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Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie
des Instituts für Hygiene und Mikribiologie der Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität-Bochum
Leiter: Prof. Dr. med. Sören G. Gatermann
Vergleich von fünf phänotypischen Methoden zur Detektion einer Penicillinase in
Staphylococcus aureus
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität-Bochum
vorgelegt von
Sarah Magdalena Lenga
aus Herne
2010
II
Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla
Referent: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann
Co-Referent: PD Dr. med. W. Cullmann
Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2012
III
Für meine Eltern
und
Oma Dodo
IV
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung .................................................................................................................. 1
1.1 Staphylococcus aureus als Spezies der Gattung Staphylococcus ..................... 1
1.2 Die Rolle als Krankheitserreger ........................................................................ 2
1.2.1 Durch S. aureus hervorgerufene Erkrankungen ....................................... 3
1.2.2 Die Bedeutung von S. aureus bei nosokomialen Infektionen ................... 4
1.3 Resistenz gegen Beta-Laktam-Antibiotika ....................................................... 4
1.3.1 Beschreibung der Wirkungsweise der Beta-Laktam-Antibiotika ............. 4
1.3.2 Zwei Resistenzmechanismen gegen Beta-Laktam-Antibiotika ................ 6
1.3.3 Eigenschaften von Beta-Laktamasen ........................................................ 7
1.3.4 Die Therapie der Infektionen mit S. aureus ............................................ 11
1.4 Ausbildung der Beta-Laktam-Resistenz ......................................................... 11
1.4.1 Regulation der Expression von Penicillinasen ........................................ 11
1.4.2 Zusammenspiel der Regulation von mecA und blaZ .............................. 12
1.5 Ziel dieser Doktorarbeit .................................................................................. 13
2 Material und Methoden ........................................................................................... 16
2.1 Material ........................................................................................................... 16
2.1.1 Chemikalien ............................................................................................ 16
2.1.2 Medien und Agar .................................................................................... 16
2.1.3 Puffer und Lösungen ............................................................................... 18
2.1.4 Antibiotika .............................................................................................. 19
2.1.5 Bakterienstämme .................................................................................... 20
2.1.6 Geräte ...................................................................................................... 20
2.2 Methoden ........................................................................................................ 21
2.2.1 Anzucht der Bakterien ............................................................................ 21
2.2.2 Identifikation von S. aureus .................................................................... 21
2.2.3 Überprüfung der Spezies als S. aureus ................................................... 22
2.2.4 Agardiffusions-Test ................................................................................ 23
V
2.2.5 Cloverleaf-Test ....................................................................................... 25
2.2.6 Nitrocefin-Test ........................................................................................ 26
2.2.7 Jod-Stärke-Test ....................................................................................... 26
2.2.8 Präparation der genomischen DNA ........................................................ 27
2.2.9 Präparation der genomischen DNA mit dem QiAmp-Kit ...................... 27
2.2.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ......................................................... 27
2.2.11 Gel-Elektrophorese ................................................................................. 29
2.2.12 Fehlerquellen .......................................................................................... 29
3 Ergebnisse ............................................................................................................... 30
3.1 Auswertung der phänotypischen Tests ........................................................... 30
3.1.1 Phänotypische Tests zur Speziesüberprüfung ......................................... 30
3.1.2 Ergebnisse der PCR-Untersuchung ........................................................ 30
3.1.3 Ergebnisse der phänotypischen Methoden zur Penicillinase-Detektion 31
3.1.4 Ergebnisse des Agardiffusions-Tests ...................................................... 32
3.1.5 Korrelation von Penicillin-MHK im VITEK 2 und Nachweis von blaZ 34
4 Diskussion ............................................................................................................... 36
5 Zusammenfassung .................................................................................................. 41
VI
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Aufbau von Antibiotika ....................................................................................... 5
Abb. 2: Methicillin (Quelle: Wikipedia) ........................................................................... 7
Abb. 3: Regulation der Expression von Penicillinasen ................................................... 12
Abb. 4: scharf demarkierter Hemmhofrand .................................................................... 24
Abb. 5: unscharf demarkierter Hemmhofrand ................................................................ 24
Abb. 6: Positiver Cloverleaf-Test ................................................................................... 25
Abb. 7: blaZ PCR und SA 442 PCR positiv ................................................................... 31
Abb. 8: Verteilung der Hemmhofdurchmesser im Agardiffusions-Test Penicillin ........ 33
Abb. 9: Verteilung der Hemmhofdurchmesser im Agardiffusions-Test Mecillinam ..... 34
VII
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Wichtige toxinbedingte Erkrankungen ................................................................. 2
Tab. 2: Klassifikation der Beta-Laktamasen nach Bush ................................................... 8
Tab. 3: Einteilung der Penicillinasen von Staphylokokken ............................................ 10
Tab. 4: Primer der blaZ und SA 442-PCR ...................................................................... 28
Tab. 5: Sensitivität der phänotypischen Tests ................................................................ 32
Tab. 6: Korrelation von Penicillin-MHK im VITEK 2 und Nachweis von blaZ ........... 35
VIII
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
bidest. bidestilliert
bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
CNS Koagulasenegative Staphylokokken
DNA Desoyribonukleinsäure
dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
g Gramm
h Stunde
HIV Humanes Immundefizienz Virus
kDA Kilodalton
LB Luria-Bertani
M Molar
mg Milligramm
min Minute
MHK minimale Hemmkonzentration
ml Milliliter
mM Millimolar
mRNA messenger RNA
MRSA methicillinresistenter Staphylococcus aureus
PBP2a Penicillin-Bindungsprotein 2a
PCR Polymerasekettenreaktion
PVL Panton-Valentine
RNA Ribonukleinsäure
IX
rpm Umdrehung pro Minute
s Sekunde
SCV small colony variants
Tab. Tabelle
TMA Trehalose-Mannitol-Agar
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
U Units
z.B. zum Beispiel
1
1 Einleitung
1.1 Staphylococcus aureus als Spezies der Gattung Staphylococcus
Staphylokokken sind grampositive Kugelbakterien und wurden früher zur Familie der
Micrococceae gezählt. Heute wird S.aureus in der gängigen Systematik wie folgt
eingeordnet: Abteilung-Firmicutes, Klasse-Bacilli, Ordnung-Bacillales, Familie-
Staphylococcaceae, Gattung-Staphylococcus, Art-Staphylococcus aureus [29]. Sie
ordnen sich in Haufen bzw. Trauben an und ihre Größe beträgt ca. 0,5-1,5 µm im
Durchmesser. Staphylokkoken sind unbeweglich, bilden keine Sporen und können
unbekapselt sein. Die Bakterien besitzen die Fähigkeit, Katalase zu bilden und sie
vermehren sich fakultativ anaerob.
Zu der Gattung Staphylococcus gehören mehr als 32 Spezies, von denen 16 Subspezies
in nennenswerter Häufigkeit in humanen mikrobiellen Proben gefunden wurden.
Aufgrund der Bildung freier Koagulase kann S. aureus von den übrigen,
koagulasenegativen Staphylokokken (KNS) differenziert werden und gilt als
wesentlicher humanpathogener Erreger unter den Staphylokokken. Seine Kolonien
weisen eine goldgelbe Farbe auf Blutagar und häufig einen hämolytischen Saum auf
[29].
Die Hauptvertreter der koagulasenegativen Staphylokokken sind S. epidermidis, S.
haemolyticus, S. hominis subsp. hominis, S.lugdunensis und S. saprophyticus. Letzterer
ist der zweithäufigste Erreger von Harnwegsinfektionen der jungen Frau [29]. S.
epidermidis, der zur physiologischen Hautflora gehört, kann ebenso wie S. haemolyticus
und S. hominis subsp. hominis Infektionen von Plastikmaterialien (Endoplastitis)
hervorrufen.
2
1.2 Die Rolle als Krankheitserreger
Die durch S. aureus hervorgerufenen Krankheitsbilder lassen sich grob in zwei
Kategorien einteilen: Infektionen, bei denen sich der Erreger am Infektionsort befindet
(oberflächlich-eitrig oder tief-invasiv verlaufend), und toxinbedingte Syndrome, bei
denen das sezernierte S. aureus-Toxin für das infektiologische Geschehen
verantwortlich ist [29].
S. aureus besitzt eine Reihe von zellwandgebundenen Virulenzfaktoren, extrazellulären
Enzymen und Toxinen, die neben der Anwesenheit des Erregers für die Symptomatik
bei Infektionen verantwortlich sind.
Bei den toxinbedingten Erkrankungen (siehe Tabelle 2) treten die Erreger selbst meist
nicht am Ort der Symptomatik auf. Eine häufige Erkrankung stellt die staphylogene
Nahrungsmittelvergiftung durch die Enterotoxine A-E dar. Diese Enterotoxine werden
typischerweise von S. aureus gebildet, während sich die Bakterien in kontaminierten
Nahrungsmitteln vermehren. Da die Toxine hitzestabil sind, bleiben sie auch nach
Wiedererhitzen intakt. Nur die Toxine befinden sich in der aufgenommenen Nahrung,
nicht die Bakterien selber, weshalb die Dauer der Symptome wie Übelkeit, Erbrechen
und Diarrhoe durch die Ausscheidung der Toxine limitiert ist [29]. Weitere
toxinvermittelte, jedoch seltenere Krankheitsbilder sind das Staphylococcal scalded skin
syndrom (SSSS) und das Toxische-Schock-Syndrom (siehe Tabelle 1).
Tab. 1: Wichtige toxinbedingte Erkrankungen
Toxin Erkrankung
Enterotoxine A-E Lebensmittelintoxikation
Exfoliative Toxine A und B Exfoliative Dermatitis
Toxisches-Shock-Syndrom-Toxin (TSST) Toxisches Schock-Syndrom
3
Häufige lokalisierte Manifestationen einer Infektion mit Staphylokokken im ambulanten
Bereich sind umschriebene Abszesse, unter anderem in Form von Furunkeln und
Karbunkeln, aber auch Tonsillarabszesse. Seltener sind im ambulanten Bereich
diagnostizierte Pneumonien, die durch S. aureus hervorgerufen werden.
1.2.1 Durch S. aureus hervorgerufene Erkrankungen
Das Spektrum der durch S. aureus hervorgerufenen Erkrankungen reicht von
superfiziellen Haut- und Weichteilinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen
Erkrankungen wie Pneumonien, endovaskulären Infektionen, Sepsis und tiefen
Gewebe- und Knocheninfektionen.
Einige Patientengruppen haben ein höheres Risiko sich mit S. aureus zu infizieren, z.B.
immungeschwächte Patienten (HIV-Infektionen), Diabetiker, Drogen- und
Alkoholabhängige und Patienten, die eine Hämo- oder Peritonealdialyse benötigen. Der
wichtigste Risikofaktor für eine Infektion mit S. aureus ist jedoch die chronische
Besiedlung der Haut.
Die Erkrankungen, für die S. aureus verantwortlich ist, kann man u.a. in lokalisierte
(z.B. Follikulitis, Erysipel, postoperative Wundinfektionen) und generalisierte (z.B.
Sepsis, Endokarditis) Erkrankungen einteilen [29].
Zu den generalisierten von S. aureus hervorgerufenen Erkrankungen gehört die
Staphylokokken-Sepsis. Eine der schwersten Komplikationen ist die infektiöse
Endokarditis einer nativen oder künstlichen Herzklappe [29]. Sie kann zur
Klappendestruktion, peripheren septischen Embolie, Myokarditis und Schock trotz
adäquater antibiotischer Therapie führen. Zudem kann S. aureus Pneumonien
verursachen. Für zehn Prozent der ambulant erworbenen Pneumonien und für 20-30%
der nosokomialen Pneumonien ist S. aureus verantwortlich [18].
Eine weitere Erkrankung, bei der S. aureus der Haupterreger ist, ist die Osteomyelitis.
In 50-70% der Fälle wird sie durch S. aureus hervorgerufen [2, 3, 27, 42]. Seit
Einführung einer effizienten antibiotischen Therapie ist ihre Inzidenz gesunken und die
Letalität liegt beinahe bei null Prozent.
4
1.2.2 Die Bedeutung von S. aureus bei nosokomialen Infektionen
Nosokomiale Infektionen sind solche, die bei hospitalisierten Patienten auftreten.
Innerhalb eines Krankenhauses treten solche Infektionen häufiger auf Intensivstationen
als auf peripheren Stationen auf. S. aureus ist neben koagulasenegativen
Staphylokokken der häufigste Erreger von nosokomial erworbenen Bakteriämien, der
häufigste Erreger von chirurgischen Wundinfektionen (28%) [11] und nosokomialen
Pneumonien (28%) [18]. Die Letalität von invasiven S. aureus Infektionen liegt
zwischen 19% und 34% [25, 26, 31, 32]. Die 30-Tages-Sterblichkeit ist insbesondere
bei Infektionen des unteren Respirationstraktes, bei Diabetes mellitus, Alter über 65
Jahre, einem nicht eradizierten Fokus, einem septischen Schock oder einer nicht
ausreichende Gabe eines penicillinasefesten Penicillins erhöht [31].
Ein wichtiger Risikofaktor ist die chronische Besiedlung der Haut mit S. aureus. Die
S. aureus-Trägerrate variiert in der gesunden Bevölkerung von zehn bis zu 40% [2, 8,
25], wobei die Nasenvorhöfe das primäre Reservoir darstellen. Aber auch an anderen
Körperstellen wie in der Axilla, der Leistenregion und im Rachen kann sich eine
Keimbesiedlung befinden. Oft ist das nasale Erregerreservoir die wichtigste
Infektionsquelle; in bis zu 80% ist der Stamm aus den Nasenvorhöfen für eine
Bakteriämie verantwortlich [9].
1.3 Resistenz gegen Beta-Laktam-Antibiotika
1.3.1 Beschreibung der Wirkungsweise der Beta-Laktam-Antibiotika
Zu den Beta-Laktam-Antibiotika zählen die Penicilline und Penicillinderivate, die
Cephalosporine, Monobactame und Carbapeneme.
Die Beta-Laktam-Antibiotika zeichnen sich alle durch einen Beta-Laktamring aus, der
ein Strukturanalogon zur D-Alanyl-D-Alanin Endgruppe des Peptidoglykans ist
(Abb.1). Sie hemmen die Zellwandsynthese der Bakterien, indem sie die
Quervernetzung von Peptidoglykan, einem Bestandteil der Zellwand grampositiver
Bakterien, verhindern. Der Beta-Laktamring der Beta-Laktame wird von dem
bakteriellen Enzym D-Alanin-Transpeptidase gebunden, so dass dieses nicht mehr für
den bakteriellen Zellwandaufbau zur Verfügung steht. Somit wirkt Penicillin bakterizid
5
auf proliferierende Keime, da Fehler in der Zellwandsynthese auftreten, die zu Lyse und
Tod der Bakterienzelle führen.
Abb. 1: Aufbau von Antibiotika
von oben nach unten: a) Beta-Laktamring, b) Penicillin, c) Cephalonsporin [47]
Penicillin G war das erste Penicillin, das therapeutisch zur Anwendung kam. Es hat
auch heute noch eine gute Wirksamkeit gegen viele Streptokokken, C. diphtheriae,
Clostridium perfringens, Treponema pallidum und Meningokokken. Die meisten
Staphylokokkenstämme sind mittlerweile aufgrund der Bildung von Beta-Laktamasen
oder veränderten Penicillinbindungsproteinen resistent.
Penicilline mit einem breiteren Wirkungsspektrum sind die Aminopenicilline
(Ampicillin, Amoxicillin) und Acylaminopenicilline (Piperacillin, Mezlocillin), die
prinzipiell auch gegen gramnegative Bakterien (H. influenza, E. coli, Salmonellen)
wirken können. Aminopenicilline und Acylaminopenicilline werden oft als fixe
Kombination mit Beta-Laktamase-Inhibitoren gegeben (Clavulansäure, Sulbactam,
Tazobactam), die die Beta-Laktamasen der Staphylokokken, und die einiger anderer
Bakterien, hemmen und selbst keine ausreichende antibakterielle Wirkung besitzen.
Ein weiteres Penicillinderivat ist Mecillinam, das ein Penicillingrundgerüst besitzt,
jedoch kein Acylierungsprodukt der 6-Aminopenicillinsäure ist. Es wirkt vor allem
gegen gramnegative Bakterien und wurde in der Vergangenheit v.a. bei
Harnwegsinfektionen eingesetzt [43]. Aufgrund der begrenzten Wirksamkeit (oft nur in
6
Kombination mit Ampicillin verwendet) und der Instabilität gegenüber Beta-
Laktamasen erreichte Mecillinam keine große Bedeutung in der klinischen Therapie
von Infektionserkrankungen.
Da die bisher genannten Penicillinderivate nicht bei Staphylokokken mit einer Beta-
Laktamase wirken, wurden Beta-Laktamase-resistente Penicilline wie Oxacillin,
Dicloxacillin oder Flucloxacillin entwickelt. Sonst gibt es keine anderen Vorteile
gegenüber Penicillin G, da sie weniger wirksam gegenüber anderen Bakterien sind.
Cephalosporine besitzen ebenfalls einen Beta-Laktamring, wirken wie die Penicilline,
und sind stabil gegenüber Penicillinasen von Staphylokokken. Die Einteilung erfolgt
nach Generationen gemäß der zeitlichen Markteinführung. Gleichzeitig spiegelt sie eine
zunehmende Spektrumserweiterung gegen gramnegative Stäbchenbakterien wieder.
Zu der ersten Generation, die gut gegen grampositive Bakterien wirksam ist, aber
Lücken im gramnegativen Bereich aufweist, gehört u.a. Cefazolin.
Cefuroxim ist ein 2. Generations-Cephalosporin mit einem erweiterten Spektrum gegen
gramnegative Stäbchen.
Breitspektrumscephalosporine gehören der dritten Generation an (Ceftriaxon,
Cefotaxim), die auch gegen Enterobakterien wirksam sind und eine Beta-
Laktamasestabilität aufweisen.
Die Carbapeneme (Imipenem) haben das breiteste Wirkungsspektrum aller Antibiotika
(fast alle grampositiven und –negativen Bakterien) und sind gegen sehr viele Beta-
Laktamasen stabil.
1.3.2 Zwei Resistenzmechanismen gegen Beta-Laktam-Antibiotika
Ein Mechanismus, über den die Penicillinresistenz vermittelt wird, ist die Produktion
einer Penicillinase. Penicillinasen von Staphylokokken sind sezernierte Enzyme, die
Penicillin G, Aminopenicilline und Acylaminopenicilline, nicht jedoch
Isoxazolylpenicilline wie Flucloxacillin und Cephalosporine inaktivieren, indem sie den
Beta-Laktam-Ring hydrolisieren. Schon kurz nach der Einführung des Penicillins als
Therapeutikum in der Mitte der 1940er Jahre tauchten die ersten Penicillinase
produzierenden S. aureus auf.
Der zweite Resistenzmechanismus basiert auf der Bildung eines zusätzlichen Penicillin-
Bindungs-Proteins, dem PBP2a bzw. PBP2´. Das PBP2a besitzt eine reduzierte Affinität
zu den Beta-Laktam-Antibiotika, so dass diese bei therapeutischer Dosis nicht mehr
7
binden. Es ist für eine breite Resistenz gegen alle derzeit zugelassenen Beta-Laktame
verantwortlich. Dieser Mechanismus liegt bei MRSA (= methicillin resistant
staphylococcus aureus) Stämmen vor. Namensgebend war dabei die Resistenz gegen
das heute nicht mehr eingesetzte penicillinasefeste Methicillin.
Abb. 2: Methicillin [48]
1.3.3 Eigenschaften von Beta-Laktamasen
Die Penicillinasen von S. aureus gehören zu den Beta-Laktamasen. Es gibt mittlerweile
hunderte von unterschiedlichen Beta-Laktamasen, die nach zwei Klassifikationen
eingeteilt werden.
Die erste Klassifikation beruht auf Bush et al. und unterscheidet nach dem bevorzugten
Substrat der Betalaktamasen und ihrer Empfindlichkeit gegenüber Beta-Laktamase-
Inhibitoren (Tabelle 2) [28]. Das Problem bei dieser Einteilung ist, dass durch
Punktmutationen die Substratspezifität und die Empfindlichkeit gegenüber Beta-
Laktamase-Inhibitoren verändert werden kann und dadurch die Gruppenzugehörigkeit
nicht stabil ist.
Die zweite Möglichkeit beruht auf einer sequenzbasierten Einteilung nach Ambler [28].
Diese beinhaltet die Beta-Laktamaseklassen A bis D. Die vier Penicillinasen (A, B, C,
D) von S. aureus gehören der Klasse A nach Ambler an [49] und der Klasse 2 a nach
Bush [28].
Klasse A nach der Klassifikation von Ambler sind Serin-Beta-Laktamasen, die aus
mehreren Untergruppen nach der Klassifikation nach Bush bestehen (2a, 2b, 2be, 2br,
2c, 2e, 2f) und verschiedene Eigenschaften besitzen können. Das bevorzugte Substrat ist
Penicillin, verschiedene Untergruppen können aber auch zusätzlich eine gleiche oder
8
höhere Affinität zu anderen Substraten haben (z.B. 2be und 2e zu Cefotaxim).
Clavulansäure als Beta-Laktamase-Inhibitor inhibiert die Penicillinasen der Gruppe A,
wobei es auch Ausnahmen gibt (2br wird nicht inhibiert, 2c nur schwach).
Die Klasse B Betalaktamasen nach Ambler heißen auch Metallo-Beta-Laktamasen. In
der Klassifikation nach Bush gehört sie der Gruppe drei an und gute Substrate sind
Penicillin, Oxacillin, Carbonylpenicillin, Cefotaxim, Cephaloridin und Imipenem.
Clavulansäure inhibiert nicht.
Die Beta-Laktamasen der Klasse C gehören nach der Einteilung nach Bush der Gruppe
eins an und haben Cephaloridin als bevorzugtes Substrat. Diese Beta-Laktamasen
können durch Cloxacillin inhibiert werden.
Beta-Laktamasen der Klasse D haben als bevorzugtes Substrat Oxacillin, können aber
auch andere Beta-Laktame hydrolysieren. Sie gehören unterschiedlichen funktionellen
Gruppen nach Bush an und werden durch Clavulansäure kaum inhibiert.
Tab. 2: Klassifikation der Beta-Laktamasen nach Bush
Bush-
Jacoby-
Medeiros
Gruppe
Molekulare
Klasse
Bevorzugte
Substrate
Inhibiert durch:
Clavulansäure/EDTA
Beispiele für
Enzyme
1 C Cephalosporine - + AmpC Beta-
Laktamase
2a A Penicillin - + Penicillinasen
grampos.
Bakterien
2b A Penicillin,
Cephalosporine
+ - TEM-1, TEM-
2, SHV-1
2be A Penicillin,
Cephalosporine,
Monobaktame
+ - TEM-3 bis
TEM-26, SHV-
2 bis SHV-6
2br A Penicilline +/- - TEM-30 bis
TEM-36, TCR-
1
9
2c A Penicilline,
Carbenicillin
+ - PSE-1, PSE-3,
PSE-4
2d D Penicilline,
Cloxacillin
+/- - OXA-1 bis
OXA-11, PSE-2
2e A Cephalosporine + - Cephalosporina-
sen P. vulgaris
2f A Penicilline,
Cephalosporine
Carbapeneme
+ - NMC-A, Sme-1
3 B meisten Beta-
Laktame, inkl.
Carbapeneme
- + L1, CcrA
4 NDb Penicillin - ? Penicillinase P.
cepacia
Übernommen von K. Bush, G.A. Jacoby und A.A. Medeiros (1995). Antimicrob. Agents Chemother. 39:
1211-1233
Die Penicillinasen von Staphylokokken werden in die Typen A, B, C und D eingeteilt.
Diese Terminologie kann verwirrend sein, denn sie alle gehören zu den Beta-
Laktamasen des Klasse A nach Ambler und werden dementsprechend durch
Clavulansäure gehemmt.
Diese Einteilung der Penicillinasen basiert auf der unterschiedlichen Fähigkeit der vier
Typen zur Hydrolyse verschiedener Antibiotika (Tab. 3), sowie unterschiedlichen
kinetischen Eigenschaften. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die
Penicillinasen zu typisieren. Richmond klassifizierte die Typen A-D immunologisch
mittels Antiseren gegen die extrazelluläre Penicillinase [39]. Die Bestimmung des
isoelektrischen Punktes ist bei Staphylokokken unbefriedigend, da sie um den
isoelektrischen Punkt wenig löslich sind [49]. Eine aktuelle Klassifikation beruht auf
Unterschieden in der Kinetik und Unterschieden in der Fähigkeit zur Hydrolyse von
Penicillin und Cephalosporinen [24 ,49].
10
Die Staphylokokken-Penicillinasen vom Typ A und C kommen in den USA und Europa
vor, während man Typ B hauptsächlich in Isolaten aus Skandinavien und den USA
findet. Typ D ist überall selten vorzufinden [28].
Tab. 3: Einteilung der Penicillinasen von Staphylokokken
Fähigkeit zur
Hydrolyse
Antibiotikum Penicillinase
Typ A
Penicillinase
Typ B
Penicillinase
Typ C
Penicillinase
Typ D
Cephaloridine - + + -
Cefazolin + - - (+)
Cephapirin + - + -
Cephalotin - (-) (-) -
Cefamandole - + + -
Cefuroxime - / / /
Nitrocefin + - - +
Ampicillin - + + -
Penicillin G (+) + + -
+ gutes Substrat; (+) Hydrolyse möglich; (-) kaum Hydrolyse möglich; - stabil
In Anlehnung an "Km-Werte (Michaelis-Konstante) für ß-Laktam-Antibiotika von gereinigten
Penicillinasen von S. aureus“ aus Zygmunt DJ, Stratton CW, Kernodle DS (1992). Antmicrob Agents
Chemother 36, 440-445
Bei S. aureus sind die Penicillinasen sind ca. 30 kDa groß und bestehen aus 257
Aminosäuren, wobei die Aminosäuren 128 und 216 die entscheidenden für das
kinetische Profil einer Penicillinase sind. Zum Beispiel kommt es durch die Substitution
von Asparagin für Serin an der Position 216 in der Typ A Penicillinase zu einer nicht
von Typ C zu unterscheidenden Kinetik [45]. Die Penicillinasen sind im Allgemeinen
durch Beta-Laktamase-Inhibitoren hemmbar.
11
Alle vier Penicillinasetypen sind gegen Benzyl-, Amino- und Carboxylpenicilline aktiv,
während Isoxazolylpenicilline, Nafcillin und Methicillin stabil sind. Es gibt aber auch
Unterschiede in der Aktivität gegenüber verschiedenen Antibiotika zwischen den
Pencillinasetypen. So ist die Hydrolyse von Cefazolin typisch für die Typ A-Beta-
Laktamase, d.h. Produzenten dieser Beta-Laktamase sind resistenter gegenüber
Cefazolin, während Typ C nicht gut durch Tazobactam hemmbar ist [28].
1.3.4 Die Therapie der Infektionen mit S. aureus
S. aureus ist primär empfindlich gegenüber Beta-Laktam-Antibiotika (Penicillin,
Cephalosporine, Carbapeneme). Wenn eine Penicillinasebildung sicher ausgeschlossen
werden kann, sollte Penicillin bevorzugt werden, da es die höchste Aktivität und somit
Wirksamkeit gegen Staphylokokken aufweist. Die Wirkungsunterschiede zwischen den
einzelnen Penicillinen beruhen u.a. auf einer verschiedenen Affinität zu den Penicillin-
Bindungsproteinen (PBP) der Bakterien, die auch eine Rolle in der Ausbildung der
Methicillinresistenz spielen (PBP2a) [16, 33]. Inzwischen bilden allerdings bis zu 80%
der Bakterienstämme eine Beta-Laktamase, die das Penicillin hydrolisiert und
unwirksam macht [13, 32].
Deshalb ist eine sichere Unterscheidung zwischen penicillinsensiblen und
penicillinresistenten S. aureus Stämmen von großer klinischer Bedeutung, da sie
therapeutische Konsequenzen nach sich zieht. Ist ein Stamm penicillinsensibel, wird
Penicillin G als Antibiotikum der ersten Wahl verabreicht.
Bei MRSA-Stämmen ist keines der derzeit zugelassenen Betalaktam-Antiobiotika
wirksam und es muss auf andere Antibiotikaklassen ausgewichen werden. Meistens
erfolgt eine Therapie von MRSA-Infektionen mittels Vancomycin oder Linezolid.
1.4 Ausbildung der Beta-Laktam-Resistenz
1.4.1 Regulation der Expression von Penicillinasen
Die Gene für Penicillinasen bei S. aureus liegen auf Plasmiden. Die Expression ist
induzierbar [5, 21]. Verantwortlich für die Synthese ist das Bla-Operon. Es besteht aus
blaZ, dem Gen, das für die Penicillinase kodiert, und zwei regulatorischen Genen,
12
blaR1-blaI, die aufwärts nebeneinander lokalisiert sind und in der entgegengesetzten
Richtung zu blaZ transkribiert werden. Dabei kodiert blaR1 für die Funktion eines
transmembranösen Signalüberträgers mit Anti-Repressor-Aktivität und blaI kodiert für
den Repressor der Penicillinase-Synthese [6].
In Anwesenheit von Beta-Laktam-Antibiotika wird die Expression der Penicillinase
induziert, indem das Beta-Laktam an den extrazellulären Teil von BlaR1 bindet.
Dadurch kommt es zu einer Konformationsänderung, die die intrazelluläre
proteolytische Aktivität von BlaR1 aktiviert. Der Repressor BlaI wird von der BlaR1-
Protease gespalten, so dass er nicht länger an den Bla-Operator binden kann. Somit
kann blaZ-mRNA abgelesen und Penicillinase produziert werden [6, 17].
Beta-Laktam-Antibiotika können über diese Kaskade die Bildung einer Penicillinase
induzieren.
Abb. 3: Regulation der Expression von Penicillinasen
1.4.2 Zusammenspiel der Regulation von mecA und blaZ
Das verantwortliche Gen für die Methicillin-Resistenz in S. aureus (MRSA) ist mecA.
Es kodiert für ein zusätzliches Penicillin-Bindungsprotein mit reduzierter Affinität für
alle Beta-Laktame, PBP2a, und liegt auf einem mobilen staphylococcal cassette
chromosome (SCCmec), das horizontal unter Staphylokokken übertragbar ist. Das Mec-
Operon ist ähnlich organisiert wie das Bla-Operon. Der Repressor MecI bindet an das
Mec-operon und verhindert so eine Transkription von mecA. Durch die Anwesenheit
von Beta-Lakam-Antibiotika wird MecR1, das wie BlaR1 ein transmembranöser
Signalübermittler mit Anti-Repressor-Aktivität ist, induziert [5, 17].
13
Der blaR1-blaI-Komplex weist eine signifikante Homologie der Aminosäuren zum
mecR1-mecI-Komplex auf [6, 23]. Daher können MecI und BlaI an dieselbe MecA-
MecR1-Promoter-Operator-Sequenz binden. Zusätzlich zur Transkription von blaZ
kann BlaI auch die Transkription von mecA reprimieren, es wirkt allerdings als
Repressor weniger stark als MecI [23, 30].
Es besteht somit eine Koregulation von mecA durch MecI und BlaI [40].
Das Ziel dieser Koregulation ist entweder PBP2a oder Penicillinase, da beide auch ohne
Induktion in großen Mengen produziert werden können. Die Überproduktion von
mecR1, was zu einer erhöhten Synthese von PBP2a in Abwesenheit von Beta-Laktamen
führt, verlangsamt das Zellwachstum und bringt so einen Selektionsnachteil für die
Zelle mit sich [40]. Die regulatorischen Gene für die Penicillinase scheinen eine Lösung
für den Bedarf an Kontrolle über die PBP2a-Produktion zu sein, da sie zu einer
Minimierung der Energie für die Aufrechterhaltung von mecA beitragen und
gleichzeitig fähig sind PBP2a in Anwesenheit von Antibiotika zu exprimieren.
Deshalb spielen Penicillinase-Plasmide, die in MRSA vorkommen, eine wichtige Rolle
in der Stabilität der phänotypischen Expression des mecA Gens [17, 23].
1.5 Ziel dieser Doktorarbeit
Über 80% der klinisch isolierten Stämme von S. aureus weisen heutzutage eine
Resistenz gegenüber Penicillin G auf [13, 32], die typischerweise durch Penicillinasen
verursacht wird. Dabei gilt S. aureus zusammen mit den koagulasenegativen
Staphylokokken als einer der Hauptverursacher von nosokomialen Bakteriämien und
ambulant erworbenen Infektionen [10, 36, 46]. Die zuverlässige Identifizierung einer
Penicillinaseproduktion ist wichtig, da Penicillin nach wie vor aufgrund seiner Affinität
zu den Bindungsproteinen von S. aureus als Mittel der Wahl bei penicillinase-negativen
penicillin-sensiblen S. aureus-Stämmen gilt [38]. Eine falsch sensible Meldung in der
Testung auf die Empfindlichkeit gegenüber Penicillin kann in einer inadäquaten
Therapie und damit in einer potentiell lebensgefährlichen Situation für den Patienten
resultieren. Andererseits führen falsch resistente Meldungen dazu, dass dem Patienten
die wirksamste Therapie vorenthalten wird. Eine MHK von ≤ 0,12 mg/l gilt formal als
sensibel, aber das CLSI empfiehlt zusätzliche Testungen [7] zur Detektion von
Penicillinasen, z.B. molekulare Methoden wie die PCR, oder phänotypische Tests.
14
Das Ziel dieser Studie war es fünf phänotypische Methoden zur Erkennung einer
Penicillinase in S. aureus miteinander zu vergleichen. Getestet wurden der
Agardiffusionstest, der Hemmhofrandcharakter, der Cloverleaf-Test, der Nitrocefin-
Test und der Jod-Stärke-Test. Als Referenzmethode wurde die blaZ PCR gewählt. Es
wurden nur Isolate getestet, die laut VITEK 2 eine MHK im sensiblen Bereich
aufwiesen (MHK ≤ 0,12 mg/l).
Nachfolgend sollen kurz die Prinzipien dieser fünf phänotypischen Methoden erläutert
werden. Dem Prinzip des Agardiffusionstests und der Hemmhofcharakterisierung liegt
eine Diffusion des Antibiotikums (hier: Mecillinam und Penicillin) in den mit dem zu
testenden Stamm beimpften Agar zugrunde. Ist der Stamm penicillinsensibel, ist der
Hemmhof größer und die Koloniegröße nimmt graduell ab, was einer unscharfen
Hemmhofrandbegrenzung entspricht. Bildet der Teststamm jedoch eine Penicillinase
aus, ergibt sich eine scharfe Begrenzung des Hemmhofrandes um das Antibiotika-
Testblättchen herum mit einer kleineren Hemmhofgröße [12, 34].
Bei der Durchführung des Cloverleaf-Tests kommt es zu einem Wachstum des
penicillinsensiblen S. aureus ATCC 25923 im Bereich des Impfstrichs des zu testenden
Stammes in den Hemmhof hinein, da bei Penicillinasebildung des Teststammes das
Enzym in den Agar hineindiffundiert und so das Wachstum des S. aureus ATCC 25923
ermöglicht [19, 34].
Nitrocefin ist ein empfindliches Cephalosporin, dessen Beta-Laktamring in
Anwesenheit einer Beta-Laktamase gespalten wird. Dabei werden chromophore
Gruppen frei, so dass das Produkt bei der Produktion einer Penicillinase farbig erscheint
[19, 34, 37].
Das Prinzip des Jod-Stärke-Tests ist, dass Jod und Stärke zusammen einen
purpurfarbenen Komplex bilden. Wird von einem Stamm Penicillinase produziert,
wandelt sich Penicillin zu Penicillinsäure um und Jod wird in Jodid umgewandelt. Jodid
kann mit Stärke keinen purpurfarbenen Komplex mehr bilden, deshalb entfärbt sich der
Agar um penicillinasepositive Stämme herum und wird weiß [19, 33, 34, 35].
Die für diese Studie verwendeten S. aureus-Isolate stammen aus dem Institut für
Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum, das sein Untersuchungsmaterial aus den
Universitätskliniken und Akademischen Lehrkrankenhäusern der Umgebung erhält. Es
wurden nur Stämme mit in die Studie eingeschlossen, die im VITEK 2 eine MHK von
≤ 0,12 mg/l besaßen, da ab dieser MHK laut CLSI die Stämme formal als
penicillinsensibel gelten [7]. Das heißt, dass diese Stämme keine Penicillinase ausbilden
und somit Penicillin als Antibiotikum klinisch wirksam ist. Dieses gilt für Penicillin G
15
und seine Derivate ebenso wie für Ampicillin, Mezlocillin und Piperacillin. Aufgrund
der ähnlichen Struktur sind die zuvor genannten Antibiotika bei Ausbildung einer
Penicillinresistenz ebenso klinisch unwirksam und man muss bei der Therapie von
Infektionserkrankungen auf Alternativen zurückgreifen oder eine Kombination mit
einem Beta-Laktamase-Inhibitor anstreben. Daher ist die zuverlässige Identifikation
einer Penicillinaseproduktion für die Therapie von Infektionskrankheiten sehr wichtig.
Ein weiteres Penicillinderivat ist Mecillinam. Aufgrund seiner begrenzten Wirksamkeit
und Instabilität gegenüber Beta-Laktamasen erreichte Mecillinam keine große
Bedeutung in der klinischen Therapie von Infektionserkrankungen und gewann
vielmehr an wissenschaftlicher Bedeutung [44]. Es bewirkt die Ausbildung großer (50-
100 faches Volumen), kugelförmiger Zellen, die in Medien mit niedriger Osmolarität
nicht lysieren. Verschiedene Elektrolytkonzentrationen in den Medien können im
gleichen Organismus verschiedene MHK oder Hemmhofrandgrößen hervorrufen [43],
so dass Mecillinam oft in wissenschaftlichen Arbeiten, wie auch hier, verwendet wurde.
16
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
di-Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland
Jod Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland
Kalium-dihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland
Kaliumjodid (KI) Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland
NaCl Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland
1 M HCL Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland
Ethanol Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland
Alle Chemikalien stammten, wenn nicht anders angegeben, von Merck KgaA,
Darmstadt, Deutschland und sind in der Qualität hochrein.
2.1.2 Medien und Agar
Agar Agar Otto Norwald GmbH, Hamburg, Deutschland
Columbia Blutagar Oxoid, Wesel, Deutsachland
31,2 g Columbia Agar
ad 800 ml Aqua bidest
32 ml defibriniertes Schafsblut
DNase-Agar Oxoid, Wesel, Deutsachland
9,75 g DNase-Agar
ad 250 ml Aqua bidest
Jod-Stärke-Agar eigene Herstellung
17
LB-Bouillon Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Mueller-Hinton Agar Merck, Darmstadt, Deutschland
34 g Mueller-Hinton-Agar
ad 1000 ml Aqua bidest
Nutrient-Agar Oxoid, Wesel, Deutsachland
Nutrient Broth
TMA(Trehalose-Mannitol)–Agar Difco über Otto Norwald GmbH, Hamburg,
Deutschland
15,5 g Purple-Agar-Base (DIFCO 222810)
ad 450 ml Aqua bidest
4,5 g Trehalose (Merck 1.08216) und 5,0 g
Mannitol (Merck 1.05982)
0,05 g Phenophthalein-diphosphat
ad 50 ml Aqua bidest
Einfriermedium 30% Glycerin
0,2% kalt lösliche Stärke Applichem, Darmstadt, Deutschland
Jod-Stärke-Agar 6,5 g Nutrient-Broth
1 g wasserlösliche Stärke
7,5 g Agar Agar
ad 500 ml Aqua bidest
0,1 mg Oxacillin
Nitrocefin-Teststäbchen Oxoid, Wesel ,Deutschland
Nutrient-Agar-Platten Oxoid, Wesel, Deutschland
0,2% kalt löslicher Stärke und 0,2 mg/l Oxacillin
Penicillin-Jod-Lösung: 2 Stammlösungen ansetzen
1M K2HPO4: 87,09 g K2HPO4 (di-Kaliumhydrogenphosphat)
ad 500 ml destilliertes Wasser
18
1M KH2PO4: 68,05 g KH2PO4 (Kalium-dihydrogenphosphat)
ad 500 ml destilliertes Wasser
2,78 ml 1 M K2HPO4 und 7,22 ml 1 M KH2PO4
verrühren
ad 90 ml Aqua bidest
0,3 g I2 und 1,5 g Kaliumjodid (KI) und über 16 –
18 Stunden lösen. PH 6,4 mit Hilfe der
Stammlösungen oder mit sterilem Aqua bidest
einstellen.
Penicillin frisch vor der Testung hinzugeben
2 ml Lösung, 100 mg Penicillin.
2.1.3 Puffer und Lösungen
Jod-Lösung : 50 g/l Benzylpenicillin, 3 g/l Jod,
15 g/l KI in 0,1 M Phosphat-Puffer pH 6,4
2.1.3.1 Präparation der DNA
10 mM Tris pH 8,0
Lysostaphin für S. aureus / S. epidermidis Sigma, Taufkirchen, Deutschland
RNase Sigma, Taufkirchen, Deutschland
2.1.3.2 Verwendete Kits
QiAmp-Kit QiAmp Mini Kit oder DNeasy Mini
Kit Qiagen, Hilden, Deutschland
- ATL-Staph: 1ml 1 M Tris pH 8,0
600 µl Triton X-100
Ad 50 ml aqua bidest, sterifiltriert
- AW 1 Puffer
19
- AL Puffer
- AE Puffer
- Proteinkinase K
- Ethanol
- QiAmp spin Säule
2.1.3.3 PCR
dNTP´s GE Healthcare
Taq-Polymerase und PCR-Puffer GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont,
England
2.1.3.4 Elektrophorese
Stop-Mix (1:5 verdünnt in Puffer)
TAE-Puffer
Agarose Biozym DNA Agarose Biozym, Hessisch
Oldendorf, Deutschland
2.1.4 Antibiotika
Lösliches Benzylpenicillin Applichem, Darmstadt, Deutschland
Oxacillin Sigma, Taufkirchen, Deutschland
2.1.4.1 Antiobiotika-Testblättchen
Die Antibiotika-Testblättchen wurden von Oxoid (Wesel, Deutschland) bezogen und
waren mit folgenden Antibiotikakonzentrationen beschickt:
Mecillinam 10 µg/Plättchen
Penicillin 10 µg/Plättchen
20
2.1.5 Bakterienstämme
Von April 2005 bis Januar 2006 wurden 197 S. aureus Isolate gesammelt. Sie
stammten aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum, das sein
Untersuchungsmaterial aus den Schwerpunktkrankenhäusern der Umgebung erhält. Es
handelt sich zumeist um Universitätskliniken oder Akademische Lehrkrankenhäuser der
Ruhr-Universität Bochum. Dadurch sind ein hohes Patientenaufkommen und ein breites
Spektrum an Grunderkrankungen gegeben.
Alle Isolate waren im Institut für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum durch
den Agglutinationstest mit Slidex Staph Plus (bioMérieux, Marcy l´Etoile, Frankreich)
als S. aureus identifiziert worden. Gesammelt und zur Abteilung Medizinische
Mikrobiologie der Ruhr-Universität-Bochum verschickt wurden sie, sofern im Vitek 2
eine MHK für Penicillin ≤ 0,12 mg/l gemessen wurde.
Die Isolate wurden an der Ruhr-Universität-Bochum in einem 30%ig Glycerin
enthaltendem Einfriermedium bei -70°C asserviert.
S. aureus N315 (penicillinresistent) und ATCC 25923 (penicillinsensibel) wurden als
Kontrollstämme benutzt.
Von D. Kernodle, Vanderbilt University, Nashville, USA wurden folgende S. aureus
Stämme mit charakterisierten Penicillinasen zur Verfügung gestellt. PC1, NCTC 9789
(Typ A Penicillinase); -22260 (Typ B Penicillinase);- 3804 (pII 3804); RN9 (pII147);-
V 137 (Typ C Penicillinase) und FAR 10 (Typ D Penicillinase)
2.1.6 Geräte
Elektrophorese-Kammern Pharmacia (LKB GPS 200/400)
Heizblock Bioblock scientific
Magnetrührer Omnilab IIKA-COMBIM1G RCO
PCR-Gerät Mastercycler personal, Eppendorf
Schüttelwasserbad GFL 1083
Tischzentrifuge Biofuge pico, Haereus instruments
Ultraschallbad Branson 2510
VITEK 2 bioMérieux, Durham, NC, USA
21
Waagen 1. Mettler AE 100
2. Sartorius
Zentrifuge Biofuge stratos, Haereus instruments
2.2 Methoden
2.2.1 Anzucht der Bakterien
Die zu testenden S. aureus Stämme wurden aus dem Einfriermedium auf Columbia
Blutagarplatten über 16–18 Stunden bei 37°C angezüchtet. Nach sorgfältiger
Betrachtung der Agarplatten zum Ausschluss einer Verunreinigung wurden von der
Reinkultur einige Kolonien zur Herstellung einer Bakteriensuspension in
physiologischer Kochsalzlösung mit einer Dichte von McFarland 0,5 verwendet. Aus
dieser Suspension wurden sowohl alle Platten zur phänotypischen Testung, als auch die
Bouillon zur DNA-Präparation beimpft, so dass nur eine einmalige Passage der
Teststämme stattfand.
Für den Agardiffusions-Test und den Cloverleaf-Test wurden frische Mueller-Hinton-
Agarplatten verwendet.
2.2.2 Identifikation von S. aureus
Um S. aureus zu identifizieren gibt es verschiedene Möglichkeiten. Zum Einen kann
man S. aureus an seiner oben beschriebenen typischen Morphologie erkennen. Die
klassische Methode zur Abgrenzung von S. aureus von anderen Staphylokokkenspezies
(KNS) ist die Testung auf Koagulase, einem Enzym, das zusammen mit Prothrombin
einen proteolytischen Komplex bildet und so als Virulenzfaktor an der Bildung der
charakteristischen Fibrinkapsel beteiligt ist. Die derzeit am meisten in der
Routinediagnostik genutzte Möglichkeit zur Identifizierung von S. aureus ist die
Anwendung eines schnellen Agglutinationstests, z.B. Slidex Staph Plus (bioMérieux).
Dieser weist den Clumping factor zum Einen durch Latexpartikel nach, die mit
humanem Fibrinogen sensitiviert wurden, zum Anderen kann er auch Protein A und
häufige Kapselantigene von S. aureus nachweisen. Er gilt als positiv, wenn es zu einer
sichtbaren Agglutination der Latexpartikel kommt [15].
22
Eine weitere Methode ist die Verwendung eines DNAse-Testagars zum Nachweis des
Enzyms Desoxyribonuclease, das bei S. aureus vorkommt. Der Agar enthält Tryptose,
Desoxyribinucleinsäure und Natriumchlorid. Durch Zugabe von 1 M Salzsäure auf den
bebrüteten Agar bilden sich im positiven Fall klare Randsäume um die Kolonien. Dieses
geschieht durch Präzipitation der polymerisierten DNA.
Als molekularbiologische Methode zur Speziesidentifizierung bei S. aureus sind PCR-
Untersuchungen auf speziesspezifische Gene, wie SA 442 zu erwähnen [41].
Zudem gibt es halbautomatisierte Verfahren, die Hefen und Bakterien unter Nutzung
der physiologischen Eigenschaften des Isolates identifizieren können, sowie eine
Resistenzbestimmung durchführen können, z.B. der VITEK 2.
2.2.3 Überprüfung der Spezies als S. aureus
Um Verwechslung oder Kontamination der bereits als S. aureus im Institut für
Medizinische Mikrobiologie identifizierten Stämme auszuschließen, wurden die
Stämme phänotypisch durch Testung auf DNase überprüft. S. epidermidis als mögliche
Kontamination wurde durch Testung auf TMA-Testagar ausgeschlossen.
Alle Isolate waren bereits durch den VITEK 2, ein halbautomatisiertes Verfahren zur
Identifikation und Resistenzbestimmung, charakterisiert.
2.2.3.1 TMA-Testagar
Mit einer 10-µl-Öse wurden Teststämme strichförmig auf TMA-Agar beimpft. Bis zu
vier Stämme wurden auf eine Platte beimpft. Die Platte wurde 16-18 h bei 37°C
bebrütet.
Eine Gelbverfärbung wurde als positiv gewertet, d.h. Trehalose oder Mannitol werden
verstoffwechselt. Blieb der Agar violett wurde das Ergebnis als negativ gewertet, d.h.
weder Trehalose noch Mannitol wurden verstoffwechselt. Letztere Konstellation ist
typisch für S. epidermidis.
23
2.2.3.2 DNase-Testagar
Mit einer 10-µl-Öse wurden Teststämme strichförmig auf DNase-Agar beimpft. Bis zu
vier Stämme wurden auf eine Platte beimpft. Die Platte wurde 16-18 h bei 37°C
bebrütet.
Der Test wurde als DNase positiv protokolliert, wenn sich nach Überschichtung mit
HCl 1 M um den Teststamm herum keine Trübung des Agars zeigte. Eine positive
Reaktion ist charakteristisch für S. aureus.
2.2.4 Agardiffusions-Test
Der Agardiffusions-Test wurde gemäß den Vorgaben des Clinical and Laboratory
Standards Institut (CLSI) durchgeführt [7].
Ein steriler Wattetupfer wurde in die oben beschriebene, auf eine optische Dichte von
McFarland 0,5 eingestellt, Zellsuspension getaucht und am Rand des Reagenzröhrchens
ausgedrückt. Die gesamte Oberfläche von Mueller-Hinton Agarplatten wurde in drei
Schritten beimpft, wobei die Agarplatte jeweils um 60 Grad gedreht wurde.
Anschließend wurden Penicillin- und Mecillinam-Testblättchen mit einer Beschickung
von je 10 µg aufgelegt. Die Bebrütung erfolgte über 16–18 Stunden bei 35 +/- 2°C.
Danach wurde der Hemmhofdurchmesser gemessen.
Zudem wurde protokolliert, ob der Penicillin-Hemmhofrand scharf demarkiert war,
oder, ob die Begrenzung des Hemmhofrandes unscharf war. Ein scharfer Rand mit
normaler Koloniegröße direkt am Hemmhof wurde als positiv gewertet, eine unscharfe
Begrenzung mit graduell abnehmender Koloniegröße als negativ [12].
24
Abb. 4: scharf demarkierter Hemmhofrand [12]
Abb. 5: unscharf demarkierter Hemmhofrand [12]
25
2.2.5 Cloverleaf-Test
Eine Mueller-Hinton Agarplatte wurde mit S. aureus ATCC 25923 als Indikatorstamm
beimpft, indem man einen zuvor in auf 0,5 McFarland eingestellte Indikatorlösung
getauchten Wattetupfer auf der Platte ausgestrichen hat. Mittig wurde ein Blättchen
Penicillin aufgelegt und der zu testende Stamm aus der oben beschriebenen
Bakteriensuspension mit der Dichte McFarland 0,5 mit einer Öse strichförmig vom
Testblättchen zum Plattenrand aufgetragen; es wurden jeweils drei Stämme pro Platte
aufgetragen. Anschließend erfolgte eine Bebrütung der Platten über 16–18 Stunden bei
37°C.
Der Test wurde als positiv bewertet, wenn im Bereich des Impfstrichs des zu testenden
Stammes der penicillinsensible S. aureus ATCC 25923 in den Hemmhof hineinwuchs
(siehe Abbildung 6).
Abb. 6: Positiver Cloverleaf-Test
26
2.2.6 Nitrocefin-Test
Der Nitrocefin-Test wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Mit einem
Nitrocefin-Teststäbchen wurden vom Penicillin-Hemmhofrand einige Kolonien
abgenommen, das Stäbchen in einem Tropfen sterilem Aqua bidest kurz angefeuchtet,
und bis zu einer Stunde in einer zur Erhaltung des feuchten Milieus geschlossenen
Petrischale inkubiert. Ein Farbumschlag des Stäbchens von gelb nach rot wurde als
positiv gewertet und nach 5, 15, und 60 Minuten abgelesen.
2.2.7 Jod-Stärke-Test
Mit einer 10-µl-Öse wurden Teststämme strichförmig auf Jod-Stärke-Agar beimpft. Bis
zu vier Stämme wurden auf eine Platte beimpft. Die Platte wurde 16-18 h bei 37°C
bebrütet.
Am nächsten Tag wurden 2 ml der frisch zubereiteten Penicillin-Jod-Lösung auf die
Jod-Stärke Testplatte gegeben und durch Schwenken der Agarplatte gleichmäßig auf
dieser verteilt.
Der Test wurde als positiv abgelesen, wenn sich der unmittelbar nach der Zugabe der
Penicillin-Jod-Lösung blau verfärbte Agar um den Teststamm herum innerhalb von 2
Minuten weiß verfärbte. Er wurde ebenfalls als positiv abgelesen, wenn sich die Platte
unter dem Impfstrich weiß verfärbte. Dieses wurde überprüft, indem mit einer Öse
vorsichtig ein Teil des Impfstrichs entfernt wurde.
2.2.7.1 Kontrollplatten
Die Kontrollplatten wurden mit derselben auf 0,5 McFarland eingestellten
Bakteriensuspension beimpft, die schon für die phänotypischen Tests verwendet wurde.
Pro zu testendem Stamm wurde je eine halben Platte Blutagar verwendet und mittels 3-
Ösen-Ausstrich beimpft. Dann wurde sie über 16–18 Stunden bei 37°C bebrütet, um sie
am nächsten Tag nochmals auf ihre Reinheit zu überprüfen.
27
2.2.8 Präparation der genomischen DNA
Mit einer 1-µl-Öse wurde direkt aus dergleichen Suspension, die schon für die
phänotypischen Test verwendet wurde (0,5 McFarland Dichte), eine 4 ml LB-Bouillon
beimpft, die über 16–18 Stunden bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert wurde.
1 ml der beimpften LB-Bouillon wurde in eine Eppendorf Pipette gegeben und 1 min
bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das übriggebliebene
Pellet in 1 ml sterilem Aqua bidest durch Vortexen resuspendiert. Dieser Vorgang
wurde zweimal wiederholt. Beim dritten Mal wurde das Pellet in 100 µl 10 mM Tris pH
8,0 resuspendiert und 10 min bei 95°C im Heizblock erhitzt. Nach Abkühlung auf
Raumtemperatur wurde die Suspension 15 min im Ultraschallbad beschallt. Danach
erfolgte eine Zentrifugation bei 15000 rpm und 4°C für 10 min. Der Überstand wurde
vorsichtig in eine frische Eppendorf Pipette pipettiert.
Diese DNA-Präparation wurde bei -20 °C eingefroren und maximal zweimal wieder
aufgetaut.
2.2.9 Präparation der genomischen DNA mit dem QiAmp-Kit
Eine beimpfte LB-Bouillon wurde 16-18 h als Schüttelkultur inkubiert. Danach erfolgte
eine einminütige Zentrifugation mit Verwerfung des Überstandes. Das so entstandene
Pellet wurde in 180 µl ATL-Staph suspendiert. Nach der Zugabe von 20 µl Lysostaphin
für S. aureus, wurde 30 min bei 37ºC inkubiert. Nun gab man 25 µl Proteinkinase K und
200 µl AL hinzu, mischte alles gut und inkubierte 30 min bei 56ºC. Es erfolgte die
Zugabe von 20 µl RNase und eine erneute Inkubation für 2 min bei Raumtemperatur
und für 10 min bei 70ºC. Nach Zugabe von 200 µl Ethanol wurde alles kurz gemischt
und vorsichtig auf QiaAmp spin Säulen gegeben. Nach 1 min Zentrifugation wurden
200 µl AE zum eluieren der DNA hinzugegeben, alles 1 min bei Raumtemperatur
stehengelassen und dann 1 min zentrifugiert. Zum erneuten Eluieren der DNA wurde
dieser Schritt wiederholt. Das Eluat wurde gepoolt und bei -20ºC eingefroren.
5 µl des Eluats wurden auf ein Agarose-Gel zur Kontrolle gegeben.
2.2.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die PCR wurde als Duplex-PCR in einem Eppendorf Thermocycler durchgeführt. In
einem PCR-Tube wurden 5 µl PCR-Puffer, 8 µl dNTP´s (1,25 mM), 2,5 µl blaZ seq
28
Primer (10 pmol/µl), 2,5 µl blaZ rev Primer (10 pmol/µl), 22 µl Aqua bidest und 0,25 µl
Taq-Polymerase (5 U/µl) eingesetzt. Als Ziel-DNA wurden 5 µl der genomischen DNA
1:10 in aqua bidest verdünnt hinzugefügt.
Es wurde gleichzeitig die SA 442-PCR durch Zugabe von 0,625 µl SA 442 seq Primer
(10 pmol/µl) und 0,625 µl SA 442 rev Primer (10 pmol/µl) zur genomischen DNA
durchgeführt.
Begonnen wurde die PCR mit einer Denaturierungszeit von 5 min bei 94°C, es folgte
eine weitere Denaturierung bei 94°C für 30 s. Das Annealing erfolgte in 30 s bei 55°C,
die Elongation fand bei einer Temperatur von 72°C für 30 s statt. Beendet wurde die
PCR mit einem letzten Elongationsschritt (7 min bei 72°C), dazwischen lagen 30-35
Amplifikationszyklen. Alle Primer sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tab. 4: Primer der blaZ und SA 442-PCR
Bezeichnung Primersequenz Annealingtemperatur Amplifikatgröße
blaZ-fwd 5´-caa aga tga tat agt
tgc tta ttc tcc-3´
58,9°C 421 bp
blaZ-rev 5´-tgc ttg acc act ttt
atc agc-3´
55,9°C
SA 442 fwd 5´-gtc ggg tac acg
ata ttc ttc acg-3´
62,7°C 182 bp
SA 442 rev 5´-ctc tcg tat gac cag
ctt cgg tac-3´
64,4°C
Die Primer blaZ-fwd und blaZ-rev wurden anhand veröffentlichter Sequenzen der vier
bekannten Penicillinasen A-D (Genbank Accession NC_005127, M25254, U58139,
NC_005951 und AF086644) ausgewählt und binden in einem konservierten Bereich des
blaZ-Gens [41].
Die Primer SA 442 fwd und SA 442 rev binden spezifisch bei S. aureus [41].
Das blaZ-Gen ist 741 Basenpaare groß, darin liegt blaZ-fwd zwischen den Basen 267-
294 und blaZ-rev zwischen 667-682, bezogen auf Accession Nr. U58139.
29
Die Primer der S. aureus-spezifischen PCR sind SA 442 seq und rev [41].
2.2.11 Gel-Elektrophorese
Die PCR-Produkte wurden durch Gel-Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel
nachgewiesen. Als Größenmarker wurde eine 1kb-Ladder verwendet.
Im positiven Fall, d.h. bei Vorliegen einer Beta-Laktamase, amplifizieren beide Primer
einen 421 bp-großen Bereich der Beta-Laktamase.
Die SA 442-PCR sollte immer positiv sein. Sie bildet im positiven Fall ein 156 bp
großes PCR-Produkt [41].
2.2.12 Fehlerquellen
Mögliche Fehlerquellen bei der Durchführung und Auswertung der Versuche wurden
vorher identifiziert. Das Plasmid, das für die Beta-Laktam-Resistenz kodiert, kann
verloren gehen, was zu diskrepanten Ergebnissen in phänotypischen und genotypischen
Tests führt. Um dieses Problem zu umgehen, wurde die DNA aus dem Ansatz
präpariert, der auch für die phänotypischen Tests verwendet wurde.
Als interne Positivkontrolle zur Kontrolle der Qualität der DNA-Präparation und
nebenbei zur Speziesbestätigung erfolgte immer gleichzeitig eine SA 442-PCR, die
immer positiv ausfiel.
30
3 Ergebnisse
3.1 Auswertung der phänotypischen Tests
3.1.1 Phänotypische Tests zur Speziesüberprüfung
Die Testung mit DNase-Testagar zur S. aureus Speziesüberprüfung durch Nachweis des
Enzyms Desoxyribonuklease fiel immer positiv aus.
Der TMA-Agar zeigte immer einen Farbumschlag nach gelb an. Damit erfolgte die
Bestätigung der Speziesdiagnose, die zuvor durch Slidex Staph Plus im Institut für
Medizinische Mikrobiologie gestellt worden war, und es konnte eine Kontamination
durch die häufigste koagulasenegative Staphylokokkenspezies S. epidermidis
ausgeschlossen werden.
3.1.2 Ergebnisse der PCR-Untersuchung
Von den 197 getesteten Stämmen ließ sich in 28 Stämmen (14,2%) mit der blaZ PCR
das für eine Penicillinase kodierende Gen blaZ nachweisen. Bei 169 Stämmen konnte
kein solches PCR-Produkt nachgewiesen werden.
Diese molekularbiologische Methode wurde als Referenzmethode gewählt, gegen den
die phänoptypischen Methoden verglichen wurden (siehe Abbildung 7).
31
Abb. 7: blaZ PCR und SA 442 PCR positiv
N315: Positivkontrolle, Negativkontrolle: ATCC 25923, Stamm 1: positiv, Stamm 2: negativ,
Stamm 3: negativ
3.1.3 Ergebnisse der phänotypischen Methoden zur Penicillinase-Detektion
Bei der Differenzierung des Hemmhofrandcharakters wurden von 28 PCR-positiven
Stämmen wurden 20 als positiv erkannt, das entspricht einer Sensitivität von 71,4%.
Der Cloverleaf-Test detektierte 19 von 28 penicillinasepositiven Stämmen, was einer
Sensitivität von 67,8% entspricht. Der Jod-Stärke-Test erkannte 12 von 28 positiven
Stämmen, seine Sensitivität beträgt 42,9%. Die Detektion des Nitrocefin-Tests stellt
sich wie folgt dar: Nach 5 Minuten Beobachtungszeit wurden 7 Stämme als positiv
detektiert (Sensitivität von 25%), nach 15 Min 10 Stämme (35,7% Sensitivität) und
32
nach 60 Minuten 11 Stämme (39,3% Sensitivität). Die Festlegung eines Grenzwertes
von ≤ 28 mm im Agardiffusions-Test, wie es vom CLSI empfohlen wird, um einen
Stamm als penicillinresistent einzustufen [7], resultierte in 16 als richtig positiv
erkannten Stämmen, was einer Sensitivität von 57,1% für diesen Test entspricht.
In keinem dieser 5 phänotypischen Tests (Cloverleaf-Test, Agardiffusions-Test,
Hemmhofrandcharakter, Jod-Stärke-Test, Nitrocefin-Test) traten falsch positive
Ergebnisse auf, d.h. bei jedem positiven Ergebnis der 5 phänotypischen Methoden war
auch die blaZ-PCR positiv.
Tab. 5: Sensitivität der phänotypischen Tests
Phänotypischer Test Sensitivität Richtig Positive N= 28
Hemmhofrandcharakter 71,4% 20
Cloverleaf-Test 67,8% 19
Nitrocefin-Test 5 min 25,0% 7
Nitrocefin-Test 15 min 35,7% 10
Nitrocefin-Test 60 min 39,3% 11
Jod-Stärke-Test 42,9% 12
Agardiffusions-Test 57,1% 16
3.1.4 Ergebnisse des Agardiffusions-Tests
16 Stämme wiesen für Penicillin einen Hemmhofdurchmesser von ≤ 28 mm auf. Dies
gilt als Grenze zur Unterscheidung zwischen resistent und sensibel, also demnach
zwischen Penicillinaseproduzenten und -nichtproduzenten nach CLSI [7]. 181 Stämme
besaßen einen Hemmhof, der größer als 28 mm war. Unter diesen Stämmen befinden
sich 12, die in der PCR als penicillinasepositiv getestet worden waren. Unter den 16
Stämmen, die einen Hemmhofdurchmesser von ≤ 28 mm aufwiesen, befinden sich 2
Stämme, die in der PCR als penicillinasenegativ getestet wurden. Diese Verteilung ist in
Abbildung 8 dargestellt.
33
Abb. 8: Verteilung der Hemmhofdurchmesser im Agardiffusions-Test Penicillin
Die Verteilung von Penicillinaseproduzenten und -nichtproduzenten überlappen sich; bei
Anwendung des von CLSI empfohlenen Grenzwertes von 28 mm zeigen sich demzufolge 12 falsch
sensible Ergebnisse
Die Durchschnittswerte für penicillinasepositive und –negative Stämme betragen 27,9
mm bzw. 36,9 mm. Anhand des Diagrammes kann man erkennen, dass sich kein
eindeutiger Grenzwert zur Unterscheidung zwischen Penicillinaseproduzenten und
Nichtproduzenten aufgrund der Größe des Hemmhofdurchmessers festlegen lässt. Die
Verteilungen überlappen sich.
Die durchschnittlichen Hemmhofdurchmesser des Agar-Diffusionstests für 10 µg
Mecillinam lagen für penicillinasepositive Stämme bei 10,0 mm und für negative
Stämme bei 14,4 mm. Für Mecillinam konnte ebenfalls kein Grenzwert festgelegt
werden, der deutlich zwischen positiven und negativen Stämmen unterscheidet.
Abbildung 9 stellt die Verteilung der Hemmhofdurchmesser für Mecillinam dar.
34
Abb. 9: Verteilung der Hemmhofdurchmesser im Agardiffusions-Test Mecillinam
Die Verteilungen von Penicillinaseproduzenten und –nichtproduzenten überschneiden sich
vollständig
3.1.5 Korrelation von Penicillin-MHK im VITEK 2 und Nachweis von blaZ
Bei einer minimalen Hemmkonzentration (MHK) von ≤ 0,03 mg/l war kein Stamm als
positiv getestet worden (0%). 6,2% der Stämme mit einer MHK von 0,06 mg/l
(insgesamt 81 Stämme, davon 5 penicillinasepositiv) produzierten eine Beta-Laktamase.
Von 99 Stämmen mit einer MHK von 0,12 mg/l waren 23 positiv. Die Rate der
penicillinasebildenden Stämme mit einer MHK von 0,12 mg/l lag bei 23,2% (Tab. 6)
35
Tab. 6: Korrelation von Penicillin-MHK im VITEK 2 und Nachweis von blaZ
MHK in mg/l N Anzahl blaZ positiver
Stämme /Anzahl
Stämme gesamt
Anzahl blaZ
positiver Stämme
≤ 0,03 17 0% 0
0,06 81 6,2% 5
0,12 99 23,2% 23
36
4 Diskussion
Fast 80% der klinisch isolierten Stämme von S. aureus weisen heutzutage eine
Resistenz gegenüber Penicillin G und seinen Derivaten auf [13, 32]. Verursacht wird
diese Resistenz durch Penicillinasen, also Beta-Laktamasen, die in der Lage sind, den
Beta-Laktamring der Antibiotika zu spalten und sie so unwirksam zu machen. S. aureus
gilt zusammen mit den koagulasenegativen Staphylokokken als einer der
Hauptverursacher von nosokomialen Bakteriämien und ambulant erworbenen
Infektionen [10, 36, 46]. Da Penicillin nach wie vor Mittel der Wahl bei S. aureus
Stämmen ist [16, 38], welche keine Penicillinase bilden, ist eine zuverlässige
Identifikation von Beta-Laktamaseproduzenten wichtig. Eine falsch sensible Messung
in der Testung auf die Empfindlichkeit gegenüber Penicillin kann in einer inadäquaten
Therapie und damit in einer potentiell lebensgefährlichen Situation für den Patienten
resultieren.
Verglichen mit unserer molekularbiologischen Referenzmethode stellten sich als relativ
sensitive und gut durchführbare phänotypische Methoden die Charakterisierung des
Hemmhofrandes mit einer Sensitivität von 71,4 % und der Cloverleaf-Test mit 67,8 %
heraus [22]. Beide Methoden sind leicht durchzuführen und mit etwas Übung sicher
abzulesen. Nachteil ist die Bebrütungsdauer von ca. 12 Stunden, bis ein
Bakterienwachstum stattgefunden hat.
Als Methoden mit geringer Sensitivität für die Erkennung einer Penicillinase in S.
aureus stellten sich der Nitrocefin-Test und der Jod-Stärke-Test heraus. Der Nitrocefin-
Test war einfach und schnell durchzuführen, jedoch war die Interpretation oft schwierig
und die höchste Sensitivität nach 60 min betrug 39,3 %. Der Jod-Stärke-Test war nicht
nur schwierig abzulesen, er war auch aufwändig durchzuführen, da die Reagenzien vor
dem Test frisch zusammengestellt werden mussten. Seine Sensitivität betrug 42,9 %
[22].
28 mm gelten nach CLSI [7] als Grenzwert zur Unterscheidung zwischen
penicillinsensiblen und penicillinresistenten, und damit zwischen penicillinasepositiven
und -negativen S. aureus-Stämmen. Stämme mit einem Hemmhofdurchmesser von
kleiner oder gleich 28 mm gelten als resistent gegen Penicillin. Stämme, die einen
größeren Hemmhofdurchmesser besitzen, gelten als sensibel gegenüber Penicillin.
Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass dieser Grenzwert keineswegs verlässlich ist. Von
den 16 Stämmen, die einen Hemmhofdurchmesser von ≤ 28 mm besaßen, wurden zwei
Stämme in der PCR als penicillinasenegativ getestet. Zwölf Stämme besaßen in der
Testung mit der PCR eine Penicillinase, obwohl ihr Hemmhofdurchmesser größer als
37
28 mm war. Die Verteilung der Hemmhofdurchmesser von penicillinasepositiven und
penicillinasenegativen Stämmen überschneidet sich. Damit ist die Festlegung eines
Grenzwertes nicht möglich und die nach CLSI festgelegten Grenzwerte sind nicht
sicher, d.h. auch wenn der Hemmhofdurchmesser mehr als 28 mm beträgt, kann eine
Penicillinase nicht ausgeschlossen werden.
Der Nitrocefin-Test besaß bei uns eine Sensitivität von 39,3% trotz Induktion mit
Penicillin und einer Inkubationszeit von 60 min. In anderen Studien erreichte er 82%
[1], 86,2% [4], 95,6% [19], 70,8-97,9%, abhängig von der Induktionsmethode und dem
verwendeten Agar [34], und 62,1-100%, abhängig vom Hersteller des Nitrocefin-Tests
[35]. Auch der Jod-Stärke-Test konnte in einer anderen Studie eine Sensitivität von
100% aufweisen [33]. In unseren Ergebnissen zeigte der Cloverleaf-Test eine
Sensitivität von 67,8%. In früheren Studien wurde über Sensitivitäten von 93,8% [19],
97,9% [34] und 96,6% [37] berichtet.
Oberhofer und Towle [33] zeigten, dass der Jod-Stärke-Test in Form des Penicillinase-
Paper-Strip-Tests verlässlich, schnell, einfach zu handhaben und billig war. Er wurde
mit azidometrischen und iodometrischen Methoden verglichen, wobei der
Agardiffusions-Test als Referenzmethode diente. In dieser Studie wies der Jod-Stärke-
Test eine hohe Korrelation mit den konventionellen Tests und der Referenzmethode auf;
es gab keine falsch positiven oder negativen Ergebnisse.
Auch bei Jarløv und Rosdahl [19] schnitt der Jod-Stärke-Test im Vergleich zum
Cloverleaf- und Nitrocefin-Test als bester Test ab. Kein phänotypischer Test erkannte
alle penicillinaseproduzierenden Stämme. Es wurden Stämme verwendet, die aus
vorherigen Studien als Penicillinaseproduzenten oder -nichtproduzenten bekannt waren.
Der Jod-Stärke-Test meldete als einziger Test keine falsch positiven Ergebnisse.
Petersson et al. [34] verglichen den Cloverleaf-Test, den Jod-Stärke-Test, den
Nitrocefin-Test und den Agardiffusions-Test mit der quantitativen macroiodometrischen
Methode nach Perret [35]. Hierbei stellte sich der Jod-Stärke-Test ebenfalls als
zuverlässig heraus, wenn man methicillin-induzierte Stämme verwendete. Allerdings
wurde bemängelt, dass der Test aufwändig durchzuführen sei, da die Reagenzien frisch
zusammengestellt werden müssen. Dieses deckt sich mit unseren Erfahrungen. Der
Agardiffusions-Test und der Cloverleaf-Test meldeten viele falsch positive und negative
Ergebnisse und wurden als nur begrenzt einsetzbar eingestuft. Diese zu unseren
widersprüchlichen Ergebnisse könnten auf die verschiedenen Referenzmethoden (bei
uns eine molekularbiologische Referenzmethode mit der PCR, sonst phänotypische wie
Agardiffusionstest) und unterschiedliche Versuchsdurchführungen zurückzuführen sein.
38
So wurden z.B. beim Cloverleaf-Test Blutagarplatten statt Mueller-Hinton-Platten
verwendet und als Indikator S. pneumoniae anstelle von ATCC 25923 benutzt.
In vielen Studien stellte sich der Jod-Stärke-Test als die beste und sicherste Methode
dar, auch wenn er aufwändig durchzuführen ist [19, 33, 34]. Ebenso schnitt der
Nitrocefin-Test oft gut ab, allerdings mit der Einschränkung, dass er oft schwierig zu
interpretieren sei [34]. In der von uns durchgeführten Studie wiesen diese beiden Tests
die niedrigsten Sensitivitäten für die Erkennung einer Penicillinase auf. Zudem waren
sie schwierig abzulesen und im Falle des Jod-Stärke-Tests aufwändig durchzuführen.
Der Cloverleaf-Test gilt bei Petersson et al. als unzuverlässig [34], während er bei uns
eine hohe Sensitivität aufweist. Der Grund für diesen Unterschied könnte in
Abweichungen in der Durchführungen liegen. Wir verwendeten Mueller-Hinton- und
nicht Kochblutagar, zudem wurden unterschiedliche Indikatorstämme verwendet.
Eine Übereinstimmung mit der Studie von Petersson et al. besteht darin, dass die Größe
des Penicillin-Hemmhofes für die Aussage, ob eine Penicillinase vorliegt oder nicht,
unzuverlässig ist [34].
Im Agardiffusions-Test wurde neben der Hemmhofgröße von Penicillin auch die
Hemmhofgröße von Mecillinam gemessen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich kein
Grenzwert festlegen lässt, der eindeutig zwischen penicillinaseproduzierenden und –
nichtproduzierenden Stämmen unterscheidet [22].
Bruun und Gahrn-Hansen [4] verglichen 2001 die Hemmhofgröße von Mecillinam mit
der Größe und dem Charakter des Hemmhofes von Penicillin, dem Nitrocefin- und dem
Cloverleaf-Test in Bezug auf die Penicillinaseproduktion von S. aureus.
Penicillinsensible Stämme besaßen größere Hemmzonen um Mecillinam herum als
Stämme, die gegen Penicillin resistent waren. Alle Stämme wurden zwei Mal getestet.
Falls eine Diskrepanz in den Ergebnissen auftrat wurde die Testung ein drittes Mal
wiederholt und mit den Ergebnissen des Cloverleaf-Tests, Agardiffusions-Tests und
Cefisone-Tests (anstelle von Nitrocefin) verglichen. Die Autoren kamen zu dem
Ergebnis, dass bei einer Mecillinam-Hemmhofgröße von > 22 mm keine Penicillinase
produziert wird. Sie stuften die Messung der Hemmhofgröße von Mecillinam als gut
durchführbaren, verlässlichen Zusatztest ein, der sicherer sei als die Hemmgröße von
Penicillin.
Die Diskrepanzen der Ergebnisse unserer Studie und der von Bruun und Gahrn-Hansen
sind letztlich unklar. Im Gegensatz zu Bruun und Gahrn-Hansen verwendeten wir
jeweils eine Antibiotikabeschickung von 10 µg, während in der dänischen Studie die
Penicillinbeschickung bei 5 µg und die Mecillinambeschickung bei 33 µg lag. Zudem
39
führten wir den Agardiffusions-Test auf Mueller-Hinton-Agarplatten durch und nicht
auf Kochblutagar.
Die niedrigeren Sensitivitäten der phänotypischen Tests könnten durch die streng
selektierte Stamm-Auswahl der Isolate mit geringer MHK im VITEK 2 hervorgerufen
worden sein.
Im Gegensatz zu den meisten der zitierten Studien, wurde in unserer Studie ein
molekularer Goldstandard benutzt. Nur Pittkälä et al. verwendeten ebenfalls die PCR als
Goldstandard, mit dem Unterschied, dass nur bovine S. aureus-Stämme getestet wurde
[37].
S. aureus ist eine der Hauptursachen für ambulant erworbene Infektionen und für
nosokomiale Bakteriämien [10, 36, 46]. Die Letalität ist hoch, sie erreicht in
verschiedenen Studien zwischen 19% und 34% [20, 21, 26, 29]. Deshalb ist es wichtig
möglichst schnell mit einer gezielten Antibiotikatherapie zu beginnen. Als wirksames
Antibiotikum gegen S. aureus gilt nach wie vor Penicillin G, vorausgesetzt, der
krankheitsverursachende S. aureus Stamm besitzt keine Penicillinase und ist sensibel.
Jedoch sind S. aureus-Stämme ohne Penicillinase selten.
Um sicher zwischen penicillinsensiblen und –resistenten Stämmen zu unterscheiden,
muss es einen schnellen und einfach durchführbaren Test geben, damit die Therapie von
S. aureus Infektionen optimiert wird. Dabei sollte der Test eine hohe Sensitivität in der
Detektion von Penicillinasen aufweisen, denn eine falsch angegebene Empfindlichkeit
gegenüber Penicillin kann zu einer potenziell gefährlichen inadäquaten Therapie von S.
aureus Infektionen führen.
Labore, die den VITEK 2 benutzen, um die Empfindlichkeit von S. aureus zu testen,
haben das Problem, dass eine MHK von ≤ 0,12 mg/l laut CLSI formal bedeutet, dass
das Isolat penicillinsensibel ist [7]. Da aber Probleme in der Detektion von
Penicillinasen bei S. aureus bekannt sind, ist ein zusätzlicher Test für Penicillin nötig.
Limitation unserer Studie ist, dass die PCR als Goldstandard nur nachweisen kann, ob
ein Stamm das nötige Gen zur Produktion einer Penicillinase in seiner DNA besitzt. Das
Vorhandensein dieses Gens garantiert jedoch nicht die phänotypische Expression der
Penicillinase; der jeweilige Stamm muss also nicht tatsächlich gegen Penicillin resistent
sein. Durch Mutationen in der Promotorregion oder Nonsense-Mutationen, bei denen es
zu keiner Proteinbildung kommt, kann die Expression einer Penicillinase verhindert
werden.
40
Während wir in dieser Studie Diskrepanzen in den Ergebnissen bedingt durch einen
Plasmidverlust mittels einer geeigneten Planung der Experimente ausschließen konnten,
ist zu beachten, dass in der Routinediagnostik Isolate bei Mischkulturen ein bis zwei
Mal passagiert werden müssen. Dabei ist das Risiko für einen Plasmidverlust gegeben
und falsch negative Ergebnisse der Testung auf Penicillinase sind prinzipiell denkbar.
Die für die PCR verwendeten Primer wurden so gewählt, dass sie bei allen vier derzeit
bei Staphylokokken bekannten Penicillinase-Genen binden. Dennoch sind durch
Auftreten neuer Penicillinasen bei Staphylokokken oder Mutationen in den
Primerbindungsstellen falsch negative PCR-Ergebnisse möglich.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der Gebrauch des Nitrocefin- oder Jod-
Stärke-Tests als zusätzliche Methode zur Testung auf Penicillinasen für Isolate mit einer
MHK von 0,06 mg/l oder 0,12 mg/l im VITEK 2 nicht geeignet ist. Höhere
Sensitivitäten weisen die Charakterisierung des Hemmhofrandes und der Cloverleaf-
Test auf. Es könnte aber zu falsch-negativen Ergebnissen kommen. Wenn bei schweren
S. aureus-Infektionen eine sehr hohe diagnostische Sicherheit vor der Entscheidung zu
einer Penicillin-Therapie nötig ist, sollte das Vorliegen einer Penicillinase durch eine
blaZ PCR ausgeschlossen werden [22].
41
5 Zusammenfassung
Heute weisen über 80% der S. aureus Stämme eine Penicillinase auf [13, 32]. Diese
vermittelt die Resistenz gegenüber Penicillin, wobei das kodierende Gen für die
Penicillinase blaZ ist. Da Penicillin nach wie vor als Mittel der Wahl gegen
penicillinsensible S. aureus-Isolate ohne Penicillinasebildung gilt, sind zuverlässige
diagnostische Verfahren zum Ausschluß einer Penicillinase nötig. Gemäß CLSI [7]
sollen S. aureus-Isolate mit einer formal sensiblen MHK von ≤ 0,12 mg/l nachgetestet
werden.
In dieser Studie wurden fünf phänotypische Methoden (Cloverleaf-Test,
Charakterisierung des Hemmhofrandes, Agardiffusions-Test, Nitrocefin-Test, Jod-
Stärke-Test) mit einer blaZ PCR verglichen. Dazu wurden 197 S. aureus Stämme
getestet. Der Jod-Stärke-Test und der Nitrocefin-Test wiesen geringe Sensitivitäten von
42,9% und 35,7% auf. Zudem war die Durchführung des Jod-Stärke-Tests sehr
aufwendig, da die Reagenzien immer frisch zubereitet werden mussten. Der Cloverleaf-
Test und die Charakterisierung des Hemmhofrandes zeigten Sensitivitäten von 67,8%
und 71,4%. Diese Methoden könnten unter bestimmten Umständen routinemäßig
durchgeführt werden, sie waren jedoch nicht so sensitiv wie die Referenzmethode [22].
Der Agardiffusions-Test mit der Bestimmung der Hemmhofgröße erreichte nur eine
Sensitivität von 71,4% für die Penicillinase-Detektion und ist daher nicht zur sicheren
Unterscheidung zwischen penicillinsensiblen und –resistenten Stämmen geeignet.
Die besten phänotypischen Methoden zum Ausschluß einer Penicillinase sind demnach
der Cloverleaf-Test und die Charakterisierung des Penicillin-Hemmhofrandes. Ist bei
schweren S. aureus-Infektionen vor Entscheidung zur Penicillintherapie eine sehr hohe
diagnostische Sicherheit erforderlich, sollte eine Penicillinase mittels blaZ-PCR
ausgeschlossen werden [22].
42
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[46] Weinstein, M. P., Towns, M. L., Quartey, S. M., Mirrett, S., Reimer, L. G.,
Parmigiani, G., Reller, L. B. (1997). The clinical significance of positive blood
cultures in the 1990s: A prospective comprehensive evaluation of the
microbiology, epidemiology, and outcome of bacteremia and fungemia in adults.
Clin Infect Dis 24, 584-602
48
[47] Wikipedia – Die freie Enzyklopädie ( Zugriff vom 08.11.2009)
http://de.wikipedia.org/wiki/B-Lactam-Antibiotika
[48] Wikipedia – Die freie Enzyklopädie ( Zugriff vom 08.11.2009)
http://de.wikipedia.org/wiki/ Methicillin
[49] Zygmunt, D. J., Stratton, C. W., Kernodle, D. S. (1992). Characterization of four
beta-lactamases produced by Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents
Chemother 36, 440-445
49
Danksagungen
Mein besonderer Dank gilt:
Herrn Prof. Dr. med. Soeren G. Gatermann für die freundliche Überlassung des
Themas, sowie für die hervorragende Betreuung,
Herrn Dr. med. Martin Kaase für eine sehr gute Betreuung und die stete Bereitschaft
meine Fragen zu beantworten und mir bei der Erstellung der Dissertation zu helfen,
Allen Mitarbeitern der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr-Universität-
Bochum für die herzliche Aufnahme und stete Hilfsbereitschaft, insbesondere Susanne
Friedrich für die gute Organisation des praktischen Teils dieser Arbeit und für die gute
Beratung,
Frau Sabine Loose-Kuhlenberg dafür, dass sie immer als Ansprechpartnerin da war und
einen wesentlichen Teil dazu beigetragen hat, dass die Arbeit auch nach dem Umzug
nach Hamburg fertiggestellt werden konnte,
Tim für seine Hilfe bei der Formatierung und der Bearbeitung der Dissertation. Ohne
seine wiederholten Rettungen hätte es die Arbeit in dieser Form nicht gegeben.
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Lebenslauf
Persönliche Daten
Name Sarah Magdalena Lenga
Geburtsdatum 11.01.1983
Geburtsort Herne
Familienstand Ledig
Berufliche Laufbahn
01/2009 bis 12/2009 Assistenzärztin in der Abteilung für Kardiologie,
Angiologie und Intensivmedizin
Marienhospital Gelsenkirchen
Chefarzt Prof. Dr. med. H. Blanke
Seit 01/2010 Assistenzärztin in der Abteilung für Innere Medizin
und geriatrische Frührehabilitation
Krankenhaus Groß Sand, Hamburg
Chefarzt Prof. Dr. med. R. Scola
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Ausbildung und Studium
08/1989 bis 06/1992 Grundschule an der Vellwigstrasse, Herne
08/1992 bis 06/1993 Albert-Schweitzer Grundschule, Datteln
08/1993 bis 06/2002 Comenius Gymnasium, Datteln
Abschluss: Abitur
10/02 bis 11/08 Medizinstudium an der Ruhr-Universität Bochum
08/2004 Ärztliche Vorprüfung
08/07 bis 07/08 Praktisches Jahr:
Innere Medizin: Prosper-Hospital Recklinghausen
Anästhesie: Prosper-Hospital Recklinghausen
Chirurgie: Prosper-Hospital Recklinghausen
10/2008 Abschluss des Medizinstudiums: Staatsexamen
Seit 06/2006 Promotion in der Abt. für Medizinische Mikro-
biologie der Ruhr-Universität Bochum über das
Thema: „Vergleich von fünf phänotypischen
Methoden zur Penicillinasedetektion bei S. aureus“
unter der Leitung von Prof. Dr. S. Gatermann
Famulaturen
02/2005 bis 03/2005 Praxis für Allgemeinmedizin Dr. M. Bergmann,
Recklinghausen
02/2006 bis 03/2006 Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil,
Klinikum der Ruhr-Universität Bochum
Abteilung für Kardiologie und Angiologie
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(Prof. Dr. A. Mügge)
07/2006 bis 08/2006 Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil,
Klinikum der Ruhr-Universität Bochum
Institut für Radiologie (Prof. Dr. V. Nicholas)
09/2006 bis 10/2006 Institut für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum
(Prof. Dr. S. Gatermann)
02/2007 bis 03/2007 St. Josef-Hospital, Klinikum der Ruhr-Universität
Bochum
Neurologische Klinik (Prof. Dr. R. Gold)
Kenntnisse und Fähigkeiten
Sprachen Englisch fliessend in Wort und Schrift
Italienisch gute Kenntnisse
Spanisch Grundkenntnisse
Französisch Grundkenntnisse
EDV Office, Outlook
Hamburg, den 08.07.2010
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