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Avaliação de quais substâncias presentes na água, estão causando as alterações endócrinas nos peixes
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1
UNIVERSIDADE DE SO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE SO CARLOS
DEPARTAMENTO DE HIDRULICA E SANEAMENTO CENTRO DE RECURSOS HDRICO E ECOLOGIA APLICADA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS DA ENGENHARIA AMBIENTAL
GUILHERME CASONI DA ROCHA
AVALIAO DA ATIVIDADE ESTROGNICA DAS GUAS DO RIO PARABA DO SUL
So Carlos
2012
2
GUILHERME CASONI DA ROCHA
AVALIAO DA ATIVIDADE ESTROGNICA DAS GUAS DO RIO PARABA DO SUL
Tese apresentada Escola de
Engenharia de So Carlos, da
Universidade de So Paulo para
obteno do ttulo de Doutor em
Cincias da Engenharia Ambiental
Orientadora: Profa. Dra. Eny Maria
Vieira
So Carlos
2012
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GUILHERME CASONI DA ROCHA
AVALIAO DA ATIVIDADE ESTROGNICA DAS GUAS DO RIO PARABA DO SUL
Tese apresentada Escola de
Engenharia de So Carlos, da
Universidade de So Paulo para
obteno do ttulo de Doutor em
Cincias da Engenharia Ambiental
Orientadora: Profa. Dra. Eny Maria
Vieira
So Carlos
2012
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Autorizo a reproduo total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrnico, para fins de estudo e pesquisa, desde que
citada a fonte.
4
ROCHA, G. C. AVALIAO DA ATIVIDADE ESTROGNICA DAS GUAS DO RIO PARABA DO SUL. Tese apresentada Escola de Engenharia de So Carlos, da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Doutor
em Cincias da Engenharia Ambiental
5
Dedico aos meus pais, Ivete e Jos por tudo o que fizeram por mim at hoje e por serem responsveis pela minha formao, aos meus irmos Gustavo e Mariana, minha av Maria, ao meu av Elvino (in memoriam), aos meus avs Joo e Ana Auta, minha grande namorada Paulinha por todo o apoio, pacincia, companheirismo e carinho e ao amigo Ozzy.
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Dedico aos meus pais, Ivete e Jos por tudo o que fizeram por mim at hoje e por serem responsveis pela minha formao, aos meus irmos Gustavo e Mariana, minha av Maria, ao meu av Elvino (in memoriam), aos meus avs Joo e Ana Auta, minha grande namorada Paulinha por todo o apoio, pacincia, companheirismo e carinho e ao amigo Ozzy.
6
AGRADECIMENTOS
Dra. Eny Maria Vieira, pela oportunidade, orientao, pacincia e dedicao. amiga Daniela Cordeiro por toda a ajuda com as anlises de gua. amiga Luciana Teresa Dias Cappelini pelas analises cromatogrficas. Ao amigo Egberto da Fonseca Casazza pela ajuda no desenvolvimento dos mapas. Renata Pereira pela amizade e horas e horas de laboratrio. Ao amigo Raphael Teixeira Verbinnen pela ajuda no laboratrio. Ao amigo Dr. Ricardo Luvizotto Santos pela grande colaborao. Dra. Adriana S. Marcantonio pelo auxlio na conduo do experimento no Laboratrio Experimental do Setor de Aquicultura do Polo Regional do Vale do Paraba. Dra. Katia Cristina Barbaro e Dra. Claudia Maris Ferreira Mostrio, por todo o ensinamento, desde a iniciao cientfica. Aos amigos da Rep. Morada do Escorpio: Ubarana, Maranho, Claudinei, Marcio, Kenji, Yuri, Ricardo, Mateus... A todos aqueles que de alguma forma colaboraram para a realizao deste trabalho. Ao Instituto de Qumica de So Carlos da Universidade de So Paulo pelo auxlio e colaborao. Ao Polo Regional do Vale do Paraba pelo auxlio e colaborao. Ao Programa de Ps-Graduao em Cincias da Engenharia Ambiental pela oportunidade. Fundao de Amparo Pesquisa (FAPESP) pela concesso da bolsa de doutorado e pelo auxilio financeiro. Ao CNPq pela concesso da bolsa de doutorado.
7
RESUMO
ROCHA, G. C. Avaliao da Atividade Estrognica das guas do Rio Paraba do Sul. 2012. 173f. Tese (Doutorado em Cincias da Engenharia Ambiental) Escola de Engenharia de So Carlos, Universidade de So Paulo, So Carlos, 2012.
A poluio da gua doce no estado de So Paulo ocorre por diversas causas. Entre
elas est a ineficincia do servio de tratamento de esgoto sanitrio. Alguns
componentes do esgoto sanitrio so desreguladores endcrinos, entre eles esto
os hormnios naturais e sintticos excretados pelos seres humanos. Estas
substncias causam modificaes no sistema reprodutivo como, por exemplo,
cncer, feminizao, alteraes na transcrio gentica, alterao nas gnadas,
induo sntese de vitelogenina, entre outros. O objetivo desse trabalho foi testar a
atividade endcrina das guas do rio Paraba do Sul, em Pindamonhangaba, SP.
Para tanto, amostras de gua do rio foram utilizadas para a quantificao dos
hormnios, 17-etinilestradiol, 17-estradiol e levonorgestrel por meio da tcnica de
cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC). Alm disso, foram realizados testes
crnicos com peixes (Danio rerio) no interior do rio e em laboratrio, e uma posterior
quantificao de vitelogenina. Os resultados no indicaram concentraes
detectveis dos hormnios pelo mtodo empregado. Entretanto, foi detectada a
induo de vitelogenina nos machos de Danio rerio. Esse fato indica a atividade
estrognica da gua utilizada. So necessrios outros estudos para a avaliao de
quais substncias presentes na gua, esto causando as alteraes endcrinas nos
peixes, entre eles a utilizao de ndices para priorizar o local inicial dessas
pesquisas. Esses estudos so importantes para a conservao da biodiversidade
aqutica do rio Paraba do Sul.
Palavras-chave: Danio rerio. 17-etinilestradiol. 17-estradiol. Levonorgestrel. Vitelogenina.
8
ABSTRACT
ROCHA, G. C. Evaluation of estrogenic activity in water samples from Paraiba do Sul River. 2012. 173f. Tese (Doutorado em Cincias da Engenharia Ambiental) Escola de Engenharia de So Carlos, Universidade de So Paulo, So Carlos, 2012.
Freshwater pollution in So Paulo state, Brazil, occurs due a several reasons.
Among them there is the inefficiency of the sewage treatment service. Some sewage
components are endocrine disrupters, including natural and synthetic hormones
excreted by humans. These substances cause modification on reproductive system
such as cancer, feminization, gene transcription and gonad alterations, vitellogenin
synthesis induction, among others. The aim of this work was to evaluate the
endocrine activity of the river Paraba do Sul, at Pindamonhangaba city, Brazil. For
this, river water samples were collected for the quantification of the hormones, 17-
etinylestradiol, 17-estradiol and levonorgestrel by high performance liquid
chromatography (HPLC). Furthermore, chronic assays were performed with fish
(Danio rerio) into the river and in the laboratory, following quantification of biomarker
vitellogenin. The studied hormones were not detected by employed methods.
However, induction of vitellogenin in male of Danio rerio was detected indicating
estrogenic activity of water. Further studies are necessary for the assessment of
which substances into the water are causing the endocrine disruption in fish. These
studies are important for the preservation of aquatic biodiversity of the Paraiba do Sul
River.
Keywords: Danio rerio. Hormone, 17-ethinylestradiol. 17-estradiol. Levonorgestrel. Vitellogenin.
9
SUMRIO 1 INTRODUO................................................................................... 1
2 OBJETIVOS....................................................................................... 2
3 REVISO DA LITERATURA............................................................. 4
3.1 Poluio............................................................................................. 4
3.2 Contaminantes emergentes............................................................... 9
3.2.1 Desreguladores endcrinos............................................................... 10
3.3 Estudos com desreguladores endcrinos em ambientes aquticos.. 13
3.4 Hormnios sintticos e naturais e sua ocorrncia em ambientes
aquticos...........................................................................................
14
3.4.1 Origem dos principais hormnios e naturais sintticos que ocorrem
em ambientes aquticos....................................................................
15
3.5 Organismos teste e biomarcadores de desreguladores endcrinos. 19
3.5.1 Vitelogenina....................................................................................... 20
3.6 Efeitos dos desreguladores endcrinos nos organismos vivos......... 21
3.7 Conservao da biodiversidade em guas continentais................... 26
3.8 reas crticas..................................................................................... 28
3.8.1 Mapeamento...................................................................................... 28
3.8.2 reas potencialmente crticas no Brasil............................................. 29
4 MATERIAIS E MTODOS................................................................. 35
4.1 Validao de mtodo para a quantificao dos hormnios
sintticos 17-etinilestradiol e levonorgestrel e do hormnio natural
17-estradiol utilizando-se cromatografia liquida de alta eficincia
(HPLC)...............................................................................................
35
4.1.1 Condies cromatogrficas para a determinao dos hormnios
em estudo.........................................................................................
35
4.1.2. Validao do mtodo para determinao dos hormnios em estudo 36
4.2 Identificao e quantificao dos hormnios sintticos 17-
etinilestradiol e levonorgestrel e do hormnio natural 17-estradiol
e de amostras do rio Paraba do Sul.................................................
38
4.3 Coleta das amostras de gua no rio Paraba do Sul......................... 40
4.4 Testes com Danio rerio...................................................................... 45
4.4.1 Aclimatao dos exemplares de Danio rerio utilizados nos testes
10
com gua do rio Paraba do Sul........................................................ 45
4.4.2 Teste crnico in situ com Danio rerio em tanques rede mantidos no
rio Paraba do Sul..............................................................................
45
4.4.3 Teste crnico ex situ com Danio rerio............................................... 46
4.5 Determinao da concentrao de vitelogenina em peixes.............. 49
4.6 Estudo de dados referentes potencial contaminao de gua
com desreguladores endcrinos de 12 municpios localizados na
bacia do rio Paraba do Sul...............................................................
52
4.6.1 ndice de Prioridade dos Municpios IPM....................................... 56
5 RESULTADOS E DISCUSSO......................................................... 60
5.1 Validao de mtodo analtico para a quantificao dos hormnios
sintticos 17-etinilestradiol e levonorgestrel e do hormnio natural
17-estradiol utilizando-se cromatografia liquida de alta eficincia
(HPLC)...............................................................................................
60
5.2 Identificao e quantificao dos hormnios sintticos 17-
etinilestradiol e levonorgestrel e do hormnio natural 17-estradiol
e de amostras do rio Paraba do Sul atravs de anlise
cromatogrfica...................................................................................
72
5.2.1 Levonorgestrel................................................................................... 72
5.2.2 17-estradiol...................................................................................... 78
5.2.3 17-etinilestradiol............................................................................... 82
5.3 Testes com Danio rerio...................................................................... 88
5.3.1 Aclimatao dos exemplares de Danio rerio utilizados nos testes
com gua do rio Paraba do Sul........................................................
88
5.3.2 Teste crnico ex situ com espcie de peixe Danio rerio................... 89
5.3.3 Teste crnico in situ com Danio rerio em tanques rede mantidos no
rio Paraba do Sul..............................................................................
94
5.3.4 Determinao da concentrao da vitelogenina em Danio rerio
utilizados nos testes crnicos ex situ e in situ...................................
96
5.3.5 Comparao dos testes in situ e testes ex situ................................. 125
5.4 Estudo de dados referentes potencial contaminao de gua
com desreguladores endcrinos de 12 municpios localizados na
bacia do rio Paraba do Sul...............................................................
127
11
5.4.1 Qualidade de gua............................................................................ 128
5.4.2 Populao total, Razo de Sexos e Taxa Geomtrica de
Crescimento Anual da Populao.....................................................
135
5.4.3 Produo Pecuria (bovinos, sunos e ovinos)................................ 137
5.5 ndice de Prioridade dos Municpios IPM...................................... 145
6 CONCLUSES.................................................................................. 149
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 151
1
1 INTRODUO Os seres humanos so expostos a milhares de produtos qumicos ao
longo de sua vida. Esse contato se d em geral atravs do ar, gua e alimentos.
Muitos desses compostos podem ser txicos e ter como efeito a alterao do
sistema endcrino (SCHUG et al., 2011).
Destaca-se a importncia da obteno do conhecimento com relao aos
efeitos causados por substncias que possuem atividade estrognica e so
constantemente utilizadas e lanadas ao ambiente atravs do esgotamento dos
efluentes de atividades antrpicas, como o caso dos hormnios naturais e
sintticos. Com isso pretende-se indicar efeitos provocados por substncias
desreguladoras endcrinas na fauna aqutica e assim, contribuir com
informaes que permitam identificar o problema.
De acordo com a prpria legislao brasileira, Resoluo CONAMA 357,
em seu captulo IV inciso 1: O efluente no dever causar ou possuir potencial
para causar efeitos txicos aos organismos aquticos no corpo receptor, de
acordo com os critrios de toxicidade estabelecidos pelo rgo ambiental
competente (BRASIL, 2005). Alm dos possveis riscos sade da populao,
outros problemas podem ser detectados em relao aos estoques naturais de
peixes, devido ao processo de feminizao, que pode existir em locais
contaminados.
O Brasil tem a obrigao de cumprir as metas propostas pela Conveno
sobre Diversidade Biolgica (UICN; WWF-BRASIL; IP, 2011). Portanto aes
para que a Meta 08 (controle de poluio das guas) se concretize devem ser
tomadas, dentre as quais o monitoramento dos cursos dgua.
O desenvolvimento econmico do Brasil proporciona uma condio
semelhante encontrada em pases ricos, a grande gerao de efluentes
oriundos de aes antrpicas. Entretanto, h uma diferena importantssima
entre as duas situaes, enquanto em pases desenvolvidos esse efluente
devidamente tratado, no Brasil no ocorre o mesmo (LEUSCH et al., 2006). Por
este motivo h uma grande contaminao de nossos corpos dgua com
1
2
poluentes, muitos deles possuidores de ao endcrina mesmo que em
pequenas quantidades.
Quando se analisa essa situao, e se avaliam regies com grande
concentrao populacional, conseqentemente tem-se a presena de
hormnios, como o potente e mais abundante estrognio de ocorrncia natural
nos seres humanos, o17-estradiol. Da mesma forma, devido aos mtodos
anticoncepcionais utilizados em larga escala pela populao feminina, h a
contaminao dos efluentes sanitrios pelos estrognios sintticos como, por
exemplo, um dos mais consumidos, o 17-etinilestradiol (em muitos casos
associado ao levonorgestrel), que produzido a partir do 17-estradiol, este
hormnio tambm utilizado em terapias de reposio hormonal (KHANAL et
al., 2006).
Devido a essa contaminao contnua dos efluentes sanitrios por
hormnios sintticos e naturais, associado aos baixos ndices de tratamento,
necessrio que existam estudos referentes situao (qualidade) das guas dos
rios onde esses contaminantes so despejados, como o caso do rio Paraba
do Sul. At mesmo porque, a exposio da populao humana a essas
substncias pode estar relacionada ao aumento dos casos de diversos
problemas de sade publica tais como, sndrome de disfuno testicular, cncer
nos testculos, criptorquidia, hipospadia, entre outros (SHARPE; IRVINE, 2004;
SAFE, 2004, SLOWIKOWSKA-HILCZER, 2006). O municpio de
Pindamonhangaba localiza-se jusante de 3 municpios com populaes
expressivas (comparadas aos outros municpios do Vale do Paraba), Jacare,
Taubat e principalmente So Jos dos Campos, sendo um local estratgico
para se avaliar os efeitos causados pela poluio montante, gerada pelo
efluente sanitrio lanado no rio Paraba do Sul e seus afluentes.
2
3
2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral O presente estudo tem como objetivo avaliar a atividade estrognica das
guas do rio Paraba do Sul em dois trechos localizados no municpio de
Pindamonhangaba, Estado de So Paulo.
2.2 Objetivos especficos
Validar mtodo para a quantificao dos hormnios sintticos 17-etinilestradiol
e levonorgestrel e do hormnio natural 17-estradiol;
Identificar e quantificar os hormnios sintticos 17-etinilestradiol e
levonorgestrel e o hormnio natural 17-estradiol em amostras de gua do rio
Paraba do Sul;
Realizar teste crnico com Danio rerio em tanques rede mantidos no rio Paraba
do Sul;
Realizar teste crnico com peixe Danio rerio, em laboratrio com a utilizao de
amostras de gua do rio Paraba do Sul;
Quantificao da protena vitelogenina (VTG) nos peixes da espcie Danio rerio;
Estudo de dados referentes potencial contaminao de gua com
desreguladores endcrinos de 12 municpios localizados na bacia do rio Paraba
do Sul
3
4
3 REVISO DA LITERATURA 3.1 Poluio
A urbanizao em grande escala, em conjunto com o grande nmero de
cidades, principalmente em pases em desenvolvimento econmico, traz em
muitos casos, um desenvolvimento no ordenado dessas comunidades e
conseqentemente, a elevao do risco sade de seus habitantes (GRAHAM
et al., 2004). O crescimento no ordenado das cidades causa a elas grandes
problemas decorrentes da falta de planejamento, essas dificuldades so de
ordem administrativa e financeira. A adequao de servios essenciais como,
por exemplo, saneamento bsico, distribuio de gua, coleta e destinao do
lixo, sade, moradia, entre outros, feita de maneira pontual, o que eleva os
riscos de problemas populao e ao meio ambiente (GOUVEIA, 1999).
Entre as conseqncias da falta ou ineficincia dos servios bsicos
anteriormente citados, destaca-se a poluio dos diversos ambientes, aqutico,
terrestre e areo.
De acordo com o regulamento da Lei Estadual 997, de 31 de maio de
1976 (SO PAULO, 1976), que dispe sobre a preveno e o controle da
poluio do meio ambiente no Estado de So Paulo, considera-se poluente toda
e qualquer forma de matria ou energia lanada ou liberada nas guas, no ar e
no solo:
I - com intensidade, em quantidade e concentrao, em desacordo com os
padres de emisso estabelecidos neste Regulamento e normas dele
decorrentes;
II - com caractersticas e condies de lanamento ou liberao, em desacordo
com os padres de condicionamento e projeto estabelecidos nas mesmas
prescries;
4
5
III - por fontes de poluio com caractersticas de localizao e utilizao em
desacordo com os referidos padres de condicionamento e projeto;
IV - com intensidade, em quantidade e de concentrao ou com caractersticas
que, direta ou indiretamente tornem ou possam tornar ultrapassveis os padres
de qualidade do Meio Ambiente estabelecidos neste Regulamento e normas dele
decorrentes;
V - que, independente de estarem enquadrados nos incisos anteriores, tornem
ou possam tornar as guas, o ar ou o solo imprprios, nocivos ou ofensivos
sade, inconvenientes ao bem-estar pblico; danosos aos materiais, fauna e
flora; prejudiciais segurana, ao uso e gozo da propriedade, bem como s
atividades normais da comunidade (CETESB, 2000).
Poluio do ar
Segundo Sewell (1978), a poluio do ar pode ser definida como a
presena de diversos materiais estranhos no ar atmosfrico. O ar considerado
normal tem que possuir, em sua composio, mais de 99,99% de nitrognio
(aprox. 78,09%), oxignio (aprox. 20,94%), argnio (aprox. 0,95%) e dixido de
carbono (aprox. 0,03%), alm de outros diversos componentes que se
encontram em quantidades baixssimas, excetuando-se esses componentes, a
presena de outros compostos considerada poluio. Entretanto, o ar
normalmente encontrado em centros urbanos contaminado por outros
elementos, por exemplo, monxido de carbono, dixido de enxofre e metano,
muitas vezes em quantidades excessivas. As principais fontes de poluio do ar
so as indstrias e os automveis, essa contribuio vem com a volatilizao de
alguns metais pesados dos combustveis (FULGNCIO, 2007)
A via de absoro dos poluentes presentes no ar a que leva o poluente
mais rpido corrente sangunea dos humanos. De acordo com Wang et al.
(2003a), a queima de combustveis fsseis, como j comprovado, libera no ar
5
6
substncias que possuem atividade estrognica (fenis), alm disso, podem agir
negativamente sobre a atividade da progesterona (WANG et al., 2005a). Os
contaminantes presentes no ar podem chegar, por deriva, ao solo e aos recursos
hdricos.
A poluio do solo De acordo com Snchez (1998), existem vrios termos utilizados como
sinnimo de rea contaminada como, por exemplo, terreno contaminado, solo
contaminado ou mesmo solo poludo. A definio de rea contaminada segundo
Van Dyck (1995) a de um local onde, como resultado de atividades antrpicas,
encontram-se resduos ou onde a poluio do solo ocorre ou ir ocorrer.
A contaminao do solo pode ter como origem a poluio difusa ou por
deposio atmosfrica (HANN, 2007; GIROTTO et al., 2007). A forma mais
comum de contaminao ao homem a ingesto de alimento contaminado
(REYS, 2001; AMARAL MENDES, 2002).
A contaminao pode ser atribuda bioacumulao nos animais criados
com a finalidade de alimentao. Esses animais recebem hormnios sintticos
para estimular o crescimento que podem ficar acumulados e atingir o homem,
alm disso, so eliminados no solo contaminando o mesmo (SHARPE, 2003). A
presena de hormnios provenientes de sunos e de bovinos descrita por
Lange et al. (2002), e a concentrao de hormnios da ordem de 2300 g/dia
e 540 g/dia, respectivamente. Ainda destaca-se o fato de que muitas vezes
esses dejetos com a presena de hormnios e outras substncias serem
utilizados como adubo na agricultura.
So muitos os problemas causados por reas contaminadas e Snchez
(1998) indica quatro principais: risco segurana da populao ou das
propriedades; riscos sade pblica e dos ecossistemas; impedimento do
desenvolvimento urbano e a reduo do valor imobilirio de propriedades.
Sabe-se que uma vez o poluente estando presente no solo o destino final
poder ser os recursos hdricos e os organismos aquticos.
6
7
Poluio da gua
Geralmente a poluio da gua ocorre por meio da incluso de
substncias ou formas de energia que alteram as caractersticas fsico-qumicas
do corpo dgua de modo a limitar o seu uso. A poluio que ocorre em corpos
dgua pode ter origem em diversos tipos de fontes: atmosfricas, pontuais,
difusas e mistas (TUCCI, 1998).
As fontes pontuais, identificveis no espao e no tempo, de poluio so
caracterizadas pela forma concentrada que os contaminantes atingem o corpo
dgua, enquanto a difusa indica a chegada da poluio ao longo da extenso do
corpo dgua (VON SPERLING, 2005 e MAURCIO, 2008).
Segundo Tucci (1998), os diversos poluentes apresentam caractersticas
distintas, com diferentes graus de poluio, conforme destacado na Tabela 1.
Tabela 1 - Caractersticas das fontes de poluio
Fontes Bactria Nutrientes Pesticidas /Herbicidas
MIcropoluentes Orgnicos Industriais
leos/ Graxas
Atmosfera 1 3-G 3-G Fontes Pontuais Esgoto domstico 3 3 1 3 Esgoto industrial 1 3-G 2 Fontes Difusas Agrcolas 2 3 3-G Dragagem 1 2 3 1 Navegao e Portos 1 1 1 3 Fontes Mistas Escoamento Urbano e depsitos de lixo 2 2 2 2 2
Depsitos de cargas industriais 1 1 3 1
(1) Fonte de significncia local; (2) de moderada significncia local/regional; (3) de significncia regional; (G) de significncia global. Fonte: Tucci (1998)
Outra definio utilizada a de que a poluio das guas acontecer
quando atingirem a elas, substncias que de algum modo possam causar algum
tipo de risco, segundo Fiorillo (2007), a poluio da gua depende do
lanamento, descarga ou emisso de substncias em qualquer estado qumico,
7
8
de forma a comprometer, direta ou indiretamente, as propriedades naturais da
gua.
Quando a matriz poluda gua superficial, Dersio (2007) as classifica
em cinco tipos:
Poluio natural: no causada por atividades humanas, e sim por chuvas, salinizao, decomposio de matria orgnica.
Poluio industrial: resultante dos processos industriais podem ser lquido, gases ou slidos.
Poluio urbana: advinda do esgoto sanitrio
Poluio agropastoril: tem origem na aplicao de defensivos agrcolas e fertilizantes, excrementos animais e eroso.
Poluio acidental: decorrentes de derramamentos acidentais de substncias qumicas.
Ocorre tambm, a classificao da poluio da gua como sendo poluio
difusa, as do tipo natural e agropastoril, e como poluio concentrada a
industrial, urbana e acidental. A poluio urbana pode ser considerada tambm
como difusa por considerar os poluentes carreados pela gua de drenagem
(PMSP, 1999).
O lanamento de esgoto sanitrio sem tratamento prvio em cursos
dgua implica na contaminao dessas guas por diversas substncias. Esses
contaminantes so definidos como xenobiticos e podem ter origem natural ou
antropognica (LIVINGSTONE, 1993; 1998). Substncias sintticas com ao
estrognica podem ser chamadas de xenoestrgenos por alguns autores (CIRJA
et al., 2008; JANEX-HABIBI et al., 2009; LIU; KANJO; MIZUTANI, 2009;
RODGERS-GRAY et al., 2000; WISE; OBRIEN; WOODRUFF, 2011).
Os xenobiticos fazem parte de um grupo de substncias que, em alguns
casos, causam estresse aos organismos presentes no corpo dgua por eles
8
9
contaminado. O estresse pode ser definido como uma condio na qual o equilbrio dinmico do organismo (homeostase) quebrado, como resultado de
aes de um estmulo intrnseco e/ou extrnseco, chamado estressor
(PICKERING, 1981). Indivduos submetidos a condies estressantes passam
por mecanismos compensatrios quebra da homeostase, ou seja, do equilbrio
dinmico do organismo do animal, segundo Adams (1990).
3.2 Contaminantes emergentes
Um dos recursos fundamentais para a sobrevivncia do homem a gua.
Mais de 20% da gua doce acessvel tem o uso domstico, agrcola e industrial
como destino. Entretanto, essas modalidades de uso, na maioria dos casos,
trazem gua uma serie de contaminantes e por esse motivo a poluio est se
tornando um dos principais focos do olhar do poder pblico em todo o mundo
(SCHWARZENBACH et al., 2006).
Um grupo de substncias encontradas em baixas quantidades no meio
aqutico, chamadas de contaminantes emergentes, tem despertado cada vez
mais interesse, uma vez que, em sua maioria, no so regulamentadas.
Entretanto, com a ocorrncia de novos estudos, esses compostos tendem ter
uma regulao dependendo de suas caractersticas de atuao junto ao
ambiente nos quais so descartados (OLLER; MALATO; SNCHEZ-PREZ,
2011).
Os contaminantes emergentes abrangem produtos farmacuticos e de
higiene pessoal, subprodutos industriais, hormnios naturais e drogas ilcitas,
produtos da indstria qumica. Devido ao fato de serem detectados em
pequenas quantidades (na ordem de ng L-1 e g L-1), so denominados micro
poluentes, entretanto os mesmos podem se acumular, no solo, sedimento, gua
e seres vivos. Esses contaminantes podem ser substncias potencialmente
txicas, tanto para o ambiente, quanto para humanos; novos compostos
9
10
desenvolvidos ou mesmo contaminantes recentemente classificados (JOBLING
et al., 1998; KUMMERER, 2011).
Esses contaminantes apresentam, em diversas escalas, risco ao equilbrio
dos ecossistemas, esses riscos esto sendo conhecidos conforme estudos so
desenvolvidos, mas ainda h uma grande lacuna relacionada a esse assunto. A
falta de conhecimento devida entre outras causas complexidade dessas
substncias, sua distribuio, seus nveis txicos, efeitos no ambiente. Os
estudos realizados at a dcada passada consideravam os produtos
convencionais (DAUGHTON; TERNES, 1999), mas agora os novos
contaminantes (emergentes) esto comeando a receber a devida ateno.
3.2.1 Desreguladores endcrinos
Termo utilizado pela primeira vez por Theo Colborn e seus colaboradores
em 1991, sendo que a primeira publicao que citou o termo data de 1992
(MATTHIESSEN, 2003; GEROLIN, 2008).
Algumas das substncias encontradas em ambientes naturais e que
podem causar estresse aos animais, so conhecidas como desreguladores
endcrinos (DE). Existem diversas definies para desreguladores endcrinos,
uma delas, adotada pelo Programa Internacional de Segurana Qumica (IPCS),
em conjunto com o Japo, os EUA, o Canad, a OECD e a Unio Europia,
define da seguinte maneira: Um desregulador endcrino uma substncia ou
um composto exgeno que altera uma ou vrias funes do sistema endcrino e
tm, conseqentemente, efeitos adversos sobre a sade de um organismo
intacto, sua descendncia, ou subpopulaes (CEC, 1999).
De acordo com outra definio, desta vez com coautoria de Ribeiro et al.
(2006), substncias de origem natural ou qumica com a capacidade de causar
interferncia no sistema endcrino de organismos alterando sua sade,
reproduo e crescimento so denominados desreguladores endcrinos, ou inda
podem ser chamados de perturbadores ou interferentes endcrinos. As
alteraes causadas por estas substncias ocorrem nos stios receptores das
clulas, modificando os nveis de produo referentes a essa clula. Essa
10
11
modificao pode aumentar ou diminuir a produo hormonal, o que leva a uma
modificao na homeostase do organismo atingido. As modificaes ocorridas
poder ser observada imediatamente no organismo, ou ao longo do tempo e at
mesmo em suas futuras geraes (LIU; KANJO; MIZUTANI, 2009; DINIZ et al.,
2010).
Segundo Damstra (2002), desreguladores endcrinos possuem
caractersticas de serem substncias que causam alteraes nas funes do
sistema endcrino e que por conseqncia traz danos a um organismo sadio e
em seus descendentes
A ao dos desreguladores endcrinos d-se pelo bloqueio, mimetizao,
estimulao, ou inibio da produo dos hormnios naturais (NIEHS, 2010,
E.HORMONE, 2012). Os desreguladores endcrinos apresentam muitos
mecanismos que facilitam a sua disperso e difuso no ambiente, alm de
impedir ou ao menos dificultar sua eliminao dos organismos vivos. (WHALEY;
KEYES; KHORRAMIL, 2001; RITTLER; CASTILLA, 2002; MAXIMIANO et al.,
2005, AURIOL et al., 2008; DUARTE, 2008; LIU; KANJO; MIZUTANI, 2009;
WISE; OBRIEN; WOODRUFF, 2011). Esses mecanismos podem ser descritos
como:
Bioacumulao/lipoflicos muitos desreguladores endcrinos apresentam a capacidade de se depositarem nos organismos, atingindo altos nveis de
concentrao e que podem ser prejudiciais a esses organismos. A
bioacumulao ocorre principalmente nos tecidos adiposos, leite e na gema do
ovo, algumas substncias permanecem por um longo perodo de tempo nesses
tecidos podendo ocorrer sua transferncia para outros indivduos atravs da
cadeia alimentar, inclusive atingindo ao homem;
Persistncia alguns desreguladores endcrinos demoram vrios anos para serem biodegradados;
Sinergia habilidade de diversos compostos de interagirem, e em alguns casos, gerando efeitos maiores;
11
12
Conjugao ligao entre desreguladores endcrinos e o organismo, o que impede a sua eliminao e conservando a sua concentrao por longo perodo
de tempo.
Existem alguns grupos de substncias com potencial ao desreguladora
do sistema endcrino (STUART; LAPWORTH, 2012) como, por exemplo:
Agrotxicos (componente principal, metabolitos)
Produtos farmacuticos (de uso humano, veterinrio, ilcito)
Compostos relacionados a hbitos da populao (ex. nicotina, cafena)
Produtos de higiene pessoal (ex. filtros de raios ultravioleta, almscar, DEET
utilizado em repelentes de insetos, triclosan componente de cremes dentais,
detergentes e sabonetes)
Aditivos industriais e subprodutos (ex. conservante dioxina, bisfenois,
combustveis contendo MTBE)
Aditivos de itens alimentares (antioxidantes BHA BHT)
Subprodutos do tratamento de gua (THM, NDMA)
Anti chamas, anti fogo (fosfato de quila, PBDE)
Surfactantes (PFOS e PFOA, alquilfenis utilizados em veculos, mobilirio,
tecidos, carpetes)
Hormnios e esteris
Lquidos inicos
Estudos demonstram uma grande diversidade destas substncias
encontradas em ambientes naturais, tais como: esterides naturais, produtos
farmacuticos, produtos qumicos industriais, substncias tensoativas, polmeros
de baixa massa molecular, alquifenois, hidrocarbonetos poli-aromticos (HPAs),
nonilfenol, octilfenol, pesticidas, bisfenol A, surfactantes, ftalato, estireno, entre
outras (GRAY et al., 2000; BIRKETT; LASTER, 2003; LINTELMANN et al., 2003;
UNEP, 2003; HEINSTERKAMP; GANRASS; RUCK, 2004; SUZUKI et al., 2004;
BARRA et al., 2005; MOZAZ; LOPEZ DE ALDA; BARCEL, 2005; PETROVIC et
al, 2005; CHAPMAN, 2006, MCGOVERN; MCDONALD, 2003; GROSS et al.,
12
13
2003; FENT; WESTON; CAMINADA, 2006; SERVOS; SERVOS, 2006;
KHETAN; COLLINS, 2007, FALCONER et al., 2006; DINIZ et al., 2010).
3.3. Estudos com desreguladores endcrinos em ambientes aquticos
Durante anos os estudos tendo como objeto a gua, na maioria dos casos
levavam em conta apenas a concentrao de oxignio, nitratos, fosfatos e
slidos em suspenso presentes, para determinar a sua qualidade. Esse quadro
vem mudando gradualmente e atualmente outras substncias como, por
exemplo, os desreguladores endcrinos, tm sido estudadas (CIRJA et al.,
2008). Contudo, ainda no so suficientemente estudadas as caractersticas de
cada um desses compostos (BRAGA et al., 2005). Muitas dessas substncias
que esto presentes nos recursos hdricos, contaminando-os, ainda no tm
seus efeitos em longo prazo bem definidos (WISE; OBRIEN; WOODRUFF,
2011).
H aproximadamente duas dcadas os estudos que tem como alvo
substncias com potencial de causar alteraes endcrinas tem aumentado
gradativamente. Esses contaminantes so capazes de, mesmo em pequenas
quantidades (na ordem de ng L-1 e g L-1), interagir e trazer danos a organismos
que habitam o subsolo, sedimentos, mares, rios e lagos (WANG et al., 2003b;
LAMBROPOULOU; ALBANIS, 2004).
Entretanto, a ocorrncia da desregulao endcrina no novidade, pois
nas dcadas de 1970 e 1980 foi comprovado que o dietilestilbestrol (DES),
criado inicialmente para servir como medicamento antiabortivo causou
problemas nos sistemas reprodutivos femininos e masculinos (SOTO;
SONNENSCHEIN, 2002). Tambm na dcada de 80 pescadores britnicos
observaram peixes da espcie Rutilus rutilus com alteraes sexuais,
apresentando intersexo. Esses animais ocupavam uma lagoa que recebia a
descarga de uma estao de tratamento de esgoto (SWEETING, 1981, apud
TYLER; ROUTLEDGE, 1998).
13
14
A exposio de animais e humanos a essas substncias tem
demonstrado indcios de alteraes hormonais. Existem estudos que
apresentam dados sobre a relao da contaminao com esses interferentes e a
possibilidade de alterao no sistema reprodutivo de indivduos a eles expostos
(MEYER; SARCINELLI; MOREIRA, 1999; RITTLER; CASTILLA, 2002;
MAXIMIANO et al., 2005).
Segundo Bila e Dezotti (2003), a presena de frmacos residuais na gua,
como antibiticos e estrognios, pode causar efeitos adversos na sade
humana, e de organismos presentes nas guas como, por exemplo, os peixes,
por isso so motivo de grande preocupao por parte de estudiosos em todo o
mundo (CIRJA et al., 2008; LEE et al., 2008).
A seguir so citados hormnios naturais e sintticos, alguns dos
principais desreguladores endcrinos que contaminam recursos hdricos,
especialmente em locais onde a urbanizao intensa (RAIMUNDO, 2007).
3.4 Hormnios sintticos e naturais e sua ocorrncia em ambientes aquticos
Grandes centros urbanos e regies de intensa atividade agropecuria
apresentam contaminao de seus corpos dgua com substncias qumicas
componentes do grupo de desreguladores endcrinos (KOLPIN, et al, 2002).
Sole et al. (2003) e Van den Belt et al. (2004) corroboram com a
constatao de que a principal fonte de contaminao de guas superficiais por
desreguladores endcrinos o lanamento de esgoto sanitrio e industrial
tratado ou in natura. Essa uma importante fonte de poluio, pois, no h a
remoo completa dessas substncias nas estaes de tratamento de esgoto.
Os corpos dgua suportam o recebimento de determinadas carga de resduos,
mas essa capacidade varia de acordo com o seu volume para ser eficiente em
dilu-las. A Tabela 2 apresenta algumas das principais fontes pontuais e fontes
difusas. (WANG et al., 2005b; ALUM et al., 2004; RUDDER et al., 2004;
JEANNOT et al., 2002).
14
15
Tabela 2 - Principais fontes de desreguladores endcrinos em guas superficiais
Fontes Tipos de Fontes Desreguladores Endcrinos Encontrados
Efluente Industrial Pontual
Hormnios naturais e sintticos, alquilfenis,
ftalatos, bisfenol A, frmacos, cafena,
pesticidas, bifenilas policloradas (PCB),
hidrocarbonetos policclicos aromticos
(HPA), retardantes de chama, dioxinas
Efluente Sanitrio Pontual Hormnios naturais e sintticos, alquilfenis,
ftalatos, bisfenol A, frmacos, cafena
Deflvio Pecurio Difusa Hormnios naturais e sintticos, antibiticos,
frmacos veterinrios
Natural Difusa HPA, estrognios naturais e fitoestrognios
Fonte: Adaptado de Raimundo, 2007.
A contaminao de corpos dgua por hormnios sexuais femininos
ocorre principalmente pelo lanamento de esgoto sanitrio sem tratamento, ou
quando seu tratamento ineficiente. Essa fonte de desreguladores endcrinos
se deve pela excreo vinda da populao de maneira natural ou somada ao
uso de anticoncepcionais orais ou injetveis (PONEZI; DUARTE; CLAUDINO,
2006). Dados citados por Fernandes (2007) indicam que em 2000, no Brasil, o
uso de anticoncepcionais era feito por 8 milhes de mulheres sendo que esse
nmero poder chegar a 45 milhes em 20 anos.
3.4.1 Origem dos principais hormnios naturais e sintticos que ocorrem em ambientes aquticos
Guyton e Hall (2005) definem os hormnios como substncias qumicas
que so produzidas por glndulas especficas e que interferem na funo de
outras clulas em todo o corpo. O transporte dos hormnios endcrinos feito
15
16
atravs do sistema circulatrio, e sua funo realizada quando os mesmos
atingem seus respectivos receptores desencadeando uma srie de reaes.
Dos hormnios naturais, o que apresenta maior potencial estrognico, o
17-estradiol. Esse o principal hormnio secretado durante o perodo de
atividade dos ovrios, e tem como metablitos a estrona, o estriol e seus
conjugados. O 17-estradiol possui atividade biolgica 12 vezes maior do que a
estrona e 80 vezes mais elevada do que o estriol (GENNARO, 2000, COLUCCI;
BORK; TOPP, 2001; KASSAB, 2001; GILMAM; HARDMAN; LIMBIRD, 2003).
Quando se trata de hormnios sintticos que so utilizados como
contraceptivos e para a realizao de tratamento de reposio hormonal,
destacam-se as suas estruturas moleculares que os torna mais potentes quando
comparados aos hormnios naturais, possuindo a capacidade de alterar o
sistema endcrino mesmo em baixas concentraes. O hormnio sinttico mais
utilizado o 17-etinilestradiol, que tem sua estrutura semelhante do hormnio
natural 17-estradiol, entretanto, possuindo uma atividade estrognica duas
vezes superior. Para poder ser aproveitado pelo organismo humano o 17-
etinilestradiol possui um agrupamento etinila que o protege da inativao pelo
fgado (KHANAL et al., 2006, KASSAB, 2001). A Figura 1 ilustra a representao
esquemtica da principal entrada dos desreguladores endcrinos no sistema
aqutico (LINTELMANN et al., 2003).
16
17
Figura 1 - Representao esquemtica da principal via de entrada de desreguladores endcrinos hormonais de origem humana (natural ou sinttico) em sistemas aquticos (LINTELMANN et al., 2003)
O hormnio 17-etinilestradiol aps ser ingerido rapidamente absorvido
pelo trato intestinal, e apresenta uma meia vida biolgica que varia de 13 a 27
horas, sendo excretado atravs da urina e das fezes e permanecendo no
ambiente aqutico de gua doce por um perodo que varia de 20 a 40 dias.
Associado ao 17-etinilestradiol, o hormnio igualmente sinttico, levonorgestrel,
utilizado para a obteno de melhores resultados. Assim como o 17-
etinilestradiol, o levonorgestrel apresenta uma rpida absoro pelo organismo,
permanecendo no organismo por mais tempo do que um hormnio natural e sua
meia vida biolgica varia de 10 a 24 horas, sendo excretado principalmente pela
urina e em menor parte pelas fezes (GENNARO, 2000 e GILMAN; HARDMAN;
LIMBIRD, 2003; ENSP, 2002, FERREIRA, 2008; RUDDER et al., 2004; WISE;
OBRIEN; WOODRUFF, 2011).
17
18
Aps serem excretados os hormnios sintticos 17-etinilestradiol e
levonorgestrel ainda se encontram na forma ativa em corpos dgua devido a
ao de bactrias, especialmente a Escherichia colli, presente em grandes
quantidades nas fezes (SOLE, et al., 2001).
As caractersticas femininas, o controle do ciclo reprodutivo, gravidez,
sistema cardiovascular, sistema imunolgico, entre outros so diretamente
influenciados por estrgenos, dentre os quais se destaca o estradiol. Johnson e
Sumpter (2001) indicam a necessidade da melhora das metodologias utilizadas
em pesquisas relativas ao tema, principalmente na reduo dos nveis de
deteco e aumento da preciso das anlises como aes prioritrias.
De acordo com Ghiselli e Jardim, (2007), mulheres grvidas dependendo
do estagio da gravidez podem excretar at 1000 vezes mais hormnios do que
uma mulher em atividade normal (da ordem de 2 a 20 g estrona/dia, 3 a 65 g
estriol/dia, e 0,3 a 5 g estradiol/dia).
Em relao ao hormnio sinttico 17-etinilestradiol, o mais utilizado na
composio de plulas contraceptivas em uma quantidade que varia de 25 a 50
g por plula (ingerida diariamente), sabe-se que desse total, aproximadamente
80% no aproveitado. A frao no utilizada liberada principalmente pela
urina. (HENRIQUES, 2008; CAMPANI et al., 2010; GABET-GIRAUD et al., 2010;
FERNANDES, 2007).
A Tabela 3 apresenta a quantidade de hormnios excretados diariamente
por humanos, por ambos os sexos e nas diferentes fases da vida (YING; BRIAN;
KOOKANA, 2002).
18
19
Tabela 3 - Excreo de estrognios pelos seres humanos (g/dia).
Categoria 17-
estradiol Estrona Estriol
17-
etinilestradiol
Homens 1,6 3,9 1,5 --
Mulheres frteis 3,5 8 4,8 --
Mulheres na
menopausa 2,3 4 1 --
Mulheres grvidas 259 600 6000 --
Mulheres -- -- -- 35
Fonte: YING; BRIAN; KOOKANA, 2002
Os hormnios que contaminam os corpos dgua tambm podem ter
como origem, o escoamento de excretas de animais, principalmente quando
criados em grande densidade. Isso ocorre, por exemplo, no caso dos bovinos e
sunos utilizados com finalidade de alimentao humana (Tabela 4). J
constatado nos EUA a contaminao de lagos por 17-Estradiol, sendo que a
quantificao do hormnio na gua foi na ordem de 0,05 a 7,4 ng/l e foram
suficientes para causar distrbios s tartarugas que habitam esses locais que
recebiam dejetos bovinos (FURUICHI et al., 2006).
19
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Tabela 4 - Excreo diria de estrognio total estimada por diferentes espcies de animais (g/dia), (adaptado de WISE; OBRIEN; WOODRUFF, 2011)
Espcie
Total de estrognio
excretado pela
urina (g/dia)
Total de
estrognio
excretado pelas
fezes (g/dia)
Total de estrognio
excretado (g/dia)
Bovino
Bezerros 15 30 45
Vacas 99 200 299
Prenhes 320 104320 256 7300 576 111620
Suno Porcos 82 21 103
Prenhes 700 17000 61 -
Ovino Ovelhas 3 20 23
Carneiros 3 22 25
3.5 Organismos teste e biomarcadores de desreguladores endcrinos
Os estudos anteriormente descritos sobre a avaliao de efeitos
fisiolgicos causados pelos desreguladores endcrinos presentes na gua de
rios, foram possveis devido ao uso de biomarcadores e organismos teste, uma
metodologia adotada recentemente.
Os mtodos tradicionais de avaliao de qualidade da gua, baseadas em
anlises fsicas, qumicas e bacteriolgicas, no conseguem fornecer
informaes de como uma determinada substncia ir agir em um organismo
sob o ponto de vista fisiolgico (CAIRNS; PRATT, 1993). Para uma anlise
eficiente deve-se utilizar os mtodos analticos juntamente com os
biomarcadores, que podem ser definidos como ferramentas utilizadas na anlise
20
21
da organizao biolgica de um organismo (organismo teste) (ARIAS et al.,
2007).
Em outra definio os biomarcadores so vistos como qualquer resposta
a um contaminante ambiental, medidos no organismo ou matriz biolgica,
indicando um desvio do status normal que no pode ser detectado no organismo
intacto. Diversos parmetros podem ser utilizados como biomarcadores como,
por exemplo, medidas de fluidos corporais, clulas, tecidos ou medidas
realizadas sobre o organismo completo que indicam, em termos bioqumicos,
celulares, fisiolgicos, comportamentais ou energticos, a presena de
substncias contaminantes ou a magnitude da resposta do organismo alvo
(LIVINGSTONE, 1993, LARCHER, 2000).
A definio de qual ser o organismo teste deve incluir uma gama de
critrios, dentre eles a disponibilidade, manuteno e conservao da espcie
em questo, a possibilidade do uso de determinada espcie para a obteno de
resultados especficos condizentes ao objetivo do trabalho (BOHRER, 1995).
Muitos organismos tm sido utilizados com esse fim, destacam-se espcies de
moluscos, peixes e crustceos (COTELLE; FERARD, 1999), alm de algumas
espcies vegetais. Entre as espcies mais utilizadas em todo o mundo como
organismo teste esto: Artemia sp (SVENSSON et al., 2005), Daphnia magna,
Vibrio fischeri, Danio rerio (KNIE; LOPES, 2004) e Allium cepa L. (ARAMBASIC;
BJELIC; SUBAKOV, 1995).
Alm da sobrevivncia dos organismos teste (crustceos, peixes, etc.)
outros fatores esto sendo observados e indicam alteraes na homeostase dos
organismos (alteraes bioqumicas, fisiolgicas e morfolgicas). Estes fatores
podem ser denominados como biomarcadores (GRINEVICIUS, 2006).
Biomarcadores so sistemas indicadores que fazem parte de um organismo e
so utilizados para a deteco de modificaes especificas (SILVA;
ERDTMANN; HENRIQUES, 2003).
Um biomarcador ideal deve demonstrar grande susceptibilidade, boa
sensibilidade, relativa especificidade e ter baixo custo em suas anlises
(STEGEMAN et al., 1992; BAINY, 1993).
Quando o intuito da pesquisa verificar atividades estrognicas de
desreguladores endcrinos biomarcadores so utilizados com freqncia, e
21
22
quando se tratam de estudos relacionados contaminao de ambientes
aquticos, a vitelogenina (VTG) demonstra bons resultados (ARUKWE;
GOKSYR, 2003; GORDON et al., 2006; HINCK et al., 2006; REMPEL et al.,
2006, ANDERSSON et al., 2007).
3.5.1 Vitelogenina A vitelogenina produzida por animais ovparos, para compor o vitelo
presente nos ovcitos. Esta fosfolipoglicoprotena produzida no fgado por
meio do estmulo causado pelo estradiol ovariano e transportada atravs do
sangue at as gnadas onde ir tornar-se parte do vitelo dos ovcitos em
desenvolvimento, para futura fonte nutricional para o embrio. A VTG
encontrada durante a maturao sexual de fmeas (ARUKWE; GOKSYR,
2003; LANGSTON et al., 2005).
A sntese da VTG depende da presena de hormnios estrognicos, que
so sintetizados pelas fmeas durante seu ciclo reprodutivo, embora os peixes
machos e os juvenis tambm apresentam receptores estrognicos hepticos.
Entretanto, a codificao do gene para estas protenas no existe ou
fracamente expressada em machos e juvenis, no sendo normal a produo de
protenas ligadas ovognese (vitelognese e zonagnese). A produo de
VTG por machos ou juvenis sinal de desequilbrio endcrino e indicador de
efeito por exposio a estrgenos ambientais; tendo em vista que sua presena
em machos, s possvel mediante induo externa, j que a sua produo
desencadeada pela atividade de hormnios femininos (ARUKWE; KNUDSEN;
GOKSYR, 1997; LINTELMANN et al., 2003; HORNUNG et al., 2004; HINCK et
al., 2006; REMPEL et al., 2006; MENDES; OLIVEIRA, 2004).
Com base nessas informaes, a vitelogenina mostra ser um bom
biomarcador para a exposio de vertebrados vivparos a xenoestrgenos. Os
peixes so importantes nos estudos relativos aos efeitos de substncias
estrognicas fisiologia reprodutiva, pois seu sistema reprodutivo regulado por
22
23
hormnios similares aos dos mamferos, portanto espera-se que os efeitos
tambm ocorram (MILLS; CHICHESTER, 2005).
3.6 Efeitos dos desreguladores endcrinos nos organismos vivos A fase de desenvolvimento o perodo em que os organismos esto mais
propcios a alteraes que levam a disfunes hormonais ou endcrinas devido
exposio desreguladores endcrinos. Essas modificaes trazem a perda
da homeostase dos organismos. Esta constatao decorrente de resultados de
diversos estudos que envolvem poluio ambiental de corpos dgua com
problemas relacionados ao sistema reprodutor de espcies de diversas classes
de animais como mamferos, aves, rpteis, anfbios e peixes, entre outros
(DAMSTRA et al., 2002).
O sistema endcrino no abrange apenas a excreo de hormnios na
corrente sangunea, h tambm a atuao no sistema nervoso, atravs dos
neurohormnios (DAMSTRA et al., 2002). Do sistema endcrino destacam-se
trs eixos principais:
Eixo hipotlamo-pituitrio-adrenal, ligado ao metabolismo de carboidratos,
protenas e gorduras, efeito antiinflamatrio e modulao de respostas ao
estresse;
Eixo hipotlamo-pituitrio-gonadal, ligado ao sistema reprodutivo;
Eixo hipotlamo-pituitrio-tiroidal, ligado a atividade metablica como um todo
Como principal funo do sistema endcrino, se destaca a manuteno
da homeostase, evitando problemas decorrentes do efeito gangorra, Figura 2
(PADUA, 2009).
23
24
Figura 2 - Representao do funcionamento do sistema endcrino com base no
principio da gangorra (PADUA, 2009)
Existem algumas questes observadas quando so analisados impactos
dos desreguladores endcrinos nas funes exercidas pelo organismo
(DAMSTRA et al., 2002):
O individuo exposto na fase adulta pode ter os efeitos dos desreguladores
endcrinos minimizados pela ao de mecanismos de homeostase, desse modo
a exposio pode no apresentar nenhuma modificao;
A exposio na fase de desenvolvimento dos organismos pode resultar em
algumas mudanas permanentes de diversas funes;
Quando a exposio ao desregulador endcrino ocorrer em diferentes estgios
desse desenvolvimento, as consequncias podem ser distintas;
24
25
Devido complexidade dos sistemas endcrinos os efeitos da exposio podem
ocorrer, em alguns casos, de maneira e local imprevisveis;
Considerando o anteriormente exposto, deve-se ter cuidado na transposio dos
resultados obtidos in vitro para condies in vivo
Problemas causados por desreguladores endcrinos em humanos
Os efeitos dos desreguladores endcrinos atingem tambm os seres
humanos e uma das principais vias de entrada destes desreguladores em
organismos humanos a ingesto de alimentos e gua que os contenham
(REYS, 2001).
Amaral Mendes (2002) descreve os desreguladores endcrinos como
sendo o principal desafio mdico, e que a atuao de diversas substncias sobre
o sistema endcrino e reprodutivo causada pela habilidade dessas substncias
em:
A) mimetizar e antagonizar os efeitos de hormnios endgenos
B) desregular a sntese e metabolismo de hormnios endgenos e de seus
receptores
Em seres humanos os desreguladores endcrinos podem causar uma
srie de problemas decorrentes de compostos naturais ou sintticos presentes
no meio ambiente. Os autores destacam distrbios na sade reprodutiva,
disfunes de fertilidade, formao de cnceres de testculos, prstata e mama,
diminuio na contagem de espermatozides, endometriose, entre outros
(HARRISON; HOLMES; HUMFREY, 1997; LARSSON et al., 1999; SHARPE;
IRVINE, 2004; SLOWIKOWSKA-HILCZER, 2006, BILA; DEZOTTI, 2007;
GHISELLI; JARDIM, 2007, CHEN; HU, 2009).
Durante os anos 40 foi observada uma diminuio na contagem de
espermatozides em trabalhadores que lidavam com aplicao do pesticida DDT
25
26
(AMARAL MENDES, 2002). Estudos comprovaram os efeitos do desregulador
endcrino, dietilestilbestrol (DES), que no perodo entre 1948 e 1971 era
utilizado com o intuito de precaver abortos e auxiliar no desenvolvimento do feto.
Aps o uso do composto, pelas mes, muitas das suas filhas nasceram estreis,
houve o desenvolvimento de um tipo raro de cncer vaginal, m formao do
tero e ovrios, alm de supresso da imunidade (DAMSTRA et al., 2002;
REYS, 2001; JANSSEN; FUJIMOTO; GIUDICE, 2007). Em homens adultos que
foram expostos a estradiol, foi detectada uma maior ocorrncia de
anormalidades nos rgo sexuais, uma baixa contagem de espermatozides,
alm de um alto ndice de cncer nos testculos (COLUCCI; BORK; TOPP, 2001;
GUILLETTE et al., 1996; LEGLER et al., 2002; JANEX-HABIBI et al., 2009).
Alm de efeitos diretos causados nos indivduos que mantm contato com
os desreguladores endcrinos, fetos podem ter seu desenvolvimento
comprometido, quando ocorrem alteraes endcrinas em suas mes. Os
efeitos teratognicos descritos so casos de m formao dos rgos sexuais e
anomalias reprodutivas, tanto em fetos do sexo masculino, quanto do sexo
feminino (COWIN; FOSTER; RISBRIDGER, 2007; SAFE, 2004; JANSSEN;
FUJIMOTO, 2007; FORSTMEIER, 2005).
Problemas causados por desreguladores endcrinos em animais
Em relao a mamferos, destacam-se anomalias no sistema reprodutor
de ratos causada por bisfenol A (MARKEY et al., 2002). Bay et al.(2006)
descrevem a infertilidade e anomalias testiculares como resultado da exposio
de fetos de ratos ftalatos. Em ambiente aqutico foi observada alta mortalidade
de golfinhos por ocorrncia de PCB (AGUILAR; BARRELL, 1994). Guerra et al.,
(1999) e Souza et al. (2000), utilizando ratos como modelo, demonstraram que o
hormnio sinttico levonorgestrel quando ministrado em doses de 15 ou 30 mg 3
vezes ao dia, levaram distrbios no crescimento e peso de rgos dos
animais.
26
27
Alteraes causadas pelo DDT e DDE foram observadas em aves por Fry
e Toone (1981), e foram causadoras da feminizao de gaivotas machos,
diminuio da espessura da casca dos ovos (com conseqente quebra da
mesma) e anomalias do sistema reprodutor. Tambm foram observadas
alteraes detectadas atravs da alterao na produo de VTG em falces
peregrino (JIMENEZ et. al, 2007)
Em rpteis os efeitos do DDT e DDE elevaram a concentrao de
hormnios sexuais no plasma alm de trazer anomalias morfolgicas s
gnadas de crocodilos, alterao da produo de esterides e variao na
concentrao de hormnios sexuais em fmeas e machos (GUILLETTE et al.,
1999; MILNES et al., 2002; WHALEY; KEYES; KHORRAMIL, 2001), mesmo no
havendo deteco de pesticidas, a substncia foi encontrada nos animais e seus
ovos (NRDC, 2007). A exposio ao estradiol tambm levou a induo da
sntese de VTG e a alteraes na produo de ovos de tartarugas (IRWIN;
GRAY; OBERDORSTER, 2001). No caso de anfbios, foi observado por Bogi et
al.(2003) que o efluente de uma estao de tratamento de esgoto causou a
induo da sntese de VTG e hermafroditismo em rs.
Como descritos em diversos estudos os peixes sofrem as aes da
presena dos desreguladores endcrinos sintticos 17-etinilestradiol e
levonorgestrel e do hormnio natural 17-estradiol. A presena dos mesmos,
ainda que em baixas concentraes, provocou distrbios como a feminizao
(RODGER-GRAY et al., 2001; KNORR; BRAUNBECK, 2002; BOMBARDELLI;
HAYASHI, 2005; EDWARDS; MOORE; GUILLETTE, 2006), alteraes na
transcrio gentica (ZUCCHI; CASTIGLIONI; FENT, 2012), alterao nas
gnadas (PANTER; THOMPSON; SUMPTER, 2000; LABADIE; BUDZINSKI,
2006), hermafroditismo (KOGER et al., 2000), incidncia de testculos-vulos
nas gnadas (KANG et al., 2002) e induo sntese de vitelogenina (PANTER;
THOMPSON; SUMPTER, 2000; ROSE et al., 2002; MONCAUT; NOSTRO;
MAGGESE, 2003; GORDON et al.; 2006; HINCK et al., 2006; REMPEL et al.,
2006; ANDERSSON et al., 2007).
Como determinado por diversos estudos, so extremamente
preocupantes as conseqncias a toda a biodiversidade, promovidas pela
presena de desreguladores endcrinos no ambiente. A ameaa
27
28
biodiversidade um assunto tratado em todo o mundo, inclusive tendo desde
1992 na Organizao das Naes Unidas (ONU) um importante instrumento, a
Conveno sobre Diversidade Biolgica (BRASIL, 2012).
3.7 Conservao da biodiversidade em guas continentais
A Conveno sobre Diversidade Biolgica (CDB) instituda durante a
Conferncia das Naes Unidas para o Meio Ambiente e o Desenvolvimento -
CNUMAD (Rio 92) define diversidade biolgica como sendo a variabilidade de
organismos vivos de todas as origens, compreendendo, dentre outros, os
ecossistemas terrestres, marinhos e outros ecossistemas aquticos e os
complexos ecolgicos de que fazem parte; compreendendo ainda a diversidade
dentro de espcies, entre espcies e de ecossistemas (MMA, 2000).
A CDB tem como objetivos a serem cumpridos, de acordo com as
disposies pertinentes, a conservao da diversidade biolgica, a utilizao
sustentvel de seus componentes e a repartio justa e equitativa dos benefcios
derivados da utilizao dos recursos genticos, mediante, inclusive, o acesso
adequado aos recursos genticos e a transferncia adequada de tecnologias
pertinentes, levando em conta todos os direitos sobre tais recursos e
tecnologias, e mediante financiamento adequado (MMA, 2000).
A gesto da CDB feita pela Conveno das Partes atravs de reunies
peridicas. Atravs dessas reunies so definidas metas, as quais os pases
signatrios assumem o compromisso de seguir. Aps a ltima reunio realizada
em Nagoya no Japo (COP 10) foram definidos o Plano Estratgico 2011-2020 e
as metas de Aichi. O Plano Estratgico 2020 da CDB (UICN; WWF-BRASIL;
IP, 2011) est organizado em cinco objetivos:
A. Tratar das causas fundamentais de perda de biodiversidade fazendo com que
preocupaes com biodiversidade permeiem governo e sociedade.
28
29
B. Reduzir as presses diretas sobre biodiversidade e promover o uso
sustentvel.
C. Melhorar a situao de biodiversidade protegendo ecossistemas, espcies e
diversidade gentica.
D. Aumentar os benefcios de biodiversidade e servios ecossistmicos para
todos.
E. Aumentar a implementao por meio de planejamento participativo, gesto de
conhecimento e capacitao.
Os cinco objetivos so compostos por 20 metas (Metas de Aichi), dentre
as quais destacamos a META 8 Controle da Poluio das guas, onde h a
indicao de que at 2020, a poluio dever ser reduzida a nveis no
prejudiciais ao funcionamento de ecossistemas e da biodiversidade (UICN;
WWF-BRASIL; IP, 2011).
No Brasil, o incio da gesto de guas iniciou-se na dcada de 30, com a
criao do Decreto 24.643/34 - Cdigo de guas (BRASIL, 1934) e tem como
marco legal a Constituio Federal de 1988 (BRASIL, 1988), a Lei 9.433/97 que
instituiu a Poltica Nacional de Recursos Hdricos e criou o Sistema Nacional de
Gerenciamento de Recursos Hdricos (BRASIL, 1997) e a Lei 9.984/00 que criou
a Agncia Nacional de guas (ANA), (BRASIL, 2000). O foco principal dos
instrumentos legais de proteo dos recursos hdricos manuteno dos
mesmos para a sustentao das atividades humanas (abastecimento urbano,
agricultura, gerao de energia, pesca, aquicultura, assimilao de esgoto, etc.).
O Brasil, como signatrio da Conveno sobre Diversidade Biolgica, tem
por obrigao cumprir as metas estipuladas em suas reunies. Para atingir o
objetivo proposto na Meta 08 definida na COP 10 (controle de poluio das
guas), uma das aes necessrias a implementao de um sistema de
monitoramento dos poluentes que atingem os corpos dgua. Para que esse
sistema de monitoramento seja eficiente so necessrios subsdios para a
definio dos locais onde sero alocados.
29
30
3.8 reas crticas 3.8.1 Mapeamento De acordo com o desenvolvimento, a utilizao dos recursos hdricos
mais intensa, assim como o risco de degradao ambiental devido interveno
humana. O corpo dgua, receptor final da gua da bacia hidrogrfica, pode ser
utilizado como indicador de alteraes ocorridas no territrio ao seu redor. Para
que o planejamento e administrao hdrica de uma regio existam, necessrio
que haja informaes organizadas desse local, para que as aes a serem
tomadas possam apresentar uma maior efetividade (MENDES; CIRILO, 2001).
Varnes (1974) define o mapeamento como a delimitao de reas
homogneas, sendo que suas heterogeneidades so consideradas para a sua
construo. A composio do mapa de um plano bidimensional onde h os
contornos das reas delimitadas e uma legenda que define os atributos que
foram utilizados. Os principais tipos de mapas utilizados nos sistemas de
informao geogrfica (SIG) so definidos por Mendona (2002):
Mapa temtico: demonstra de forma qualitativa a distribuio espacial de uma grandeza geogrfica;
Mapa cadastral: cada componente considerado como um objeto geogrfico que possui atributos, podendo estar associado a vrias
representaes grficas;
Produto de sensoriamento remoto: imagens obtidas por satlites e fotografias areas;
Modelo numrico do terreno: reproduz uma superfcie real a partir de algoritmos e de um conjunto de pontos, em um referencial qualquer, que
descrevem a variao contnua da superfcie.
30
31
O desenvolvimento de um mapa com dados especficos, no a
sobreposio de diversos mapas, mas sim a soma de valores de diversos
atributos que se encontram em cada ponto, esses pontos so identificados por
coordenadas (CEOTMA, 1983).
3.8.2 reas potencialmente crticas no Brasil
Estudo publicado em 2005 pelo Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatstica (IBGE, 2005) indica a poluio por esgoto sanitrio como a principal
fonte de contaminao de mananciais, alm disso, a existncia de atividades
agropecurias e descarte de resduos slidos tambm causam contaminao. A
Figura 3 ilustra a contaminao e a sua causa nas cinco regies do Brasil.
Figura 3 - Proporo de municpios com ocorrncia de poluio do recurso gua, por
tipo de causas mais apontadas. Fonte: IBGE, Diretoria de Pesquisas, Coordenao de Populao e Indicadores Sociais, Pesquisas de Informaes Bsicas Municipais 2002 (IBGE, 2005)
31
32
O Brasil apresenta algumas reas crticas, quando a qualidade da gua
considerada. Estudos demonstram que essas regies localizam-se prximas aos
principais centros metropolitanos (MMA, 2006):
Regio Hidrogrfica do Paran: bacias do Alto Iguau, alto Tiete, Piracicaba,
Meia Ponte, Rio Preto;
Regio Hidrogrfica do So Francisco: bacia do rio das Velhas, Para e
Paraopeba;
Regio Hidrogrfica Atlntico Leste: bacia dos rios Joanes e Ipitanga;
Regio Hidrogrfica Atlntico Sul: bacia dos rios dos Sinos e Gravata;
Regio Hidrogrfica Atlntico Sudeste: bacia do rio Paraba do Sul, bacia do rio
Jucu;
Regio Hidrogrfica do Paraguai: bacia do rio Miranda.
Mesmo com o risco por conta do potencial de presena de
desreguladores endcrinos nessas regies, o monitoramento no uma prtica
aplicada no Brasil, entretanto, os riscos provavelmente existem, pois a ocupao
desses locais leva ao lanamento dessas substncias ao meio. Pases
considerados desenvolvidos apresentam programas de monitoramento da
contaminao das guas considerando a contaminao atravs de
contaminantes emergentes (STAVRAKAKIS et al., 2008; PICKERING;
STUMPTER, 2003; CEC, 2004) fato que deveria ocorrer tambm no Brasil.
De acordo com Who (2006), quando se considera a sade pblica como
questo a ser tratada, a presena de contaminantes deve ter trs questes
primordiais:
Probabilidade de exposio
Concentrao que pode resultar em efeitos adversos sade
32
33
Evidncia de efeitos adversos sade em decorrncia da exposio pelo
consumo de gua
Para que seja possvel identificar s quais potenciais desreguladores
endcrinos a populao exposta e corre risco, uma importante ferramenta a
ser utilizada a avaliao de risco ambiental (WHO, 2006) e o monitoramento
faz parte desse tipo de avaliao. O monitoramento deveria ser efetivado
principalmente nas reas potencialmente crticas (como j definido pelo IBGE),
que na Regio Hidrogrfica Atlntico Sudeste inclui a bacia do rio Paraba do
Sul.
3.8.3 Rio Paraba do Sul
A importncia do rio Paraba do Sul em seu trecho paulista destacada por
Muller (1969), quando cita que o rio Paraba do Sul serviu de corredor,
facilitando o deslocamento e a fixao do homem, tornando-se o eixo bsico de
toda a vida regional, e em suas proximidades foram surgindo e evoluindo os
principais ncleos populacionais atualmente existentes na regio. Como toda
regio para se desenvolver necessita obrigatoriamente de recursos hdricos,
problemas no rio Paraba do Sul certamente trariam srias complicaes para
um maior desenvolvimento de todo o Vale do Paraba, tendo em vista que a
Unidade de Gerenciamento de Recursos Hdricos (UGRHI) 2 - Paraba do Sul
engloba 34 municpios e 1.944.638 habitantes, representando 5% da populao
do Estado de So Paulo (CETESB, 2007).
A rea de drenagem da bacia do rio Paraba do Sul tem cerca de 55.500
km2 compreendida entre os paralelos 2026 e 2300 sul e os meridianos
4100e 4630 oeste de Greenwich e est localizada na Regio Sudeste entre
os estados de So Paulo com cerca de 13.900 km2, Minas Gerais 20.700 km2 e
Rio de Janeiro com aproximadamente 20.900 km2 (ANA, 2001).
33
34
O rio Paraba do Sul tem sua nascente localizada na Serra da Bocaina, no
Estado de So Paulo, a 1.800 m de altitude, e sua foz no norte fluminense, mais
precisamente no municpio de So Joo da Barra, percorrendo
aproximadamente 1.150 km. Sua bacia distribui-se na direo leste oeste entre
as serras do Mar e da Mantiqueira, chegando a mais de 2.000 m de latitude nos
pontos mais elevados (ANA, 2001).
Por apresentar diferentes caractersticas fsicas, o rio Paraba do Sul pode
ser dividido em quatro partes:
a) Curso Superior inicia-se desde a nascente at a cidade de Guararema, em So Paulo, caracteriza-se por apresentar declives acentuados e regime
torrencial, tem extenso de 317 km.
b) Curso Mdio Superior possui 208 km de extenso e vai de Guararema (SP) at Cachoeira Paulista (SP), nesse percurso o rio sinuoso e meandrado.
c) Curso Mdio Inferior est localizado entre os municpios de Cachoeira Paulista (SP) e So Fidlis (RJ), tem uma extenso de 480 km, apresentando-se
com reas de cachoeiras.
d) Curso Inferior o trecho terminal do rio, indo de So Fidlis (RJ) sua foz, em So Joo da Barra e possui 95 km.
O rio Paraba do Sul tem como seus principais afluentes, em sua margem
direita, os rios Bananal, Pira, Piabanha e Dois Rios, em sua margem esquerda,
os rios Jaguar, Paraibuna, Pirapetinga, Pomba e Muria (ANA, 2001). A bacia
do rio Paraba do Sul abrange 180 municpios e seu sistema hidrulico
composto por cinco reservatrios, Paraibuna, Jaguari, Santa Branca, Funil e
Santa Ceclia. A parte paulista da bacia est localizada entre as coordenadas
22o24 e 23o39 de latitude Sul e 44o10 e 46o26 de longitude Oeste (AGEVAP,
2010).
34
35
Urbanizao, uso e ocupao do solo do Vale do rio Paraba do Sul
De acordo com Santos e colaboradores (2006), as atividades antrpicas,
juntamente com o desenvolvimento, a urbanizao e a industrializao trazem
grandes impactos no ambiente, sobretudo aos importantes recursos hdricos.
A Tabela 5 demonstra quais as principais atividades que utiliza gua na
Bacia do rio Paraba do Sul.
Tabela 5 - Principais usos das guas da Bacia do rio Paraba do Sul
Usos da gua Captao (m3s-1) Consumo (m3s-1)
Abastecimento pblico 16,84 3,37
Uso industrial 13,65 6,19
Irrigao 49,73 30,28
Pecuria 3,45 1,73
Total 83,67 41,57 Fonte: Laboratrio de Hidrologia e Estudos do Meio Ambiente/COPPE/UFRJ (2002)
De acordo com dados da CETESB (2007), o ndice de coleta do esgoto
sanitrio das cidades da regio da Bacia do rio Paraba do Sul, em seu trecho
paulista, de 89%, mas apenas 37% desse efluente recebem tratamento. As
principais atividades de uso das guas desta bacia envolvem o abastecimento
pblico e industrial, a gerao de energia eltrica, o afastamento de esgoto
sanitrio e industrial e a irrigao de plantaes O lanamento de esgoto
sanitrio sem tratamento prvio em cursos dgua implica na contaminao
dessas guas por diversas substncias, inclusive desreguladores endcrinos.
35
36
4 MATERIAIS E MTODOS 4.1 Validao de mtodo para a quantificao dos hormnios sintticos 17-etinilestradiol e levonorgestrel e do hormnio natural 17-estradiol utilizando-se cromatografia liquida de alta eficincia (HPLC) 4.1.1 Condies cromatogrficas para a determinao dos hormnios em estudo
17-etinilestradiol - fase mvel: acetonitrila e gua ultrapura (50:50), 10 min, C-18 (Zorbax SB 4,6 x 250 mm, 5 m, Agilent Technologies) FLU
excitao: 230 nm; emisso: 306 nm, tempo de reteno: 8 min
Levonorgestrel - fase mvel: acetonitrila e gua ultrapura (50:50), 25 minutos, C-18 (Zorbax SB 4,6 x 250 mm, 5 m, Agilent Technologies) DAD
240 nm, tempo de reteno: 17,5 min
17estradiol - fase mvel: acetonitrila e gua ultrapura (60:40), 10 min, coluna PAH (LiChrospher PAH, 250 x 4,6 mm, 5 m, Agilent Technologies), no
apresentou reprodutibilidade com a coluna C-18 (Zorbax SB 4,6 x 250 mm, 5
m, Agilent Technologies). FLU excitao: 230 nm; emisso: 306 nm, tempo
de reteno: 4,5 min
Condicionamento da coluna SPE utilizando bomba vcuo, o condicionamento da coluna se d com 6 mL de hexano, seguido de 2 mL de
acetona, 6 mL de metanol e 10 mL de gua ultrapura pH 3.
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37
4.1.2. Validao do mtodo para determinao dos hormnios em estudo A validao do mtodo seguiu as recomendaes descritas na Resoluo - RE 899 da AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA (ANVISA)
(ANVISA, 2003). Nesta etapa todas as amostras foram preparadas com gua de
nascente e adio do analito em questo, ou seja, o padro dos hormnios foi
adicionado gua de nascente filtrada completando o volume de 200 mL. Aps
isso, a amostra sempre era extrada por SPE e analisada por HPLC/FLU/DAD.
A gua de nascente foi considerada como a matriz isenta dos hormnios
17-estradiol, 17-etinilestradiol e levonorgestrel. As etapas foram procedidas da
seguinte maneira:
Seletividade: A matriz utilizada pode conter interferentes, a seletividade avalia o grau dessa interferncia, que pode ser oriunda de outra substncia,
produtos de degradao, compostos similares, etc. (ARAUJO, 2006). Nessa etapa foi analisada uma amostra do branco, ou seja, a matriz sem o analito e
uma amostra com o analito, ou seja, gua ultrapura com o analito, ambos nas
mesmas condies cromatogrficas.
Limite de deteco (LD) e quantificao (LQ): O limite de deteco a indicao da quantidade mnima que pode ser detectada, entretanto esse valor
no necessariamente exato. O limite de quantificao o mnimo possvel de
ser quantificado, tendo como resultado um valor exato (LANAS, 2004). Nessa
etapa foram preparadas diferentes concentraes do analito adicionado a gua
de nascente. O limite de deteco deve ser de duas a trs vezes maior do que o
rudo, j o limite de quantificao tem que ser no mnimo cinco vezes maior que
o rudo.
Limite Inferior de quantificao (LIQ): Sabendo-se a concentrao do limite de quantificao (LQ) prepararam-se cinco amostras diferentes da mesma.
Havendo preciso e exatido dentro dos limites aceitveis, ou seja, preciso de
at 20% e exatido de 80 a 120%, admite-se esse valor como limite inferior de
37
38
quantificao (LIQ). Se no houver preciso e exatido aceitveis deve-se
aumentar a concentrao at obter os resultados considerados aceitveis.
Linearidade: A linearidade corresponde competncia do mtodo em dar resultados diretamente proporcionais concentrao da substncia em exame,
dentro de uma determinada faixa de aplicao. O intervalo de trabalho expressa
a faixa entre a menor a maior concentrao dos padres usados na construo
do grfico de calibrao (BRITO et al., 2001).
A curva de calibrao foi determinada utilizando-se seis concentraes
diferentes, sendo que para cada concentrao foram feitas trs amostras. Para
que a curva fosse aceita o LIQ deve ter desvio de at 20% comparado com a
concentrao nominal e para as outras concentraes desvio de at 15%; e
coeficiente de correlao linear deve igual ou superior a 0,98.
Preciso e exatido: A preciso de um mtodo demonstrada quando uma mesma amostra analisada varias vezes e os resultados so prximos
entre si; e a exatido de um mtodo demonstra a sua competncia de obter
resultados prximos ao valor real (BRITO et al., 2001). Foram feitas cinco concentraes diferentes abrangendo as concentraes baixa, mdia e alta.
Para cada concentrao foram preparadas cinco amostras, as quais foram
extradas e analisadas. Essa etapa foi repetida duas vezes em dias diferentes
para determinar a preciso e exatido intra-corrida e inter-corridas, sendo que o
desvio ou coeficiente de variao deve ser de at 15% para todas as
concentraes, menos para o LIQ que admitido at 20%, e a exatido deve
estar entre 80 a 120%.
Recuperao: Esta etapa indica a eficincia da extrao dos hormnios estudados atravs da tcnica de extrao por fase solida (SPE) (BRITO et al.,
2001). Nesta etapa prepararam-se cinco solues de concentrao diferentes
abrangendo novamente, concentrao baixa, mdia e alta, e para cada
concentrao fez-se trs amostras, que posteriormente foram extradas e
analisadas. Foram feitas tambm cinco solues de concentrao diferentes, e
para cada concentrao fez-se trs amostras, que no foram extradas por SPE,
38
39
ou seja, foram injetadas diretamente no HPLC/FLU/DAD. Os resultados obtidos
das amostras, que devem ser precisos e exatos, com extrao e sem extrao
por SPE foram comparados.
4.2 Identificao e quantificao dos hormnios sintticos 17-etinilestradiol e levonorgestrel e do hormnio natural 17-estradiol e de amostras de gua do rio Paraba do Sul A quantificao dos hormnios sintticos 17-etinilestradiol e
levonorgestrel, e do hormnio natural 17-estradiol foi feita de acordo com as
normas da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA, 2003) Resoluo -
RE n 899, de 29 de maio de 2003, modificando-a para uma anlise utilizando-se
gua e esgoto como matriz.
Aps a coleta e devido armazenamento da gua do rio Paraba do Sul,
municpio de Pindamonhangaba, nos pontos 1 e 2 as amostras congeladas
foram transportadas em caixas termicamente isoladas ao municpio de So
Carlos. A continuao dos procedimentos ocorreu no Laboratrio de Qumica
Analtica Aplicada a Medicamentos e a Ecossistemas Aquticos e Terrestres, do
Instituto de Qumica de So Carlos, na Universidade de So Paulo, em So
Carlos.
O procedimento adotado para a utilizao das amostras foi o
descongelamento das mesmas, seguido por um processo de filtrao com
membrana de acetato celulose (0.45 m) e auxlio de uma bomba de vcuo,
para a remoo de partculas solidas em suspenso.
Aps a filtragem, o mtodo analtico utilizado para a extrao,
concentrao e quantificao dos hormnios nas amostras foi a extrao em
fase slida (SPE) e cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC), A extrao e
concentrao dos hormnios estudados ocorreram atravs de uma fase slida
(SPE), com cartuchos C18 (Accu BondR II cartridge Agilent Technologies, West
Lothan, UK), como representado na Figura 4.
39
40
De acordo com a ANVISA, a validao deve garantir, por meio de estudos
experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes analticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar
preciso, exatido, linearidade, limite de deteco e limite de quantificao,
especificidade, reprodutibilidade, estabilidade e recuperao adequadas
anlise. Todos estes requisitos foram realizados para a validao da
metodologia modificada.
Figura 4 - Cartucho empregado na extrao em
fase solida (SPE) (Fonte: FALONE, 2007)
40
41
4.3 Coletas das amostras de gua no rio Paraba do Sul
As coletas no rio Paraba do Sul foram feitas em dois pontos localizados
na rea urbana do municpio de Pindamonhangaba / SP. O ponto1 localiza-se
prximo rea de captao de gua para abastecimento pblico do municpio
(Figura 5 a 8), (coordenadas UTM 45 16 60.94 m E, 74 66 11 1.14 m S).
O ponto 2 encontra-se aproximadamente 2,5 km jusante em relao ao
ponto 1 e coincide com o local de descarte da estao de tratamento de esgoto
do municpio de Pindamonhangaba (coordenadas UTM 45 25 07.00 m E; 74 66
12 9.00 m S) (Figura 9 a 11).
Figura 5 - Pontos de coleta de gua no rio Paraba do Sul para realizao de teste crnico
com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 1- estao de captao para abastecimento pblico (Sabesp) Ponto 2- local de despejo de efluente da estao de tratamento de esgoto
41
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Figura 6 - Imagem do ponto de coleta de gua no rio Paraba do Sul para realizao
de teste crnico com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 1- estao de captao para abastecimento pblico (Sabesp)
Figura 7 - Ponto de coleta de gua no rio Paraba do Sul para realizao de teste
crnico com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 1- estao de captao para abastecimento pblico (Sabesp). Foto: Guilherme Casoni da Rocha.
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Figura 8 - Ponto de coleta de gua no rio Paraba do Sul para realizao de teste
crnico com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 1- estao de captao para abastecimento pblico (Sabesp). Foto: Guilherme Casoni da Rocha.
Figura 9 - Foto area aproximada do ponto de coleta de gua no rio Paraba do Sul
para realizao de teste crnico com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 2- local de despejo de efluente da estao de tratamento de esgoto.
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Figura 10 - Pontos de coleta de gua no rio Paraba do Sul para realizao de teste
crnico com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 2- local de despejo de efluente da estao de tratamento de esgoto. Foto: Guilherme Casoni da Rocha.
Figura 11 - Pontos de coleta de gua no rio Paraba do Sul para realizao de teste
crnico com espcie de peixe padronizada (Danio rerio) mantido em laboratrio e coleta de amostras de gua. Ponto 2- local de despejo de efluente da estao de tratamento de esgoto. Foto: Guilherme Casoni da Rocha.
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45
As coletas foram feitas com o auxilio de baldes amarrados com cordas, e
em todos os dias de coleta, a mesma, ocorreu no perodo da manh (8 - 9 horas)
(Figura 12 e 13). Logo em seguida coleta com baldes, a gua foi armazenada
em gales e encaminhada imediatamente ao laboratrio, onde as amostras
foram filtradas. Parte dessa gua foi prontamente utilizada para a realizao dos
testes toxicolgicos em aqurios com exemplares de Danio rerio, e parte foi
congelada e armazenada para ser posteriormente analisada quanto s
concentraes de hormnios.
Figura 12 - Coleta de gua dos pontos 1 e 2, com auxilio de balde e armazenamento em
gales. Foto: Guilherme Casoni da Rocha.
Figura 13 Material utilizado para a coleta de gua dos pontos 1 e 2 ocorreu
com auxilio de balde e armazenamento em gales. Foto: Guilherme Casoni da Rocha.
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46
4.4 Testes com Danio rerio 4.4.1 Aclimatao dos exemplares de Danio rerio utilizados nos testes com gua do rio Paraba do Sul
Foram utilizados tanto nos ensaios in situ, quanto nos ex situ exemplares
de Danio rerio adquiridos junto a um produtor comercial de peixes ornamentais.
Os 300 animais (aprox.) adquiridos para cada um dos trs perodos de teses
eram do mesmo lote e ficaram em aclimatao por um perodo de 15 dias
antes de serem utilizados nos experimentos. Os animais foram mantidos em um
tanque contendo gua desclorada e recebendo rao comercial Tetra duas
vezes ao dia (manh e tarde).
4.4.2 Teste crnico in situ com Danio rerio em tanques rede mantidos no rio Paraba do Sul Foram feitos testes crnicos utilizando-se exemplares de Danio rerio
introduzidos nos Ponto 1 e 2 do rio Paraba do Sul, atravs da utilizao de
tanques-rede (Figura 14). Os testes foram feitos em 3 perodos, Teste 1 durante
o ms de dezembro, Teste 2 em abril e Teste 3 durante julho. Em cada um dos
experimentos foram utilizados 30 exemplares da D. rerio, sendo 15 machos e 15
fmeas. Os animais foram mantidos durante 21 dias nestes tanques rede,
consumindo alimento natural vindo da gua. Ao final deste prazo os peixes
foram anestesiados (banho em benzocana 4%), medidos e pesados, e
imediatamente congelados (COBEA, 1991). Para as anlises de VTG, foram
feitos extratos dos peixes, como descrito por Rose et al. (2002). Os peixes foram
macerados individualmente em soluo tampo sob refrigerao (50mM Tris-
HCl; pH 8,0; 0,02% Aprotinina, 0,1 mM PMSF) e em seguida centrifugados
5000xg por 60 min a 4oC. O sobrenadante foi armazenado a -70oC at o
momento das anlises.
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Figura 14 - Tanque rede utilizado no teste crnico in situ com Danio rerio mantidos no rio Paraba do Sul, municpio de Pindamonhangaba (Ponto 1). Foto: Guilherme Casoni da Rocha.
4.4.3 Teste crnico ex situ com espcie de peixe padronizada (Danio rerio)
O local que em que ocorreu o teste crnico ex situ utilizando-se a espcie
Danio rerio como modelo foi o laboratrio do Setor de Aquicultura do Polo
Regional Vale do Paraba (Agencia Paulista de Tecnologia dos Agronegcios,
Secretaria de Agricultura e Abastecimento). Os testes foram realizados
concomitantemente ao teste crnico com tanques rede (Teste 1- dezembro;
Teste 2- abril e Teste 3- julho.
Para a realizao dos testes foram utilizados aqurios de vidro com
capacidade de 10 litros. Foram testadas 5 diferentes condies (tratamentos) de
gua nos aqurios, sendo os seguintes grupos:
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1- grupo controle: gua desclorada (controle)
2- captao para abastecimen
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