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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL
CAMILA BARBOSA AMARAL
AVALIAÇÃO CLÍNICA, RADIOGRÁFICA, HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-
HISTOQUÍMICA DE NEOPLASIAS ÓSSEAS EM CÃES (Canis familiaris,
LINNAEUS, 1758)
NITERÓI 2013
CAMILA BARBOSA AMARAL
AVALIAÇÃO CLÍNICA, RADIOGRÁFICA, HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-
HISTOQUÍMICA DE NEOPLASIAS ÓSSEAS EM CÃES (Canis familiaris,
LINNAEUS, 1758)
Orientadora: Profª.Dra. ANA MARIA REIS FERREIRA
Co-Orientador: Profº. Dr. MÁRIO ANTÔNIO PINTO ROMÃO
Niterói 2013
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária – Clínica e Reprodução Animal da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Patologia e Diagnóstico por Imagem.
CAMILA BARBOSA AMARAL
AVALIAÇÃO CLÍNICA, RADIOGRÁFICA, HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-
HISTOQUÍMICA DE NEOPLASIAS ÓSSEAS EM CÃES (Canis familiaris,
LINNAEUS, 1758)
Aprovada em maio de 2013.
BANCA EXAMINADORA
Profª.Dra. ANA MARIA REIS FERREIRA – Orientadora Universidade Federal Fluminense
Profº Dr. JÚLIO LOPES SEQUEIRA – Membro Externo Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
Profº.Dr. RICARDO SIQUEIRA DA SILVA – Membro Externo Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
Profª. PhD. LOUISIANE DE CARVALHO NUNES– Membro Externo Universidade Federal do Espírito Santo
Profª Dra. JULIANA DA SILVA LEITE – Membro Interno Universidade Federal Fluminense
Niterói - 2013
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária – Clínica e Reprodução Animal da Universidade Federal Fluminense, como requisito final para obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Patologia e Diagnóstico por Imagem.
A todos os cães; Os meus, os seus, os nossos; E a todos aqueles que se importam.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Ana Maria Reis Ferreira, pelo auxílio mais uma vez
nessa empreitada mesmo frente à distância e às dificuldades encontradas.
Ao meu co-orientador, Mário A. P. Romão, pelo suporte e dedicação. É
sempre bom ter você por perto.
A todos os médicos veterinários e proprietários que confiaram seus cães a
mim estivessem eles vivos, mortos e, porque não dizer, em partes. Espero que este
trabalho ajude outros cães a não passarem pelo que eles passaram. Do contrário,
esse projeto não teria razão de existir. Muitíssimo obrigada.
Aos colegas do Setor de Anatomia Patológica, pela ajuda nesse vai e vem e
por muitas vezes otimizarem meu tempo na UFF. Fabiane C. Lopes, você é demais
também na Patologia!
A minha querida amiga Juliana da S. Leite, que sempre esteve ao meu lado
nessas aventuras desde a graduação e foi incansável na realização da imuno-
histoquímica. Não tenho palavras para expressar minha gratidão. Esse trabalho
também é seu!
Profª Ana Beatriz Monteiro, responsável pela análise estatística dos dados.
Muito obrigada pela ajuda e paciência e mais uma vez desculpe-me pela correria.
Às amigas Emanuele A. Alves, Lyvia C. R. Carvalho e Gabriela P. Passoss
pelo companheirismo e cumplicidade durante esse período ouvindo meus desabafos
e muitas vezes passando por coisa parecida.
A minha querida amiga e companheira no dia-a-dia alegrense, Andréia Weiss,
por ouvir meus resmusgos, meus gritos e até mesmo meu silêncio. Aprendo cada dia
mais contigo e não sei o que seria de mim em Alegre sem você. Tenho muito
orgulho de ti, loira!
Aos colegas de trabalho, de departamento ou não, pela acolhida em Alegre.
Às minhas “pestes”, também chamados de alunos, por me ensinarem cada
vez mais e me surpreenderem sempre, só me dando certeza da decisão que tomei.
Em especial aos meus criminals, pela ajuda no nosso Setor, por entenderem
“minhas crises” e por se mostrarem tão unidos a ponto de quase se detestarem!
Amo vocês demais!
Às minhas cadelas, as que já partiram e as que seguem comigo hoje, vocês
sempre foram a razão de tudo isso. Muito obrigada por esse amor incondicional.
Aos cães do CCA-UFES, pelo carinho (ou seria carência?), pela companhia,
pela bagunça nossa de todo dia. Vocês alegram a faculdade e nos divertem todo
dia. Afinal, apesar de alguns discordarem, CACHORRO É TUDO DE BOM!!!
Amarelo, sinto sua falta e conviverei para o resto da minha vida com o meu
arrependimento. Te amo, onde quer que você esteja.
Ao meu pai, Jorge Amaral, por ter se disponibilizado desde o início a me
acompanhar durante o período de coleta de material, mesmo quando eu achava que
não era preciso.
À minha mãe, Rosane B. Amaral, por todas as vezes em que, tão
altruistamente, deixou seus compromissos de lado para me disponibilizar o carro
falicitando e muito o translado Rio-Niterói-Rio.
Ao meu irmão, Bernardo B. Amaral, por manter a “sanidade mental” do meu
computador, peça de trabalho fundamental.
A Deus e aos meus anjos, pois como diria Julie Andrews em “A Noviça
Rebelde”: “nada vem do nada, e nem poderia, mas em algum momento da minha
infância ou juventude, eu devo ter feito algo de bom”. Aliás, de muito bom para
merecer tudo isso. Não tenho do que reclamar (mesmo que, de vezes em quando, o
faça).
“Words are, in my not so humble opinion, our most inexhaustible source of magic.”
Professor Albus Percival Wulfric Brian Dumbledore
SUMÁRIO
CAPA ____________________________________________________________________1
FOLHA DE ROSTO ________________________________________________________2
FOLHA DE APROVAÇÃO ___________________________________________________3
DEDICATÓRIA ____________________________________________________________4
AGRADECIMENTOS _______________________________________________________ 5
EPÍGRAFE_______________________________________________________________ 7
SUMÁRIO ________________________________________________________________ 8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES _________________________________________________ 10
RESUMO ________________________________________________________________ 15
ABSTRACT ______________________________________________________________ 16
1 INTRODUÇÃO __________________________________________________________ 17
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ___________________________________________ 19
2.1 NEOPLASIAS ÓSSEAS PRIMÁRIAS MALIGNAS EM CÃES: ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS E
CLÍNICOS. ___________________________________________________________________________ 20 2.1.1. Osteossarcoma _________________________________________________________________ 20 2.1.2. Condrossarcoma ________________________________________________________________ 22 2.1.3. Fibrossarcoma _________________________________________________________________ 23 2.1.4. Hemangiossarcoma _____________________________________________________________ 24 2.1.5. Tumor ósseo multilobular ________________________________________________________ 25 2.1.6. Outras considerações ____________________________________________________________ 26
2.2 NEOPLASIAS ÓSSEAS PRIMÁRIAS MALIGNAS EM CÃES: ASPECTOS RADIOGRÁFICOS,
MACROSCÓPICOS E MICROSCÓPICOS _________________________________________________ 26 2.2.1. Osteossarcoma _________________________________________________________________ 26 2.2.2. Condrossarcoma ________________________________________________________________ 29 2.2.3. Fibrossarcoma _________________________________________________________________ 30 2.2.4. Hemangiossarcoma _____________________________________________________________ 31 2.2.5. Tumor Ósseo Multilobular ________________________________________________________ 32
2.3 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS _________________________________________________________ 32
2.4 IMUNO-HISTOQUÍMICA ___________________________________________________________ 34 2.4.1. Introdução ____________________________________________________________________ 34 2.4.2. Histórico e Aplicações Gerais _____________________________________________________ 34 2.4.3. Anticorpos Utilizados ____________________________________________________________ 36
9
2.4.4. Alvos antigênicos em Oncologia ___________________________________________________ 37 2.4.5. Limitações ____________________________________________________________________ 38 2.4.6. Vantagens _____________________________________________________________________ 39 2.4.7. Desvantagens __________________________________________________________________ 40 2.4.8. Interpretação de resultados _______________________________________________________ 40 2.4.9. Marcadores de interesse em Neoplasias Ósseas _______________________________________ 41
2.4.9.1.Marcadores de Linhagem Celular____________________________________________ 41 2.4.9.2. Marcadores ósseos proteicos ______________________________________________ 45
2.4.10. A imuno-histoquímica na Oncologia Veterinária _____________________________________ 50
3 OBJETIVOS ____________________________________________________________ 52
3.1 OBJETIVO GERAL _________________________________________________________________ 52
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS __________________________________________________________ 52
4 MATERIAIS E MÉTODOS ________________________________________________ 54
4.1 ANIMAIS _________________________________________________________________________ 54
4.2. METODOLOGIA __________________________________________________________________ 54 4.2.1. Avaliação clinica _______________________________________________________________ 54 4.2.2. Exames Radiográficos ___________________________________________________________ 55 4.2.3. Obtenção de Amostra ____________________________________________________________ 56
4.2.3.1. Biópsias _________________________________________________________________ 56 4.2.3.2. Peças cirúrgicas e necrópsias ______________________________________________ 57
4.2.4. Processamento histológico _______________________________________________________ 58 4.2.5. Processamento imuno-histoquímico ________________________________________________ 58 4.2.6. Avaliação Histopatológica e Imuno-Histoquímica _____________________________________ 59 4.2.7. Análise Estatística ______________________________________________________________ 60
5 RESULTADOS __________________________________________________________ 61
5.1 ANIMAIS _________________________________________________________________________ 61 5.1.1 Avaliação clínica _______________________________________________________________ 61 5.1.2 Exame radiográfico _____________________________________________________________ 62 5.1.3 Avaliação Anatomo-Histopatológica ________________________________________________ 65 5.1.5 Avaliação Imuno-Histoquímica ____________________________________________________ 72
6 DISCUSSÃO ____________________________________________________________ 77
7 CONCLUSÃO ___________________________________________________________ 89
8 OBRAS CITADAS _______________________________________________________ 91
9 ANEXOS _______________________________________________________________ 99
9.1 Autorização para posse de cadáver canino. ______________________________________________ 100
9.2 Autorização para realização de procedimento em canino. ___________________________________ 101
9.3 Certificado do Comitê de Ética no Uso de Animais da UFF. _________________________________ 102
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1: Protocolo imuno-histoquímico utilizado para os anticorpos vimentina,
osteonectina (SPARC) e osteocalcina em neoplasias ósseas caninas, f. 59.
Tabela 1: Distribuição de valores relativos a idade e peso dos 22 cães avaliados, f.
61.
Figura 1: Frequencia de distribuição das lesões sugestivas de neoplasia óssea
primária ao exame radiográfico dos cães avaliados (n=22), f. 62.
Figura 2A: Radiografia: Caso nº. 20, canino, fibrossarcoma. Radiografia simples,
lateral oblíqua esquerda, mandíbula: lise e perda de opacidade óssea em corpo
mandibular esquerdo na altura do segundo pré-molar (seta), f. 64.
Figura 2B: Radiografia: Caso nº. 6, canino, osteossarcoma. Radiografia simples,
latero-lateral, membro pélvico esquerdo: proliferação óssea acentuada em metáfise
e diáfise proximal de fêmur esquerdo, f. 64.
Figura 2C: Radiografia: Caso nº. 13, canino, osteossarcoma. Radiografia simples,
médio-lateral, membro torácico direito: proliferação óssea discreta em diáfise
média e distal e metáfise distal radial direita, f. 64.
11
Figura 2D: Radiografia: Caso nº. 14, canino, fêmea, osteossarcoma. Radiografia
simples, médio-lateral, membro torácico direito: lise óssea em metáfise proximal de
úmero direito, alterando o padrão trabecular, f. 64.
Figura 2E: Radiografia: Caso nº. 10, canino, osteossarcoma. Radiografia simples,
médio-lateral, membro torácico direito: áreas de lise e proliferação óssea com
destruição de cortical em metáfise proximal de úmero direito, f. 64.
Quadro 2: Avaliação das neoplasias ósseas nos cães analisados segundo sexo,
idade, raça, local biopsiado e resultado histopatológico (n=22), f. 66.
Figura 3: Frequencia de distribuição dos tipos histológicos diagnosticados em cães
avaliados com neoplasia óssea (n=22)., f. 67.
Figura 4: Frequencia de órgãos acometidos por metástase nos animais portadores
de osteossarcoma avaliados por meio de necropsia, f. 69.
Figura 5A: Fotomacrografia: Caso nº 2, canino, osteossarcoma. Membro pélvico
direito: aumento de volume em região distal de membro torácico direito (região
cárpica), com vasculatura evidente e coloração avermelhada, f. 70.
Figura 5B: Fotomacrografia: Caso nº 8, canino, osteossarcoma. Necropsia: cavidade
torácica revelando líquido sanguinolento e coração (asterisco), pulmões (p) e pleura
(pl) com focos metastáticos, f. 70.
Figura 5C: Fotomacrografia: Caso nº 10, canino, osteossarcoma. Peça cirúrgica,
membro torácico direito (corte transversal): formação tumoral envolvendo diáfise
umeral (asterisco) com extensa área de componente extra-ósseo proliferativo e
necrose (arco), f. 70.
Figura 5D: Fotomacrografia: Caso nº 8, canino, osteossarcoma. Peça cirúrgica,
membro pélvico esquerdo (corte transversal): formação tumoral envolvendo diáfise
umeral (asterisco) com extensa área de componente extra-ósseo proliferativo e
atrofia de musculatura (seta), f. 70.
12
Figura 6A: Fotomicrografia – Hematoxilina e Eosina. Caso nº. 10, canino,
osteossarcoma osteoblástico produtivo. Peça cirúrgica, membro torácico direito:
material osteóide mineralizado formando trabéculas desorganizadas entremeadas
por células neoplásicas. (A-F – HE; A,C – 40x original; barra: 200 µm; B,D – 400x
original; barra: 50 µm), f. 71.
Figura 6B: Fotomicrografia – Hematoxilina e Eosina. Caso nº. 10, canino,
osteossarcoma osteoblástico produtivo. Peça cirúrgica, membro torácico direito:
trabéculas desorganizadas entremeadas por células neoplásicas, revelando
anisocitose e nucléolos evidentes. (A-F – HE; A,C – 40x original; barra: 200 µm; B,D
– 400x original; barra: 50 µm), f. 71.
Figura 6C: Fotomicrografia – Hematoxilina e Eosina. Caso nº. 7, canino,
condrossarcoma. Peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: ilhas de cartilagem
neoplásica com tecido conjuntivo ao redor. Observa-se processo de ossificação
central da ilha. (A-F – HE; A,C – 40x original; barra: 200 µm; B,D – 400x original;
barra: 50 µm), f. 71.
Figura 6D: Fotomicrografia – Hematoxilina e Eosina. Caso nº 20, canino,
fibrossarcoma. Peça cirúrgica, mandíbula esquerda: células fusiformes dispostas em
feixe, com moderado pleomorfismo e nucleolação evidente. (A-F – HE; A,C – 40x
original; barra: 200 µm; B,D – 400x original; barra: 50 µm), f. 71.
Tabela 2: Distribuição de valores relativos ao percentual de marcação para
vimentina, SPARC e osteocalcina nos gupos de cães avaliados, f. 73.
Figura 7A: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. Caso nº.
18, canino, osteossarcoma osteoblástico minimamente produtivo. Peça cirúrgica,
membro torácico direito: intensa marcação citoplasmática (+++) em osteoblastos
malignos. (A,B,C,D,F – 400x original; barra: 50 µm; E – 40x original; barra: 200 µm.
Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 75.
13
Figura 7B: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. Caso nº.
8, canino, osteossarcoma osteoblástico produtivo. Peça de necropsia, membro
pélvico esquerdo: moderada marcação citoplasmática (+++) em osteoblastos
malignos. (A,B,C,D,F – 400x original; barra: 50 µm; E – 40x original; barra: 200 µm.
Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 75.
Figura 7C: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. Caso nº
7, canino, condrossarcoma. Peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: condrócitos
malignos marcados (asterisco) (+++) em transição para formação de cartilagem
madura (jogo da velha). (A,B,C,D,F – 400x original; barra: 50 µm; E – 40x original;
barra: 200 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 75.
Figura 7D: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. Caso nº
7, canino, condrossarcoma. Peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: marcação de
condrócitos em cartilagem madura (+++). (A,B,C,D,F – 400x original; barra: 50 µm; E
– 40x original; barra: 200 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 75.
Figura 7E: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. Caso nº
7, canino, condrossarcoma. Peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: marcação em
nicho cartilaginoso e em vasculatura periférica intensa (+++). (A,B,C,D,F – 400x
original; barra: 50 µm; E – 40x original; barra: 200 µm. Contra-coloração:
hematoxilina de Meyer), f. 75.
Figura 7F: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. Caso nº.
9, canino, osteossarcoma osteoblástico minimamente produtivo. Peça cirúrgica,
membro pélvico direito: osteoblasto maligno em divisão celular atípica (detalhe).
Observa-se marcação exclusivamente citoplasmática e de menor intensidade nas
demais (++) células. (A,B,C,D,F – 400x original; barra: 50 µm; E – 40x original; barra:
200 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 75.
14
Figura 8A: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-
osteocalcina. Caso nº. 18, canino, osteossarcoma osteoblástico minimamente
produtivo. Peça cirúrgica, membro torácico direito: marcação discreta (+) anti-
SPARC citoplasmática em osteoblastos malignos. (A-F – 400x original; barra: 50 µm.
Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 76.
Figura 8B: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-
osteocalcina. Caso nº 20, canino, fibrossarcoma. Peça cirúrgica, mandíbula
esquerda: marcação acentuada (++) anti-SPARC citoplasmática em células
fusiformes. (A-F – 400x original; barra: 50 µm. Contra-coloração: hematoxilina de
Meyer), f. 76.
Figura 8C: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-
osteocalcina. Caso nº 7, canino, condrossarcoma. Peça cirúrgica, membro pélvico
esquerdo: marcação discreta (+) anti-SPARC em condrócitos malignos. (A-F – 400x
original; barra: 50 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 76.
Figura 8D: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-
osteocalcina. Caso nº. 4, canino, osteossarcoma osteoblástico produtivo. Peça de
necropsia, membro torácico direito: moderada marcação (++) anti-osteocalcina
citoplasmática em osteoblastos malignos. Observa-se célula gigante central. (A-F –
400x original; barra: 50 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 76.
Figura 8E: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-
osteocalcina. Caso nº 7, canino, condrossarcoma. Peça cirúrgica, membro pélvico
esquerdo: marcação discreta (+) anti-osteocalcina em condrócitos malignos. (A-F –
400x original; barra: 50 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 76.
Figura 8F: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-
osteocalcina. Caso nº 20, canino, fibrossarcoma. Peça cirúrgica, mandíbula
esquerda: ausência de marcação (-) anti-osteocalcina em células fusiformes. (A-F –
400x original; barra: 50 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 76.
RESUMO
Os tumores ósseos primários em cães apresentam características radiográficas e histopatológicas marcantes. Em alguns casos, o diagnóstico pode ser complicado pela ausência dessas características. A utilização de anticorpos contra proteínas que caracterizam essas neoplasias pode auxiliar na elucidação destes casos. O presente trabalho teve por objetivo avaliar neoplasias ósseas primárias por meio da istopatologia e da imuno-histoquímica associada à análise clínica e radiográfica, auxiliando na classificação dos tipos neoplásicos e determinação de subtipos. Foram coletadas amostras de em 22 cães da cidade do Rio de Janeiro e Niterói, sendo sete machos e 15 fêmeas. O diagnóstico histopatológico foi realizado a partir de amostras coletadas com agulha Jamshidi calibre 11 ou de fragmentos de peças de amputação ou cadáveres com até seis horas pós-óbito. As amostras coletadas foram fixadas em formol. Após descalcificação foram processadas, incluídas em parafina, coradas por HE e realizada a imuno-histoquímica com anticorpos anti-vimentina, anti-SPARC e anti-osteocalcina. Foi realizada análise estatística descritiva dos parâmetros clínicos e histopatológicos. Os cães pertenciam às raças Rottweiler, Dobermann Pinscher, Husky Siberiano, Bulldog Inglês, Pastor Alemão, Boxer, Akita, Golden Retriever além de cães sem raça definida (SRD); tinham peso variando de 15 a 58kg (média: 36,59kg) e idade de 3 a 18 anos (média: 8,59 anos). Os principais sinais clínicos apresentados foram claudicação, dor e aumento de volume local. Noventa e um por cento das lesões acometeram esqueleto apendicular. Os ossos úmero e rádio foram os mais acometidos. Todas as lesões foram monostóticas. Os membros torácicos foram mais afetados que os pélvicos e a metáfise foi a área mais atingida. O osteossarcoma foi o tumor mais frequente, com quase oitenta e dois por cento dos casos. Houve ainda dois casos de condrossarcoma, um hemangiossarcoma e um fibrossarcoma. Os percentuais de marcação nas amostras positivas dos anticorpos anti-vimentina, anti-SPARC e anti-osteocalcina foram: 87,9%, 98,0% e 99,9%. Um osteossarcoma não apresentou marcação positiva para vimentina e das amostras submetidas a marcação com osteocalcina, três casos de osteossarcoma e um de fibrossarcoma não marcaram positivamente. A avaliação imuno-histoquímica mostrou resultados relevantes no auxílio diagnóstico e prognóstico nas neoplasias ósseas em cães. Palavras-chave: neoplasias ósseas, cães, radiografia, histopatologia, imuno-histoquímica.
ABSTRACT
Primary bone tumors in dogs have remarkable radiographic and histopathological features. In some cases, diagnosis can be complicated by the absence of these features. The use of antibodies against proteins that characterize these neoplasms can help elucidating such cases. This experiment objective was to evaluate canine primary bone neoplasms histopathologically and with immunohistochemically to diagnose neoplasms types and to help determining their subtypes, associating its results with clinical and radiological findings. Samples from radiographically detected neoplastic bone lesions were collected from 23 dogs from Rio de Janeiro and Niteroi being eight males and fifteen females. Histopathological diagnosis were establish from Jamshidi needle collected samples, fragments of amputated pieces or six-hour post mortem corpses. Samples were collected and formalin-fixed. After descalcification, they were routinately processed, paraffin-embbebed, stained with HE and imunohistochemistry was performed using antibodies anti-vimetin, anti-SPARC and anti-osteocalcin. Descriptive statistic analyses of clinical and histopathological parameters were performed. Dogs belonged to Rottweiler, Dobermann Pinscher, Siberian Husky, English Bulldog, German Shepard, Boxer, Golden Retriever breeds and no-specific-breed dogs with weight average of 33,61 kg and age average of 8,35 years. The main symptoms were lameness, pain and local swelling. Ninety one percent of the lesions occurred in the apendicular skeleton. Umerus and femur were the most affected bones followed by the radium. Only one dog had two simultaneous lesions. Thoracic limbs were more affected than pelvic limbs and the metaphysis area the main location. Osteosarcoma was the most frequent primary bone tumor with almost eighty two percent of the cases. There were also two chondrosarcomas, one haemangiosarcoma and one fibrosarcoma. Antibodies used for immunohistochemistry evaluation were anti-vimentin, anti-SPARC and anti-osteocalcin. Respective percentuals for positive immunostaining were 87,9%, 98,0% and 99,9%. One osteosarcoma showned negative immunostain for vimentin and of samples submitted to anti-osteocalcin immunostaining, three osteosarcomas and one fibrosarcoma had negative staining. Immunohistochemistry evaluation showed relevant results concerning diagnosis and prognosis of bone neoplasms in dogs. Keywords: bone neoplasms, dogs, radiography, histopathology, immunohistochemistry.
1 INTRODUÇÃO
O sistema esquelético, seja dos cães ou dos seres humanos, é
frequentemente acometido por doenças metabólicas, infecciosas e neoplásicas. Em
muitos casos, há uma lesão radiográfica visível, mas não conclusiva. Nestes casos,
para se obter o diagnóstico, a biópsia é o único método (PRAMESH et al., 2001;
JELINEK et al., 2002; AMARAL, 2008; AMARAL; ROMÃO; FERREIRA, 2013).
Toda e qualquer lesão óssea que apresente uma imagem radiográfica
agressiva, supostamente maligna que gere margem para diversos diagnósticos
diferenciais ou que não se possa correlacionar com alguma doença frequentemente
conhecida deve ser submetida à confirmação histopatológica (PRAMESH et al.,
2001; AMARAL, 2008; AMARAL; ROMÃO; FERREIRA, 2013).
Apesar de o diagnóstico de tumor ósseo primário maligno em cães ser
frequentemente sugerido apenas radiograficamente, a biópsia é necessária para
confirmação diagnóstica, além de permitir uma classificação específica do tipo
tumoral. Com o desenvolvimento de técnicas de preservação do membro e a
utilização de drogas quimioterápicas, é crucial o conhecimento do tipo tumoral ósseo
para que seja adotado o protocolo terapêutico adequado. Com relação a outros tipos
de lesões ósseas, é necessário diferenciá-los entre tumores primários malignos,
tumores primários benignos, tumores originados da medula óssea, tumores
metastáticos, osteomielite, fraturas e lesões degenerativas (POWERS et al., 1988;
MEHL et al., 2001; CHUN, 2005; DONATO et al., 2005; AMARAL, 2008; BOSTON;
BARRY; O’SULLIVAN, 2011; AMARAL; ROMÃO; FERREIRA, 2013).
Os tumores ósseos primários em cães, na maioria das vezes, são
caracterizados histopatologicamente pelo tipo celular envolvido e tipo de matriz
18
extracelular produzida. Entretanto, nem sempre este material é facilmente
identificado nos subtipos tumorais e em diversas ocasiões uma única lesão
apresentará heterogeneicidade tanto celular como de matriz, devido às
diferenciações mesenquimais que podem ocorrer. Isto é particularmente verdadeiro
em casos de neoplasias atípicas tanto clínica quanto radiograficamente, tumores
anaplásicos ou em casos de análise de fragmentos pequenos, como os oriundos de
biópsia óssea (POWERS et al., 1988; SLAYTER et al., 1994; FLETCHER; UNNI;
MERTENS, 2002; AMARAL, 2008).
Para elucidar tais casos, em Medicina Humana, tem-se utilizado marcadores
de linhagem celular com o objetivo de identificar a origem da célula neoplásica em
questão e ainda marcadores de matriz extracelular, que identificam componentes
presentes na matriz produzida pelas células, relacionando-as a determinado tipo
celular. Outra utilização destes marcadores está na identificação de produtos de
genes de proliferação celular e apoptose alterados. Muitos desses produtos já foram
identificados e relacionados ao prognóstico e sucesso do tratamento em diversos
tipos tumorais, ósseos ou não-ósseos em pacientes humanos (HAINES; WEST,
2005; WERNER et al., 2005; DE MATOS et al., 2010).
A utilização de marcadores para determinadas proteínas de matriz assim
como linhagens celulares não é utilizada com frequência na Medicina Veterinária, ao
contrário do que acontece na Medicina Humana. A literatura descreve apenas casos
isolados de neoplasias ósseas não-características em que estes marcadores foram
utilizados com a intenção de auxiliar no esclarecimento do diagnóstico
(HOENERHOFF et al., 2004, BARGER et al., 2005; AMORIM, 2009). É possível que
a identificação de determinados marcadores celulares permita não só a reavaliação
do tipo histopatológico mas principalmente das opções de tratamento e prognóstico
do paciente.
Assim sendo, este projeto visa realizar estudos imuno-histoquímicos de
potenciais marcadores das neoplasias ósseas em cães após sua caracterização
radiográfica e sua possível implicação no prognóstico dos pacientes desta área da
Oncologia Ortopédica Veterinária de Pequenos Animais.
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
As neoplasias ósseas malignas representam menos de 2% do total das
neoplasias em cães. Apesar disso, são sempre um dilema clínico. Muitas vezes, os
sinais clínicos não são específicos e, além de não serem reconhecidos pelo
proprietário no início da doença, na maioria dos casos, geram uma suspeita clínica
equivocada, sendo confundido com outras afecções ortopédicas (DONATO et al.,
2005; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008).
Em contraste com os tumores humanos, onde as metástases ósseas de
carcinomas, em particular, são comuns, os tumores ósseos caninos são primários
(LOUKOPOULOS; THORNTON; ROBINSON, 2003). O principal deles é o
osteosssarcoma, seguido do condrossarcoma, fibrossarcoma, hemangiossarcoma e
o tumor ósseo multilobular (LOUKOPOULOS; THORNTON; ROBINSON, 2003;
CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; KEALY; MCALLISTER, 2012).
Outras neoplasias ósseas primárias incluem o tumor de células gigantes e os
tumores metastáticos como linfoma e mieloma múltiplo. No entanto, sua frequencia
em Medicina Veterinária é muito baixa, sendo as informações pertinentes a cada um
deles oriundas de relatos de casos (ERDEM; PEAD, 2000; DHALIWAL; REED;
KITCHELL, 2001; THOMAS; PRESSLER; ROBERTSON, 2001; CHUN, 2005;
HIDAKA et al., 2006; PAKHRIN et al., 2006).
20
2.1 NEOPLASIAS ÓSSEAS PRIMÁRIAS MALIGNAS EM CÃES: ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS E CLÍNICOS.
2.1.1. Osteossarcoma
Em Medicina Veterinária, o osteossarcoma é o tumor ósseo primário mais
frequente, representando 85% de todos os tumores ósseos (SLAYTER et al., 1994;
ERDEM; PEAD, 2000; THOMPSON; POOL, 2002; CHUN, 2005; DERNELL et al.,
2007; AMARAL, 2008; THRALL, 2010; BHANDAL; BOSTON, 2011; KEALY;
MCALLISTER, 2012). É uma neoplasia progressiva e rápida com alta mortalidade. É
mais frequente em cães de meia idade a idosos com pico aos sete anos
(THOMPSON; POOL, 2002; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; BHANDAL;
BOSTON, 2011). As raças mais afetadas são o São Bernardo, Setter Irlandês,
Dobermann Pinscher, Pastor Alemão, Rottweiler, Golden Retriever e Dog Alemão
(DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; BHANDAL; BOSTON, 2011; KEALY;
MCALLISTER, 2012). Os machos parecem ser pouco mais afetados que as fêmeas
com relação ao osteossarcoma apendicular, com exceção da raça Rottweiler, São
Bernardo e Dog Alemão (DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008). Segundo estudo
realizado, o aumento do peso e principalmente da altura predispõem o aparecimento
do tumor (RU; TERRACINI; GLICKMAN, 1998). De modo semelhante, cães de raças
gigantes tendem a apresentar a lesão mais cedo que cães de raças menores
(THOMPSON; POOL, 2002).
Os sinais clínicos demonstrados pelos cães não diferem muito dos pacientes
humanos. Considerando que 75% dos casos de osteossarcoma atingem
principalmente o esqueleto apendicular, não é surpreendente que a claudicação
associada a dor seja o sinal clínico principal e na maioria das vezes, o primeiro a ser
notado pelo proprietário (PHILLIPS et al., 1986; ERDEM; PEAD, 2000; LUCROY;
PECK; BERRY, 2001; MEHL et al., 2001; THOMPSON; POOL, 2002; HIDAKA et al.,
2006; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; BHANDAL; BOSTON, 2011). A
duração da claudicação pode variar de duas semanas até três meses para que o
proprietário encaminhe o animal ao veterinário e pode ainda ser complicado por uma
fratura patológica embora esta esteja presente em menos de 3% dos casos
(PHILLIPS et al., 1986; THOMPSON; POOL, 2002; BHANDAL; BOSTON, 2011). O
grau de dor pode variar de leve a torturante, dependendo do avanço e grau de
21
destruição óssea da lesão. Os membros torácicos costumam ser duas vezes mais
afetados que os pélvicos e o esqueleto apendicular é de três a quatro vezes mais
afetado que o axial (THOMPSON; POOL, 2002; DONATO et al., 2005; DERNELL et
al., 2007; AMARAL, 2008; BHANDAL; BOSTON, 2011). Dernell et al. (2007),
Bhandal e Boston (2011) e Kealy e McAllister (2012) afirmam que é comum o relato
de um trauma prévio, o que pode levar a uma suspeita ortopédica equivocada,
entretanto, Phillips et al. (1986) não relataram este achado.
O desenvolvimento de osteossarcoma apendicular pode estar associado a
casos de osteomielite crônica, utilização de implantes metálicos, locais de fratura
prévia e possivelmente infartos ósseos (MARCELLIN-LITTLE et al., 1999;
THOMPSON; POOL, 2002; DERNELL et al., 2007; THRALL, 2010). Outros sinais
associados a neoplasias ósseas são: aumento de volume local por edema,
proliferação de tecido ósseo ou por invasão de tecidos adjacentes pela massa
tumoral, relutância e dor à manipulação (ERDEM; PEAD, 2000; LUCROY; PECK;
BERRY, 2001; MEHL et al., 2001), atrofia muscular local e linfonodo satélite
aumentado de tamanho e firme (ERDEM; PEAD, 2000; THOMPSON; POOL, 2002).
Raramente há mais de um local acometido. O osteossarcoma multicêntrico
representa menos de 15% dos casos no diagnóstico inicial (LARUE; WITHROW;
WRIGLEY, 1986, DERNELL et al., 2007).
Sinais como retenção urinária e fecal, paraparesia e alterações neurológicas
tendem a estar relacionadas com casos de osteossarcoma e outras neoplasias em
esqueleto axial e são local-dependente já tendo sido descritos em mandíbula,
maxila, vértebras lombares e torácicas, crânio, costela, cavidade nasal e pelve
(THOMPSON; POOL, 2002; CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007; KEALY;
MCALLISTER, 2012). Cerca de 50% dos osteossarcomas axiais acometem os ossos
da cabeça e o Boxer é a raça mais afetada por ele. Pode-se observar disfagia,
exoftalmia, dor ao abrir a boca, deformidade facial e descarga nasal (THOMPSON;
POOL, 2002; DERNELL et al., 2007).
Sinais respiratórios são a primeira evidência clínica de metástase pulmonar
que pode se desenvolver rapidamente podendo estar associada a anorexia e
osteoartropatia hipertrófica pulmonar já descrita em alguns casos (DERNELL et al.,
2007). A maioria dos cães morre ou são eutanasiados, em média, seis meses após
o diagnóstico devido às lesões metastáticas principalmente para os pulmões, sendo
que a maioria deles não apresentam lesões radiograficamente visíveis no momento
22
do diagnóstico (THOMPSON; POOL, 2002, LOUKOPOULOS; THORNTON;
ROBINSON, 2003; DONATO et al., 2005; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008;
KIRPENSTEIJN et al, 2008; BHANDAL; BOSTON, 2011; EBERLE et al., 2011).
Metástases para outros ossos e linfonodo regional são descritas embora sejam
incomuns. O tempo de sobre-vida costuma ser maior nos animais com lesões axiais
que apendiculares devido a velocidade de metástase (THOMPSON; POOL, 2002).
2.1.2. Condrossarcoma
Além do osteossarcoma, outros tumores ósseos primários têm sido relatados
na literatura porém abrangem cerca de 5 a 12% do total dos tumores ósseos. O
condrossarcoma é o segundo tumor ósseo primário mais comum em cães com até
10% de prevalência e pode surgir a partir de lesões exostosas cartilaginosas ou
osteocondromas, mas não há relatos de seu surgimento a partir de osteomas. As
raças grandes como Golden Retriever, Boxer e Pastor Alemão são as mais afetadas,
sendo raro em raças gigantes e pequenas, com pico de idade por volta dos oito
anos. Não há predileção por sexo (HAMERSLAG; EVANS; DUBIELZIG, 1980;
SLAYTER et al., 1994; MADARAME et al., 1998; CHUN, 2005; DERNELL et al.,
2007; KIM et al., 2007; AMARAL, 2008; FARESE et al., 2009; AEFFNER et al., 2012;
KEALY; MCALLISTER, 2012).
A maioria dos tumores (61%) surge em ossos chatos como costela, escápula,
pelve, ossos do crânio e cavidade nasal (HAMERSLAG; EVANS; DUBIELZIG, 1980,
SLAYTER et al., 1994; MADARAME et al., 1998; CHUN, 2005; DERNELL et al.,
2007; KIM et al., 2007; AMARAL, 2008; FARESE et al., 2009; KEALY;
MCALLISTER, 2012). O condrossarcoma apendicular é frequentemente citado na
literatura sendo a tíbia o osso mais acometido, na metáfise proximal, seguida do
fêmur e úmero, diferentemente do que ocorre no osteossarcoma (CHUN, 2005; KIM
et al., 2007; FARESE et al., 2009). Há ainda relatos de ocorrência em locais menos
comuns como dígitos, osso peniano e sítios extra-esqueléticos como glândula
mamária. Os sinais clínicos serão derivados da sua localização (MADARAME et al.,
1998; THOMPSON; POOL, 2002; CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007; KIM et al.,
2007; AMARAL, 2008; FARESE et al., 2009; KEALY; MCALLISTER, 2012).
23
Os animais podem apresentar sobrevida de até dois anos e meio. As lesões
costumam apresentar crescimento mais lento que os osteossarcomas assim como
taxa de metástase menor, porém podem formar grandes massas. Normalmente uma
ressecção cirúrgica agressiva, como a amputação, resulta em controle satisfatório
por longo período ou mesmo cura. Caso isso não seja possível, como no caso dos
seios nasais, a recorrência é frequente. Há relatos de metástases porém em menor
número (variação entre 0% e 60%, com média em torno de 25%) e mais tardiamente
quando comparados aos osteossarcomas. Os órgãos mais comumente
comprometidos são: pulmões, rins, fígado, coração, linfonodos, pleura e outros
ossos, porém, na maioria das vezes as metástases localizam-se somente no pulmão
(HAMERSLAG; EVANS; DUBIELZIG, 1980; THOMPSON; POOL, 2002; CHUN,
2005; DERNELL et al., 2007; KIM et al., 2007; WALTMAN et al., 2007; AMARAL,
2008; FARESE et al., 2009; KEALY; MCALLISTER, 2012).
2.1.3. Fibrossarcoma
O fibrossarcoma é um tumor frequentemente relatado ocorrendo em tecidos
moles de cães e gatos, no entanto, como tumor ósseo primário é considerado
menos frequente. Nestes casos, produz uma matriz colagenosa e muitas vezes é
confundido com o osteossarcoma fibroblástico pouco produtivo em amostras
pequenas e exames citológicos (SLAYTER et al., 1994; THOMPSON; POOL, 2002;
CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007). Essa neoplasia é observada em cães adultos
machos de raças de médio e grande porte, embora haja relatos da ocorrência em
fêmeas, não sendo possível determinar a real predileção racial (CHAUVET et al.,
1999; SCHERRER et al., 2005). O principal sinal clínico é a claudicação
especialmente em casos de rápido desenvolvimento (CHUN, 2005).
Quando localizados em maxila apresentam distorção da face, perda de
dentes, erosão do osso maxilar e em casos mais avançados invasão da cavidade
nasal, palato duro e órbita, apesar de serem histologicamente considerados como de
baixo grau. Foi relatado por Chauvet et al. (1999) um fibrossarcoma vertebral de
grau intermediário. Muitos cães são eutanasiados devido a possibilidade de sarcoma
anaplásico porém, na necropsia nem sempre se observa metástases (CHAUVET et
al., 1999). Chauvet et al. (1999) não relataram recorrência local ou ocorrência de
24
metástase dois anos após realização de vertebrectomia e vacinação antitumoral em
uma cadela. Essa informação contrasta com o observado em fibrossarcomas de
tecidos moles, principalmente subcutâneo, relacionados a locais de injeção, em cães
e gatos (VASCELLARI et al., 2003; CHUN, 2005). Nesses, a exérese tumoral
completa é um desafio devido à característica infiltrativa do tumor e as recidivas são
frequentes (GOLDSCHMIDT; HENDRICK, 2002; VASCELLARI et al., 2003; CHUN,
2005; LIPTAK; FORREST, 2007). No caso do fibrossarcoma ósseo, a obtenção de
margem cirúrgica limpa é dada pela amputação alta e a exérese cirúrgica agressiva
deve ser considerada independente do caso já que não se tem dados estatísticos
suficientes a respeito da sobrevida após a cirurgia (THOMPSON; POOL, 2002;
CHUN, 2005; SCHERRER et al., 2005).
Em relação às metástases, Chauvet et al. (1999) não as relataram em seu
trabalho. Nos fibrossarcomas subcutâneos, o potencial metastático é baixo
inicialmente porém este aumenta de acordo com a sobrevida do paciente
(GOLDSCHMIDT; HENDRICK, 2002), com taxa em torno de 20% no momento do
diagnóstico (CHUN, 2005; LIPTAK; FORREST, 2007). Ainda, é relatada por Speltz
et al. (2007) a presença de metástase pulmonar derivada de um fibrossarcoma
primário cardíaco em um Retriever de Labrador.
2.1.4. Hemangiossarcoma
O hemangiossarcoma ósseo primário é raro e surge a partir do endotélio
vascular do osso. Pode ocorrer em cães de qualquer tamanho porém alguns estudos
ressaltam cães de médio e grande porte como Boxer, Dog Alemão e Pastor Alemão.
Não parece haver predileção sexual. É um tumor bastante agressivo causando dor,
claudicação, aumento de volume de tecidos moles e destruição óssea. Entretanto,
tende a ficar confinado na cavidade medular e pode abranger uma grande área do
osso antes mesmo dos sinais clínicos surgirem, normalmente após uma fratura
patológica (THOMPSON; POOL, 2002; CHUN, 2005; NORTON; DRENEN; EMMS,
2006). Erdem e Pead (2000), Hidaka et al. (2006) e Norton, Drenen e Emms (2006)
relataram casos de cães que apresentaram claudicação e dor decorrentes de lesões
em escápula e úmero devido ao hemangiossarcoma ósseo primário, entre outros
tumores. Já Reed, Payne e Aronson (1994) e Mackenzie, Bellah e Threatte (2003)
relataram casos de hemangiossarcoma vertebral. Este tipo de neoplasia é altamente
25
metastática podendo atingir diversos órgãos como pulmão, fígado, baço, coração,
cérebro e outros ossos (CHUN, 2005; NORTON; DRENEN; EMMS, 2006; DERNELL
et al., 2007). Alterações não específicas podem ocorrer e até mesmo morte súbita
por hemorragia devido a ruptura do tumor (ERDEM; PEAD, 2000). O tempo de
sobrevida varia de 2 a 3 e de 7 a 8 meses nos casos de micro e macrometástases
respectivamente (CHUN, 2005).
2.1.5. Tumor ósseo multilobular
O tumor ósseo multilobular é um tumor de crescimento lento, progressivo e
invasivo localmente porém potencialmente maligno. Outras denominações como
osteocondrossarcoma multilobular, condroma rodens ou osteoma não se aplicam
mais. Atinge ossos chatos, principalmente no crânio, mandíbula e maxila, a área
temporo-ocipital podendo envolver órbita, bulha timpânica e arco zigomático
(FORREST, 2010; CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007; PSYCHAS et al., 2009).
Acomete cães de meia idade a idosos e raças médias e grandes sendo raras em
raças gigantes (THOMPSON; POOL, 2002; CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007;
PSYCHAS et al., 2009). Há relatos em caninos da raça Husky Siberiano, Rodhesian
Ridgeback, Golden Retriever e cães sem raça definida (STOLL; ROUSH; MOISAN,
2001; BANKS; STRAW, 2004; PSYCHAS et al., 2009; EUBANKS et al., 2010).
Os cães apresentam massas palpáveis, sésseis e firmes surgindo a partir de
ossos da cabeça. O crescimento é simétrico e excêntrico, exceto no caso relatado
por Psychas et al. (2009) onde o crescimento foi internalizado e levou a compressão
cerebral e cerebelar acompanhada de sinais clínicos graves. Alterações de
comportamento podem estar incluídas devido a compressão de estruturas
adjacentes. Outros sinais incluem: exoftalmia, obstrução nasal, perda de dente ou
dificuldade de mastigação. A recorrência pós-cirúrgica pode chegar a 50% se a
ressecção cirúrgica não for agressiva (FORREST, 2010; CHUN, 2005), no entanto
demora até dois anos devido a baixa taxa de crescimento. Metástases pulmonares
ocorrem em menos de 60% dos casos e o animal pode permanecer bem
clinicamente por vários meses (THOMPSON; POOL, 2002; CHUN, 2005). Banks e
Straw (2004) e Eubanks et al. (2010) relatam sobrevida de 14 meses em casos onde
houve ressecção cirúrgica da lesão em palato duro e mandíbula. Já em casos de
26
remoção mais complexa com localização vertebral ou cranial a eutanásia é
considerada (STOLL; ROUSH; MOISAN, 2001; PSYCHAS et al., 2009).
2.1.6. Outras considerações
Sinais menos específicos relacionados às neoplasias ósseas incluem apatia,
anorexia, perda de peso e caquexia podendo esta ser devido a síndrome
paraneoplásica. As síndromes paraneoplásicas são alterações associadas a
neoplasia mas que ocorrem em estruturas do corpo distantes ao tumor e muitas
vezes podem ser o primeiro sinal da malignidade ou até característica de um
determinado tumor (DERNELL et al., 2007). A caquexia paraneoplásica é fator
prognóstico negativo para muitas neoplasias, principalmente o linfoma e pode
ocorrer mesmo nos casos onde há envolvimento ósseo. A febre não está presente
na maioria dos casos. As alterações laboratoriais são mínimas e na maioria das
vezes inespecíficas, podendo-se ressaltar em alguns casos o aumento sérico dos
valores de fosfatase alcalina (THOMPSON; POOL, 2002, HIDAKA et al., 2006;
DERNELL et al., 2007) e do cálcio sérico em cães com neoplasias ósseas. Os sinais
de hipercalcemia são: constipação, uremia, hipertensão, fraqueza, depressão,
bradicardia, estupor, coma e morte (DERNELL et al., 2007).
2.2 NEOPLASIAS ÓSSEAS PRIMÁRIAS MALIGNAS EM CÃES: ASPECTOS RADIOGRÁFICOS, MACROSCÓPICOS E MICROSCÓPICOS
2.2.1. Osteossarcoma
As três principais neoplasias ósseas raramente são passíveis de serem
diferenciadas entre si somente através da imagem radiográfica tanto em humanos
(JELINEK et al., 2002; ROZEMAN; CLETON-JANSEN; HOGENDOORN, 2006) como
em animais (CHUN, 2005; AMARAL, 2008; KEALY; MCALLISTER, 2012).
A avaliação inicial deve ser feita sempre em duas projeções ortogonais
(DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; THRALL, 2010; KEALY; MCALLISTER,
2012). Os locais mais frequentemente acometidos pela forma medular ou central do
osteossarcoma são a região metafisária de ossos longos principalmente a região
distal de rádio e proximal de úmero em membros torácicos e distal de fêmur e tíbia e
proximal de tíbia em membros pélvicos (THOMPSON; POOL, 2002; HOENERHOFF
27
et al., 2004; BARGER et al., 2005; CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007; THRALL,
2010; BHANDAL; BOSTON, 2011; KEALY; MCALLISTER, 2012). Observa-se
inicialmente perda do padrão trabecular metafisário, alteração de radiopacidade da
cavidade medular e pequenas áreas pontuais de lise óssea que progridem para
destruição da cortical óssea, neoformação periosteal irregular e que quando se
desenvolve sob o periósteo elevado forma uma massa óssea triangular
característica denominada triângulo de Codman na periferia do tumor (PHILLIPS et
al., 1986; LUCROY; PECK; BERRY, 2001; MEHL et al., 2001 THOMPSON; POOL,
2002; DONATO et al., 2005; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; BHANDAL;
BOSTON, 2011; KEALY; MCALLISTER, 2012). Pode haver fratura patológica
associada (PHILLIPS et al., 1986; THOMPSON; POOL, 2002; DERNELL et al.,
2007; AMARAL, 2008; BHANDAL; BOSTON, 2011; KEALY; MCALLISTER, 2012).
Nota-se aumento de volume de tecidos moles periféricos (DERNELL et al., 2007;
KEALY; MCALLISTER, 2012) e não há indícios de invasão do osso subcondral
adjacente ou da cartilagem articular (LUCROY; PECK; BERRY, 2001; THOMPSON;
POOL, 2002; DONATO et al., 2005; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008). Na
maioria das vezes a lesão é monostótica (THOMPSON; POOL, 2002; DERNELL et
al., 2007; AMARAL, 2008). Os osteossarcomas do esqueleto axial apresentam
alterações radiográficas semelhantes ao apendicular.
Os osteossarcomas são lesões dinâmicas e pode-se observar alterações
significativas na imagem em sete a 10 dias que servirão de base para o radiologista
durante uma avaliação seriada do paciente. O diagnóstico final é dado através da
histopatologia já que que não há padrões radiográficos patognomônicos
(THOMPSON; POOL, 2002, CHUN, 2005; AMARAL, 2008). Alguns autores relatam
que a alteração da arquitetura trabecular pode ser uma das primeiras alterações que
indiquem o surgimento de uma lesão óssea (KEALY; MCALLISTER, 2012).
Em cães, a imagem radiográfica pode apresentar certo grau de
heterogeneicidade, podendo variar desde predominantemente lítica passando por
mista até predominantemente esclerótica (AMARAL, 2008; THRALL, 2010; KEALY;
MCALLISTER, 2012) sendo o padrão misto mais freqüente nos casos de
osteossarcoma (AMARAL, 2008). Tal fato pode estar relacionado ao percentual de
material osteóide produzido ou do grau de mineralização deste. Isto tem relação
direta com os subtipos que o osteossarcoma apresenta ou ainda a
28
heterogeneicidade das lesões já que o osteossarcoma não é um tipo de tumor
considerado homogêneo.
O osteossarcoma pode ser classificado nos seus subtipos histológicos, com
base na quantidade e qualidade da matriz extracelular produzida e predominante
nas seções observadas segundo a Classificação Histológica dos Tumores Ósseos e
Articulares dos Animais Domésticos, da Organização Mundial de Saúde (SCHULZ et
al., 1988; SLAYTER et al., 1994; LOUKOPOULOS; THORNTON; ROBINSON, 2003;
HOENERHOFF et al., 2004), tendo-se:
Osteossarcoma pouco diferenciado ou anaplásico: com células malignas
que podem apresentar variado pleomorfismo, se assemelhando a células
mesenquimais primitivas e que produzem pequenas quantidades de
matriz osteóide.
Osteossarcoma osteoblástico: apresenta osteoblastos anaplásicos e pode
ainda, de acordo com a quantidade de material osteóide produzido, ser
subclassificado em osteossarcoma osteoblástico produtivo e minimamente
produtivo. Em humanos este subtipo representa 50% dos casos
(HOENERHOFF et al., 2004) e em cães pode chegar a quase 90%
(BARGER et al., 2005; AMARAL, 2008).
Osteossarcoma condroblástico: produz matriz osteóide e condróide que
na maioria das vezes encontram-se entremeadas. Quando separadas, a
coleta de uma amostra da área condróide pode levar ao falso diagnóstico
de condrossarcoma.
Osteossarcoma fibroblástico: a formação de material osteóide acontece
conforme as células aumentam a sua capacidade de formar a matriz
mineral. Inicialmente uma população de células alongadas irá predominar.
Apresenta melhor prognóstico que os demais.
Osteossarcoma telangectásico: apresenta lesões císticas dominantes
contendo sangue circundadas por células neoplásicas podendo ser difícil
a visualização do material osteóide. Apresenta pior prognóstico que os
demais com taxa metastática de 100%.
Osteossarcoma de células gigantes: apresenta áreas onde células
gigantes predominam em meio ao material osteóide. Deve ser
diferenciado do tumor ósseo de células gigantes.
29
Podem ainda ser classificados como simples, quando o material osteóide é o
único encontrado, ou composto se há mais de um tipo de material de matriz
extracelular produzidas pelas células cancerígenas (SCHULZ et al., 1988;
LOUKOPOULOS; THORNTON; ROBINSON, 2003; HOENERHOFF et al., 2004).
Essa característica multipotencial do ostessarcoma pode ser explicada pelo fato de o
tecido mesenquimal possuir alto potencial de diferenciação (HOENERHOFF et al.,
2004). O critério decisivo para seu diagnóstico é a observação do material osteóide
tumoral mesmo que em um pequeno foco (SCHULZ et al., 1988; GRUNDMANN et
al. 1995; FANBURG et al., 1997; BARGER et al., 2005).
Hoje sabe-se que os subtipos histológicos do osteossarcoma representam
entidades clínico-patológicas diferentes tanto para cães quanto para humanos
(GRUNDMANN et al, 1995; LOUKOPOULOS; THORNTON; ROBINSON, 2003;
HOENERHOFF et al., 2004). Se determinados subtipos estão associados a maior ou
menor tempo de sobrevida ainda não está claro. No entanto, a familiaridade com
estes subtipos auxilia no diagnóstico acurado e consequentemente uma melhor
abordagem terapêutica o que se reflete indiretamente no tempo de sobrevida
(HAUBEN et al., 2002; LOUKOPOULOS; THORNTON; ROBINSON, 2003;
HOENERHOFF et al., 2004).
2.2.2. Condrossarcoma
Radiograficamente é impossível a distinção entre osteossarcoma e
condrossarcoma. Os condrossarcomas podem ser radiopacos com áreas mais
intensas correspondendo aos locais de ossificação. Nas costelas tendem a se
localizar próximo a junção costo-condral e formar massas grandes. Na cavidade
nasal deslocam o septo nasal e substituem o padrão turbinado normal por padrão
radiográfico amorfo com densidade de tecidos moles. Tumores vertebrais tendem a
ser menores e osteolíticos. Os condrossarcomas escapulares tendem a ser
volumosos e pouco mais radiodensos que os tecidos moles periféricos.
Condrossarcomas de ossos longos são menores e menos produtivos que os
osteossarcomas e podem ser muito osteolíticos destruindo a arquitetura óssea
esponjosa e cortical sem produzir uma matriz radiodensa ou resposta periosteal
marcante. Apresentam crescimento consideravelmente lento a partir da superfície de
30
ossos chatos preferencialmente com mínimo poder de invasão (THOMPSON; POOL,
2002).
Os condrossarcomas produzem abundante matriz condróide e nunca
osteóide, o que lhe dá um aspecto cinza-azulado à macroscopia. A cartilagem
neoplásica forma lobulos irregulares entremeados por tecido fibroso ou ainda
invadindo a trabécula óssea. Ossificações centrais às ilhas de cartilagem neoplásica
podem ser observadas. Tal achado pode ser derivado de processos metaplásicos
(SLAYTER et al., 1994; FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002, AMARAL, 2008).
Os condrossarcomas são hipercelulares. Os condrócitos atípicos variam em
tamanho e formato e possuem núcleo grande e hipercromático. A binucleação é
frequentemente observada assim como necrose e mitose em lesões de alto grau. A
classificação pelo grau é importante no prognóstico do condrossarcoma. A escala
varia de 1 a 3 e abrange fatores como: índice de mitose, índice de celularidade, grau
de pleomorfismo e hipercromasia nuclear e grau de necrose tumoral (SLAYTER et
al., 1994; FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002; LOUKOPOULOS; THORNTON;
ROBINSON, 2003).
2.2.3. Fibrossarcoma
O fibrossarcoma pode apresentar basicamente dois tipos de comportamento:
comumente provoca destruição óssea por um período de meses até um ano e é
mais lento em gerar metástase que o osteossarcoma ou tem comportamento
agressivo, anaplásico, mais lítico (KEALY; MCALLISTER, 2012) causando rápida e
maciça destruição do osso, podendo causar metástases.
Os casos em Medicina Veterinária de fibrossarcoma ósseo de origem medular
sugerem uma predileção pelas metáfises dos ossos longos, mas pode acontecer em
mandíbula e vértebra. Quando originado a partir do periósteo, tende a ocorrer nos
ossos da cabeça. Dependendo do tempo de curso da lesão, muitas vezes não é
possível distinguir o fibrossarcoma ósseo periosteal das formas gengival, labial ou
da mucosa oral. O material fibroso pode se infiltrar nos espaços trabeculares da
metáfise mantendo as trabéculas intactas. Em lesões mais agressivas, o osso é
destruído e substituído por tecido neoplásico. A destruição do osso subcondral
permite a extensão para a cavidade articular através das fraturas na cartilagem. O
31
tecido tumoral pode invadir a camada fibrosa da cápsula articular e atingir o próximo
osso. A invasão dos tecidos periféricos é parcialmente contida pelo periósteo.
Quando há resposta perióstica, esta tende a ser moderada embora o aumento de
volume seja notável (THOMPSON; POOL, 2002).
O fibrossarcoma tende a formar uma lesão radiográfica lítica, sendo difícil de
diferenciá-lo de outros tumores ósseos que também assumem este padrão.
Radiografias seqüenciais podem ter valor diagnóstico uma vez que a progressão é
mais lenta que nos osteossarcomas e outros tumores ósseos altamente malignos
(SLAYTER et al., 1994; FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002; THOMPSON; POOL,
2002).
O tumor surge a partir de elementos do estroma da cavidade medular e
produz células fusiformes típicas dos fibrossarcomas de tecidos moles com variável
quantidade de matriz colágena. Não há produção de cartilagem ou osso. Áreas de
necrose e mitoses atípicas podem estar presentes (SLAYTER et al., 1994;
FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002).
2.2.4. Hemangiossarcoma
O hemangiossarcoma tem predileção pelo terço distal e proximal dos ossos
longos podendo acometer pelve, esterno, costela, maxila e coluna vertebral. O
hemangiossarcoma de tecidos moles pode metastatizar para os ossos produzindo
lesões semelhantes. O hemangiossarcoma ósseo primário destrói grande área de
osso normal incluindo a esponjosa e a cortical sendo comum fratura patológica
porém, normalmente a reação periosteal não acontece ou é mínima. Tal observação
pode ser decorrente da isquemia local provocada pela hemorragia do tumor que
evita a osteogênese. Não costumam invadir os tecidos periféricos como outros
sarcomas (SLAYTER et al., 1994; FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002;
THOMPSON; POOL, 2002).
Pode-se observar lesões múltiplas, o que torna impossível distingui-las como
primária ou secundária (THOMPSON; POOL, 2002; DERNELL et al., 2007). Hidaka
et al. (2006) relatam que no hemangiossarcoma ósseo primário descrito por eles, a
lesão radiográfica em úmero se caracterizava por áreas semelhantes a “roído de
traça” havendo crescimento expansivo em forma de bolhas associado a destruição
32
óssea maciça (ERDEM; PEAD, 2000; DERNELL et al., 2007) e fratura patológica.
Nos casos de hemangiossarcoma ósseo primário em escápula, o posicionamento
crânio-caudal da escápula permite melhor investigação diagnóstica deste tipo de
tumor (ERDEM; PEAD, 2000). Independente disso, os autores relatam ser difícil a
diferenciação radiográfica entre este tumor e o osteossarcoma sendo o diagnóstico
definitivo dado pela histopatologia.
O estroma do hemangiossarcoma não forma matriz calcificada o que torna a
diferenciação entre ele e um osteossarcoma telangectásico com baixo potencial
osteoblástico difícil em alguns casos mesmo para a histopatologia (DERNELL et al.,
2007).
O hemangiossarcoma se assemelha ao seu equivalente de tecidos moles.
Apresenta canais vasculares sustentados por um estroma variável de colágeno.
Pode ser consideravelmente anaplásico com atipia nuclear proeminente e alto
número de figuras de mitose atípicas (SLAYTER et al., 1994; FLETCHER; UNNI;
MERTENS, 2002; THOMPSON; POOL, 2002).
2.2.5. Tumor Ósseo Multilobular
O tumor ósseo multilobular é comumente uma lesão solitária, apresenta como
característica bordas bem demarcadas com lise limitada do osso adjacente e
observa-se uma densidade mineral granular grosseira. Sinais como reação óssea
marcante nas bordas tumorais e grandes áreas de lise podem sugerir alteração
maligna (THOMPSON; POOL, 2002).
É caracterizado por ilhas de diferenciação variável, podendo ser cartilagem
e/ou osso separadas por septos de células fusiformes. A malignidade é dada pela
superexpressão de um dos elementos, atividade mitótica aumentada, perda da
arquitetura e diferenciação e invasão de tecidos adjacentes (SLAYTER et al., 1994;
FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002; THOMPSON; POOL, 2002).
2.3 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
A confirmação por outros meios que não apenas a imagem, seja ela
radiográfica ou tomográfica, é mandatória para o estabelecimento do diagnóstico
das neoplasias ósseas primárias já que informações específicas são necessárias
33
antes da instituição da terapia mais adequada. Além disso, o diagnóstico final é dado
pela histopatologia já que o osteossarcoma e outros tumores ósseos como
condrossarcoma e fibrossarcoma não produzem padrões radiográficos
patognomônicos. Não necessariamente os tumores ósseos serão a suspeita
principal, sendo igualmente importante identificar histologicamente lesões benignas,
inflamatórias e infecciosas, até mesmo para se fazer o diagnóstico diferencial
(HAUBEN et al., 2002; JELINEK et al., 2002; AMARAL et al., 2006; AMARAL, 2008;
AMARAL; ROMÃO; FERREIRA, 2013).
A determinação histopatológica pode ser obtida através de biópsia incisional,
obtida por agulhas específicas, ou excisional, realizada após a exérese da lesão
como nos casos de amputação de membro. Neste último caso, a quantidade de
material obtida é comumente maior mas nem sempre implica em maior pencentual
de acerto (AMARAL et al., 2006; AMARAL, 2008; AMARAL; ROMÃO; FERREIRA,
2013).
Em todos os casos de obtenção de material, o patologista deve estar
familiarizado com os tipos de lesões observadas em sistema locomotor e a
integração entre as áreas envolvidas aumenta as chances de se obter um
diagnóstico final acurado (PRAMESH et al., 2001; AMARAL et al., 2006; AMARAL,
2008; AMARAL; ROMÃO; FERREIRA, 2013). A biópsia incisional permite a
obtenção de quantidade ideal de tecido e maior precisão do resultado quando
comparado com as técnicas citológicas, porém essa técnica apresenta como
desvantagens o envolvimento de procedimento cirúrgico, risco de complicações pós-
cirúrgicas como formação de hematoma, infecção, disseminação do tumor e fratura
patológica (BARGER et al., 2005; DALECK et al., 2006) principalmente quando a
técnica é realizada com o bisturi, sendo mais invasiva. A incidência dessas
complicações são consideravelmente reduzidas quando se realiza a biópsia óssea
percutânea por agulha (AMARAL et al., 2006; AMARAL, 2008; AMARAL; ROMÃO;
FERREIRA, 2013).
Em Medicina Veterinária as principais indicações para a realização da biópsia
óssea por agulha atualmente são a confirmação do tipo de neoplasia em questão, as
lesões suspeitas de serem infecciosas, mas apresentando características agressivas
de malignidade e lesões primárias radiograficamente típicas, no entanto
apresentando-se em faixas etárias e locais pouco comuns (POWERS et al., 1988;
34
BREUR; SLOCOMBE; BRADEN, 1988; AMARAL, 2008; AMARAL; ROMÃO;
FERREIRA, 2013).
Mehl et al. (2001), Dernell et al. (2007) e Amaral (2008) enfatizam que o
diagnóstico de tumores ósseos, principalmente o osteossarcoma devido a sua
heterogeneicidade, tem seu percentual de acerto aumentado com biópsias
adicionais, ou seja, a coleta de múltiplas amostras aumenta a chance de fechar o
diagnóstico corretamente.
O diagnóstico histopatológico das lesões ósseas em cães não apresenta a
mesma diversidade dos casos humanos, sendo o osteossarcoma e suas
subclassificações a principal neoplasia causadora de lesões ósseas primárias,
seguido do condrossarcoma (ERDEM; PEAD, 2000; DERNELL et al., 2007;
AMARAL, 2008).
Em alguns casos, a identificação do osteossarcoma pode ser dificultada pelo
fato de suas variantes histológicas mimetizarem outros tumores ósseos primários ou
metastáticos, o osso neoplásico pode não estar presente em espécimes de biópsia e
que o tecido conjuntivo denso hialino pode parecer com o osso neoplásico quando
examinado na microscopia ótica (FANBURG et al., 1997; AMARAL; ROMÃO;
FERREIRA, 2013).
2.4 IMUNO-HISTOQUÍMICA
2.4.1. Introdução
Imuno-histoquímica é uma técnica que permite a observação da quantidade,
distribuição tecidual e localização celular de antígenos in situ, isto é, em cortes
histológicos. Baseia-se no uso de anticorpos primários direcionados contra o
antígeno a ser pesquisado e, posteriomente, a aplicação de um anticorpo secundário
acoplado a um sistema de revelação (HAINES; WEST, 2005; AMORIM, 2009; DE
MATOS et al., 2010; CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).
2.4.2. Histórico e Aplicações Gerais
A técnica surgiu na década de 40, quando o médico Albert Coons demonstrou
ser possível localizar microrganismos em cortes histológicos de tecidos usando
35
anticorpos específicos contra Streptococcus pneumoniae corado com fluoresceína e
visualizado sob luz ultra-violeta (HAINES; WEST, 2005; DE MATOS et al., 2010;
LEONG; COOPER; LEONG, 2010). Na década de 60, Nakane desenvolveu
anticorpos marcados com enzimas, tornando possível a visualização da reação sob
microscopia ótica. Isso aumentou o número de laboratórios capazes de realizar a
técnica (HAINES; WEST, 2005; DE MATOS et al., 2010). As descobertas seguintes
dos sistemas da peroxidase e da fosfatase alcalina expandiram a aplicação da
técnica. No mesmo período, passou-se a utilizar a molécula de diaminobenzidina
(DAB) como agente cromógeno para a peroxidase que produz um precipitado
eletrodenso passível de ser utilizado na microscopia eletrônica (DE MATOS et al.,
2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).
No entanto, a técnica só foi aceita como método diagnóstico de rotina na
anatomia patológica a partir de 1974. Isso só ocorreu após a descoberta dos
métodos de recuperação antigênica e da aplicação dos sistemas de anticorpos
secundários que permitiu a utilização da imuno-histoquímica não só em espécimes
frescas mas também em formolizadas (HAINES; WEST, 2005; WERNER et al.,
2005; DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010; CATALDO;
FICARRA; MACII, 2012).
Os primeiros tecidos-alvo foram as lesões auto-imunes que, a partir de uma
mesma peça, tiveram sua aparência histológica determinada e a demonstração da
presença e do padrão da deposição das imunoglobulinas usadas. Em muitos casos,
dependendo da molécula em questão, tornou-se possível inferir considerações a
respeito da patogênese dessas além da confirmação diagnóstica. Outra aplicação
está nos casos onde a lesão histológica gerada pelo patógeno não é patognomônica
e na ligação de agentes já conhecidos a novas manifestações da doença em
hospedeiros já conhecidos ou não (HAINES; WEST, 2005).
Atualmente, em medicina, a aplicação primária da técnica de imuno-
histoquímica, além das doenças auto-imunes, é a demonstração de antígenos
associados a neoplasias para melhor diagnosticar e determinar o prognóstico de
pacientes com câncer. O objetivo é determinar a origem celular da população
tumoral (HAINES; WEST, 2005; WERNER et al., 2005). Os principais alvos são
proteínas filamentares intermediárias especialmente em casos de tumores
anaplásicos onde não se pode determinar a origem mesenquimal ou epitelial das
células. Os anticorpos utilizados contra essas proteínas podem ser utilizados em
36
medicina veterinária pois as mesmas são altamente conservadas entre as espécies.
(HAINES; WEST, 2005).
Nos últimos dez anos, observou-se um crescimento logarítmo do número de
publicações envolvendo técnicas imuno-histoquímicas tanto na medicina quanto na
veterinária, o que reflete a posição ocupada pela técnica nos laboratórios de
patologia como complementar na elucidação de diagnóstico diferencial que não é
obtido por análises convencionais coradas com hematoxilina-eosina (HE) (WERNER
et al., 2005; DE MATOS et al., 2010).
2.4.3. Anticorpos Utilizados
Os anticorpos primários podem ser monoclonais ou policlonais. Os anticorpos
monoclonais são aqueles capazes de identificar um único epítopo antigênico e são
produzidos normalmente em camundongos pela técnica do hibridoma. Os anticorpos
policlonais reagem contra diferentes epítopos antigênicos num mesmo antígeno e
são produzidos em imunizações em coelhos ou outro animal. Os anticorpos
policlonais possuem maior sensibilidade. Os anticorpos monoclonais são mais
específicos que os policlonais e a chance de reação cruzada entre as espécies é
bem menor. Isso pode prejudicar a utilização de anticorpos monoclonais,
comumente humanos, em medicina veterinária, salvo casos onde há homologia
entre os epítopos humano e da espécie estudada (regiões conservadas) (AMORIM,
2009; DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).
Os anticorpos secundários devem se direcionados contra a espécie para qual
foi feito o anticorpo primário e deve ser produzido em outra espécie animal. Esses
anticorpos costumam apresentar moléculas acopladas a eles que servem de
substrato para uma enzima e o produto gerado apresenta coloração específica,
sendo então observado nos tecidos. Exemplos destas moléculas são o complexo
estreptavidina-biotina e substratos da peroxidase (AMORIM, 2009).
Atualmente, devido ao processo de recuperação antigênica, um grande
número de anticorpos passou a ser utilizado em tecidos processados rotineiramente.
Isto só foi possível pois a recuperação antigênica libera os antígenos ligados às
moléculas de formol, permitindo a sua identificação pelo anticorpo. Anteriormente a
isso, somente eram utilizados cortes de tecidos congelados, o que na maioria das
vezes tinha seu uso limitado (AMORIM, 2009; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).
37
2.4.4. Alvos antigênicos em Oncologia
Nos casos de neoplasias indiferenciadas, utiliza-se um painel de anticorpos
primários que tem por função identificar antígenos característicos de determinado
tipo celular (AMORIM, 2009; LEONG; COOPER; LEONG, 2010). Neste caso, a
experiência do patologista é fundamental para que o número de anticorpos usados
seja o menor possível devido ao custo (AMORIM, 2009).
Muitas neoplasias e suas metástases preservam a expressão de filamentos
intermediários, as proteínas da rede de sustentação celular. Existem quatro tipos: a
vimentina, presente na maioria das células mesenquimais; a desmina, presente nas
células musculares; a proteína ácida fibrilar glial (GFAP – glial fibrillary acidic protein)
dos astrócitos e as citoqueratinas das células epiteliais. Elas auxiliam na
identificação da origem das células avaliadas (AMORIM, 2009).
Marcadores de proteínas envolvidas na gênese tumoral, como marcadores do
ciclo celular, da apoptose, da adesão celular, da angiogênese, da expressão de
proto-oncogenes e genes supressores de tumor podem ser identificados no tecido
neoplásico para avaliação de prognóstico e resposta a terapia. São exemplos, a p53,
o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e Ki-67 (MIB-1) (AMORIM, 2009;
LEONG; COOPER; LEONG, 2010).
A cinética do crescimento tumoral envolve a taxa de proliferação celular e a
proporção de células que sofrerão morte celular. A apoptose é importante no
controle populacional celular e a perda desse mecanismo confere pior prognóstico
às neoplasias, que se tornam resistentes à morte celular programada. Pela imuno-
histoquímica, pode-se avaliar o percentual de células em apoptose com o uso de
marcadores específicos com a caspase-3 e o bcl-2 (WERNER et al., 2005; LEONG;
COOPER; LEONG, 2010; CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).
São alvos ainda da imunistoquímica moléculas envolvidas na formação de
vasos como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF – vascular endothelial
growth factor) e enzimas de importantes rotas metabólicas celulares como a tirosina
quinase e a cicloxigenase-2 (WERNER et al., 2005; LEONG; COOPER; LEONG,
2010).
O número de marcadores utilizados varia de acordo com o estudo em
questão. Casos mais simples requerem menor número de anticorpos enquanto que
diagnósticos diferenciais mais complexos como no caso de neoplasias malignas
38
indiferenciadas solicitam um maior número de anticorpos. Este número pode variar
de um a 15, sendo a média de anticorpos utilizados em torno de 4-5 tipos (WERNER
et al., 2005). O uso de um único anticorpo para a prática diagnóstica deve ser
desencorajado (LEONG; COOPER; LEONG, 2010).
É importante ressaltar que, apesar de o número de casos avaliados
rotineiramente ser pequeno, a imuno-histoquímica contribui positivamente na
balança custo/benefício nesta pequena parcela de casos, e consolida a sua posição
de ferramenta complementar e não essencial para o exercício da patologia cirúrgica
de um modo geral (WERNER et al., 2005; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).
2.4.5. Limitações
A imuno-histoquímica pode não contribuir para o diagnóstico das neoplasias
principalmente em casos de exiguidade de amostras onde o tecido obtido não é
quantitativamente suficente para a realização das reações necessárias, presença de
necrose extensa provocando coloração inespecífica além de o pouco tecido viável
ser insuficiente para a interpretação das reações e indiferenciação extrema de
algumas neoplasias quando todos os marcadores são negativos. Além disso, a
fixação inadequada, utilizando formol é um fator complicador (WERNER et al., 2005;
LEONG; COOPER; LEONG, 2010).
Apesar destas considerações, a quantidade de material utilizado tem sido
questionada pois cada vez mais os patologistas são impelidos a realizar um
diagnóstico preciso em pequenas amostras. Na maioria das vezes um bloco é
suficiente mas este deve conter um fragmento representativo da lesão e com parte
do parênquima da interface da lesão, devendo-se excluir áreas de necrose e
hemorragia já na análise macroscópica (DE MATOS et al., 2010, LEONG; COOPER;
LEONG, 2010).
A aquisição, manuseio, fixação e chegada do material no laboratório e a
recuperação antigênica são fatores críticos. Espécimes frescas fixadas
inadvertidamente por períodos longos podem levar a perda de antigenicidade. A
fixação em formaldeído e a consequente inclusão em parafina são os procedimentos
de processamento histológico mais usados internacionalmente. Alguns especialistas
propõem que este método deve ser padrão para comparação diagnóstica frente a
39
imuno-histoquímica. No entanto, a fixação em formol resulta em perda variavelmente
reversível de imunorreatividade seja mascarando ou danificando locais de ligação do
anticorpo (DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).
Apesar de muitos epítopos serem desmascarados através de métodos de
recuperação antigênica, o sistema de detecção imuno-histoquímico ainda deve ser
sensível o suficiente para produzir um sinal forte. Para alguns epítopos, o tempo de
duração da fixação em formol pode ser crucial. Já em outros casos, dependendo da
resistência do epítopo-alvo às alterações autolíticas, a demora na fixação pode levar
a perda da imunorreatividade (DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG,
2010).
É importante enfatizar que a utilização de temperaturas altas (acima de 60° C)
durante o processo de inclusão em parafina pode comprometer a antigenicidade
através da desnaturação dos epítopos. A preparação dos cortes deve ser realizada
entre 3 e 7 µm e estes devem ser depositados em lâminas previamente preparadas
com algum sistema adesivo. Entre eles pode-se citar o silane e a polilisina. Cortes
abaixo de 3 µm resultam em fraca coloração enquanto que acima de 7 µm pode
levar a perda de tecido na lâmina (DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER;
LEONG, 2010).
2.4.6. Vantagens
A vantagem da imuno-histoquímica está não só na identificação do antígeno
mas também na associação com a sua localização no tecido, permitindo relacionar
sua expressão com determinado tipo celular (AMORIM, 2009; LEONG; COOPER;
LEONG, 2010; CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).
Apresenta ampla viabilidade, facilidade de execução e manutenção das
lâminas coradas por longos períodos (CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).
Em 95% dos casos nos quais o patologista humano está diante de um caso
de diagnóstico difícil nas lâminas coradas com HE, a imuno-histoquímica pode
ajudá-lo a firmar se não o diagnóstico correto pelo menos um diagnóstico apropriado
(WERNER et al., 2005).
Diversos relatos de neoplasias são encontrados na literatura onde o
diagnóstico e determinação da origem do tumor se deu graças a utilização da imuno-
histoquímica (HOENERHOFF et al., 2004, WERNER et al., 2005). Em medicina,
40
vastos são os trabalhos que pesquisam moléculas específicas em determinados
tipos de neoplasias para estabelecimento de prognóstico (LEONG; COOPER;
LEONG, 2010).
A princípio, o custo de aquisição dos anticorpos constituiria uma desvantagem
(AMORIM, 2009). Apesar disso, alguns trabalhos citam-na como de baixo custo, e
que, mesmo que o custo da técnica aumentasse cinco vezes, ainda assim seria
vantajosa (WERNER et al., 2005; CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).
2.4.7. Desvantagens
A experiência do patologista que escolhe os anticorpos e interpreta os
resultados imuno-histoquímicos é o fator mais importante para a eficiência da imuno-
histoquímica no diagnóstico de tumores, devendo-se integrar os resultados obtidos
na imuno-histoquímica com o diagnóstico suspeitado nas lâminas coradas com HE
(WERNER et al., 2005; DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).
É relatado que a má seleção do painel de anticorpos pode ser responsável em até
40% pelas discrepâncias diagnósticas. Outro ponto a ser considerado é a
característica dos anticorpos utilizados incluindo a titulação e os controles positivo e
negativo (DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).
Tecidos submetidos a análise por congelação devem ser evitados (DE
MATOS et al., 2010) embora, segundo Hosoya et al. (2005), a utilização de cortes
frescos congelados é indicada para tecidos calcificados, onde a imunorreatividade
das proteínas é preservada assim como sua localização.
2.4.8. Interpretação de resultados
A interpretação dos dados imuno-histoquímicos em muitos casos é qualitativa
sendo a quantificação colocada como de menor importância uma vez que sua
reprodutibilidade é baixa (DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG,
2010).
Ainda assim, alguns autores discordam sobre o que considerar como um
resultado positivo. Para muitos, a simples coloração castanha já é suficiente
enquanto que para outros, a localização desta marcação tem importância no
julgamento. É fundamental então conhecer as funções e os fenômenos biológicos
41
nos quais a molécula estudada está envolvida (DE MATOS et al., 2010; LEONG;
COOPER; LEONG, 2010; CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).
Atenção deve ser dada em casos onde a coloração do anticorpo, de função
documentada e conhecida, não se manifesta conforme esperado e o pesquisador
pode considerar este um resultado falso positivo. No entanto, é importante
considerar que pode-se estar diante de outra função biológica daquela molécula,
ainda não descrita na literatura. Nos casos onde a natureza do antígeno ou sua
função não foi completamente elucidada, tal determinação pode ser mais trabalhosa
(DE MATOS et al., 2010).
Algumas questões devem ser consideradas na interpretação dos resultados.
Sabe-se que a quantificação da marcação imuno-histoquímica está diretamente
relacionada a concentração tissular daquele antígeno. As colorações biológicas,
entretanto, são difíceis de controlar em termos de intensidade o que pode dificultar o
estudo comparativo. Essa dificuldade tende a diminuir com a utilização de técnicas
de automação e microscopia digital (DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER;
LEONG, 2010; CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).
As análises semi-quantitativas, baseadas em categorias (ou scores) variam
de acordo com a experiência do analisador sendo dependentes do mesmo e
portanto são inadequadas. As técnicas de análise quantitativa assistida por
computador tem sido superior, representando uma solução frente a reproducibilidade
e aplicabilidade dos métodos semi-quantitativos (DE MATOS et al., 2010;
CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).
2.4.9. Marcadores de interesse em Neoplasias Ósseas
2.4.9.1.Marcadores de Linhagem Celular
2.4.9.1.1. Vimentina
A vimentina é uma proteína de 57 kDa pertencente ao grande grupo de
filamentos intermediários. Os filamentos intermediários, juntamente com os
microfilamentos e microtúbulos, compreendem os três grandes grupos das principais
proteínas do citoesqueleto de céluas eucarióticas não-musculares. A família dos
filamentos intermediários possui seis grandes classes, estando a vimentina
classificada como tipo III. É a mais expressada e conservada proteína do grupo,
42
ainda composto pela desmina, periferina e proteína ácida de filamento glial (MININ;
MOLDAVER, 2008; PAN et al., 2010; SATELLI; LI, 2011).
A vimentina possui 466 aminoácidos, com uma estrutra central de -hélice
altamente conservada de duas extremidades N- e C-terminais. É codificada por um
gene único localizado no cromossomo 10p13 (MININ; MOLDAVER, 2008; SATELLI;
LI, 2011).
Em indivíduos adultos, a expressão da vimentina está limitada às células do
tecido conjuntivo mesenquimal, do sistema nervoso central e do músculo. É
expressa numa variedade de células incluindo precursores celulares pancreáticos e
neurais, células de Sertoli, células gigantes trofoblásticas, fibroblastos, células
endoteliais que delimitam vasos, células tubulares renais, macrófagos, neutrófilos,
células mesangiais e do estroma renal (MININ; MOLDAVER, 2008; SATELLI; LI,
2011).
Sendo uma proteína estrutural de citoesqueleto, é esperado que sua
localização seja restrita ao citossol, no entanto, sua presença já foi demonstrada no
núcleo assim como extracelularmente. Em ambos os casos, ainda não se definiu seu
papel exatamente (SATELLI; LI, 2011).
A principal função da vimentina está relacionada a manutenção da arquitetura
celular e integridade tecidual. Ela interage com várias proteínas e participa de
diversos processos celulares (MININ; MOLDAVER, 2008; MENDEZ; KOJIMA;
GOLDMAN, 2010; PAN et al., 2010; SATELLI; LI, 2011). Sua interação com as
mitocôndrias, através do grupamento N-terminal já foi comprovada (NEKRASOVA et
al., 2011). Ela ainda está implicada diretamente na distribuição intracelular das
organelas e proteínas, influenciando suas funções. Os filamentos polimerizados de
vimentina apresentam considerável mobilidade celular, ligadas a poteínas motoras
como a cinesina e dineína. Os filamentos ainda se ligam a proteínas acopladoras de
filamentos como a plectina previnindo a mobilidade do citoesqueleto, necessário
para estabilizar regiões especiais do citoplasma que sofra por stress mecânico ou
deformação (MININ; MOLDAVER, 2008; PAN et al., 2010; MENDEZ; KOJIMA;
GOLDMAN, 2010).
Algum grau de regulação da vimentina é dado através de reações de
fosforilação da molécula (MININ & MOLDAVER, 2008; PAN et al., 2010; MENDEZ;
KOJIMA; GOLDMAN, 2010).
43
A vimentina é utilizada na identificação de linhagem de origem mesenquimal,
tendo importante valor diagnóstico principalmente em casos de neoplasias
anaplásicas tanto em humanos quanto em animais (THOMAS; PRESSLER;
ROBERTSON, 2001; HOENERHOFF et al., 2004; BARGER et al., 2005; MININ &
MOLDAVER, 2008; WIERSMA et al., 2010; PALMIERI et al., 2011; SATELLI; LI,
2011). Segundo Hoenerhoff et al. (2004), é comumente expressa em
osteossarcomas caninos.
A vimentina tem ganho destaque recentemente devido ao seu envolvimento
com a transformação epitelial-mesenquimal, um processo de reprogramação celular
onde células epiteliais adquirem fenótipo mesenquimal, o que altera drasticamente
seu formato e aumenta sua motilidade (LI et al, 2010; MENDEZ; KOJIMA;
GOLDMAN, 2010; PAN et al., 2010; SATELLI; LI, 2011). Essa transformação é
caracterizada pela expressão de vimentina nas células epiteliais, que normalmente
expressam apenas citoqueratinas, filamentos intermediários pretencentes ao tipo I e
II (AMORIM, 2009; LI et al, 2010; MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010; PAN et al.,
2010; SATELLI; LI, 2011). O processo inverso, transformação mesenquimal-epitelial
também acontece, e neste, as células mesenquimais adquirem fenótipo epitelial,
reduzem a expressão de vimentina e apresentam menores taxas de motilidade
(MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010; SATELLI; LI, 2011).
Aumento na expressão de vimentina já foi observado em várias linhagens
tumorais em seres humanos (LI et al, 2010; MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010;
SATELLI; LI, 2011).
No câncer de próstata, a expressão da vimentina é detectada principalmente
nos casos pouco diferenciados e nas metástases ósseas mas é praticamente
indetectável nos casos mais diferenciados. Especula-se que a expressão da
vimentina contribua para o desenvolvimento do fenótipo invasivo em conjunção com
outros elementos (MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010; SATELLI; LI, 2011).
Em seres humanos, a expressão da vimentina nos cânceres gástricos está
associada a carcinoma de fenótipo invasivo e parece ter papel nas metástases do
mesmo, servindo como fator prognóstico (SATELLI; LI, 2011). Observação
semelhante ocorre em linhagens agressivas de neoplasias mamárias (MENDEZ;
KOJIMA; GOLDMAN, 2010; SATELLI; LI, 2011). No carcinoma de células
escamosas esofágico, células que expressam vimentina exibem maior incidência de
metástases em linfonodos. Já nos tumores colon-retais, a vimentia está restrita aos
44
fibroblastos do estroma, células endoteliais permeando vasose linfócitos infiltrativos
(SATELLI; LI, 2011).
A superexpressão de vimentina em melanomas primários não apenas serve
como marcador diagnóstico mas também como prognosticador de metástases
hematogênicas o que se reflete no resultado clínico, conduzindo estratégias de
tratamento de forma individual (LI et al, 2010).
Em meningiomas, a forma fosforilada da vimentina está associada a tumores
não-infiltrativos quando comparado com os invasivos (SATELLI; LI, 2011).
A quinase AKT se liga a vimentina fosforilada e a protege da proteólise
induzida pela caspase o que leva a um aumento da motilidade celular e da invasão
nas células de sarcomas de tecidos moles (SATELLI; LI, 2011). Scrib, uma proteína
envolvida na migração celular, é protegida da degradação proteossomal através de
interação com a vimentina sugerindo a possibilidade de a regulação positiva da
vimentina na transformação epitelial-mesenquimal leva a estabilização da Scrib,
promovendo diretamente a migração celular para aumentar a capacidade invasiva
das células. A vimentina ainda atua como um freio na diferenciação de osteoblastos
imaturos. (MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010; SATELLI; LI, 2011).
Em relação às metástases, Schoumacher et al. (2010) relatam sua
participação na formação da invadopodia, o prolongamento celular das células
tumorais responsáveis pela degradação da membrana basal e consequente invasão
tecidual. A formação do invadopodia é primariamente dependente dos filamentos de
actina porém, seu alongamento, uma vez rompida a membrana basal, requer a
formação da rede de microtúbulos e filamentos intermediários, incluindo a vimentina.
Assim sendo, a vimentina atua não só como ferramenta diagnóstica mas
também tem papel no desenvolvimento e progressão do câncer. Apesar de sua
maior ênfase ser na transformação epitelial-mesenquimal, parece estar envolvida em
outros eventos da gênese tumoral uma vez que diversos estudos demonstram
relação positiva entre sua expressão e a migração e invasão celular (LI et al, 2010;
PAN et al., 2010; SATELLI, LI, 2011).
Sendo isso verdade, a vimentina torna-se alvo da terapia anticancerígena
(PAN et al., 2010; SATELLI; LI, 2011). A silibinina, um flavonolignano, e principal
constituinte da silimarina isolada do cardo leiteiro (Silybum marianum), demonstrou
atividades anticancerígenas e quimioprotetoras fortes por inibir a invasão, motilidade
e migração de células prostáticas via regulação negativa da vimentina. De forma
45
semelhante, o antibiótico salinomicina diminui drasticamente os níveis de vimentina
em células de câncer colon-retal. Os mecanismos pelos quais isso acontece ainda
não forma elucidados (SATELLI; LI, 2011).
2.4.9.2. Marcadores ósseos proteicos
2.4.9.2.1. Osteocalcina
É a principal proteína não-colágena da matriz óssea, abrangendo entre 10 e
20% do material orgânico não-colágeno. A molécula precursora possui 100
aminoácidos enquanto que o peptídeo maduro consiste de 47-50 resíduos de
aminoácidos, com peso molecular variando entre 5,2 e 5,9 kDa, dependendo da
espécie (VERMEULEN; VERMEER; BOSMAN, 1989; CHEN et al., 2012). É
codificada pelo gene BGLAP em humanos (CHEN et al., 2011; CHEN et al., 2012).
Produzida por osteoblastos, odontoblastos e condrócitos hipertróficos, possui três
resíduos de ácido ɣ-carboxiglutâmico cuja formação ocorre pós-transicionalmente
num processo dependente de vitamina K e estimulado pela vitamina D3. Estes
resíduos se ligam ao cálcio e promovem uma mudança na conformação da proteína
que parece então funcionar como um sítio de localização para os cristais de
hidroxiapatita durante a síntese da matriz óssea (VERMEULEN; VERMEER;
BOSMAN, 1989; INGRAM et al., 1994; PARK et al., 1995; FANBURG et al., 1997;
PULLIG et al., 2000; HOENERHOFF et al., 2004; KIM et al., 2010; CHEN et al.,
2011; CHEN et al., 2012). Os índices de osteocalcina aumentam no osso conforme a
mineralização ocorre (PARK et al., 1995; CHEN et al., 2011) e a distribuição da
molécula no osso em humanos varia conforme sexo e idade (INGRAM et al., 1994).
Tanto a osteólise quanto a osteogênese liberam osteocalcina no sangue, que é
eliminada pelo clearence renal e degradação. Por isso, os níveis de osteocalcina
refletem o metabolismo ósseo em geral e não apenas a osteogênese. Somado a
isso, a detecção de osteocalcina plasmática ou sérica pode ser comprometida pelo
nível de lipídeos no sangue devido a capacidade da osteocalcina se ligar a eles. Há
múltiplas isoformas na circulação e os exames tem capacidade limitada de identificar
todas elas. (HOENERHOFF et al., 2004; KIM et al., 2010).
A fixação do tecido tem pouca influência sobre a imunorreatividade da
osteocalcina mas agentes descalcificadores como o EDTA podem reduzir
46
consideravelmente o percentual de imunorreatividade da mesma através da
extração da proteína durante o processo de calcificação. Quanto mais rápido for
este, como o que ocorre com o uso de ácidos, maior a imunorreatividade
encontrada, desde que não haja desnaturação da proteína (VERMEULEN;
VERMEER; BOSMAN, 1989; INGRAM et al., 1994; PULLIG et al., 2000). Para evitar
tais alterações, pode-se utilizar espécimes não-descalcificados embebidos em glicol-
metilmetacrilato (INGRAM et al., 1994).
A presença da osteocalcina já foi demonstrada em linhagens celulares de
osteossarcoma. Em tecido ósseo normal, foi detectada em osteócitos, sendo
proporcional ao tamanho dessas células: quanto maior a célula, mais intensa a
marcação. A imunorreatividade da osteocalcina também foi detectada nas margens
das lacunas ósseas e junto ao colágeno lamelar da matriz óssea sob a forma de
depósitos granulares. Em áreas de deposição óssea, o material osteóide
praticamente não se cora, diferente das trabéculas ósseas pré-existentes mas já se
observa marcações de osteocalcina em focos recém-mineralizados. A partir dessas
observações conclue-se que a deposição da osteocalcina na matriz óssea é uma
característica de tecido ósseo maduro, metabolicamente inativo (VERMEULEN;
VERMEER; BOSMAN, 1989; INGRAM et al., 1994; PARK et al., 1995; CHEN et al.,
2011; CHEN et al., 2012).
A osteocalcina é regulada positivamente pela proteína p53, estando este
envolvido na diferenciação dos osteoblastos e remodelamento ósseo (CHEN et al.,
2011). Sugere-se ainda o envolvimento do gene Mdm2 e do receptor de vitamina D
que se liga ao elemento VDR no promotor da osteocalcina (CHEN et al., 2012).
O anticorpo monoclonal bovino tipo IgG anti-osteocalcina tem a capacidade
de reconhecer tanto a osteocalcina bovina quanto a humana (VERMEULEN;
VERMEER; BOSMAN, 1989; INGRAM et al., 1994; PARK et al., 1995).
A osteocalcina parece ser exclusiva de osteossarcomas (GRUNDMANN et al.,
1995; CHEN et al., 2011). Observa-se marcação positiva para osteocalcina no
citoplasma dos osteoblastos independente do subtipo de osteossarcoma em
humanos. A marcação também é observada nas células gigantes dos diversos tipos
de osteossarcoma mas não no tumor ósseo de células gigantes. Condrócitos
normais não se coram para osteocalcina (PARK et al., 1995). Nos osteossarcomas,
o índice de marcação varia entre 70-80% (sensibilidade), havendo ausência de
marcação em alguns casos de osteossarcomas de células pequenas. É ainda
47
relatado que, em osteossarcomas que sofrem rearranjos do gene p53 e perdem a
sua expressão, a expressão de osteocalcina também é perdida (CHEN et al., 2012).
Tumores que não formam osso (condrossarcoma, lipossarcoma, tumor de células
gigantes, carcinomas, linfomas, etc) não reagem com a osteocalcina. Portanto, sua
especificidade para neoplasias formadoras de tecido ósseo é de 100%, mesmo em
amostras sem evidências de tecido ósseo (FANBURG et al., 1997; HOENERHOFF
et al., 2004; CHEN et al., 2012).
2.4.9.2.2. SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine)
É uma glicoproteína fosforilada de 32 kDa e representa aproximadamente um
quarto das proteínas não-colágenas do osso (SCHULZ et al., 1988; GRUNDMANN
et al., 1995; PORTER et al., 1995; DELANY et al., 2003; McKNIGHT et al., 2006;
TAI; TANG, 2008). Quando relacionada a membrana basal, é denominada BM-40 e
se liga ao colágeno tipo IV (YAN; SAGE, 1999; DELANY et al., 2003; McKNIGHT et
al., 2006; TAI; TANG, 2008). É uma proteína secretada e uma marcação granular,
perinuclear evidencia sua localização no complexo de Golgi intracelularmente. Há
vários questionamentos relacionados às suas potenciais funções no citoplasma e no
núcleo (YAN; SAGE, 1999).
É uma proteína de matriz extracelular codificada por um único gene e
altamente preservada entre as espécies, havendo mais de 70% de aminoácidos
idênticos entre mamíferos e aves (PORTER et al., 1995; FANBURG et al., 1997;
YAN; SAGE, 1999; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010).
Inicialmente apresenta 303 resíduos de aminoácidos, os primeiros 17 sendo
uma sequência sinalizadora, posteriormente clivada. A proteína humana madura
apresenta 286 resíduos de aminoácidos divididos em três domínios distintos e está
localizada no gene 5q31-q33. O domínio I se liga a íons cálcio com baixa afinidade e
interage com a hidroxiapatita. Parece estar implicado na mineralização de cartilagem
e osso e possui os principais epítopos imunológicos da SPARC. Devido a presença
de cistina, pode formar pontes dissulfeto entre moléculas e com outras proteínas.
Essa modificação pós-tradução contribuiria para a sua diversidade de funções. O
domínio II é rico em cistina e é semelhante a folistatina. Possui dois sítios de ligação
com o cobre e um deles, a sequência KGHK (resíduos 119-122) estimula a
48
proliferação celular e a angiogênese. O domínio III tem estrutura helicoidal e sítios
de ligação de alta afinidade com o cálcio (YAN; SAGE, 1999; TAI; TANG, 2008;
CHLENSKI; COHN, 2010).
Inicialmente denominada osteonectina, foi primeiramente isolada como o
principal componente não-colágeno do osso. Sua função e estrutura é modulada por
íons cálcio e a ligação entre eles aumenta a afinidade pelo colágeno. Sua ligação
com diversos tipos de colágeno (I, II, III, IV, V e VIII) já foi demonstrada e parece
influenciar o remodelamento da matriz extracelular (YAN; SAGE, 1999; McKNIGHT
et al., 2006; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010).
Porém, sua potente habilidade em retardar a formação dos cristais de
hidroxiapatita sugere seu papel na prevenção da mineralização da matriz óssea. É
encontrada em osteoblastos ativos e osteócitos jovens e está envolvida nas
primeiras etapas da mineralização do tecido ósseo, sendo um marcador de
diferenciação de células osteogênicas normais (YAN; SAGE, 1999; HOENERHOFF
et al., 2004; CHLENSKI; COHN, 2010). Fibroblastos e macrófagos começam a
expressar SPARC em feridas em cicatrização, onde esta também é liberada pela
degranulação plaquetária. Sua expressão também aumenta em célula sob stress.
Não foi identificada em osteócitos quiescentes nem em células inativas da superfície
endosteal (SCHULZ et al., 1988; YAN; SAGE, 1999; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI;
COHN, 2010).
Fisiologicamente, tem propriedades anti-adesivas promovendo o
arredondamento celular, inibindo o espalhamento celular, estimulando a síntese de
enzimas (metaloproteinases) que degradam a membrana basal e o interstício e
retardando o ciclo celular de diversas células em G1. Tal característica pode estar
implicada na invasão tecidual por células neoplásicas (PORTER et al., 1995;
FANBURG et al., 1997; YAN; SAGE, 1999; DELANY et al., 2003; HOENERHOFF et
al., 2004; McKNIGHT et al., 2006; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010). É
sabido que sua propriedade anti-adesiva se dá em parte pela dissolução de
complexos focais de adesão e reorganização das fibras de actina (YAN; SAGE,
1999; TAI; TANG, 2008). Esta ação produz um estado “intermediário” de adesão que
favorece a motilidade celular porém mantendo a ligação de integrinas com a matriz
(McKNIGHT et al., 2006).
49
Em relação ao ciclo celular, compõe a matriz nuclear na intérfase, forte
marcação imuno-histoquímica é detectada na metáfase e anáfase mas não em
células em telófase (YAN; SAGE, 1999).
A SPARC está implicada ainda na formação de novos vasos. Ela é capaz de
se ligar a fatores de crescimento como o VEGF (vascular endothelial growth factor –
fator de crescimento de endotélio vascular) e PDGF (platelet derived growth factor –
fator de crescimento derivado de plaquetas) inibindo a proliferação celular e
modulando a angiogênese (YAN; SAGE, 1999; CHLENSKI; COHN, 2010). Isso
relaciona suas funções a processos cicatriciais e ao desenvolvimento de metástases
(PORTER et al., 1995; FANBURG et al., 1997; YAN; SAGE, 1999; HOENERHOFF et
al., 2004; TAI; TANG, 2008).
Não é considerada específica para o material osteóide produzido por tumores
ósseos malígnos como o osteossarcoma uma vez que é produzida por diversos tipos
celulares, normais ou neoplásicos. No entanto, a imunorreatividade da SPARC é
citoplasmática e consideravelmente maior em células neoplásicas do que em células
normais na maioria dos casos (SCHULZ et al., 1988; GRUNDMANN et al., 1995;
PORTER et al., 1995; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010) como observado
em carcinomas invasivos de mama e células de câncer de próstata (McKNIGHT et
al., 2006). Neste último, há regulação positiva com as metástases ósseas embora,
no carcinoma de mama, a SPARC não tenha sido identificada como um fator quimio-
atrativo (McKNIGHT et al., 2006). Também já foi observado que células neoplásicas
com baixa expressão de SPARC estão relacionadas a fenótipos tumorais mais
agressivos (McKNIGHT et al., 2006; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010).
Seu papel na gênese tumoral parece depender de suas diversas funções num dado
microambiente não sendo absoluta entre os tipos tumorais (CHLENSKI; COHN,
2010).
Assim como os anticorpos bovinos produzidos contra osteocalcina, os
anticorpos bovinos produzidos contra a osteonectina também apresentam reação
cruzada entre as proteínas bovina e humana. A osteonectina já foi identificada
intracelularmente em osteoblastos ativos normais e em neoplasias formadoras de
tecido ósseo mas não em condrossarcomas e neoplasias de tecido mole. A
osteonectina também foi identificada em osteossarcomas fibroblásticos e
anaplásicos, que apresentam raro material mineral. Tal achado é importante pois
demonstra que as células formadoras do tumor pertencem a linhagem óssea,
50
aprimorando o diagnóstico destes subtipos tumorais (SCHULZ et al., 1988). Nos
osteossarcomas, o índice de marcação pela osteonectina pode chegar a quase 90%
(sensibilidade), havendo ausência de marcação em alguns casos de
osteossarcomas de células pequenas. Em tumores ósseos benignos, observa-se
100% de imunorreatividade mas observa-se marcação também em tumores
benignos não-formadores de tecido ósseo, neoplasias de tecidos moles,
melanomas, carcinomas e linfomas, o que a descarta como marcador celular ósseo
específico, reduzindo sua especificidade em 50%. Quando associada a osteocalcina,
pode auxiliar na identificação da matriz neoplásica óssea em detrimento ao colágeno
denso (FANBURG et al., 1997; HOENERHOFF et al., 2004).
Já foi demonstrado em alguns tumores que a SPARC é capaz de aumentar a
sensibilidade das células aos quimioterápicos ou ainda inibir a taxa de proliferação e
aumentar a de apoptose, conferindo-lhe potencial terapêutico embora mais estudos
ainda sejam necessários (TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010).
2.4.10. A imuno-histoquímica na Oncologia Veterinária
A medicina veterinária inicialmente se beneficiou desse método na distinção
acurada de doenças como os diversos tipos de pênfigos e o lupus eritematoso
sistêmico. Ainda hoje, a medicina veterinária faz intenso uso da técnica na detecção
de patógenos de doenças infecto-contagiosas, principalmente nos casos onde o
isolamento clássico do agente em questão é difícil, caro ou envolve períodos muito
longos (HAINES; WEST, 2005).
As aplicações da imuno-histoquímica na oncologia veterinária são
semelhantes à medicina: diagnóstico de neoplasias indiferenciadas, determinação
do imunofenótipo das células neoplásicas e subtipagem de neoplasias,
determinação da origem do tumor primário e de metástases, avaliação de fator
prognóstico e avaliação da terapia instituída e identificação de estruturas, produtos e
organismos produzidos pelas células. (HAINES; WEST, 2005; WERNER et al., 2005;
AMORIM, 2009; DE MATOS et al., 2010). Isto se deve a evolução e sofisticação do
tratamento das neoplasias em animais, o que incentiva a melhor determinação das
características de uma pupolação tumoral em questão. Tal fato é particularmente
verdade nas neoplasias linfóides e nos tumores de células redondas que ocorrem
como massas na pele dos animais (HAINES; WEST, 2005).
51
O uso frequente da imuno-histoquímica ainda não é uma realidade na
medicina veterinária devido ao custo, possibilidade de obtenção da peça cirúrgica e
principalmente conhecimento acerca destes marcadores nas neoplasias animais
(AMORIM, 2009).
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar neoplasias ósseas em cães por meio da histopatologia e da imuno-
histoquímica associada à análise clínica e radiográfica, auxiliando na
classificação dos tipos neoplásicos e determinação de subtipos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Descrever os achados clínicos dos cães com neoplasias ósseas.
Descrever os achados radiográficos de caninos com neoplasias ósseas.
Identificar e descrever macroscopicamente e microscopicamente os diferentes
processos neoplásicos ósseos observados nos caninos analisados.
Avaliar por meio de imuno-histoquímica utilizando marcadores específicos de
linhagem mesenquimal (vimentina) e marcadores ósseos proteicos
(osteocalcina e osteonectina) as neoplasias ósseas nos caninos analisados,
visando a diferenciação dos tipos neoplásicos e identificação de subtipos e
variantes tumorais.
53
Relacionar os achados da avaliação clínica, radiográfica, histopatológica e
imuno-histoquímica em caninos com neoplasia óssea primária.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
O estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais
(CEUA) da Universidade Federal Fluminense (UFF) sob o número 140 (Anexo 9.3).
Foram utilizados vinte e dois cães. Todos os animais apresentavam lesão
sugestiva de neoplasia óssea primária radiograficamente detectável. Foram
utilizados caninos independente de sexo, castrados ou não, raça, com idade acima
de dois anos (adultos) e de porte médio a gigante.
Os animais eram provenientes do Hospital Universitário de Medicina
Veterinária Profº Firmino Mársico Filho e de clínicas e centros diagnósticos privados
da cidade do Rio de Janeiro e de Niterói.
4.2. METODOLOGIA
4.2.1. Avaliação clinica
Todos os pacientes incluídos neste estudo foram utilizados após assinatura
de termo de consentimento e esclarecimento pelos responsáveis (Anexo 9.1 e 9.2).
Foi analisada a ficha clínica destes animais dando-se ênfase aos problemas
ortopédicos prévios concernentes a traumas que resultaram em fraturas, episódios
de claudicação, dificuldade de deambulação, paresia ou paralisia de membros e
possíveis doenças infecciosas.
55
Todos os animais foram submetidos ao exame clínico e os sinais relacionados
ao local da lesão como aumento de volume, integridade de pele (presença ou não
de fístulas), edema ou atrofia de membro foram registrados. Foi avaliado
subjetivamente a temperatura local da lesão.
Em casos de animais que vieram à óbito, foi considerada a possível causa
mortis e, naqueles submetidos à eutanásia, a realização do procedimento.
4.2.2. Exames Radiográficos
As imagens radiográficas foram obtidas a partir do local indicado pelo clínico
como suspeito de lesão baseando-se em sinais e sintomas clínicos como aumento
de volume, alteração estrutural (deformidade) quando comparado contra-
lateralmente e incapacidade de sustentação do peso principalmente em casos de
membros, dor local, indícios de lambedura e alteração de pelagem e pele.
Amostras de lesões radiográficas que após exame histopatológico revelaram
não se tratar de neoplasia óssea foram excluídas deste estudo.
De cada local suspeito realizaram-se duas incidências complementares; nos
casos de lesões mais extensas foram abrangidas também as articulações proximal e
distal adjacentes e se necessário, áreas mais distais. As tomadas radiográficas
foram nas posições lateral, crânio-caudal (ou caudo-cranial) e dorso-plantar ou
dorso-palmar se tratando de membros e lateral, oblíquas e dorso-ventral ou ventro-
dorsal em casos do esqueleto axial. Sempre que possível foram realizadas
incidências torácicas nas posições lateral e ventro-dorsal para investigação de
metástase pulmonar.
Foram utilizados filmes radiográficos nos tamanhos compatíveis com o porte
do animal alojados em chassis forrados com écran intensificadores de terras raras e
conversão verde nos tamanhos correspondentes aos filmes. Utilizou-se técnica
adequada para cada região e de acordo com cada aparelho. Os sistemas de
revelação utilizados foram o manual e o automático, dependendo do local em
questão.
56
4.2.3. Obtenção de Amostra
As amostras ósseas foram coletadas em animais vivos submetidos à
anestesia geral, em cadáveres de animais que tiveram morte natural ou que foram
submetidos a eutanásia com até seis horas pós-óbito e de peças cirúrgicas. Sempre
que possível, foi realizada a necropsia completa para investigação de outras lesões
relacionadas ou não à lesão óssea observada.
4.2.3.1. Biópsias
Os animais submetidos à biópsia óssea in vivo foram anestesiados para a
realização do procedimento, de acordo com o seguinte protocolo: acepromazina
como medicação pré-anestésica (dose 0,1 mg/kg) ou diazepam (dose 0,2 mg/kg),
propofol para indução anestésica (dose 6 mg/kg), e isofluorano em mistura com
oxigênio em circuito semi-aberto para manutenção anestésica.
Nestes animais foi utilizada a agulha Jamshidi calibre 11, obtendo-se
espécimes de dois milímetros de largura por comprimentos variando de 0,3 a 2,5 cm.
O número de fragmentos obtidos por procedimento variou entre uma a seis amostras
em função do tamanho da lesão e facilidade de obtenção das amostras. Em lesões
discretas, abrangendo até 3,0 cm de comprimento do osso afetado, obteve-se no
máximo dois espécimes; lesões bem desenvolvidas, abrangendo entre 3,0 e 8,0 cm
obteve-se entre dois e quatro espécimes, devendo-se considerar os aspectos
proximal e distal da lesão e, lesões com mais de 8,0 cm de comprimento, pode-se
coletar até seis amostras das regiões proximal, média e distal da área lesionada.
A área a ser biopsiada foi examinada por meio de projeções radiográficas de
forma a se obter a morfologia e profundidade da lesão nos animais acometidos.
Decidido o local da biópsia, o animal era colocado na posição mais vantajosa
para se obter o menor trajeto possível para a agulha atingir a lesão. A trajetória
proposta para a agulha levou em consideração a anatomia subjacente para evitar
estruturas vasculares e neurais principais. Em alguns casos foi possível contar com
o auxílio da sonda ultrassonográfica ou radiográfica. Após localizar o ponto de
entrada, a região era tricotomizada e a pele limpa com solução anti-séptica como
Povidine ou Clorexidine num raio de cinco centímetros partindo do ponto de entrada.
57
Uma pequena incisão (cerca de três milímetros) foi feita com lâmina de bisturi de
Bard-Parker para facilitar a entrada da agulha e evitar contaminação com células
epidérmicas. A agulha era introduzida perpendicularmente à pele e depois
profundamente a área da anormalidade com o mandril posicionado.
A entrada na cavidade medular foi comumente detectada como uma queda na
resistência. O mandril era então removido e a cânula avançada lenta e
delicadamente com movimentos horário e anti-horário. Depois, a agulha era
rotacionada completamente diversas vezes ao longo do seu eixo e lentamente
removida com movimentos de rotação alternada. O espécime obtido era
delicadamente removido com a sonda longa ou o próprio mandril introduzido pelo
orifício de corte e a amostra foi expelida facilmente pelo orifício proximal. Em
algumas situações, a entrada da agulha se deu obliquamente em relação a cortical
óssea, facilitando a aquisição de espécimes de comprimento maior.
Como medicação pós-procedimento foram utilizados cloridrato de tramadol
(dose: 5mg/kg, SID, PO) e cefalexina (dose: 30mg/kg, BID, PO) para controle da dor
e profilaxia antibacteriana.
Os materiais biopsiados foram colocados em solução de formol a 10% por,
pelo menos, 24 horas visando promover a fixação do mesmo.
4.2.3.2. Peças cirúrgicas e necrópsias
Foram recebidas peças cirúrgicas contendo também os linfonodos satélites.
Em seguida, o osso afetado foi clivado em duas ou três partes dependendo de seu
tamanho e da extensão da lesão e os segmentos acondicionados em formol a 10%
para melhor fixação juntamente com o(s) linfonodo(s) satélite(s).
Nos animais necropsiados realizou-se a inspeção externa e a abertura das
cavidades torácica e abdominal. Num primeiro momento os órgãos foram
inspecionados in situ. A retirada destes seguiu o padrão técnico adotado pelo Setor
de Anatomia Patológica Veterinária da Universidade Federal Fluminense. Os órgãos
foram inspecionados individualmente, coletadas amostras de regiões significativas
com ou sem lesão e estas acondicionadas em formol a 10%. Os principais órgãos
avaliados foram: coração, pulmões, linfonodos traqueo-brônquicos, fígado, baço,
rins, estômago, intestinos, pâncreas, bexiga e gônadas. Os ossos lesionados e o(s)
58
linfonodo(s) satélite(s) provenientes destes cadáveres receberam tratamento
semelhante ao das peças cirúrgicas.
4.2.4. Processamento histológico
Depois de fixadas em solução de formol a 10%, algumas amostras de biópsia
necessitaram ser transferidas para solução de formol contendo EDTA a 10% para
descalcificação da porção mineral permitindo assim o corte em micrótomo. O tempo
de descalcificação foi controlado e variou dependendo do tamanho e espessura da
peça em questão. Procedimento semelhante foi realizado nas peças cirúrgicas após
clivagem das áreas-alvo. Fragmentos com alta rigidez foram colocados em solução
de ácido nítrico a 5% para aceleração da descalcificação, porém sem danos ao
material.
Após descalcificação, as peças foram lavadas em água corrente por pelo
menos duas horas para melhor eliminação das soluções descalcificantes e do
formol. Posteriormente foram processadas em seis baterias de álcool sendo imersas
inicialmente em álcool a 80% (duas baterias) e as quatro restantes em álcool
absoluto, permanecendo por pelo menos 40 minutos em cada uma para
desidratação. Na etapa seguinte foram diafanizadas em solução de xilol em duas
baterias por no mínimo 60 minutos em cada uma e a seguir foram imersas por 90
minutos em parafina a 60ºC (dois banhos) para posterior emblocamento.
A partir dos blocos, foram realizados cortes de 5 micra de espessura,
dispostos em lâmina de vidro e corados pelo método de hematoxilina e eosina (HE).
4.2.5. Processamento imuno-histoquímico
Das amostras processadas, parte dos cortes obtidos foi direcionada a análise
imuno-histoquímica. Seções de cinco micrômetros de espessura foram dispostas em
lâminas cobertas por silano. As secções de tecido foram desparafinizadas em xilol e
re-hidratadas com álcool etílico e tratadas com solução de peróxido de hidrogênio a
3% por 30 minutos para bloqueio da peroxidase endógena (fase de inibição I) antes
da recuperação antigênica induzida pelo calor (banho-maria a 96-98°C, em solução
59
de recuperação - Target Retrieval Solution 10X concentrated - (DAKO Corporation,
Carpinteria, CA, USA)). Após a recuperação antigênica, as secções foram incubadas
com uma solução de leite e albumina bovina, para inibição de ligações inespecíficas
(fase de inibição II), seguido por tratamento com os seguintes anticorpos primários:
anticorpo monoclonal de camundongo anti-vimentina humana DAKO (para
identificação de linhagem mesenquimal), anticorpo monoclonal de camundongo anti-
osteocalcina humana Abcam e anticorpo policlonal de coelho anti-osteonectina
(SPARC) humana Abcam (para identificação de linhagem osteogênica), nas
diluições e tempos especificados pelo fabricante em questão (Quadro 1).
As secções foram lavadas com tampão TBS (tris-buffered saline – salina tris-
tamponada), antes do tratamento com seus respectivos sistemas reveladores à
temperatura ambiente (anticorpo secundário – fase de revelação). Depois de nova
lavagem com tampão TBS, as secções foram tratadas com solução de DAB (3,3-
diaminobenzidina tetrahidroclorídrico) (DAKO Corporation, Carpinteria, CA, USA),
cromógeno usado para a marcação castanha das células positivas (etapa de
revelação).
Todas as secções foram contra-coradas com hematoxilina. Secções
histológicas de ossos sadios dos cadáveres obtidos foram usados como controles
positivos e para controles negativos, o anticorpo primário foi omitido.
O protocolo utilizado foi padronizado pelo grupo de pesquisa do Setor de
Anatomia Patológica da Faculdade de Veterinária da UFF.
Anticorpo
primário Diluição Inibição I
Recuperação
antigênica Inibição II Sistema de revelação
Vimentina 1:150 30 min 30 min 30 min LSAB da DAKO.
SPARC 1:1000
30 min 30 min 30 min Envision Anti-rabbit
Osteocalcina 1:200 30 min 45 min 30 min Envision Anti-mouse
Quadro 1: Protocolo imuno-histoquímico utilizado para os anticorpos vimentina, osteonectina (SPARC) e osteocalcina em neoplasias ósseas caninas.
4.2.6. Avaliação Histopatológica e Imuno-Histoquímica
As lesões neoplásicas tiveram seu diagnóstico firmado seguindo a
Classificação Histológica dos Tumores Ósseos e Articulares dos Animais
60
Domésticos, da Organização Mundial de Saúde (SLAYTER et al., 1994) apoiada
pela Classificação dos Tumores Ósseos, da Organização Mundial de Saúde
(FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002).
Na avaliação imuno-histoquímica, a imunorreatividade foi classificada de
acordo com o percentual de células marcadas. Para isso, selecionou-se cinco
campos seguindo o modelo da barra grega e fez-se a contagem diferencial de todas
as células de cada campo sob objetiva de 40 vezes. O percentual de células
marcadas naquela lâmina foi dado pela média dos cinco campos contados.
Em relação a intensidade de marcação, independente do percentual de
células marcadas, os cortes foram classificados como tendo marcação intensa
(+++), média (+) ou fraca(+).
4.2.7. Análise Estatística
Para as análises estatísticas foram utilizadas ferramentas de estatística
descritiva baseadas em média, desvio padrão e percentual dos parâmetros clínicos,
histológicos e imuno-histoquímicos considerados, uma vez que tratou-se de um
único grupo.
5 RESULTADOS
5.1 ANIMAIS
5.1.1 Avaliação clínica
Foram avaliados vinte e dois cães com neoplasias ósseas sendo sete machos
(31,8%) e quinze fêmeas (68,2%) com idade média de 8,59 ± 2,92 anos e peso
médio de 36,59 ± 11,24 quilos (Tabela 1).
Tabela 1: Distribuição de valores relativos a idade e peso dos 22 cães avaliados.
Parâmetros Média Desvio Padrão Mínimo Máximo
Idade (anos) 8,59 ± 2,92 3 18
Peso (quilos) 36,59 ± 11,24 15 58
Dos cães analisados, observou-se a seguinte distribuição racial: seis cães
sem raça definida (SRD) (27,3%), nove Rottweilers (40,9%), além de Boxer, Husky
Siberiano, Dobermann Pinscher, Bulldog Inglês, Akita, Pastor Alemão e Golden
Retriever com um representante cada (4,5%). Dos seis animais sem raça definida,
quatro deles tinham sabidamente um dos progenitores da raça Labrador, da raça
São Bernardo, da raça Poodle e da raça Rottweiler respectivamente.
62
Todos os cães com lesão relacionadas a membro apresentaram claudicação.
Com exceção de dois cães, esta ocorreu sempre associada a aumento de volume
do local afetado (Figura 5A) cuja consistência variou de firme no caso das
neoplasias mais desenvolvidas a macia por edema ou ambos e dor. Três animais
apresentaram atrofia muscular cranialmente ao local afetado.
De 18 cães com histórico completo, quatro apresentavam algum grau de
emagrecimento embora nenhum animal apresentasse caquexia nestes casos, a
maioria dos animais tinha um mês ou mais de progressão da lesão.
Somente um animal apresentou dispnéia no momento da realização da
biópsia.
5.1.2 Exame radiográfico
Todos os animais apresentavam algum tipo de lesão óssea radiográfica
sugestiva de neoplasia óssea primária.
Dois cães (9,1%) apresentaram lesão em esqueleto axial enquanto os demais
(90,9%) apresentaram em esqueleto apendicular.
Os achados radiográficos tiveram como localização os seguintes ossos:
úmero, fêmur, rádio, tíbia, ílio, escápula e mandíbula. O úmero seguido do rádio
foram os locais mais acometidos, com sete e cinco animais respectivamente. (Figura
1).
Figura 1: Frequencia de distribuição das lesões sugestivas de neoplasia óssea
primária ao exame radiográfico dos cães avaliados (n=22).
31%
18%22%
14%
5%
5% 5%
Úmero
Fêmur
Rádio
Tíbia
Ílio
Escápula
Mandíbula
63
Das lesões em membros, treze (65%) foram em membros torácicos (Figura
5A) e sete (35%) em membros pélvicos.
Dos 22 animais avaliados, obteve-se imagem radiográfica torácica de onze e
em nenhuma das imagens houve indício de doença metastática.
As imagens radiográficas nas quais se basearam os diagnósticos de
neoplasias apresentaram processos escleróticos e líticos associados. Em seis, lise e
esclerose apresentaram-se igualmente distribuídas (Figura 2E); em onze
predominou a lise (Figura 2A e 2D) e em quatro a esclerose (Figura 2B e 2C).
Nos ossos longos, no esqueleto apendicular, as metáfises foram as áreas
mais atingidas, havendo algumas vezes extensão da lesão para a epífise e/ou terço
diafisário.
64
Figura 2: Radiografias. A: Caso nº. 20, canino, fibrossarcoma: radiografia simples, lateral oblíqua esquerda,
mandíbula: lise e perda de opacidade óssea em corpo mandibular esquerdo na altura do segundo pré-molar (seta). B: Caso nº. 6, canino, osteossarcoma: radiografia simples, latero-lateral, membro pélvico esquerdo: proliferação óssea acentuada em metáfise e diáfise proximal de fêmur esquerdo. C: Caso nº. 13, canino,
osteossarcoma: radiografia simples, médio-lateral, membro torácico direito: proliferação óssea discreta em diáfise média e distal e metáfise distal radial direita. D: Caso nº. 14, canino, fêmea, osteossarcoma: radiografia
simples, médio-lateral, membro torácico direito: lise óssea em metáfise proximal de úmero direito, alterando o padrão trabecular. E: Caso nº. 10, canino, osteossarcoma: radiografia simples, médio-lateral, membro torácico
direito: áreas de lise e proliferação óssea com destruição de cortical em metáfise proximal de úmero direito.
A
C D E
B
65
5.1.3 Avaliação Anatomo-Histopatológica
Das amostras obtidas, seis foram coletadas com a agulha Jamshidi (27,3%),
nove de peças cirúrgicas de amputação (40,9%) e cinco por meio de necropsia
(22,7%). Em dois animais, sendo um da raça Golden Retriever e um da raça Boxer,
a amostra foi obtida por biópsia incisional (9,1%).
As amostras avaliadas a partir de peças cirúrgicas ou de necrópsia não
apresentaram heterogeneicidade tumoral significativa exceto com relação às áreas
de necrose, cujo percentual nas amostras foi variável, de acordo com o fragmento
clivado.
O Quadro 2 resume os locais biopsiados e o resultado anatomo-
histopatológico.
66
Quadro 2: Avaliação das neoplasias ósseas nos cães analisados segundo sexo, idade, raça,
local biopsiado e resultado histopatológico (n=22).
Nº animal Sexo Idade Raça Local Biopsiado Resultado Anatomo-
Histopatológico
1 F 8 anos Rottweiler Metáfise distal de fêmur
direito Osteossarcoma osteoblástico
produtivo
2 F 3 anos SRD Metáfise distal de rádio
direito Osteossarcoma osteoblástico
minimamente produtivo
3 M 10 anos SRD Metáfise proximal de tíbia
direita Condrossarcoma
4 F 8 anos Rottweiler Metáfise proximal de
úmero direito Osteossarcoma osteoblástico
produtivo
5 M 6 anos Bulldog Inglês
Asa ilíaca direita Osteossarcoma osteoblástico
minimamente produtivo
6 F 18 anos Pastor Alemão
Metáfise proximal de fêmur esquerdo
Osteossarcoma osteoblástico produtivo
7 F 6 anos Husky
Siberiano Metáfise proximal de tíbia
direita Condrossarcoma
8 F 9 anos SRD Metáfise distal de tíbia
esquerda Osteossarcoma osteoblástico
produtivo
9 F 9 anos Dobermann Metáfise distal de fêmur
direito Osteossarcoma osteoblástico
minimamente produtivo
10 F 7 anos Rottweiler Metáfise proximal de
úmero direito Osteossarcoma osteoblástico
produtivo
11 F 7 anos SRD Metáfise proximal de
úmero esquerdo Osteossarcoma osteoblástico
minimamente produtivo
12 M 12 anos Rottweiler Metáfise proximal de
úmero direito Osteossarcoma osteoblástico
produtivo
13 M 8 anos Rottweiler Metáfise distal de rádio
direito Osteossarcoma osteoblástico
produtivo
14 F 8 anos Rottweiler Metáfise proximal de
úmero direito Osteossarcoma osteoblástico
produtivo
15 M 7 anos Boxer Metáfise proximal de fêmur
esquerdo Osteossarcoma osteoblástico
minimamente produtivo
16 F 11 anos Rottweiler Metáfise distal de rádio
esquerdo Osteossarcoma osteoblástico
produtivo
17 F 7 anos SRD Metáfise proximal de
úmero direito Osteossarcoma osteoblástico
produtivo
18 F 12 anos SRD Metáfise distal de rádio
direito Osteossarcoma osteoblástico
minimamente produtivo
19 F 9 anos Golden
Retriever Escápula Hemangiossarcoma
20 F 9 anos Rottweiler Mandíbula esquerda Fibrossarcoma
21 M 7 anos Rottweiler Metáfise proximal de
úmero direito Osteossarcoma osteoblástico
produtivo
22 M 8 anos Akita Metáfise distal de rádio
esquerdo Osteossarcoma osteoblástico
produtivo
67
Todos os casos avaliados tiveram diagnóstico estabelecido sendo 18
osteossarcomas (81,8%), dois condrossarcomas (9,1%), um fibrossarcoma e um
hemangiossarcoma (4,5%) (Figura 3).
As médias de idade dos cães com osteossarcoma foi 8,61 ± 3,16 anos e a
média de peso foi de 37,28 ± 11,0 quilos. Dos 18 cães diagnosticados com
osteossarcoma, oito (44,4%) eram da raça Rottweiler, sendo cinco fêmeas (62,5%).
Ambos os condrossarcomas, diagnosticados em um cão SRD e em uma
cadela da raça Husky Siberiano, tiveram localização apendicular.
O único fibrossarcoma teve localização em esqueleto axial, na mandíbula de
uma cadela da raça Rottweiler e o único hemangiossarcoma acometeu a escápula
de um cão da raça Golden Retriever.
Figura 3: Frequencia de distribuição dos tipos histológicos diagnosticados em cães
avaliados com neoplasia óssea (n=22).
As peças de osteossarcomas apresentaram consistência firme ao corte, de
coloração amarelo-palha, com notável proliferação de tecido mineralizado
perifericamente a diáfise e áreas de necrose de tamanhos variados (Figuras 5C e
5D). Em três casos (nº 1, 9 e 15) observou-se fratura patológica do osso afetado,
sendo o fêmur em todos os casos. Os casos de osteossarcoma osteoblástico
minimamente produtivo apresentaram mínima quantidade de material mineralizado,
localizado primariamente na cavidade medular, e uma extensa área de necrose
associada.
81,8%
9,1%
4,5%4,5%
Osteossarcoma
Condrossarcoma
Hemangiossarcoma
Fibrossarcoma
68
Na análise microscópica, os dezoito osteossarcomas foram classificados de
acordo com SLAYTER et al. (1994). O único subtipo encontrado foi o osteoblástico.
Observou-se desde células mesenquimais anaplásicas com escasso material
eosinofílico filiforme entremeando-as até franca produção de material osteóide
mineralizado e desorganizado. Os primeiros foram classificados como minimamente
produtivo e os outros produtivos (Figura 6A e 6B). No caso nº 9, observou-se
mitoses atípicas em diversos campos.
A peça de condrossarcoma (caso nº 7) apresentou macroscopicamente
consistência amolecida, sendo possível o corte com faca do componente extra-
ósseo que circundava a diáfise tibial. Ao corte, este era esbranquiçado e brilhante
com uma pequena área de necrose . Na microscopia observou-se diversas ilhas de
cartilagem composta por condrócitos de moderado pleomorfismo, algumas com
centros de ossificação, e uma delgada matriz extracelular entre elas (Figura 6C).
A peça de fibrossarcoma (caso nº 20) apresentou superfície externa
multinodular castanho-pardacenta, de consistência firme ao corte e superfície de
corte compacta ora brancacenta, ora acinzentada ou acastanhada. A microscopia
revelou células alongadas, fusiformes, com pleomorfimo acentuado, na maior parte
das vezes dispostas ora em feixes, ora entrelaçadas. Notou-se anisocariose,
cromatina dispersa, nucleolação evidente e figuras de mitose típicas e atípicas
(Figura 6D).
O fragmento de hemangiossarcoma apresentava superfície externa de
tonalidade ora enegrecida, ora amarelada ou pardacenta. A consistência ao corte
era de macia à friável com superfície de corte compacta. À microscopia, havia
proliferação de células fusiformes com pleomorfismo celular discreto a moderado;
núcleo ovóide a fusiforme e hipercromático. As células estavam organizadas
formando vasos sanguíneos irregulares e de diferentes tamanhos, contendo no seu
interior hemácias.
Em cinco animais com suspeita de osteossarcoma (casos nº 1, 4, 6, 8 e 11),
após autorização dos proprietários, realizou-se a necropsia completa com o objetivo
de identificar outras lesões relacionadas ou não a lesão óssea avaliada.
Observaram-se lesões metastáticas em pulmão (100% dos casos) (Figura 5B), rim
(60% dos casos), fígado e pleura (40% dos casos), baço e coração (20% dos casos)
(Figura 4). Em todos os casos, macroscopicamente as lesões eram arredondadas,
com tamanhos variando de 0,2 cm a 3,0 cm de diâmetro, sendo a menor lesão
69
encontrada na pleura parietal e a maior no baço, de aspecto amarelado e
consistência pétrea, inseridas em meio ao tecido normal, conforme observado em
musculatura atrial esquerda. Na microscopia ótica, em todas elas observou-se focos
de notável produção de material osteóide mineralizado e desorganizado entremeado
por células neoplásicas em meio ao tecido normal.
Figura 4: Frequência de órgãos acometidos por metástase nos animais portadores
de osteossarcoma avaliados por meio de necropsia.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Pulmão Rim Fígado Pleura
Parietal
Baço Coração
70
Figura 5: Fotomacrografia. A: Caso nº 2, canino, osteossarcoma: membro pélvico direito: aumento de volume
em região distal de membro torácico direito (região cárpica) com vasculatura evidente e coloração avermelhada. B: Caso nº 8, canino, osteossarcoma, necropsia: cavidade torácica revelando líquido sanguinolento e coração (asterisco), pulmões (p) e pleura (pl) com focos metastáticos. C: Caso nº 10, canino, osteossarcoma: peça
cirúrgica, membro torácico direito (corte transversal): formação tumoral envolvendo diáfise umeral (asterisco) com extensa área de componente extra-ósseo proliferativo e necrose (arco). D: Caso nº 8, canino,
osteossarcoma: peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo (corte transversal): formação tumoral envolvendo diáfise umeral (asterisco) com extensa área de componente extra-ósseo proliferativo e atrofia de musculatura (seta).
A
C
*
*
D
B
p
pl
*
71
Figura 6: Fotomicrografia – Hematoxilina e Eosina. A: Caso nº. 10, canino, osteossarcoma osteoblástico
produtivo: peça cirúrgica, membro torácico direito: material osteóide mineralizado formando trabéculas desorganizadas entremeadas por células neoplásicas. B: Caso nº. 10, canino, osteossarcoma osteoblástico
produtivo: peça cirúrgica, membro torácico direito: trabéculas desorganizadas entremeadas por células neoplásicas, revelando anisocitose e nucléolos evidentes C: Caso nº. 7, canino, condrossarcoma: peça cirúrgica,
membro pélvico esquerdo: ilhas de cartilagem neoplásica com tecido conjuntivo ao redor. Observa-se processo de ossificação central da ilha. D: Caso nº 20, canino, fibrossarcoma: peça cirúrgica, mandíbula esquerda: células
fusiformes dispostas em feixe, com moderado pleomorfismo e nucleolação evidente. (A-F – HE; A,C – 40x original; barra: 200 µm; B,D – 400x original; barra: 50 µm)
AA BB
CC DD
72
5.1.5 Avaliação Imuno-Histoquímica
As três proteínas avaliadas por meio da imuno-histoquímica nas células
neoplásicas apresentaram localização citoplasmática, de coloração amarronzada
(Figuras 7A e 7B), embora tenha-se observado marcação perinuclear intensa em
diversas amostras com marcação anti-vimentina e anti-SPARC e em poucos casos
uma aparente marcação nuclear anti-vimentina. Na marcação imuno-histoquímica
contra todas as três proteínas foi possível verificar nos osteossarcomas,
fibrossarcoma e hemangiossarcoma prolongamentos citoplasmáticos marcados. Não
se observou tal fato nos condrossarcomas, que eram constituídos basicamente de
células arredondadas (Figuras 7B e 7F).
Em todas as neoplasias ósseas caninas analisadas, tanto na avaliação da
vimentina quanto da osteocalcina, a marcação foi uniforme (Figuras 7A e 8D),
enquanto que na avaliação de SPARC, observou-se uma marcação granulada
(Figura 8B).
Não foi observado marcação em estroma ou matriz osteóide em nenhuma
amostra das neoplasias ósseas caninas para qualquer um dos anticorpos.
Foram observadas diferenças de intensidade de marcação entre as amostras
das neoplasias ósseas caninas analisadas, para todos os anticorpos (Figuras 7A e
7B). Em muitos casos, dentro de uma mesma amostra, algumas áreas da neoplasia
óssea tiveram intensa marcação enquanto que em outras, isso não foi observado.
Essa observação foi mais frequente nas amostras marcadas pelos anticorpos anti-
vimentina.
Em algumas neoplasias que apresentavam células em mitoses atípicas
(Figura 7F), a intensidade de marcação anti-vimentina nessas células era menos
evidente que nas demais células adjacentes.
A avaliação anti-osteocalcina foi realizada somente nos casos de neoplasias
ósseas nº 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 20, 21 e 22.
A Tabela 2 demonstra o percentual médio de marcação de cada um dos
anticorpos utilizados, sua variação e valores mínimo e máximo nas neoplasias
ósseas caninas analisadas. O percentual de marcação para osteocalcina inclui
somente os osteossarcomas marcados (10 amostras).
73
Tabela 2: Distribuição de valores relativos ao percentual de marcação para
vimentina, SPARC e osteocalcina nos gupos de cães avaliados.
Parâmetros n Média (%) Desvio Padrão Mínimo Máximo
Vimentina 21 87,93 11,77 64,65 100
SPARC 22 98,03 3,37 84,60 100
Osteocalcina* 10 99,91 0,18 99,44 100
n: número de animais. *:somente osteossarcomas.
Em todos os tipos neoplásicos avaliados, a marcação das células avaliados
foi semelhante, não havendo características específicas relativas a algum tipo
tumoral. No entanto, foi possível observar uma intensa (+++) marcação de vasos
sanguíneos em duas amostras de osteossarcoma osteoblástico sendo um produtivo
e um minimamente produtivo, um condrossarcoma e um fibrossarcoma, avaliados
com anticorpos anti-vimentina mas não com anti-SPARC e anti-osteocalcina.
Foi possível observar que, em três casos de osteossarcoma osteoblástico
produtivo, a marcação com anticorpo anti-vimentina apresentou-se mais discreta
(++) quando comparado aos demais, inclusive aos casos de osteossarcoma
minimamente produtivos. Em dois desses casos de osteossarcoma osteoblástico
produtivo, observou-se baixo percentual de marcação positiva com anticorpo anti-
vimentina (65%). Além desses dois casos, com um dos mais baixos percentuais de
positividade para vimentina, há somente um caso de osteossarcoma osteoblástico
minimamente positivo com percentual semelhante.
Somente em um osteossarcoma osteoblástico produtivo não se observou
marcação para vimentina (caso nº 10).
Em todas as amostras de neoplasias ósseas caninas foi observado marcação
do anticorpo anti-SPARC. Neste caso, a marcação se apresentou menos intensa
(++) quando comparado com a marcação do anticorpo anti-vimentina porém com
maior uniformidade entre as amostras de neoplasias ósseas caninas, não sendo
frequentes a visualização de áreas marcadas e não marcadas dentro de uma
mesma amostra. Os percentuais de positividade de marcação do anticorpo anti-
SPARC foram altos sendo o mais baixo deles, 85%, pertencente a um
osteossarcoma osteoblástico produtivo.
Na marcação do anticorpo anti-osteocalcina, foram avaliados 14 casos e
destes, somente em 10 observou-se marcação positiva. Dos quatro casos onde não
74
se observou marcação (-), teve-se dois osteossarcomas osteoblásticos minimamente
produtivos, um osteossarcoma osteoblástico produtivo e um fibrossarcoma (Figura
8F). Destes, somente o osteossarcoma osteoblástico produtivo não apresentava
padrão radiográfico lítico. Observou-se que, na marcação anti-osteocalcina, a
coloração amarronzada apresentou-se consideravelmente mais fraca (+) quando
comparada com a marcação anti-SPARC e ainda mais em relação a anti-vimentina.
Não foi possível observar marcação positiva do anticorpo anti-osteocalcina nas
lacunas ósseas porém em dois osteossarcomas osteoblásticos produtivos,
observou-se marcação pouco mais intensa nos osteoblastos aprisionados nas
lacunas ósseas.
Foi possível observar a relação entre a avaliação imuno-histoquímica e os
achados histopatológicos. Em alguns casos, os achados de marcação de anticorpo
anti-osteocalcina justificam o diagnóstico histopatológico assim como os achados
radiográficos onde observa-se lise óssea, como ocorreu no fibrossarcoma e em
alguns osteossarcoma osteoblástico minimamente produtivo.
75
Figura 7: Fotomicrografias – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. A: Caso nº. 18, canino, osteossarcoma
osteoblástico minimamente produtivo: peça cirúrgica, membro torácico direito: intensa marcação citoplasmática (+++) em osteoblastos malignos. B: Caso nº. 8, canino, osteossarcoma osteoblástico produtivo: peça de necropsia, membro pélvico esquerdo: moderada marcação citoplasmática (+++) em osteoblastos malignos. C, D e E: Caso nº 7, canino,
condrossarcoma: peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: (C) condrócitos malignos marcados (asterisco) (+++) em transição para formação de cartilagem madura (jogo da velha); (D) marcação de condrócitos em cartilagem madura (+++); (E) marcação em nicho cartilaginoso e em vasculatura periférica intensa (+++). F: Caso nº. 9, canino,
osteossarcoma osteoblástico minimamente produtivo: peça cirúrgica, membro pélvico direito: osteoblasto maligno em divisão celular atípica (detalhe). Observa-se marcação exclusivamente citoplasmática e de menor intensidade nas demais (++) células. (A,B,C,D,F – 400x original; barra: 50 µm; E – 40x original; barra: 200 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer)
AA BB
CC DD
EE FF
*
#
76
Figura 8: Fotomicrografias – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-osteocalcina. A: Caso nº. 18,
canino, osteossarcoma osteoblástico minimamente produtivo: peça cirúrgica, membro torácico direito: marcação discreta (+) anti-SPARC citoplasmática em osteoblastos malignos. B: Caso nº 20, canino, fibrossarcoma: peça cirúrgica, mandíbula esquerda: marcação acentuada (++) anti-SPARC citoplasmática em células fusiformes. C: Caso nº 7, canino,
condrossarcoma: peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: marcação discreta (+) anti-SPARC em condrócitos malignos. D: Caso nº. 4, canino, osteossarcoma osteoblástico produtivo: peça de necropsia, membro torácico direito:
moderada marcação (++) anti-osteocalcina citoplasmática em osteoblastos malignos. Observa-se célula gigante central. E: Caso nº 7, canino, condrossarcoma: peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: marcação discreta (+) anti-osteocalcina em condrócitos malignos. F: Caso nº 20, canino, fibrossarcoma: peça cirúrgica, mandíbula esquerda:
ausência de marcação (-) anti-osteocalcina em células fusiformes. (A-F – 400x original; barra: 50 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer)
AA BB
CC DD
EE FF
6 DISCUSSÃO
Com relação às neoplasias ósseas, na literatura consultada não se tem
relatos quanto a predileção por sexo que possa explicar o número duas vezes maior
de fêmeas em relação aos machos na presente casuística. No entanto, com relação
ao osteossarcoma, Dernell et al. (2007) relatam que os machos são pouco mais
afetados que as fêmeas com exceção das raças Rottweiler, São Bernardo e Dog
Alemão. Dos sete machos avaliados, somente um deles apresentava
condrossarcoma (caso nº 3) enquanto os seis restantes apresentavam
osteossarcoma (casos nº 5, 12, 13, 15, 21 e 22). Em contraste, no grupo de fêmeas,
dos quinze animais avaliados, somente três apresentaram diagnóstico diferente de
osteossarcoma, sendo um fibrossarcoma, um hemangiossarcoma e um
condrossarcoma. Tal observação vai contra os autores previamente citados mas ao
encontro dos achados de Amaral (2008), que relatou um maior número de fêmeas
do que machos acometidas por lesões ósseas neoplásicas ou não. Todos os autores
supracitados relatam ser o osteossarcoma a neoplasia óssea primária mais
frequente.
Dos doze casos de osteossarcoma em fêmeas, observa-se que cinco delas
eram da raça Rottweiler, uma da raça Pastor Alemão, uma da raça Dobermann e
cinco não tinham raça definida. Destes casos, dois animais apresentavam
progenitores sabidamente das raças Labrador, Rottweiler e São Bernardo
respectivamente, todas raças de grande porte. Estes dados vão ao encontro dos
relatos de Dernell et al. (2007) e Amaral (2008) em que as fêmeas da raça Rottweiler
são mais acometidas pelo osteossarcoma do que os machos, fato semelhante
ocorrendo com a raça São Bernardo. Nesta raça, Dernell et al (2007) admitem que a
78
predisposição para desenvolvimento de osteossarcoma pode ter um componente
hereditário. Recentemente, Thomas et al. (2009) relataram a presença de
desequilíbrios genômicos graves em cães da raça Rottweiler que estão implicados
no desenvolvimento do osteossarcoma nessa raça, independente de sexo ou idade.
Tal achado justifica o elevado número de animais acometidos dessa raça na
amostra e presume que o elevado número de fêmeas da raça Rottweiler acometidas
esteja relacionado a aleatoriedade da amostra, que apresenta quase o dobro de
fêmeas em relação aos machos, e não a uma tendência.
Os animais sem raça definida não formam maioria entre os animais avaliados,
estando a raça Rottweiler em primeiro lugar, com nove exemplares enquanto os
SRD somam seis animais. Além destes dois casos, teve-se cães das raças Husky
Siberiano, Dobermann Pinschers, Boxer, Bulldog Inglês, Pastor Alemão e Golden
Retriever com um representante cada. As raças Rottweiler, Pastor Alemão e
Dobermann Pinscher são largamente citadas como predispostas ao
desenvolvimento de osteossarcoma (DALECK et al., 2006; DERNELL et al., 2007;
AMARAL, 2008; THOMAS et al., 2009; KEALY; MCALLISTER, 2012) ao contrário do
Bulldog e do Husky Siberiano, não comumente citados. Os caninos Husky Siberiano,
Boxer e Golden Retriever podem ser incluídos na lista de animais predispostos, já
que, segundo Ru, Terracini e Glickman (1998), o aumento do peso e principalmente
da altura predispõem o aparecimento do tumor principalmente em membros.
A média de idade dos animais avaliados foi de 8,59 ± 2,92 anos. A média de
idade dos cães com osteossarcoma é bastante semelhante, 8,61 ± 3,16 anos, pouco
acima da média descrita na literatura. Thompson e Pool (2002), Donato et al. (2005),
Daleck et al. (2006), Dernell et al. (2007) e Amaral (2008) relatam ser o
osteossarcoma mais freqüente em cães de meia idade a idosos com pico aos sete
anos. A média de peso dos animais acometidos por lesões ósseas neoplásicas
primárias foi 36,59 ± 11,24 quilos e osteossarcoma foi 37,28 ± 11,0 quilos
respectivamente, sendo este o peso de raças consideradas de grande porte, o que
concorda com as observações de Thompson e Pool (2002), Donato et al. (2005),
Daleck et al. (2006), Dernell et al. (2007), Amaral (2008) e Kealy e Mcallister (2012).
Considerando que a grande maioria das lesões ocorreu em esqueleto
apendicular (90,9%), é de se esperar que a claudicação seja o sinal clínico
predominante, o que também é citado por Erdem e Pead (2000), Lucroy; Peck e
Berry (2001), Mehl et al. (2001), Thompson e Pool (2002), Donato et al. (2005),
79
Hidaka et al. (2006), Dernell et al. (2007) e Amaral (2008). Dois cães apresentaram
lesão em ossos do esqueleto axial sendo um caso de osteossarcoma em asa ilíaca
direita e um caso de fibrossarcoma em corpo mandibular esquerdo. O canino
portador da lesão neoplásica na asa ilíaca apresentou claudicação, esta
possivelmente devido a extensão do tumor para a musculatura da coxa, interferindo
com a movimentação do membro. Foi possível observar ao corte, nos planos
superficiais, extensa necrose da musculatura adjacente a asa ilíaca afetada que
corrobora tal afirmação. Já a cadela com fibrossarcoma mandibular apresentou
aumento de volume local e discreto comprometimento da apreensão de alimentos.
Todos os cães com neoplasia óssea primária manifestaram dor. Tal fato é
esperado uma vez que no crescimento neoplásico ocorre não só a elevação do
periósteo (KEALY; MCALLISTER, 2012) como muitas vezes há ruptura da cortical
óssea e necrose causando dor extrema.
O aumento de volume regional foi observado em quase todos os cães
portadores de neoplasia óssea podendo ser devido a proliferação de tecido ósseo
associado a algum grau de edema inflamatório ou ainda por interferência na
drenagem venosa principalmente no caso de membros, conforme descrito por
Erdem e Pead (2000), Lucroy; Peck e Berry (2001), Mehl et al. (2001), Donato et al.
(2005), Hidaka et al. (2006), Dernell et al. (2007), Amaral (2008) e Kealy e Mcallister
(2012). Somente uma cadela da raça Rottweiler portadora de osteossarcoma (caso
nº 14) não apresentou aumento de volume local uma vez que as alterações ósseas
eram bem iniciais, não havendo grande proliferação óssea nem componente extra-
ósseo notável.
O emagrecimento foi observado em apenas quatro cães. Sabe-se que a
perda de peso pode ser devido a síndrome paraneoplásica (DERNELL et al., 2007)
ou ainda, derivada de anorexia por dor intensa. Todos os cães nessa situação
apresentaram tempo de lesão acima de 45 dias, o que pode justificar este achado.
Embora trauma seja amplamente associado as neoplasias ósseas (DERNELL
et al., 2007; KEALY; MCALLISTER, 2012) nenhum animal com neoplasia óssea
apresentou histórico prévio.
Somente em uma cadela com neoplasia óssea houve relato de dispnéia no
momento da coleta de material em função do tempo decorrido da neoplasia, cerca
de três meses, ter sido suficiente para o desenvolvimento de lesões metastáticas
observadas à necropsia em pleura parietal e parênquima pulmonar pois não havia
80
imagem radiográfica do mesmo. Dos outros quatro animais, o tempo decorrido
desde a observação da lesão radiográfica sugestiva de neoplasia óssea até a
necropsia foi semelhante e havia lesões metastáticas nos pulmões de tamanhos
similares, porém em número consideravelmente menor, o que pode não ter
interferido tanto na capacidade respiratória destes até o momento da necropsia.
Em todas as neoplasias em esqueleto apendicular, a metáfise foi o local mais
acometido, concordando com os achados de Thompson e Pool (2002), Dernell et al.
(2007), Amaral (2008), Thrall (2010) e Kealy e Mcallister (2012). O elevado
percentual de pacientes portadores de osteossarcoma apendicular assim como a
alta frequência de acometimento de úmero e rádio concordam com os trabalhos de
Thompson e Pool (2002), Dernell et al. (2007), Amaral (2008), Thrall (2010) e Kealy
e Mcallister (2012).
Os dois casos de condrossarcoma localizaram-se em metáfise proximal de
tíbia (Quadro 1) discordando de Thompson e Pool (2002) que citam ter como
localização predominante os ossos chatos. Entretanto, estes mesmos autores
afirmam que a imagem radiográfica nos casos apendiculares é predominantemente
lítica, de baixa radiodensidade, com pouca ou nenhuma reação periosteal,
compatível com as imagens observadas nestes casos.
Todas as neoplasias ósseas foram lesões únicas, o que está de acordo com o
descrito por Thompson e Pool (2002), Dernell et al. (2007) e Amaral (2008) que
relatam serem as lesões de osteossarcomas monostóticas na grande maioria dos
casos.
Os membros torácicos foram mais afetados que os pélvicos, inclusive
considerando-se somente os osteossarcomas apendiculares, concordando com os
relatos de Thompson e Pool (2002) e Dernell et al. (2007) que afirmaram ser os
membros torácicos duas vezes mais afetados que os pélvicos. No entanto, tal
achado é contrário ao relatado por Amaral (2008) que encontrou maior número de
lesões neoplásicas e não-neoplásicas em membros pélvicos do que em membros
torácicos em 20 cães avaliados.
Dos 22 animais portadores de neoplasia óssea, onze realizaram radiografia
de tórax no momento da descoberta da lesão óssea, não havendo imagem sugestiva
de metástase em nenhum caso. Apesar de não se observar radiograficamente
indícios de metástase, em dois animais (casos nº 1 e 12) observou-se nódulos tanto
na macro como na microscopia. Além deste, outros três animais (casos nº 4,6 e 8)
81
que não tiveram o tórax radiografado apresentavam nódulos metastáticos em
pulmão à necropsia e contrariamente a descrição de Kealy e McAllister (2012),
apresentavam dimensões pequenas, da ordem de milímetros enquanto as
metástases “em bala de canhão”, da ordem de centímetros, são consideradas
diretamente relacionadas com osteossarcoma. Recentemente, Eberle et al. (2011)
observaram que a detecção de metástases pulmonares em cães com
osteossarcoma apendicular é significativamente maior quando examinada através
da tomografia computadorizada em comparação com radiografias, comprovado
através da avaliação macroscópica. Tal observação reforça o fato de a grande
maioria dos cães terem desenvolvido doença metastática pulmonar embora esta não
tivesse sido detectada no momento do diagnóstico ósseo. Provavelmente, as lesões
já estavam presentes no parênquima pulmonar embora não tivessem tamanho
suficiente para imprimir imagem no filme radiográfico. É sabido que a tomografia
computadorizada é uma técnica mais acurada que a radiografia. Apesar disso,
Waters et al. (1998) afirmam que lesões pulmonares abaixo de 1 mm de diâmetro
não são detectadas pela tomografia helicoidal.
Segundo Amaral (2008), Thrall (2010) e Kealy e McAllister (2012), as lesões
neoplásicas apresentam heterogeneicidade, ora com predomínio lítico ora
esclerótico. Das lesões radiográficas consideradas mistas, cinco foram
diagnosticadas como osteossarcomas sendo quatro osteossarcomas osteoblásticos
produtivos e um osteossarcomas osteoblásticos minimamente produtivos. Um
condrossarcoma apresentou padrão misto. Naquelas com predomínio esclerótico,
quatro eram osteossarcoma osteoblástico produtivo. Lesões com predomínio lítico
incluíram um condrossarcoma, o hemangiossarcoma, o fibrossarcoma e nove
osteossarcomas sendo quatro subclassificado como osteoblástico produtivo e cinco
como não produtivo. Segundo Thompson e Pool (2002), o padrão misto não está
associado ao osteossarcoma osteoblástico minimamente produtivo, diferente ao
observado no presente trabalho.
É interessante ressaltar que todos os quatro osteossarcomas com padrão
radiográfico esclerótico foram subclassificados como osteoblásticos produtivos. Isto
é esperado uma vez que a produção de material osteóide é franca, o que gera uma
imagem radiográfica de produção óssea. Já os subtipos minimamente produtivos
apresentaram somente padrão radiográfico misto ou lítico.
82
De forma semelhante, era de se esperar que o fibrossarcoma (Figura 2A) e o
hemangiossarcoma apresentassem padrão radiográfico lítico uma vez que são
neoplasias que não produzem material osteóide ou osso e são caracterizadas pela
substituição do tecido ósseo sadio pelas células neoplásicas fibroblásticas e
vasculares (SLAYTER et al., 1994; FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002;
THOMPSON; POOL, 2002).
Três osteossarcomas apresentaram fratura patológica associada a imagem
radiográfica sendo dois deles com padrão radiográfico lítico e um misto. Este fato é
esperado uma vez que nestes dois padrões, observa-se perda de integridade de
cortical óssea levando ao enfraquecimento e consequente fratura do osso (KEALY;
MCALLISTER, 2012). Nenhuma das neoplasias classificadas radiograficamente
como esclerótica, onde há aumento da proliferação óssea, apresentaram fratura
patológica, o que pode estar relacionado ao aumento da ddensidade óssea local.
Em cinco neoplasias observou-se a formação de componente extra-ósseo,
isto é, uma proliferação tumoral que se expande para fora do limite do osso (AHRAR
et al., 2004). O componente extra-ósseo foi observado em quatro osteossarcomas e
no fibrossarcoma, em todos os três padrões radiográficos.
As metáfises foram as áreas atingidas na maioria dos casos, excetuando-se
as lesões da escápula e do esqueleto axial. Algumas lesões muitas vezes se
estenderam para a epífise e o terço diafisário distal e médio. Tal achado vai ao
encontro aos relatos de Thompson e Pool (2002), Dernell et al. (2007), Amaral
(2008), Thrall (2010) e Kealy e McAllister (2012).
Todas as formas de coleta forneceram material diagnóstico, semelhante ao
descrito por Amaral (2008).
Vale ressaltar que, ao contrário do que acontece em pacientes humanos, a
anestesia geral é sempre recomendada não apenas para contenção do paciente
veterinário durante o procedimento, mas principalmente pelo conforto e analgesia
segundo orientação do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Assim sendo, em medicina veterinária, seja na biópsia fechada ou na aberta, a
obrigatoriedade do emprego da anestesia geral pode ser considerada uma
desvantagem devido aos riscos anestésicos e aumento do custo de realização do
exame, diferente do que ocorre em medicina conforme citado por Logan et al.
(1996), Pramesh et al. (2001) e Jelinek et al. (2002).
83
A maioria dos trabalhos consultados relata ser o pulmão o local mais atingido
por metástases, semelhante aos achados deste estudo, onde o pulmão foi o órgão
mais atingido por metástases, presentes em 100% dos casos avaliados na
necropsia. No entanto, com relação aos demais órgãos, não há dados de frequência
relatados (DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; KEALY; MCALLISTER, 2012).
A ocorrência de metástase principalmente nos casos de osteossarcoma é um
importante fator a ser considerado. Nenhum cão apresentou lesão pulmonar
radiograficamente visível no momento do diagnóstico radiográfico da lesão óssea,
porém quatro animais biopsiados e sem a peça para comparação evoluiram para
quadros graves de metástase pulmonar alguns meses após o diagnóstico ósseo.
Isso reforça a importância do acompanhamento clínico em casos onde a biópsia foi
inconclusiva ou não foi capaz de identificar o exato tipo tumoral.
Todas as marcações encontradas para os três anticorpos foram
citoplasmáticas, o que concorda com avaliações semelhantes em Medicina
(VERMEULEN; VERMEER; BOSMAN, 1989; INGRAM et al., 1994; PARK et al.,
1995; YAN; SAGE, 1999; SATELLI; LI, 2011).
Em relação aos achados de marcação anti-vimentina, segundo Minin e
Moldaver (2008), a formação da rede de filamentos intermediários começa próxima
ao núcleo e já foi demonstrado que filamentos de vimentina podem se mover no
citoplasma em direção ao núcleo ou a membrana plasmática. Ainda, já foi
demonstrado a presença da proteína no núcleo. Isso concorda com o observado na
leitura de praticamente todas as lâminas de vimentina, onde havia marcação
perinuclear notável e eventualmente nuclear mesmo que neste último caso, ainda
não se saiba exatamente a função dela (SATELLI; LI, 2011).
Observou-se diferença na intensidade de marcação anti-vimentina entre as
lâminas avaliadas. Tal achado apresenta algumas possibilidades de ocorrência. A
primeira delas seria a diferença quantitativa na expressão de vimentina entre os
tipos celulares avaliados. Sabe-se que a vimentina é superexpressa em diversos
tipos celulares tumorais e está diretamente implicada na transformação epitelial-
mesenquimal (LI et al, 2010; MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010; PAN et al.,
2010; SATELLI; LI, 2011). As neoplasias avaliadas foram todas de origem
mesenquimal. Assim sendo, é possível que, durante a carcinogênese, o gene da
vimentina sofra alterações que levem a uma superexpressão da mesma. Observou-
se diferenças de intensidade de marcação e até mesmo ausência desta dentro de
84
uma mesma amostra. Em muitos casos não se observou marcação anti-vimentina
em áreas que continham células neoplásicas. A ausência de marcação dentro de um
mesmo corte pode ser explicada pela maior ou menor expressão da proteína entre
as diferentes células.
Seria esperado também que células anaplásicas apresentassem menor
intensidade de marcação pela proteína indicando perda de semelhança com a célula
original, entretanto isso não foi observado. Algumas neoplasias mais bem
diferenciadas, com produção marcante de matriz osteóide tiveram menor
intensidade de marcação anti-vimentina assim como o percentual de positividade.
Esse foi o caso de dois osteossarcomas osteoblásticos produtivos. A produção de
osteóide é característica dos osteoblastos e nos osteossarcomas osteoblásticos
produtivos, ela se mantém, o que indica uma proximidade maior com as funções
originais da célula quando comparado com os minimamente produtivos (CHEN et al.,
2011). Assim sendo, é possível que, nos osteossarcomas caninos, o aumento da
expressão de vimentina esteja relacionado a fenótipos tumorais mais agressivos,
mais anaplásicos e menos semelhantes às células originais, e portanto a menor
expressão de vimentina nestas neoplasias pode ser justificada como algo positivo
em termos de prognóstico.
A segunda possibilidade para uma redução na intensidade de marcação seria
a interferência dos processos de fixação e descalcificação que alguns cortes
sofreram principalmente em se tratando de regiões mais internas do corte onde a
fixação pode não ser tão eficiente ou demorar mais a acontecer (DE MATOS et al.,
2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010). Apesar disso, houve cortes do mesmo
animal, fixados e descalcificados da mesma forma que tiveram intensidade de
marcação diferente, não justificando a interferência desses fatores, pelo menos não
neste caso. Entretanto, é possível que a não marcação do anticorpo anti-vimentina
observada no caso nº 10 esteja relacionada a estes fatores.
Nos casos de mitoses atípicas, a marcação do anticorpo anti-vimentina foi
mais suave em várias lâminas. Duas explicações são possíveis. A primeira é que
durante a mitose, a relação núcleo:citoplasma se altera e com isso, a porção
citoplasmática tornaria-se menos visível à microscopia, daí a marcação menos
evidente. Outra possibilidade é que, durante a mitose das células neoplásicas, a
expressão de vimentina seja reduzida em detrimento a outros tipos de proteínas de
citoesqueleto mais necessárias ao evento com por exemplo, os microtúbulos.
85
Autores relacionam a superexpressão da vimentina com a motilidade e a
invasão celular e consequentemente sua implicação nas metástases (LI et al, 2010;
MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010; SCHOUMACHER et al., 2010; SATELLI; LI,
2011). Essa relação pode ser verdadeira também nas neoplasias caninas,
especialmente os osteossarcomas. Nestas neoplasias, o percentual de pacientes
que apresentam metástases pulmonares radiograficamente detectáveis no momento
do diagnóstico é baixo, no entanto, a maioria deles vem a óbito ou são eutanasiados
devido a elas (THOMPSON; POOL, 2002, LOUKOPOULOS; THORNTON;
ROBINSON, 2003; DONATO et al., 2005; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008;
KIRPENSTEIJN et al, 2008; BHANDAL; BOSTON, 2011; EBERLE et al., 2011).
No presente estudo e em estudos anteriores (AMARAL, 2008), observou-se a
presença de micrometástases pulmonares em um pequeno número de pacientes
portadores de osteossarcoma e eutanasiados em intervalo menor que um mês após
o diagnóstico da lesão apendicular. Essa observação suporta a idéia de que a
disseminação tumoral ocorre logo nos primários estágios da doença, mesmo quando
a lesão óssea ainda é discreta e não há sinais pulmonares, semelhante ao
observado por Barger et. al (2005) que relata um percentual de aproximadamente
90% de cães acometidos por micrometástases no momento do diagnóstico. É
possível que a vimentina, estando superexpressa nessas células, impulsione a
capacidade que elas tem de motilidade e invasão. Caso essa capacidade consiga
ser demonstrada nos osteossarcoma caninos, a utilização de drogas anti-vimentina
poderiam alterar e auxiliar consideravelmente o prognóstico dessas neoplasias em
cães.
Outra observação importante é a identificação de células endoteliais
marcadas com anticorpo anti-vimentina. Sabe-se que estas células normalmente
expressam vimentina (MININ; MOLDAVER, 2008; SATELLI; LI, 2011). Neste caso,
essa marcação pode ser importante na avaliação da vasculatura tumoral. O aumento
da vasculatura pode estar diretamente implicado na possibilidade de disseminação
metastática por via hematógena. Vasculatura evidente foi observada em quatro
casos, sendo dois osteossarcomas, um condrossarcoma e um fibrossarcoma. Com
exceção do canino portador do fibrossarcoma, sobre o qual não se tem essa
informação, os outros três animais desenvolveram metástases. Sabe-se que as
neoplasias malignas tem a capacidade de induzir a neoangiogênese não apenas
para suprimento da massa tumoral mas também para disseminação (THOMPSON;
86
POOL, 2002; DERNELL et al., 2007). É importante ressaltar que a visualização dos
vasos se deu em peças de necropsia e amputação e que sua identificação pode não
ser possível em amostras de biópsia devido ao tamanho das mesmas. A utilização
de anticorpos anti-vimentina para identificação de neoplasias mesenquiais pode
também fornecer informação a respeito da vasculatura tumoral como função
adicional.
Todas as amostras apresentaram marcação positiva para o anticorpo anti-
SPARC de aparência granular, conforme previamente descrito (YAN; SAGE, 1999).
A SPARC é encontrada em osteoblastos ativos e osteócitos jovens normais (YAN;
SAGE, 1999; HOENERHOFF et al., 2004; CHLENSKI; COHN, 2010) e sua
expressão é maior em células neoplásicas na maioria dos casos, apesar de não ser
exclusiva dos osteossarcomas (SCHULZ et al., 1988; GRUNDMANN et al., 1995;
PORTER et al., 1995; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010), o que concorda
com os resultados aqui observados.
O percentual de positividade encontrado nas neoplasias avaliadas foi
semelhante aos relatos de literatura médica, principalmente em relação ao
osteossarcoma (FANBURG et al., 1997; HOENERHOFF et al., 2004), confirmando
sua alta sensibilidade.
O envolvimento da SPARC em eventos celulares como inibição do
espalhamento celular, estímulo a síntese de metaloproteinases que degradam
membrana basal e neoangiogênese (PORTER et al., 1995; FANBURG et al., 1997;
YAN; SAGE, 1999; DELANY et al., 2003; HOENERHOFF et al., 2004; McKNIGHT et
al., 2006; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010) a correlacionam com a
invasão tecidual por céulas neoplásicas, ou seja, as metástases. Com isso, a
imunorreatividade positiva desta proteína em neoplasias ósseas caninas pode ter
implicação prognóstica negativa, semelhante ao observado em humanos.
Apesar de presente em todas as amostras, a marcação anti-SPARC se
apresentou menos intensa quando comparado com a marcação anti-vimentina
porém com maior uniformidade entre as amostras, não sendo frequentes a
observação de áreas marcadas e não marcadas dentro de uma mesma amostra. Os
percentuais de positividade foram altos sendo o mais baixo deles, quase 85%,
pertencente a um osteossarcoma osteoblástico produtivo.
Não foi possível identificar a razão da fraca marcação do anticorpo anti-
osteocalcina. Alguns autores relatam que, o processo de osmificação após a
87
revelação produz uma cor marrom enegrecido mais marcante e efeito semelhante
pode ser atingido após tratamento com sulfato de níquel ou cloreto de cobalto
(LEONG; COOPER; LEONG, 2010). É provável que tal procedimento produzisse
uma melhor marcação pelos anticorpos anti-osteocalcina e aprimorasse a
observação.
Os percentuais de positividade do anticorpo anti-osteocalcina nas amostras
positivas foi extremamente alto entretanto, a marcação não ocorreu em todas as
amostras avaliadas. Isso pode estar relacionado aos processos de descalcificação,
uma vez que a fixação tem pouca influência sobre a imunorreatividade da
osteocalcina (VERMEULEN; VERMEER; BOSMAN, 1989; INGRAM et al., 1994;
PULLIG et al., 2000). Outra possibilidade para a fraca marcação ou ausência desta
pode estar relacionada a própria expressão da proteína nos osteossarcomas, que é
relatada como sendo baixa naqueles que se originam de osteoblastos (CHEN et al.,
2012). Entretanto, destes casos, a ausência de marcação no fibrossarcoma era
esperada uma vez que esta neoplasia não se caracteriza pela produção desta
proteína, sendo muitas vezes considerada exclusiva dos osteossarcomas
(GRUNDMANN et al., 1995; FANBURG et al., 1997; HOENERHOFF et al., 2004). A
identificação dessa proteína pode ser importante na diferenciação entre o
fibrossarcoma e o osteossarcoma fibroblástico uma vez que, apesar da semelhança
histopatológica, principalmente em amostras de biópsia, somente o segundo produz
a osteocalcina (GRUNDMANN et al., 1995; FANBURG et al., 1997; HOENERHOFF
et al., 2004).
Outra colocação importante é que, das três amostras de osteossarcoma que
não apresentaram marcação positiva, duas eram do tipo osteoblástico minimamente
produtivo, coerente com o padrão radiográfico lítico. Estas amostras são
caracterizadas pela mínima produção de material osteíde e não apresentam lacunas
mineralizadas. Sendo a osteocalcina uma proteína sintetizada conforme a
mineralização ocorre (PARK et al., 1995, CHEN et al., 2011; CHEN et al., 2012),
seria esperado que este subtipo tumoral não apresentasse marcação para
osteocalcina. No entanto, sua especificidade para neoplasias formadoras de tecido
ósseo é citada como de 100%, mesmo em amostras sem evidências de tecido ósseo
(FANBURG et al., 1997; HOENERHOFF et al., 2004) o que traz uma oposição
interessante.
88
O percentual de positividade encontrado (99,9%) nos osteossarcomas
caninos foi acima dos observados em osteossarcomas humanos cuja a ausência de
marcação nestes casos seja devido a osteossarcomas de células pequenas
(VERMEULEN; VERMEER; BOSMAN, 1989; PARK et al., 1995; FANBURG et al.,
1997), um subtipo raramente encontrado em osteossarcomas caninos. No presente
estudo, a ausência de marcação foi observada em osteossarcomas osteoblásticos,
semelhante ao citado por Chen et al. (2012).
Sabe-se que agentes descalcificadores como o EDTA podem reduzir
consideravelmente o percentual de imunorreatividade da osteocalcina
(VERMEULEN; VERMEER; BOSMAN, 1989) porém, este não foi usado nos casos
onde não foi detectada marcação. .
Mesmo sendo passível de detecção nas lacunas ósseas (VERMEULEN;
VERMEER; BOSMAN, 1989; PARK et al., 1995), não se observou marcação positiva
para o anticorpo anti-osteocalcina nas lacunas ósseas das amostras avaliadas.
Porém, observou-se marcação pouco mais intensa nos osteoblastos aprisionados
nas lacunas ósseas, em dois osteossarcomas osteoblásticos produtivos. Tal
observação pode estar relacionada ao processo de mineralização e deposição de
hidroxiapatita nestes locais.
Condrócitos normais não apresentam marcação para osteocalcina (PARK et
al., 1995) assim como condrócitos neoplásicos (FANBURG et al., 1997;
HOENERHOFF et al., 2004). Ainda assim, observou-se marcação positiva no
condrossarcoma avaliado (caso nº 7). O mesmo apresentava alguns nichos com
centros de ossificação, o que pode justificar a presença desta proteína.
7 CONCLUSÃO
As fêmeas caninas foram mais afetadas por neoplasias ósseas que os
machos.
A raça Rottweiler apresentou o maior número de cães acometidos por
neoplasias ósseas.
Os animais acometidos por neoplasias ósseas primárias apresentaram faixa
de idade acima de sete anos e foram de porte grande a gigante.
A claudicação associada a dor e o aumento de volume foram os sinais
clínicos mais freqüentemente observados em caninos com lesão óssea
apendicular.
A maioria das neoplasias ósseas ocorreu em esqueleto apendicular e os
ossos com maior freqüência de lesão foram úmero e rádio, sendo a região
metafisária a mais acometida.
A maioria das lesões ósseas foram monostóticas.
O padrão radiográfico mais frequente nas neoplasias ósseas primárias foi o
misto.
Dos animais com neoplasia óssea primária que realizaram radiografia torácica
no momento do diagnóstico da lesão óssea, nenhum deles apresentou
imagem metastática, caracterizando o método como inadequado para
identificação precoce de metástases.
O osteossarcoma foi a neoplasia óssea mais frequentemente encontrada,
seguida do condrossarcoma.
A maioria dos animais desenvolveu metástases pulmonares posteriormente,
sendo este o principal motivo da indicação da eutanásia.
90
A imunorreatividade da vimentina, SPARC e osteocalcina nas neoplasias
ósseas caninas foi alta, semelhante ao observado em neoplasias ósseas
humanas.
A marcação positiva dos anticorpos anti-vimentina e anti-SPARC pode ter
implicação prognóstica nas neoplasias ósseas caninas, sendo o prognóstico
desfavorável em casos de imunorreatividade alta e vice-versa.
A identificação da osteocalcina auxilia no diagnóstico definitivo.
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9 ANEXOS
100
9.1 Autorização para posse de cadáver canino.
AUTORIZAÇÃO
Eu, ______________________________________________________,
identidade nº ________________________, expedida por _______________,
CPF _______________________, residindo em ________________________
_______________________________________________________________,
telefone _______________, proprietário do animal ______________________, da
espécie _____________________, da raça _____________________, pelagem
________________________, porte ____________________, idade
________________ e sexo __________________, autorizo a médica veterinária
Camila Barbosa Amaral (CRMV-RJ 7661) a obter a posse do CORPO do animal
acima citado para experimentação científica de sua inteira responsabilidade e
utilização em aula prática, nada podendo contestar a respeito posteriormente.
Rio de Janeiro, / / .
_________________________________________
Assinatura do Proprietário
101
9.2 Autorização para realização de procedimento em canino.
AUTORIZAÇÃO
Eu, ______________________________________________________,
identidade nº ________________________, expedida por _______________,
CPF _______________________, residindo em ________________________
_______________________________________________________________,
telefone _______________, proprietário do animal ______________________, da
espécie _____________________, da raça _____________________, pelagem
________________________, porte ____________________, idade
________________ e sexo __________________, autorizo a médica veterinária
Camila Barbosa Amaral (CRMV-RJ 7661) a realizar o procedimento
_______________________________________________________________
do animal acima citado, tendo sido esclarecido dos riscos anestésicos e do
procedimento, nada podendo contestar a respeito posteriormente.
Rio de Janeiro, / / .
_________________________________________
Assinatura do Proprietário
102
9.3 Certificado do Comitê de Ética no Uso de Animais da UFF.
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