. Paratyphi.

2- Sorovares adaptados ao hospedeiro (alguns dos quais são patógenos humanos e costumam ser adquiridos por meio de alimentos): S. Gallinarum (frango), S. Dublin (gado), S. Abortus-equi (equino), S. Abortus-ovis (ovino) e S. Choleraesuis (suíno)

3- Sorovares não adaptados (sem preferência por hospedeiro)- são patogênicos aos homens e animais, incluindo muitos sorovares causadores de infecções alimentares.

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2 DISTRIBUIÇÃO AMBIENTAL

Amplamente distribuídas na natureza, sendo o trato intestinal do homem e de animas os principal reservatório natural.

Entre os animas, as aves são as mais importantes (aves podem se portadores assintomáticos=eliminação de Salmonella nas fezes.

Alimentos envolvidos: Carnes resfriadas – congeladas – pH= 4,5-9,0 – temperatura até 41-45ºC; ovos, leite cru.

Água do mar (3% NaCl): pescado

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Causas da salmonelose humana consumo alimentos contaminados – métodos de processamento tecnológico -

Transmissão direta (animal – animal; humano-humano) – fontes residuais (água – esgoto); alimentos processados

Salmonelose impacto: sócio-econômico – alimentar – saúde coletiva

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3 CARACTERÍSTICA DA DOENÇA

As doenças causadas por salmonelas são divididas em:

Febre tifóide (S. Typhi) Febres entéricas (S. Paratyphi) Enterocolites – demais salmonelas

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Febre tifóide

Só acomete o homem (água e alimentos contaminados com material fecal humano).

Sintomas muito graves: septicemia, febre alta, diarréia , vômito

Se multiplicam dentro de células fagocitárias

Duram 1-8 semanas Antibióticos: cloranfenicol e ampicilina

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Febre entérica

Semelhante a tifóide, mas os sintomas são mais brandos.

No máximo 3 semanas Antibióticos –mesmo da outra

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Enterocolites (salmoneloses)

A infecção alimentar é causada pela ingestão de alimentos que contenham números significativos de sorovares não hospedeiro-específicos do gênero Salmonella.

A S. Choleraesuis foi descrita como a que apresenta a maior taxa de mortalidade (21%). S. Dublin e S. Enteretidis também são as mais patogênicas para o homem.

Diarréia, vômito, febre, dores abdominais PI:12-36 h, dura 4 dias – geralmente não necessitam de antibióticos Muitos pacientes tornam-se portadores após a cura da doença!!!! Em crianças e imunodeprimidos: pode ser grave: atingir outros

orgãos

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Mecanismos de patogenicidade:

Começa na mucosa do intestino delgado e cólon Salmonelas atravessam a camada epitelial intestinal,

alcançam a lâmina própria (camada na qual as células epiteliais estão ancoradas) onde proliferam

Causam uma mudança na aparência da superfície da célula hospedeira, resultando na internalização da bactéria em uma vesícula – este efeito é denominado arrepio.

São fagocitadas resultando em resposta inflamatória. Ao contrário das outras doenças (febre entérica e tifóide),

neste caso, as salmonelas ficam somente nesta lâmina, não indo para corrente circulatória.

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Uma vez dentro das células de defesa, as salmonelas permanecem em vacúolos ligados à membrana durante todo o seu estágio intracelular.

Após a multiplicação, as células se rompem e o patógeno é disseminado.

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Endotoxina (LPS) – seu papel como agentes causadores de diarréia é questionado

Todos os sorovares de S. enterica apresentam ilhas de patpgenicidade (SPI)-regiões do DNA bacteriano que possuem um número de genes de virulência.

Enterotoxina: acredita-se que esta é responsável pelo processo diarréico

Adesinas:fímbrias Citotoxina: inibidora da síntese protéica Proteína SpiC –previne a fusão das vesículas com

os lisossomos (capacidade de x dentro dos fagócitos)

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4 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO

4.1 ENRIQUECIMENTO NÃO SELETIVO OU PRÉ-ENRIQUECIMENTO

Meio Caldo nutritivo não seletivo Água Peptonada Tamponada (APT) Incubação 35-37°C/24h

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4.2 ENRIQUECIMENTO SELETIVO

Meio Caldo nutritivo seletivo

Meios : Caldo Rappaport e Caldo Selenito Cistina Caldo Tetrationato –tb pode ser usado Incubação: banho-maria 41°C ± 0,5/24h (ou

35-37°/24h)

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4.3 PLAQUEAMENTO SELETIVO

Classificação dos meios: baixa, média e alta seletividade

Baixa seletividade Ágar Mac Conkey – Ágar Eosina Azul de Metileno

Média seletividade Ágar Salmonella – Shigella – Ágar Hektoen

Alta seletividade –Ágar XLD (xilose lisina desoxicolato)– Ágar BPLS (verde brilhante-vermelho de fenol-lactose-sacarose)

Incubação 35-37°C/24h

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Ágar Hektoen: colônias verdes ou pretas (H2S)

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Ágar XLD: colônias vermelhas, da cor do meio ou pretas (H2S)

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4.4 TRIAGEM

Selecionar duas colônias características de cada placa

Meios: Ágar “Triple Sugar Iron” (TSI) –indicador:

vermelho de fenol Ágar “Lisine Iron” (LIA) – indicador púrpura

de bromocresol

TSI

Se a bactéria fermentar apenas a glicose (presente em baixa concentração –0,1g), a quantidade de ácido produzida será suficiente somente para provocar a viragem no fundo do tubo.

Mas se a bact utilizar tb lactose e/ou sacarose, produzirá muito ácido , virando todo o meio para amarelo.

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Leitura: TSI: Base amarela com ou sem

produção de gás; produção de sulfeto de hidrogênio: muitos aa contém enxofre e a salmonela pode usá-lo produzindo H2S. O ágar TSI contêm sal de ferro. A reação do sal de ferro com o H2S produz sulfeto ferroso que é um sal preto; bisel rosa ou inalterado

Não inoculado

Típico de Salmonella

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LIA: a bactéria fermenta a glicose (fica amarelo), depois que acaba a glicose do meio, a salmonela vai utilizar o aa lisina, gerando metabólitos alcalinos, virando a cor do meio para púrpura novamente (meio volta a cor púrpura original).

A bactéria que não descarboxila a lisina continua com o meio ácido (amarelo)

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Leitura LIA: Não muda

de cor + Observa-se

produção de sulfeto

Descarboxila a lisina –meio alcalino

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LIA: a bactéria fermenta a glicose (fica amarelo), depois que acaba a glicose do meio, a salmonela vai utilizar o aa lisina, gerando metabólitos alcalinos, virando a cor do meio para púrpura novamente (meio volta a cor púrpura original).

A bactéria que não descarboxila a lisina continua com o meio ácido (amarelo)

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4.5 SERIAÇÃO BIOQUÍMICA

Uréia (-) –Caldo uréia Meio SIM(sulfeto, indol, motilidade) (+) (-)

(+) Caldo uréia e meio SIM:Incubação 35-

37°C/24h Oxidase (-) palito esterilizado – tiras. Leitura

em 10-20 segundos.

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Leitura: Caldo uréia –permanece da mesma cor (uréia negativo) não

produz a enzima urease SIM- produção de sulfeto, motilidade e indol negativo Teste do indol: verifica se a bactéria é capaz de desaminar o

aa triptofano – libera indol que é detectado pelo reativo de Kovacs. A reação do indol com o reativo de Kovacs gera uma coloração avermelhada.

Oxidase: verifica a presença da enzima citocromo c oxidase (transfere elétrons na cadeia). O reativo, ao receber os elétrons, na cadeia respiratória de oxida e muda de cor =azul

SIM

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Comportamentos atípicos:

Fermentação da lactose: TSI todo amarelo Fermentação sacarose: TSI com o bisel amarelo Não produção de sulfeto (14% não produz sulfeto) Não descarboxilação da lisina (meio ácido). 4 a 5%

são lisina negativo Produção do indol (anel vermelho no meio SIM).

1% são indol + Não motilidade: algumas são imóveis

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4.6 SOROLOGIA

Triple Sugar Iron Ágar Nutriente Suspensão Bacteriana Soro Polivalente Aglutinação

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Resultado Positivo para Salmonella spp. quando

as culturas apresentarem reações típicas nas provas bioquímicas E reação sorológica + (antisoro polivalente O)

Resultado: Presença ou ausência em 25g

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5 MEDIDAS PREVENTIVAS

Calor Exclusão competitiva: impede que a

Salmonella colonize o TGI das aves no início de suas vidas: culturas microbianas mistas contendo bactérias inócuas que ocuparão os sítios de ligação das salmonelas –reduz a presença deste patógeno na granja