View
32
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Bidang Ilmu: Peternakan . '... .,. - . .. ~ . . ~ ~
LAPORAN HIBAH KOMPETITIF PENELITIAN SESUAI PRIORITAS NASIONAL
TEMA: KETAHANAN PANGAN
JllDUL PENELITIAN
Potensi Protein Spesifk Susu kambing sebagai Irnmunomodulator dan Immunogen: Upaya Pengembangan
Pangan Nutrasetika. 1 ~ 9 " 4 3 8
Peneliti Utama: drh.Masdiana Padaga. MAppSc
Anggota PeneIiti: 1r.Manik Eirry Sawitri. MS Dr. Sri Murwani, drh.MP
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG
NOVEMBER 2009
HALAMAN PENGESAHAN LAPORAN PENELITIAN HIBAH BERSAING
I. Judul Penelitian
2. Ketua Peneliti a Nama Lengkap dan Gelar b. Jenis Kelamin c. NIP d. Jabatan Fungsional e. Jabatan Strukhlral
f. Bidang Keahlian g. FakultaslJurusan h. Perguruan Tinggi
: Potensi Protein Spesifik Susu kambing sebagai fmmunomodulator dan Immunogen: U P ~ Y ~ Pengembangan Pangan Nutrasetika.
: drh.Masdiana Padaga M.App.Sc. : P : 19560210 198403 2001 : Lektor Pembina tkllIII-c : Staf pengajarlpeliti
Fakultas Peternakan UB : Teknologi dan Mikrobiologi Pangan : PetemakaruTeknologi Hasil Ternak : Universitas Brawijaya, Malang
3. Pendanaan dan jangka waktu penelitian a Jan& Waktu penelitim yang diusulkan : 8 bulan b. Biaya Total yang diusullcan Tahun 1 : Rp. 98.460.000,-
Tahun 2 : Rp. 97.700.000,- c. Biaya yang disetujui tahun 2009 : Rp. 98.460.000,-
i. T i Peneliti
Malang, 30 Nopember 2009 Ketua Peneliti,
M'% drh.Mudina Padaga. MApp.Sc. NIP. 19560210 198403 2 001
Menyetujui, Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyankat Universitas Brawijaya Ketua,
PERGURUAN TMGGJ
Universitas Bmwijaya Universitas Bmwijaya
Prof. Dr. IT. Siti Chnzaemi, MS NIP.195305141980022001
FAKULTAWJURUSAN
Potarnmcknologi Hasil Ternnk Kedolaeran
- NAMA
' I . 1r.Manik Einy Sawitri. Ms 2. Dr. Sri M u m i , &. MP
BIDANG KEAHLIAN
Teknologi Susu
Biomedik
RINGKASAN Susu merupakan pangan nutmsetika alami yang mengandung bahan-bahan
bioaktiv terutama protein yang mempunyai manfaat penting untuk kesehatan. Diantara protein protein yang telah diidentifikasi, diketahui bahwa a-Lactalburnin dan Lactoferrin mempunyai fungsi sebagai immunomodulator. Pada penelitian ini dilakukan isolasi protein susu kambing dan dibandingkan dengan protein susu sapi untuk mengetahui apakah protein spesifik susu kambing mempunyai fungsi immunomodulator dan bersifat immunogen. Penelitian dilakukan selama 2 tahun melalui 4 tahap percobaan. Penelitian tahun 1 terdiri dari 2 tahap pcrcobaan meliputi (1) isolasi dan karakterisasi protein spesifik (PSI) Susu kambing dan (2) kajian potensi PSI sebagai immunomodulator menggunakan hewan coba.
IIasil penelitian mcnuqjukkan bahwa terdapat variasi kandungan protein susu dari berbagai sampel susu Kambing ( A,B dan C ) dan sampel susu Sapi. Campuran hasil elusi protein susu kambing diperoleh kadar protein yang cukup tinggi yaitu 51625 mg/Liter. Karakterisasi protein dari susu kambing dan susu sapi menggunakan metoda SDS-PAGE dapat diketahui bahwa susu kambing mengandung protein spesifik (PSI) susu yang berbeda dengan protein susu sapi dengan berat molekul36-55 kDa. Pengujian pada hewan coba diberi perlakuan artritis rematoid complete fieud adjuvant (CFA) clan enteritis membuktikan bahwa PSI 36-55 kDa dapat mengurangi peradangan pada jaringan tulang dan usus. Data ini dipe jelas dengan pengujian aktivitas SOD dan Kadar malondial dehida (MDA), dimana SOD meningkat dan kadar MDA jaringan menurun setelah mcndapat tcrapi Psl.
Berdasarkan hasil penelitian, dapdt disirnpulkan bahwa Protein spsiiik (PSI) susu kambing terbukti mampu mencegah proses peradangan, dapat berperan sebagai antiinflamasi dan antioksidan dan bcrfungsi scbagai imunomudulator. Hasil penelitian ini menjadi bahan informasi bahwa susu kambing mengandung kandidat imunomudulator yang digunakan sebagai antioksidan dan antiinflamasi.
SUMMARY
Milk is a natural nutraceutical food that contains bioaotive ingredients especially native pmtcin which is a great health %due. Pmtcin in milk which has been identified are Caseins (a, P and K), a-Lactalbumin, P-Lactoglobulin, Immunoglobulins A, M and G, Lactoferrin, Lactoperoxidase, and Lysozyme. Among these proteins, a-Laolalbumin and Lactoferrin has a special function as immunomodulator. In a milk-processed product, those components will have no function because of heating. Therefore, now there is a development of a new milk-processed product, which contains immunomodulator protein supplement in order to maintain milk function as a nutraceutical food that can the immune system. However, milk protein can also cause allergic reaction for some people. Therefore, to some extent consumers prefere to drink goat's milk as an alternative to cow's milk and it is believed that it can enhance health and cure some diseases. This calls for a scientific provc whether the main components of goat's milk especially protein h a an immunomodulator effect.
Research showed that goat's milk has an advantage compares to cow's milk in terms of health. Goat's milk contains 35% medium chain fatty acids. therefore it is safer to consume especially for the hyper-cholesterol. Goat's milk
protein also has an amino acid composition that is different to other mammalian milk and does not causes allergy. Goat's milk protein also enhances immunity because it contains irnmunomodulator protein. This is the importance of researches to study the potency of specific protein (PSI) in goat's milk as the immunomodulator so that it can be developed to nutraceuticd food.
'The objectives of this research are to study the protein profile of goat's milk compares to cow's's milk, to explore the potential of PSI in goat's milk as an immunomodulator, to prove that the antibody against PSI is specific and has a cross reaction effect with other sources so that it can be used in development of diagnostic kit for nutraceutical food quality.
This research is using experiment method and spanning for 2 years which divided into 4 stages of experiments methods. In ihc first year, 2 stages of the experiment is done, which are: (1) isolation and characterization of specific protein (PSI) in goat's milk compares to cow's milk and (2) potential review of PSI as an irnmunomodulator using rheumatoid arthritis and enteritis male white rat (Rarrus norvegicus). Goat's milk sample is taken from public f m s . Goat's milk is originated from 3 different goat (A.B.C) and sample taking is done duplex.
Experiment results shows that there is a variety of milk protein content from various goat's milk sample (A, B mld C) and cow's milk sample. The mix from goat's milk elution resulted in a high protein content of 51,625 mgL. This shows that protein isolates has fulfill the requirement to be used as bioactive molecule that will be tested as an anti inflammation and anti-oxidant. Using SDS- PAGE method showed that profile of protein of goat differ from cow's milk . it can be seen that goat's milk contain specific protein (PSI) milk with moleculer weight of 36-55 kDa. Next, using this electro elution technique, the protein is isolated and tested its potential as an immunomodulator. Test using experimental animal with arthritis rheumatoid complete Freud adjuvant (CFA) treatment showed that PSI 36-55 kDa is also has the function as an antioxidant, which can lessen inflammations, and as an irnmunomodulator, which is proven from the recovery of bone surface tested microscopically. This macroscopic and microscopic data is clarified with data of enzyme superoxide dismutation (SOD) activity as a scavenger radical, where the PSI therapy enhances the SOD tissue activity. This result proved that goat's milk PSI has the function as an antioxidant by radical scavenger.
The rat induction with indomethacin 15 mgkg BW causes enteritis. The microscopic result @athologyanatomic/PA) showed tissue repairing after PSI therapy in duodenum, jejunum and ilium, which has been damaged because of enteritis. This data is clarified by activity of SOD and Malone Dialdehide (MDA) contain, where the SOD is increased and MDA content is less after PSI therapy. This proved that PSI also has an antioxidant, anti-inflammatory and imunomodulator.
Based on the experiment results, can be concluded that the specific protein (PSI) from goat's milk can prevent inflammation, has an antioxidant and immunomodulator effect. The result of this research is an information that goat's milk is a candidate for immunomodulator which is used as an antioxidant and an ti-inflammatory.
Atas berkat R a k h a t Tuhan Yang Maha Pengasih dan PenyayangPami telah &pat menyelesaikan penelitian dan penulisan laporan penelitian yang bejudul :" Potensi Protein Spesifik Susu Kambing Sebagai Immunomodulator dan Immunogen : Upaya Pengembangan Pangan Nutraselika".
Benama ini kami mengucapkan banyak terima kasih kepada : 1. Di jen Pendidikan T~nggi, Departemen Pendjdikan Nasional, atas bantuan
dana gum Pelaksamn Kibah Kompetitif Penelitian ini. 2. Rektor Universitas Brawijaya yang telah memberikan sarana dan
prasarana dalam penyelesaian penelitian ini. 3. Ketua Lernbaga Penelitian clan Pengabdian Kepada Masyarakat,
Universitas Brawijaya dan staf dalam menyelesaikan administrasi penelitian ini.
4. Ketua Laboratorium Biokimia, Universitas Brawijaya d m staf yang telah membantu secara penuh &lam pelaksanaan penelitian ini.Tak lupa ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Merri Budimi S dan Arisanti A
5. Happi Wahyu R dan Halima T, mahasiswa Program Studi Teknologi llasil Temak, Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya serta semua pihak yang telah membantu dalam penelitian ini yang tak dapat kami sebutkan.
Penelitian tahun peitama ini belumlah dapat dikatakan sempurna oleh karena itu kami harapkan penelitian ini *at berlanjut dengan penelitian hhun kedua, dan sumbang saran yang bersifat membangun kami harapkan.
Peneliti
DAFTAR IS1
......................................................................... HALAMAN PENGESAHAN i . . ................................................................. RINGKASAN DAN SUMMARY I I
.................................................................................................... PRAKATA iv
DAFTAR IS1 ................................................................................................ v . . ....................................................................................... DAFTAR TABEL VII ... .......................................... .................................... DAFTAR GAMBAR ... VIII
BAB I . PENDAHULUAN ....................................................................... 1 2.1. Latar Belakang ......................................................................... I . . 2.2. Urgensi Penelltlan .................................................................... 2
BAB II . TINJAUAN PUSTAKA .................................................................. 4 2.1. Fungsi Immunomodulator Protein Susu .................................. 4 2.2. Susu Kambing sebagai Pangan nutmetika ................... ...... 6
BAB 111 . TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN ............................... 8 3.1. Tujuan ........................................................................................ 8 3.2. Manfaat ..................... ......... .................................................... 8
............................................................... . BAB 1V ME'TODE PENELI'TIAN 9 4.1. Rancangan (Desain Riset) .................................................... 10
.................. 4.2. Metoda Percobam Tahun 1 ............................ .. 10 .................................................. . 4.2.1 Bahan dan Peralatan 10
4.2.2. Percobaan Tahap 1 .................................................... 11 4.2.2. I . Isolasi Protein Susu ..................................................... 11 4.2.2.2. Karakterisasi dan [den t i fh i Protein
............................................. susu dengar1 SDS-PAGE 12 4.2.2.3. Isolasi Protein spesifik (Psi) susu dengan
..................................................... l'eknik Elektroelusi 13 4.2.3. Tahap 2 ...................................................................... 15 4 2.3.1. Uji potensi PSI susu kambing sebagai
.................................................... immunomodulator 15 4.2.3.2. Pengukuran aktivitas superoksida dismutase
(SOD) jaringan ........................................................ 16 4.2.3.3. Pengukuran kadar MDA jaringan ............................... 16 4.2.3.4. Pemcriksaan I listopotologi ....................... .. .......... 18
BAB V . IIASIL DAN PEMBAHASAN ............................................. 19 5.1. Isolasi protein susu sapi dan susu karnbing ............................ 19 5.2. Karakterisasi d m identifikasi Prolein susu
dengan SDS-PAGE ................................................................. 19 5.3. Isolasi Protein spesifik (PSI) susu dengan
Teknik Elekiroelud ................................................................. 21 5.4. Uji potensi PSI susu kambing sebagai
Immunomodulator ................................................................... 21 5.4.1. Imunomudulator pada Artitis Mematoid ............................. 21 5.4.2. Imunomudulator pada Enter~tis ............................................ 24
................... BAB VI . KESIMPULAN DAN SARAN ....... ..................... ., 27
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 28
DAmAR TABEL
. . .................................................................. 2.1 Fungsl blologis protein susu 4 2.2 Peptida bioaktif dalam protein suw dan hngsinya .................................. 5 2.3 Beberapa aktivitas immunomodulator protein susu ................................ 6 5.1 Konsentrasi Protein Sarnpel ................................................................... 19 5.2 Hasil berat molekul pada pita (kDa) ...................................................... 21 5.3 Aktifivitas SOD .................................................................................... 24 5.4 h d a SOD pada Tikus Kontrol . Enteritis dm Terapi .......................... 26 5.5 Kadar malondial dehida Tikus Enteritis ................................................ 26
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
4.1 Bagan Rancangan Penelitian Tahun Ke l : Isolasi dan Karakteriasi Protein spesifik Susu
................... kumbiny. I lusil : I'rolcin bposilik in~~nunor~~odulutor (I'sl) I U ................................................................... 4.2 Metode isolasi protein susu 12
.................... 4.3 Metode analisis profil protein menggunakan SDS-PAGE 13 4.4 Metode lsolasi Protein spesifik (Psl) susu dengan
............................................................................... Teknii Elektroelusi 14 . . ............................................................ 4.5 Pembuatan tikus artnt~s adjuvan 15 ................................................................... 4.6 Skema penelitian enteritis 16
......................... 4.7 Metode pengukuran MDA pada jaringan periartikuler 17 .................................................................... 5.1 Hasil elektroforesis protein 20
5.2 Kaki tikus sehat (kontrol) ...................................................................... 22 5.3 Kaki tikus artritis .................................................................................. 22 5.4 Kaki tikus yang telah diterapi ................................................................. 22 5.5 Perbandingan makroskopis kaki tikus
............................................................. (kontrol, sakit dan pasca terapi) 23 5.6 Hasil . PA jaringan Periartikuler Sendl ................................................. 23 5.7 Perbandingan gambar duodenum, jejenum. ileum, pada tikus
......................... kontrol, enteritis dan pasca terapi secara rnikroskopis 25
BAB l PENDAHULUAN
Adanya perubahan gaya hidup dan pola makan masyarakat yang lebih
memperhatikan kesehaian, memberi dampak pada indusbi pangan yaitu
berkembangnya produk pangan dengan label "pangan nutrasetika" yang diyakini
dapat memberikan efek pada kesehatan. Salah satu aspek kesehatan yang dapat
diperoleh melalui konsumsi pangan nutrasetika adalah meninpkatkan sistem
kekebalan tub& . Susu mempakan pangan nutrasetika alami ymg mengandung bahan-bahan
bioaktiv terutama protein yang mempunyai manfaat penting untuk kesehatan.
Protein susu yang sudah diidentifikasi meliputi Caseins (a, P and K), a-
Lactalbumin, P-Lactoglobulin, Immunoglobulins A, M and G, Lactoferrin,
Lactoperoxidase, dan Lysozyme. Diantara protein-protein tersebut, a-Lactalbumin
dan Lactoferrin rnempunyai fungsi sebagai immunomodulator. Pada produk
olahan susu, komponen tsb akan rusak karena pemanasan sehingga saat ini telah
berkembang pmduk olahan susu yang diberi suplementasi protein
immunomodulator untuk dapat memperbbmkan h g s i susu sebagai pangan
nutrasetika terutama untuk meningkatkan atau mempertahankm sistim immun.
Disisi lain protein yang terdapat dalam susu sapi dapat menyebabkan reaksi alergi
bagi orang-orang tertentu. Hal ini menyebabkan konsumen memilih susu kambing
sebagai altematif pengganti susu sapi bahkan diyakini dapat meningkatkan
keschatan dan menyembuhkan beberapa penyakit. Hal ini tentlmya perlu
pembuktian secara ilmiah tentang kompnen-komponen terutama protein d a l m
susu kambing yang mempunyai efek immunomodulaior.
Beberapa hasil penelitian melaporkan bahwa susu kambing memilki
keunggulan dibandingkan susu sapi temtama ditinjau dari aspek kesehatan. Susu
kambiig mengandung 35% lemak ranw sedang (medium chain fatty acids)
sehingga aman dikonsumsi terutama bagi penderita hiperkolesterol. Selain itu
protein susu kambing memiliki komposisi asam amino yang berbeda dengan susu
dari mamalia lainnya dan tidak menyebabkan reaksi alergi. Protein susu kambing
juga dapat meningkatkan immunitas karena mengandung protein yang bersifat
immunomodulator. Berdasarkan pada ha1 tersebut maka pada penelitian ini akan
dipelajari fungsi protein spesifik (PSI) yang terdapat dalam susu kambing sebngai
immunomodulator dan apakah PSI bersifat immunogenik, sehingga dapnt
digunakan sebagai dasar untuk pengembangan pangan nutrrlsetika.
1.2. Urgensi Penelitian
Saat ini kepercayaan konsumen terhadap manfaat pangan nutrasetika
sangat tinggi. Hal ini terbukti dengan semakin berkernbangnya industri-industri
pengolahan pangan hgsional dan nutrasetika Mrususnya berbasis susu. Pada
umumnya pangan fungsional berbasis susu dipmduksi meialui proses fementasi.
Selma proses fermentasi tejadi biosintesis kberapa senyawa bioaktif dari
peptida-pepticla dan eksopolisakarida. Senyawa-senyawa tersebut telah terbukti
memberikan efek terhadap kesehatan, meskipun mekanismenya belum
sepenuhnya diteliti. Dampak positip yang dapat diperoleh dari fenomena
tersebut, temtama di Indonesia adalah adanya perubahan pola konsumsi yang
mulai memilih pangan yang diyakini dapat memberikan efek kesehatan.
Da lm periode 10 tahun terakhi~, industri petemakan kambing penghasil
susu mulai berkembang karena susu kambig diyakini mempunyai berkgai
manfaat kesehatan antara lain sebagai anti kanker, anti infeksi, dapat
meningkatkan kekebalan, menunmkan kolesterol dan anti alergi. Bebempa
penelitian menunjukan bahwa terdapat perbedaan komponen nutrisi terutama
lemak dan protein pada susu sapi dan susu kambing. Hal .hi kemungkinan yang
menyebabkan susu kambing mempunyai bebempn keunggulan d iband i i an susu
sapi dan konsumen lebii menyukai minum susu kambiig tanpa dipanaskan atau
diolah.
Untuk &pat membuktikan bahwa susu kambiig mempunyai komponen
bioaktif terutama protein spesifik yang mempunyai fungsi immunomodulator
(Psl) sehingga &pat dikembangkan sebagai m b e r pangan nutrasetika maka
sangat penting untuk dilakukan penelitian melalui isolasi clan kaTakterisasi protein
dari susu kambing dan dilanjutkan dengan uji biologis menggunakan hewan coba
tikus (Rarlus nomegigus, galur wistar) yang telah diberi perlakuan menjadi
artritis, dan asrna IJntuk mengetahui apakah PSI bersifat immunogenik maka
perlu dilakukan uji spesifisitas dan reaksi silang dengan komponen protein lain.
J i i penelitian ini dapat membuktikan hipotesa tersebut maka antibodi PSI dapat
dikembangkan sebagai M a n untuk deteksi komponen protein spesifik pada susu
sebagai pangan nutrasetika Pada akhir penelitian diharapkan dapat dihasilkan
data komponen bioaktif susu kambing sebagai immunomodulator dan kit
diagnostik untuk pengujian kualitas pangan nutrasetika.
BAB I1 TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Fungsi Immunomodulator Protein Susu
Susu dad ternak nuninansia terutama susu sapi merupakan bahan pangan
yang memberikan konbibusi cukup besar terhadap keseimbangan nubisi dalam
diet. Komponen utama susu sapi adalah air, laktosa (4,8%), protein (3,2%), lemak
(3,7%) nitrogen non protein (1,9%) dan abu (0,7%). Protein utama yang terdapat
pada susu sapi adalah kasein (go%), whey, dan imunoglobulin. Ketiganya berbeda
s e r a fisiologis dan biologis. Protein whey terdiri dari ldctalbumin dan
laktoglobulin (70-80%) dan sisanya adalah imunoglobulin, glikomakropeptida,
serum albumin, laktoferin, dan berbagai enzim. Fungsi biologis protein susu dapat
dilihat pada Tabel 2.1.
Tabel 2.1. Fungsi biologis protein susu
I laktoferin 1
Protein K k i (a, p, dan k) a-laktalbumin
P-Laktoglobulin Imonoglobulii A, M, danG Glokomakropeptida Laktoferin
- Laktoperoksidase Lisosim
Komponen protein pada susu memiliki beberapa fungsi antara lain
menyediakan asam amino yang dibutuhkan tubuh untuk pertumbuhan dan
perkembangan, selain itu protein susu juga berfungsi sebagai sumber utama
peptida-peptida bioaktif. Peptida bioaktif terbentuk melalui proses hidrolisis
protein secara e nzimatis pada saluran p n c d a n atau karena adanya aktifitas
proteolitik dari bakteri asam taktat yang terdapat dalam usus. Jenis peptida yang
dihasilkan selama proses pencemakan swu tergantung pada proses hidrolisis yang
terjadi dan memilii fimgsi yang lebih spesifk dibandingkan dengan protein.
Fungsi biologis Karier zat besi (Ca, Fe Zn, Cu) Sintesis laktosa dalam kelenjar susu, karier Ca, imunomodulator, antikarsinogenik Karier retinol, mengikat asam lemak, antioksidan Pelindung sistem imun
Antiviral, antibakteri, bifidogenik Mengikat toksin, antimikroba, antiviral, imunomodulator, antilrarsinogenik, antioksidan Anthikrobial Antirnikrobial, sinergis dengan imunoglobulin dan
Sebagian besar peptida tersebut dapat bertahan dalam saluran pencemaan. Tabel
2.2, menunjukkan beberapa peptida bioaktif dan hgsinya.
Tabel 2.2. Peptida bioaktif dalarn protein susu dan fungsinya
Efek terhadap sistem immun secara m u m disebabkan adanya komponen
bioaktiv dalam susu seperti protein whey, kasein, honnon clan faktor pertumbuhan
(Gill, 2000; Cross and Gill, 2000). Sifat-sifat biologis protein susu atau peptida
yang berasal dari protein susu meliputi aktivitas antibakterial (lactofenin),
assimilasi nutrien, regulator h g s i fisiologis. Pada susu juga terdapat hormon,
prolaktin, dan analog yang berperan dalarn perkernbangan jaringan dan organ
serta sebagai imunomodulator.
Beberapa penelitian yang sudah dilakukan selama periode 10 tahun
t e d rnelalui ident i fh i dan karakterisasi komponen susu yang dapat
mempengaruhi fungsi sistem immun menunjukkan bahwa komponen yang paling
berpemn adalah protein ssusu (Gill et al. 2000). Secara in vilto a, P, dad x casein,
whey protein, lactofenin, dan endogenus Igg susu terbukti dapat rnemoduIasi
prolifersi limfosit. Efek ini &pat te jadi pada beberapa spesies ruminan dan non
ruminan. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa potensi immunornodulator
protein susu secara filogenetik tidak terbatas, narnun terdapat variasi pada
penganh antar species (Martin el al. 2000). Caseinophosphopeptides (CPPs)
dilaporkan mempunyai efek antihipertensi. Anticames clan antialergi (Fitzgerald
et al. 2003). Percobaan secara in vivo pada hewan coba tikw menunjukkan bahwa
derivat a-casein, isracidin, dapat mencegah infeksi Staphylococcus aureus (Gill el
a1.2000). Rotein susu juga terbulrti &pat meningkatkan respon antibodi mucosal
terhadap pemberian antigen dan vaksin secara per oral. Percobaan ini dilakukan
menggunakan hewan coba tikus ymg diberi ovalbumin, toksin kholera, toksi
polio dan vaksin flue (Gill et al., 2002% b, c, d; Low et a l , 2001). Beberapa
aktivitas immunomodulator protein rusu secara lengkap disajikan pada Tabel 2.3.
Tabel 2.3. Beberapa aktivitas immunomodulator protein susu
Sumber : (Gill et 81.2000)
Protein as1 casein Isracidin
2.2. Susu Kambiag sebagai Pangan nutrasetika
Pangan nutmsetika didefinisikan sebagai pangan atau komponen pangan
yang dapat mernberikan manfaat kesehafan kepada konsurnen (Marriot, 2000).
Susu kambing sebagaimana halnya susu sapi mengandung komponen-komponen
yang telah terbukti mempunyai manfaat kesehatan (Haenlein, 2000). Menurut
McCullough (2003) kandungan laktosa dan protein susu kambing hampir sama
dengan susu sapi, namun terdapat perbedaan struktur dan protein immnologik.
Effek immunologis Limfosit proliferasi, pembentukan antobodi Proteksi terhadap infeksi bakteri dan kapang, limfosit
selain itu susu kambiig mengandung asam-asam lemak rantai sedang dan globuIar
lernak pada susu k d i g relatif lebih kecil dibandingkan lemak susu sapi.
Sebagai pangan nutrasetika susu kambing dapat memberikan solusi
terhadap penderita alergi terhadap susu sapi atau susu kedelai. Reaksi alergi
terhadap susu biasanya disebabkan oleh laktosa atau protein susu. hkhlburnin
dan kasein pada susu kamb'mg mempunyai struktur yang berbeda dengan susu
sapi sehingga tidak menyebabkan reaksi alergi pada bayi dan an&-anak yang
sensitive terhadap laktalbumin sapi (Lamothe et al., 2007). Susu sapi
mengandung as1 casein yang merupakan allergan utama sampai 33,7%
dibandingkan dengan susu kambiig yang hanya 3,9% (Tornotake et al, 2006) dan
p-casein sebagai antihiprknsi lebii tinggi pada susu kambing (Lamothe et al.,
2007). Namun perlu juga dipertimbangkan bahwa beberapa protein susu kambing
memberikan reaksi silang immunologis dengan protein susu sapi sehingga perlu
behti-hati dalam rnemberikan substitusi susu pada anak-an& dengan kelainan
sistem imrnun (McCullougb, 2003).
Hasil penelitinn menunjukkan bahwa terdapat perbedaan sifat fisiko-kimia
antara lemak susu karnbiig dan susu sapi. Menurut McCullough ( 2003) globula
lemak susu kambing relatif lebih kecil sehingga lebih mudah dicerna dan area
permuknan globula Iemak yang lebih luas pada m u kambing dapat
rneningkatkan aktivitas lipase pankreas. Tomotake et a[.,( 2006) melaporkan
bahwa jumlah total asam lemak rantai pendek dan sedang (C4, C6, C8 dan C10)
rnencapai 16,1 % - 19,7% pada susu kambing dibandingkan susu sapi yang hanya
5,8%. Susu kambing rnengandung asam palmitat (C16) lebih rendah dibandingkan
suSu sapi. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Alferez el al., (2003) dengan
hewan coba tikus, rnenunjukkan bahwa konsumsi susu kambing dapat
meningkatkan ketersediaan zink d m selenium. Dengan mempertimbangkan
beberapa karakteristik susu kambing diantaranya mudah dicerna, sumber energi
yang baik dan tidak menyebabkan alergi maka susu kambing dapat dimanfaatkan
sebagai sumber pangan nubasetika.
BAB 111
TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
3.1. Tujuan
Beberapa tujuan yang akan dicapai &ah :
I . Mengetahui profil protein susu kambing dibandingkan dengan susu sapi.
2. Mengekplorasi potensi protein spesifk susu kambing sebagai
immunomodulator (PSI)
3. Membuktiian bahwa antibodi terhadap PSI bersifat spesifik dan dapat
bereaksi silang dengan PSI surnber lain.
4. Membukrikan bahwa antibodi PSI dapat dikembangkan sebagai reagensi
untuk analisis clan deteksi bahan immunomodulator dalam susu sebagai dasar
pengembangan pangan fungsional.
5. Merancang kit diagnostik untuk pengujian kualitas pangan nutrasetika
3.2. Manfaat
Manfaat yang dapat diperoleh dari hasil penelitian addah
1. Memperoleh dasar ilmu berupa data profil protein susu kambing
2. Mendapatkan protein spesifik susu kambing yang berfungsi sebagai
immunomodulator (PSI)
3. Mendapatkan antibodi terhadap PSI yang akan dikembangkan untuk uji
adanya immunomodulator pada susu dan produk susu sebagai dasar
pengembangan pangan nutrasetika.
4. Menghssilkan kit diagnostik untuk pengujian kualitas pangan nutrasetika
5. Memberikan pertimbangan pada industri pangan berbasis susu untuk
pengembangan pangan nutrasetika berbasis susu sebagai upaya meningkalkan
manfaat susu dan produk olahan susu bagi kesehatan.
Pada akhir Tahun 1 akan dihasilkan profil protein spesitik susu kambing
yang mempunyai fungsi sebagai immunomodulator. Hasil Tahun I ini akan
dipublikasi pada jumal nasional atau internasional.
BAB IV METODE PENELITIAN
4.1. Rancangan (Desain Riset) :
Penelitian ini dilakukan dengan metoda percobaan yang akan dilaksanakan
selama 2 tahun melalui 4 lahap percobaan. Rangkaian percobaan pada penelitian
yang akan dilakukan selama 2 tahun ini akan rnenjawab beberapa pertanyaan
sebagai berikut :
1. Apakah terdapat perbedaan profil protein dalam susu sapi dan susu kambing?
2. Apakah protein spesifik (PSI) susu kambiig &pat berfimgsi sebagai
immunomodulator ?
3. Apakah PSI dari susu karnbing bersifat immunogenik?
4. Apakah antibodi hasil induksi PSI dari susu kambing bersifat spesifik dan dapat
bereaksi silang dengan protein spesifik yang ada pada susu sapi dan produk
olahan susu?
5. Apakah antibodi terhadap PSI dapat dikembangkan sebagai reagensi untuk
deteksi bahan immunomodulator untuk pengembangan pangan nutrasetika ?
Seluruh percobaan dilakukan dengan rancangan tahapan penelitian
sebagai berikut :
Pada tahun 1 telah dilakukan 2 tahap percobaan seperti dijelaskan pada Gambar
4.1 yaitu (1) isolasi dan karakterisasi protein spesifk (PSI) Susu karnbmg
dibandingkan dengan susu sapi d m (2) kajian potensi PSI sebagai
immunomodulator menggunakan hewan caba. Pada akhir tahun 1 dihasilkan
bahan immunomodulator berbasis protein spesifik susu kambig.
I Koleksi sampel susu (sapi dan kambing) I -
Isolasi Protein
ldentiikasi Profil Protein + pada hewan coba
Artritis, colitis dan asma
Gambar 4.1. Bagan Rancangan Penelitian Tahun Ke 1 : Isolasi dan Karakteriasi Protein spesifik Susu kambing Hasil : Protein spesifik Immunomodulator (PSI)
4.2. Metoda Percobaan Tahun 1
4.2.1. Bahan dan Petalatan
Bahan yang diperlukan adalah
Tius putih (Rattus nonegicus) wistar jantan umur 2 bulan berat 100-130
g (Lab Biologi Molekuler Seluler P.MIPA, Malang),
Buffer sitrat pH 4.5,
r Antibodi primer Rat Anti N O S (Santa cruz biotechnology),
Anhbdi selmnder Anti Rabbit IgG Biotin labelled,
w Pewarna Mayer Hematoxylen (Pierce), Eosin, Cromogen DAB (Santa cruz
biotechnology),
PBS (Phospat Buffer Saline),
PBS PMSF, Tris Ha, butmol, Dl (Deionized Water), Hidrogen Peroksida
(H202) 3% @ako,Inc), Aquades, Ethanol 7004 Ethanol SO%, Ethanol
90%, ethanol 95%, Ethanol Absolut, Xylol,
w Parafin, NaCl 0.9%, Entellan, Serum BSA (Bovine Serum Albumin)
(Sigma, USA), Aquades clan PBS-Tween.
Sedangkan peralatan yang di@makan arlalah sepemngkat alat gelas, sentrifuge,
sonikator, refigerator, ttlbung eppendorf, Sodium Dodecyl Sulphate-
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE).
43.2. Percobaan Tabap 1.
Isolasi dan Karakterisasi Protein spesifik (PSI) Susu sad dan Susu
kambiig.
4.2.2.1. Isalasi Protein Susu
Isolasi protein susu dilakukan dengan metoda Aulani'am (2005). Kedalam
-pel susu ditambahkan PBS PMSF 4 mM, kemudian dilakukan sonifikasi
selama 10 menit dan dilanjutkan dengan sentrihgasi pada 10.000 rpm selama 15
menit. Pelet yang diperoleh dilarutkan dalam Tris HC120 mM d m dishpan pada
suhu -20°C sampai siap untuk analisis selanjutnya. Pelet dithawing kemudian
diambil masing-masing s e h y a k 10 mikroliter secara duplo. Selanjutnya
ditambahkan Tds C1 sebanyak 800 rnikroliter clan ditambah biueret TABM
sebanyak 190 mkoliter kemudian divoltek 1 menit dilarjutkan dengan inkubasi
pada suhu 37" selama 30 menit. Selanjutnya diukur absorbansi masing- masing
sampel pada panjang gelombang 550 nm, pembacaan absobansi dilakukan duplo.
Untuk menghitung konsentrasi protein dihitung dengan menggunakan persamaan
garis dari kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin) Y=5.4663 l o 5 X. Metode
isolasi protein susu dapat dilihat pada Gambar 4.2.
200pL sampel
4 Dltambah PBS-Tween-PMSF eebanyak 8 x volume
1
I Diwnikasi 10 menit
4 DisenMhrs 6000 rpm selama 15 menit
presipitan L e l supematan
4 Ditambah etanol absolute dingin (1:l) I
I + Disimpan dalam refmenerator 12 iam
Dikeringanginkan hingga bau etanol hilang I
1 Ditambah tris-HCl pH 6.8 (1:1) I 4
Dlsimpan pada suhu -20'
Gambar 4.2. Metode isolasi protein susu (Aulani'am, 2005)
4.2.2.2. Karakterisasi dan Identifikasi Protein susu dengan SDS- PAGE
Protein hasil isolasi diidentifhi menggunakan SDS-PAGE (Aulani'am
2005). Kedalam alat SDS-PAGE masukkan running gel melalui dindiig sampai
kUrang dari batas atas, kemudian ditambahkan butanoll ml dan dibiarkan selama
25 menit. Setelah gel membeku, butanol d i b w g , dibersihkan dengan PBS, dan
dikeringkan dengan kertas saring Whotman . Selanjutnya dibuat stacking gel
melewati dinding sampai penuh, mtukkan comb dan ditunggu sarnpai
b e w - b e w set (25 menit). Selanjutnya comb diambii dan dibersihkan dari
sisa-sisa gel dengan larutan buffer. Isolat protein susu sebanyak 2,s p1 dicarnpur
dengan 17,5 p1 Tris HCI dan 20 pl RSB d m dipanaskan 100 '~ selama 5
menit. Selanjutnya 30 p1 dimasukkan kedalam summan gel. Alat dijalankan Jika
reaksi gel sudah sampai bawah kemudian dimatikan dan plate dibuka dan
dipisahkan. Gel yang diperoleh dicuci dengan larutan buffer clan hasilnya
divisualisasikan dengm pewmaan silver atau langsung ditransfer ke rnernbron
nifroselulose. Metode analisis profil protein menggunakan SDS-PAGE dijelaskan
pada Gambar 4.3.
I - dimasukkan dalam tabung mikm - dimbah dengan 20 pL RSB (perbandingan volume 1:l) - dipanaskan pada suhu 100°C sebma 7 menit pada waterbath - diding~n pada suhu ruang
- dlsuntlkkan ke dalarn 10 sumuren @ 30 pL - dilakukan runnlng dengan arus 28 mA, 128 V hingga warns biru berada 2 0,5 cm dari batas bawah plat gel
Gel hasil running ?l dalam lamtan staining sambil dikocok
menggunakan shaker selama 20 menlt direndam dalam larutan destaining sambil dikocok menggunakan shaker hingga pita pada gel tampak jelas
Pita-p~ta pada gel hasil elekmforesis + I I - ditentukan harga R, dan massa molekul relatifnya
masingmasing
Gambar 4.3. Metode analisis profil protein menggunakan SDS-PAGE (Aulani'am, 2005)
4.2.2.3. Isalaai Protein spesifik (PI) sosu dengaa Teknik Elektmelusi
Gel SDS-PAGE ymg tidak diwamai dipotong sepmjang pita yang
dikehendaki. Masing-masing potongan gel dimasukkan ke dalam kantong nilon.
Selanjutnya dimasukkan dalam block glass yang mengandung PBS, setelah itu di
stirer selama 24 jam. Sdap 6 jam dilakukan penggautian PBS. Untuk mengetahui
bahwa protein sudah mengalmi elusi maka potongan gel diwamai dengan
pewmaan silver, bila tidak terdapat pita artinya protein sudah ter-elusi. Metode
isolasi protein secara lengkap dapat dilihat pada Garnbar 4.4.
I Crude protein I v
I Dirunning elekbvforesis SDS Page 1
Pita target dipotong dan gel dipotong kecil-kecil L
r-- 6masukkan ke dalam tielofan I - - -
Dltarnbah buffer tosfat 0,2 M (2 mL) I Dimasukherl ke &Ism chembw elsk!roelu$i yang
berisi buffer fosfat 0.1 M &
Dielekmlusi 250 V, 20 mA, overnight suhu 4'
C supernatan
Dirnasukkan ke dalam tabung rnikro a750 pL 1.
Ditambah etanol dingin (1:l) L w
I Disirnwn overnight dalam refrigenerator I
Ditambah tris-C1 pH 6,8 (1:l) .L
I Disenhifue 10.000ivm 10 menit + .c f
I Disirnpan pada suhu -20' I Gambar 4.4. Metode Isolasi Protein spesifik (PSI) susu dengan Teknik
Elektroelusi (Aulani'am, 2005)
I supematan I pelet
+ dikeringanginkan
*
4.2.3. Tahap 2
4.2.3.1. Uji poteasi PSI susu kambing sebagai immunomodulator Pada penelitian ini fungsi immunomodulator diuji rnenggunakan hewan
model T i (Rattus norvegicw, galw wistar) umur 10 w p a i 12 minggu dengao
berat badan 150 g dan diberi perlakuan artritis rematoid complete fieud adjuvant
(CFA) dan enteritis. Skema pernbuatan artritis adjuvan dan skema penelitian
enteritis dengan induksi indomethacin dapat dilihat pada Gambar 4.5 d m Gambar
4.6. Selanjumya dilakukan terapi dengan PSI dan fungsi immunomodulator diuji
melalui pemeriksaan:
- rad'ial bebas yaitu pemeriksaan MDA (malonaldialdehid) dan SOD
(superoksid disrnutase).
- Histopatologis pada organ spesifik (persendim dan usus) dengan
rnenggunakan pewama Hematoxylen-Eosin (HE)
Tikus Wistar Jantan 10-12 Minggu I
1 Pisulltik CFA 0,l mL intrddermal pads panfzkal ekor 1
[ ~isunt ik CFA 0,l mL intrademal pada kaki kiri dan 1
Gejala artritis adjuvan E?zl Gambar 4.5. Pembuatan tikus artritis adjuvan
Kelompok Perlakuan - Pemberian PSI susu kambing
7% BB makanan sampai penelitian berakhir . Tanpa Pemberian PSI susu I T ]
+ Induksi enteritis dengao indomethacin 15 mgkg BB secara per
oral pada hari ke 7 setelah pemberian PSI susu kambing
Pemeriksaan MU& SOD, dao gambaran hispatologi jaringan usus kecil (duodenum, jejunum, ileum)
4 Pemeriksaan MDA, SOD, dan gambaran hispatologi jahgan
usus kecil (duodenum, jejunum, ileum)
Gambm 4.6. Skema penelitian enteritis
4.23.2. Pengukumn aktivitas superoksida dismutase (SOD) jaringan
Pengukuran SOD dilakukan secara spekcrofotometri pada panjang
gelombang 580 nm menggunakan reaksi warna sebagai indikator. Akfivitas
superoksida dismutase ditentukan dengan interpolasi kurva baku yang sudah
disiapkan terlebih dahulu (Laboratorium Biomedik, 2003).
4.233. Pengukunn kadar MDA jaringan
Pengujian MDA dilakukan dengan mengukur absorbansi menggunakan
spekmfotometer pada panjang gelombang 531 nm. Kadar MDA ditentukan
dengan interpolasi kurva baku (Laboratdum Biomedik, 2003). Mctode
pengukuran MDA pa& jaringan periartikuler dapat dilihat pada Gambar 4.7.
1 100 rngjaringan I
I Ditambah NaCl fis 200 I
Ditambah 550 pL aquades e trikloroasetat atau TCA 100%
Ditambah 250 pL HCI 1 N r z z = l 1 Ditambah 100 1L Na-thio 1
I Dihomogenkan dengan vorteks 1
I Dipanaskan dalam waterbath dengan suhu 100'C selama 20 (
Diangkat dan dibiarkan pada suhu
Disentrifugasi 500 rpm selarna 10 c + Diambil supernatant dan disaring dengan glass
I D l u k u r absorbansinya dengan spektrofotometer pada 53 1.8 nm 1 -- -
Gambar 4.7. Metode pengukuran MDA pada jaringan periartikuler
4.2.3.4. Pemeriksnan Histopntologi
Pada pembuatan sediaan histopatologi, jaringan h m s diftksasi terlebih
dahulu dengan tujuan untuk menghentikan proses autolisis pada sel yang
disebabkan oleh enzim pencemaan pada lisosim yang dilepaskan pada saat sel
mengalami kematian (Labomtorium Biomedik, 2004).
Pewnmaan Hemntoxylen-Eosin
Tahap awal dilakukan deparafiisasi preparat dalam xylol bertingkat 1-3
masing-masing selama 5 menit. Selanjutnya dilakukan rehidrasi preparat
menggunakan etanol beningkat mulai dari etanol 95, 90, 80 dan 70% masing-
masing selama 5 menit dan kemudian direndarn dalam aquades selama 5 menit.
Pewamaan preparat dilakukan menggunakan pewama hematoxylen selama 10
menit untuk mendapatkan hasil yang cukup baik. Selanjutnya dicuci dengan air
mengalir selama 30 menit, kemudian dibilas dengan aquades. Selanjuinya
preparat diiasukkan pada pewarna eosin alkohol selam 5 menit. Tahap
betikutnya adalah dehidrasi dengan memasukkan preparat pada seri etanol
bertingka! dari 80,90 dan 95% hingga etanol absolut 1-3. Selanjutnya clearing
dilakukan dengan memasukkan preparat pada xylol 1,2 dan dikeringanginkan.
Selanjutnya dilakukan mounting dengan entellan.
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1. Isolasi protein susu sapi dan susu kambing
Susu kambing dan susu sapi diperoleh dari peternakan rakyat. Susu
kambing dikoleksi dari 3 ekor kambig yang berbeda (A.B.C) dan pengambilm
sampel dilakukan duplo. Isolasi protein susu dilakukan dengan metoda Aulani'am
(2005). Data konsentrasi protein susu sapid an susu kambing seperti pada Tabel
5.1.
Tabel 5.1. Konsentrasi Protein Sampel
Tabel 5.1. menunjukkan bahwa terdapat variasi kandungan protein susu
dari berbagai sampel susu Kambing ( A,B dan C ) , sampel susu Sapi ( S) d m
hasil elusi. Pada carnpuran hasil elusi protein suw kanlbing diperoleh kadar
protein yang cukup tinggi yaitu 51625 mglliter. Hal ini rnenjelaskan bahwa isolat
protein memenuhi persyaratan untuk digunakan sebagai molekul bioaktif yang
akan diuji sebagai anti idamasi dan anti mdang.
5.2. Karaktcrisasi dan Ident i fh i Protein susu dengan SDS-PAGE
Sarnpel susu separti Tabel 5.1. selanjutnya dianalisis profil profeinnya
dengan SDS-PAGE, hasil elektroforesis protein susu dapat dilihat pada Gambar
5.1.
Iktsrnnman :
A : Kamblng 1
B : KamMng 2
C : Kamblng 3
s : say
M : marker pro(
Gambar 5.1. Hasil elektroforesis protein susu
Dari Gambar 5.1. dapat diketahui terdapat protein spesifik susu kambig
yang berbeda dengan protein susu sapi yaitu pada berat molekul36-55 kDa. Hasil
perhitungan berat molekul @a) pada pita dapat dilihat pada Tabel 5.2. Protein
spesifik susu lambing dengan berat molekul 32 kDa dan 61.4 kDa ti&
ditemukan pada susu sapi. Demikian juga pmtein spesifik susu sapi dengan berat
molekul 19.3; 30,l; 66,8 dan 86,O kDa tidak ditemukan pada susu kambing. Hd
ini menunjukan bahwa susu sapid an susu kambing mengandung potensial protein
spesifik yang &pat diembangkan rnenjadi m b e r pangan nutmsetika. Pada
percobaan selanjutnya, dilakukan isolasi prokin spesifik (PSI) susu kambing
dengan teknik elektroelusi untnk menguji fungsi imrnunomodulator PSI.
Dari Tabel 5.2 dapat diketahui bahwa pada pita protein susu kambig ke-
3,5,9,12 tidak terdapat pada pita protein susu sapi. Sedangkan pada pita protein
susu sapi ke-6 d m ke-8 tidak terdapat pada pita protein susu kambinng. Menurut
Lamothe et a/., (2007) protein susu kambing mempunyai struktur yang berbeda
dengan susu sapi. Susu sapi mengandung a s 1 casein lebih tin& dibandingkan
susu sapi (Tornotake et al., 2006) dan sedangkan p-casein yang mempuriyai fimgsi
antihiperkmi lebih tinggi pada susu kambiig (Lamothe et a/., 2007). Hal ini
memungkinkan beberapa protein spesifik yang terdapat pada susu kambing
digunakan sebagai bahan bioaktif pada pangan nutrasetika.
Tabel 5.2. Hasil berat molekul pada pita (kDa)
53. Isolasi Protein spesifrk (PSI) susu dengan Teknik Elektroelusi
Gel SDS-PAGE dipotong sepanjang pita yang dikehendaki (pita dengan
berat molekul (36-55 kDa). Masing-masing potongan gel dtnawkkan ke dalam
kantong nilon. Selanjutnya diiasukkan dalam block glass yang mengandung
PBS, setelah itu di stirer selama 24 jam. Setiap 6 jam dilakukan penggantian PBS.
Untuk mengetahui bahwa protein sudah mengalami elusi maka potongan gel
diwarnai dengan pewarnaan silver, bila tidak terdapat pita artinya protein sudah
ter-elusi.
5.4. Uji potensi PSI susu knrnbing sebagai hrnunomodulator
5.4.1. Irnunomudulator pada Artitis Rhcmatoid
Sampel yang telah djelektroelusi disimpan dan digunakan sebagai bahan
uji immunomodulator pada hewan coba artritis. Tikus yang digunakan untuk uji
hewan sebanyak 6 ekor tikus yaitu 2 ekor tikus kontrol, 2 ekor &us artritis dm 2
ekor tikus amitis mendapat terapi protein spesifik. Setelah tikus mempunyai
gejala artritis, maka dilakukan terapi selama 14 hari dengan cara disonde 100 pl
hasil isolasi protein susu kambing sampai 14 hari. Perbandingan gambar hasil kaki
hewan coba yaag sehat, sakit dan terapi &pat dilihat pada Gunbar 5.2, 5.3 dan
5.4.
Gambar 5.2. Kaki tikus sehat (kontrol)
Gambar 5.3. Kaki tikus arhitis
Gambar 5.4. Kaki tikus yang telah diterapi
Gambar 5.5. Perbandingan makroskopis kaki tikus (kontrol, sakit dau pasca tempi)
Pada Gambar 5.2. terlihat bahwa kaki tikus sehaf tidak ada
pembengkakan. Gambar 5.3. menunjukkan terjadi pembengkakan sebagai
konfirmasi bahwa tikus menjadi arthritis rematoid. Pada Gambar 5.4. terlihat kaki
tikus artitis terjadi perbaikan pembengkakan mendebti kaki normal pasca terapi
Psl. Data maksroskopis tersebut dikonfirrnasi dengan data mikroskopis melalui
pewarnaan HE ( Hemaktoxilen Eosin), seperti pada Cambar 5.6
Data Gambar 5.6 tersebut menunjukan bahwa pada gambar kontrol
tam@ gambam tanpa adanya peradangan dengan kondisi pemukaan yang
halus, sedang pada garnbaran Sakit te qadi kerusakan pemukan dengan adanya
penonjola germukaan tulang sedang pa gambaran pasca terapi sudah terjadi
perbaikan permukaan tulang. Hasil tersebut menunjukkan bahwa PSI berfungsi
sebagai antioksidan dapat mengurangi peradangan dan sebagi imunomudulator
I I Kontrol
Gambar 5.6. Hasil. PA jaringan Periartikuler Sendi
Sakit Pasca Terapi
yang terbukti adanya perbaikan permukaan tulang. Data makroskopis d m
mikroskopis ini diperjelas dengan data SOD, dimana PSI ini berfungsi sebagai
antioksidan, antiidamasi dan imunomudulator. Tabel 5.3 menunjukkan adanya
penurunan aktivitas SOD pada tikus sakit dan setelah mendapat terapi PSI
aktivitas SOD meningkat mendekati nilai SOD pada hewan control. Hasil ini
mempunyai arti bahwa PSI susu kambing dapat berfungsi sebagai antioksidan
melalui scavenger mdilcal.
Tabel 5.3. Aktifivitas SOD
Perlakuan 73.45
53.45
5.42. Protein Spesifii sebagai Imunomudulator pada Enteritis
Hewan coba yang diberi perlakuan induksi indomethacin mengalami
enteritis dan selanjutnya dilakukan terapi dengan PSI b i l elektroelusi untuk
menguji fungsi imrnunomodulator pada hewan coba enteritis. Gambaran
mikroskopis tikus kontrol, enteritis dan pasca terapi dengan PSI seperti pada
Gambar 5.6 dimana dapat dijelaskan tejadi perubahan jaringan duodenum,
jejunum dan ileum pada hewan enteritis (b). Terapi dengan PSI dapat
memperbaiki struktur jaringan mendekati ,jaringan normal (c).
-- Duodenum
I I
I I Jejenum
Gambar 5.7. Perbandingan gambar duodenum, jejenum, ileum, pada tikus kontrol, enteritis dan pasca terapi secara milcroskwpis
I I
Data mikroskopis ( Gambar 5.7) ini dipejelas dengan data SOD dan
MDA, dimana PSI susu kambing berfangsi sebagai antioksidan, antiidamasi
dan imunomudulator. Tabel 5.4 menuqukkan adanya penunman aktivitas SOD
pada tikus sakit dan meningkat setelah mendapat terapi protein spesifik. Hasil ini
mempunyai arti bahwa PSI ini dapat berfungsi sebagai antioksidan melalui
scavenger radikal. Demikian juga kadar MDA (Tabel 5.5) menurun rnendekati
Kontrol Enteritis Pasca Terapi
normal setelah mendapat terapi PSI. Kadar MDA jaringan akan meningkat pada
kondisi dimana tejadi kerusakan jaringan.
Tabel 5.4. Kadar SOD pada Tikus Kontrol. Enteritis dan Terapi
- No 1
2
Organ jejunum
duodenum ileum
Perlakuan kontrol negatif (sehat)
3
Kadar SOD 109.354 111.673 117,172
konhl positif (sakit)-1 24 jam setelah induksi indometacin
4
1 1 1 ileum 1 0.235 1 0.240 1 0.238 1 1.951 1
kontrol positif (sakit)-2 7 hari stelah induksi indometacin
Tabel 5.5. Kadar malondial dehida Tikus Enteritis
jejunum duodenum
ileum
Pasca Terapi PSI susu kambing
NO -
1
62.840 59.563 58.658
jejunum duodenum
ileum
53.370 51.621 49.890
jejunum duodenum
ileum
93.675 96.968 102.438 -
Perlakuan
kontrol negatif (sehat)
Absorbansi
jejunum
duodenum
Rata- rata
0.1400
0.1950
1
0.138
0.194
kadar MDA
1.145
1.504
2
0.142
0.196
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN
6.1. Kesimpulsn
1. Protein spesifik dari susu kambing terbukti mampu menueunkan proses
peradangan 2. Protein Spesitik dari susu kambing terbukti sebagai antiinflamasi dan antioksidan
3. Protein spesifk terbukti b e h g s i sebagai imunomudulator.
Hasil penelitian menjadi bahan informasi bahwa susu kambing mengandung
kandidat imunomudulator yang digunakan sebagai antioksidan dan antiinflamasi.
DAETAR PUSTAKA
Alferez M.J.M., Aliaga LL., Barrionuevo M. and Campos M.S. 2003. Effect of Dietary Inclusidn of Goat Milk on the Bioavailability of Zinc and Selenium in Rats. J. Dairy Research (2003) 70 18 1-1 87.
Aliaga I.L., Alferez M.J.M., Nestares M.T., Ros P.B., Barrionuevo M., and Campos M.S. 2005. Goat Milk Feeding Causes an Increase in Biliary Secretion of Cholesterol and a Decrease in Plasma Cholesterol Levels in Rats. J. Dairy Sci. 88: 1024-1 030.
Allen TC, 1994. Hematoxylin and eosin. In (Prophet EB, Mils B, Arringtom JB, Sobii LH, eds). Laboratory methads in histotechnology. Washington : Aimed Forces Institute of Pathology, pp 53-58.
Allen TC, 1994. Mounting media. In (Prophet EB, Mills B, Aningtom JB, Sobin LH, eds). Laboratory methods in histotechnology. Washington : Armed Forces Institute of Pathology, pp 59-6 1.
Aulanni'am. 2005. Protein & Analisisnya. Citra Mentari Group, Malang. ISBN 978508423- X
Ausubel FM, Brent R, Kingston, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, SEruhl K, 1995. Short protocol in molffiular biology. Third edition, John Willey & Sons, Inc : 10.1-10.48; 11.5-11.7.
Chen W.Y., Weng M.H., Chen S.E., PehH.C., Liu W.B., YuT.C., Huang M.C., Chen M.T., Naglrhata H., and Chang C.J. 2007. Profile of Gelatinolytic Capacity of Raw Goat Milk and the Implications for Milk Quality. J. dairy Sci. 90:4954-4965.
Clare D.A., and Swaisgood H.E. 2000. Bioactive Milk Peptides: a Prospectus, J Dairy Sci, 83,1187-1 195.
Cross M.L. and Gill H.S. 2000. Immunomodulatory Properties of Milk. British Journal of Nutrition, 84. Suppl. 1, S81-S89
Dinarello CA, Moldawer LL, 2000. Proinflamatory and anti-inflamatory cytokines in rheumatoid arthritis. Second edition, Thousand Oaks : Amgen, pp 111-1 18.
Fiat A.M., Sarnour D.M. and Jolles P. 1993. Biologically Active Peptides from Milk Proteins with Emphasis on two Examples Concerrung Antithrombotic and Immunomodulating Activities. J. Dairy Sci 76:301-310
FitzGerald RJ, and Meisel H. 2003. Caseinophosphopeptides (CPPs) as fimctional ingredients, In Functional dairy products Edited by Tiina Mattila-Sandholm and Maria Saarela Woodhead Publishing Ltd and CRC Press LLC
Geerlings A., Vilim I.C., Zarco F.H., Sanchez M., Vera R., Gomez A.Z. 2006. Identification and Characterization of Novel Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors Obtained h m Goat Milk. J. Dairy Sci. 89: 3326-3335.
Gill H.S., Cross M.L., Rutherfurd K.J. and Gopal, P.K. 2001a. Dietary Probiotic Supplementation to Enhance Cellular Immunity in the Elderly. Brit J Biomed Sci, 58, 94-96.
Gill H.S., Darragh A.J. and Cross M.L. 2001b. Optimising Immunity and Gut Function in the Elderly. JNurr, Health Ageing, 5,80-91.
Gill H.S., Doull F., Rutherfurd K.J. and Cross M.L. 2000, Immunoregulatory Peptides in Milk. Br JNutr, 84 (supplement I), 11 1-1 17.
Gill H.S., Doull F., Rutherfurd K.J., and Cross M.L. 2000. Immunoregulatory Peptides in Bovine Milk. British Journal of Nutrition, 84. Suppl. 1, S81-S89
Gill H.S., Rutherfurd K.J. and Cross M.L. 2001c. Dietary Probiotic Supplementation Enhances Natural Killer Cell Activity in the Elderly: an Investigation of Age-Related Immunological Changes. J Clin Immunol, 2 1,26&271.
Gill H.S., Rutherfwd K.J., Cross M.L. and Gopal P.K. 2001d. Enhancement of Immunity in the Elderly by Dietary Supplementation with the Probiotic Bifidobacterium lactis HN019. Am J Clin Nup, 74,833-839.
Gill H.S., Rutherfurd, K.J., and Cross, M.L. 2000. Bovine milk : A Unique Source of Immunomodulatory Ingredients for Functional Foods. In Funtional Foods 11 - Claims and Evidence. Pp 82-90. Cabridge: Royal Society of Chemistry Press.
Goldsby RA, Kindt TJ, Osbome BA, 2000. Kuby immunology. Fourth edition, New York : W.H. Freeman and Company, pp 1-514.
Haenlein G.F.W. 2001. The Many Medicinal Benefits of Goat Milk. Countryside and Small stock journal; Nov/Dec 2001; 85,6.
Hall 1,1994. Embedding. In (Prophet EB, Mills B, Aningtom JB, Sobii LH, eds). Laboratoly methods in histotechnology. Washington : Armed Forces Institute of Pathology, pp 39-43.
Haryono D. 2008. Mekanisme immunoneuromodulasi Teknik "Assited Drainage" pada Reaksi T i Alergi yang Terpapar Lipopolisaktuida Phorpyromonas gingivalis. Disertasi.
Korhonen H., Pihlanto-Lepptila A., Ran- P. and Tupasela T. 1998. Impact of Processing on Bioactive Proteins and Peptides. Trends Food Sci Technol, 8,307-319.
Lamothe S, Robitaille G, St-Gelais D, and Britten M. 2007. Short Communication: Extraction of B-casein from Goat Milk. J. Dairy Sci. 905380-5382.
Leporanta K. 2001. Developing Fermented Milks into Functional Foods. Innov Food Technol, 10,46-47.
Marriot B.M. 2000. Functional foods : an ecological perspective. Am.J.Clin.Nutr. 71(suppl): 1728s-I 734s.
McCullough F.S.W. 2003. Nutritional Evaluation of Goat's Milk. British Food Journal; 2003; 105,415.
Miller G.D., Jarvis JX., and Mcbean L.D. 2000. Handbook of Dairy Foods and Nutrition. second edition, Boca Raton, London, New York, Washington DC, CRC Press.
Pins J. and Keenan J.M. 2002. The Antihypertensive Effects of a Hydrolysed Whey Protein Isolate Supplement (BioZatelaj)). Cardiovasc Drugs Ther, 16 (Suppl I), 68.
Saxelin M., Korpela R., and Makinen A.M., 2003. Classifying Functional Dairy Products. In Functional dairy products Edited by Tiina Mattila-Sandholm and Maria Saarela. Woodhead Publishing Ltd and CRC Press LLC
Tabatabai L.B. 2004. Good News for Goat's Milk Drinkers. Agri Research; 52,lO.
Tomotake H., Okuyama R., Katagiri M., Fuzita M., Yarnato M., and Ota F. 2006. Comparison Between Holstein Cow's Milk and Japanese-Saanen Goat's milk in Fatty Acid Composition, Lipid Digestibility and Protein Profile. Biosei, Biotechnol. Biochem., 70 (1 I), 2771-2774.
Xi-Ming Xu, Jie-Ping yu, Xiao-fei he, Jun-Hua Li, Liang-Liang Yu, Hong-Gang Yu. 2005. Effects of Garlicin on Apoptosis in Rat Model of Colitis. World Journal of Gastroenterology ISSN 1007-932.
Young A, dan R.J. Levi. 1990. Diarrhoea of Famine and Malnutrition-Investigations Using a Rat Model. 2-Ileal hypersecretion Induced by Starvation. Pubmed Central February (21):162-169.
DRAFT ARTIKEL ILMlAHlJURNAL NASlONAUlNTERNASlONAL
JUDUL: PROFIL PROTEIN SPESlFlK SUSU KAMBING SEBAGAI PANGAN NUTRASETIKA
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG
NOVEMBER 2009
PROFIL PROTEIN SPESlFlK SUSU KAMBING SEBAGAI PANGAN NUTRASETIKA
Masdlana Ch Padaga 'I, Manik Eirry Sawitri 'I, den Srl Mumanin
"program Stud1 Teknologl Hesll Ternak, Fakultas Peternakan Un~vers~tas Braw,aya.Malang 2'~ekultas Kedokteran Unlversltas Bram)aye,Malang
ABSTRACT
This research aims to study the protein profib of goat's milk compares to cow's milk, to
explore the potential of PSI in goat's milk as an i~nmunomodulator, to prove that the antibody
against PSI is specific and has a cross reaction effed with other sources so that if can be used
in development of diagnostic kit for nutmceutical food quality. &periment results shows that
there is a variety of milk protein content from various goat's milk sample (A, 8 and C) and cow's
milk sample. The mix from goat's milk elution resulted in a high protein content of 51.625 mgR.
Usipg SDS-PAGE method showed that pmffle of proteln of goat dMer hwn cow's mllk. The
goat's milk contain specific protein (Psl) milk with moleculer weight of 36-55 kDa. Test using
arthritis rheumatoid and entetitis animal models showed that PSI 36-55 kDa has the function as
an antioxidant. which can lessen inflammations. The acfivity of SOD and Malonal D~aldehide
(MDA) contain isdated from the tissues closed to normal condition affer treated with PSI This
results proved fhat goat's milk PSI has the function as an antioxidant by radical scavenger. The
rat induction with indomethaan 15 mgAg BW causes enteritis. l l m micrascopic result
(pathdogyanatomiflA) showed tissue repairing asfter PSI therapy in duodenum, jejunum and
ilium, which has been damaged because of enteritis. This data is clarif~md by This proved that
PSI also has an antioxidant, anti-iflammatory and imunomodulator. It can be concluded fhat
specific pmtein (Pso fmm goaf's milk can prevent inflammation, has an antioxidant and
immunomoduIator effect The results of this research is an informatmn that goat's milk is a
candidate forimmunomodulator which is used as an antioxidant and anti-inflammatory.
KEY WORDS: goat's milk, nutraceutical food, SOD, Malonal Dialdahide (MDA), immunomodulator.
PENDAHULUAN
Pangan nutrasetika didefinisikan ~ b a g a i pangan atau komponen pangan yang dapat memberikan manfaat kesehatan kepada konsurnen (Marriot. 2000). Susu kamblng sebagaimana halnya susu sepi mengandung komponen-komponen yang telah terbukti mempunyai manfaat kesehatan (Haenlein, 2000). Menurut McCullough (2603) kandungan laktosa dan protein susu kambing hampir sama dengan susu sapi, namun terdapat perbedaan struktur dan protein immnologik. selain itu susu kambing mengandung asarn-asam lemak rantai sedang dan globular lemak pada susu kambing relatif lebih kecil dibandingkan lemak susu sapi.
Sebagai pangan nutrasetika susu kambing dapat memberikan solusi terhadap penderita alergi terhadap susu sapi atau susu kedelai. Reaksi alergi terhadap susu biasanya disebabkan oleh laktosa atau protein susu. Laktalbumin dan kasein pada susu kambing mempunyai struktur yang berbeda dengan susu sapi sehingga t i a k menyebabkan reaksi alergi pada bayi dan anak-anak yang sensitive terhadap laktalburnin sapi (Lamothe et al.. 2007).
Susu sapi mengandung as1 casein yang merupakan nllergan utamn snrnpai 33,756 dibandingkan dengan susu kambing yang hanya 3.9% (Tomotake et al. 2006) dan pcasein sebagai antihipertensi leblh Unggi pada swu kambing (Lamothe et al.. 2007).
Hasil penaltian menunjukkan bahwa terdapat perbedaan sifat fisikekimia antara lemak susu kambing dan susu sap1 Menurut McCullough ( 2003) globula lemak susu kambing relatif lebih kecil sehingga lebih mudah dicema dan area perrnukaan globula lemak yang leb~h luas pada susu kambing dapat meningkatkan aktivitas lipase pankreas. Tomotake et el.,( 2008) melaporkan bahwa jumlah total asam lemak rantai pandek dan sedang (C4. C6. C8 dan ClO) mencapal 16,l % - 19,7% pada susu kambing dibandingkan
susu sapi yang hanya 58%. Susu kambing mengandung asam palmitat (C16) lebih rendah dibandingkan susu sapi. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Alferez et a/., (2003) dengan hewan wba tikus, menunjukkan bahwa konsumsi susu kambing dapat meningkatkan keterrediaan zink dan selenium. Dengan mernpertimbangkan beberapa karakteristik susu kambing diantaranya mudah dicerna, sumber energi yang baik dan tidak menyebabkan blergi maka susu kambing dapat dimanfaatkan sebagai sumber pangan nutrasetika.
Beberapa penelitlan yang sudah dilakukan selama periode 10 tahun terakhir melalui identifikasi dan karakterisasi komponen susu yang dapat mempengaruhi fungsi sistem lmmun menunjukkan bahwa komponen yang paling berperan adalah protein susu (Gill et a/. 2000). Secara in vibo a, p, dan x casein, whey protein, lactoferrin. dan endogenus lgg susu terbukti dapat memodulasi prolifersi limfosit. Efek ini dapat tejadi pada beberapa spesles ruminan dan non ruminan. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa potensi immunomodulator protein susu secara filogenetik tidak terbatas, namun terdapat variasi pada pengaruh antar species (Martin et a/. 2009). Caseinophosphopeptides (CPPs) diiaporkan mempunyai efek antihipertensi. Anticaries dan antialefa (Fitzgmld et al. 2003).
Percobaan seura in vivo pada hewan wba tikus menunjukkan bahwa derivat a- casein, isracidin. dapat mencegah infeksi SIaphylocaxus aumus (Gill et a/. 2000). Protein susu juga terbukti dapat meningkatkan respon antibodi mucosal terhadap pernbenan antigen dan vakiilrl secara per oral. Percobaan ini dilakukan menggunakan hewan coba tikus yang diberi ovalbumin, toksin kholera, toksin polio dan vaksin Rue (Gill et al.. 2002a, b, c, d: Low et a/., 2001).
Bahan dan Alat Bahan yang diperlukan adalah Tikus
putih (Rattus norvegicus) wistar jantan umur 2 bulan berat 100-130 g (Lab Biologi Molekuler Seluler F.MIPA. Malang), Buffer silrat pH 4.5, Antibodi primer Rat Anti iNOS (Santa cruz biotechnology), Antibodi sekunder Anti Rabbit IgG Biotin labelled. Kit Apoptag, kit iNOS. Pewama Mayer Hematoxylen (Pierce), Eosin, Cromogen DAB (Santa cruz biotechnology). PBS (Phospat Buffer Saline), PBS PMSF, Tris HCI, butanol, Dl (Deionized Water). Hidrogen Peroksida (H2O2) 3% (Dako,lnc), Aquades. Ethanol 70%. Ethanol 80%, Ethanol 90%, ethanol 9S%, Ethanol Absolut, Xylol, Parafln. NaCl 0.9%, Entellan, Serum BSA (Bovine Serum Albumin) (Sigma, USA), Aquades dan PBS-Tween.
Peralatan yang akan digunakan adalah seperangkat alat gelas, sentrifuge. sonlkator, refrigerator, tsbung eppendorf, Sodium Dodecyl Sulphate- Polyacrylamide Gal Electrophoresis (SDS-PAGE). Alat-alat yang diperlukan unluk pemeliharaan dan perlakuan tikus adalah sekam sterll, kandang. wadah minum, wadah pakan, syringe (volume 1 ml).
Metodolog1 Penelltian Tahap 1 Isolasl Pmteln Susu
lsolasi protein susu dilakukan dengan metoda Aulani'am (2005). Kedalam sampel susu ditambahkan PBS PMSF 4 mM, kemudian dilakukan sonifikasi selama dan d~lenjutkan dengan sentrtfugas~ pada 10.000 rpm. Polet yang diperoleh dilarutkan dalam Tris HCI 20 mM dan disimpan pada suhu - 20°C sampai siap untuk analis~s sdanjutnya.
Karakterisesl dan ldentifikasi Pmtein susu deqan SDS- PAGE
Protein hasil lsolasi dlldentiflkasi menggunakan SDS-PAGE (Aulani'am 2005). Kedalam alat SDS-PAGE masukkan running gel melalul dlndlng sampal kunng dad bates atas, kemudian ditambahkan butanol 1 ml dan
dibiarkan selama 25 menit. Sefeiah gel membeku, butanol dibuang, dibersihkan dengan PBS, dan dikeringkan dengan Whatman paper. Selanjutnya dibuat stacking gel melewati dinding sampai penuh, masukkan comb dan ditunggu sampai benar-benar set (25 menil). Selanjutnya comb diambil dan dibenihkan dari sisesisa gel dengan buffer. Gel yang diperoleh dicuci dengan buffer dan hasilnya divisualisasikan dengan pewamaan silver atau langsung ditransfer ke membmn nitr0s~Iulose.
lsolasi Protein spesifik (Psl) susu dengan Teknlk Elektroelusi
Gel SDS-PAGE yang tidak diwarnai drpotong sepanjang plta yang dikehendakl. Masingmasing potongan gel dimasukkan ke dalam kantong nilon. Selanjutnya d~masukkan dalam block glass yang mengandung PBS, setelah ~ t u di stirer selama 24 jam Setiap 6 jam dilakukan penggantian PBS Untuk nlengetahui bahwa protein sudah mengalami elusi maka potongan gel diwamai dengan pewarnaan silver, bila tidak terdapat plta artinya protein sudah ter-elusi.
Tahap 2 Uji potensl Psl susu kambing sebagal
immunomodulator Pada penelitian in1 fungsi
immunomodulator diuji menggunakan hewan model Tlkus (Raltus norvegicus, gaslr wlstar) berat 150 g dan diberi perlakuan artr~t~s rematoid dan enteritis.
Selanjutnya dilakukan tempi dengan Psl dan fungsi immunomodulator diuji melalui pemenksaan: mediator-medtator s~stem lmmun (immunohistokimia), radikal bebas melalui pemeriksaan MDA (malonaldiaklehid) dan SOD (superoksid dlsmutase),Histopatol~gis Dada organ sp&flL, (pemdian, usus, trachea dan bronchus) dengan HE
Pengukuran aktlvltas superokslda dismutaw (SOD) jaringan
Pengukuran SOD dllakukan 6euara spektrofotometri panjang gelombang 580 nm menggunakan reaksi warna sebagai indikator.
3
Aktivitas supsroksida dlsrnutase diteritukan dengan lnterpolasl kurva baku yang sudah dlslapkan terlebih dahulu (Laboratonurn O~orned~k, 2003)
Pengukuvan kadar MDA jaringan Pengujian MDA dilakukan dengan
rnengukur absorbansi rncnggunakan spekrofotorneter pada panjang gelombang 531 nrn. Kader MDA drtentukan dengan interpolasi k u ~ a baku (Laboratonurn Biornedik, 2003)
Pemeriksaan Histopatulogi Pada pernbuatan sed~aan
histopatolqi, jaringan harus drfiksas~ terlebih dahulu dengan tuluan untuk menghentikan proses autolisis pada sel yang disebabkan oleh enzirn pencemaan oada lisoslrn van9 - - dilepaskan Gda saat sel mengalami kernatian (Laboratoriurn Biornedik, 2004).
HASlL DAN PEMBAHASAN
lsolasi protein susu sapi dan susu kambing
Susu kambing dan susu sapi diperoleh dari peternakan rakyat. Susu karnbing dikoleksi dari 3 ekor karnbing yang berbeda (A B.C) dan pengambilan sarnpel dilakukan duplo. lsolasi protein susu dilakukan dengan rnetoda Aulani'arn (2005). Data konsentrasi protein susu sapi dan susu karnbing sepetti pada Tabel 1.
Tabel 1 menunjukkan bahwa terdapat variasl kandungan protein susu dari berbagai sampel susu karnbing ( A,B dan C ) , sarnpel susu Sap1 ( S) se~ta hasil el us^ Pada carnpuran hasil elusi protein susu karnbing diperoleh kadar protein yang cukup tlnggi yaitu 51625 mg/Liter Hal in1 rnenjelaskan batlwa rsolat protein rnemenuhi persyaratan untuk d~gunakan sebagai molekul b~oakt~f yang akan dluji sebagai anti inflarnas~ dan ant1 radang
Karakterisas! dan lderrtifikasi Protein susu dengan SDS-PAGE
Sarnpel protein susu selanjutnya dianalisis profil protelnnya dengan SDS. PAGE, hasil elektroforesis protein susu dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Hasil elektroforesis protein susu Deri Camber 1 dapat diketahui
terdapat protein spesifik susu karnbing yang berbeda denaan arotein susu saai vaitu oada berat rnolekd 3&55 kDa ~asrl ' p&rhllungan
Tabel 1. Konsenlrasi Protein Sarnpel berat molekul (kDa) pada plta dapat dlllhat
- 5 / Campwan / o.ia / o,nl / 0.207 5782,s -4 surnber pangan nutrasetika. ~ a d a percobaan
selanjutnya, dilakukan isolasi protein spesifik
3 -- . 4
. .
elusi I (Psl) susu kambing dengan teknik elekt;oelusi untuk rnenguji fungsi imrnunomodulator Psi.
4
pada Tabel 5 2 Proteln spesifik susu karnblng dengan berat molekul 32 kDa dan 61 4 kDa tidak ditemukan pada susu sap1 Dernikian juga proteln spesmk susu sapi dengan berat molekul 10 3, 30,1, 66,s dan 86,O kDa tidak diternukan pad8 susu kambing Hal ini
NO
1 -- 2
c .-s--
Sampei
A ' B
0,173
1,oX
Absomnsi (541~m)
0,152
0,042
Prde'n
(ppm)
612.5
3437,5
A1
0.010
Qs151
protein m x '')
6125
-34@7c
0,183
0,039
A2
0.039
Rerata
0,025 --
Q,138
4082,5
Q75,O
40625
9750
menunjukan bahwa susu sapi-dan susu karnblng mengandung potensial protein spesifik yang dapat dikernbangkan rnenjadi
Tabel 2 menunjukan bahwa protein susu dengan berat mol 32 kDa dan 81,4 kDa hanya terdapat pada susu kambing. Demikian juga protein spesifik susu sapi dengan berat molekul 19.3; 30.1; 663 dan 86,O kDa tidak ditemukan pada susu kambing. Menurut Lamothe el a/.. (2007) protein susu kambing mempunyai struktur yeng berbeda dengan susu sapi. Susu sapi mengandung as1 casein lebih tinggi dibandingkan susu sapi (Tomotake et el.. 2006) den sedangkan P- casein yang mempunyai fungsi antihipertensi lebih tinpgi pada susu kambing (Lamothe ot a/., 2007). Hal ini rnemungkinkan beberapa protein spesifik yang terdapat pada susu kambing digunakan sebagai bahan bioaktif pada pangan nutrasetika.
Tabel 2. Hasil berat molekul pada pita (kDa) _
lsolasl Protein speslfik (Pel) susu dengan Teknlk Elektmelusl
Pita ke-
1
Gel SDS-PAGE dipotong wpanjang pita yang dikehendaki (pita dengan berat molekul (36-55 kDa). Masing-masing potongan gel dimasukkan ke dalam kantong nilon. Selanjutnya dimasukkan dalam Mock glass yang mengandung PBS, setelah itu di stlrer da rn8 24 jam, Setlap 0 lam dllakukan penggantian PBS. Untuk mengetahui bahwa protein sudah mengalami elus1 maka
potongan gel dmarnai dengan pewarnaan silver, bila tidak terdapat plta artinya proteln sudah ter-dusi. Protein hasil elust diuji fungslnya sebagai irnmunomodulator untuk membuktikan bahwa susu kambing sebagai pangan nutraset~ka.
BM (kDa)
KESIMPULAN
Terdapat perbedaan profil protein susu sapi dari susu karnbing. Protein spesifik susu kambing dengan berat molekul 36-55 kDa dapat dikembangkan sebagai sumber pangan nutrasetika setelah dilakukan pengujian fungsi immunomodulator
Sapi Kamb~ng
DAPTAR PUSTAKA
(A) (R)- (C) 142.6 1 142.5 142.5 1 1426
Kamb~ng Kambing Alferez M.J M., Aliaga l , L , Barrionuevo M.
and Campos M S 2003 Effect of Dietary Inclusibn of Goat Milk on the Bioavailability of Zinc and Selenium in Rats J. Dalry Research (2003) 70 181-187.
Al~aga I L , Alferez M.J M., Nestares M T , Ros P B , Barrionuevo M.. and Campos M.S 2005 Goat Mtlk Feeding Causes en Increase in Biliary Secretion of Cholesterol and a Decrease in Plasma Cholesterol Levels in Rats. J. Dairy Sci. 88: 1024- 1030.
Allen TC, 1994. Hematoxylin and eosin In (Prophet EB, Mills B. Arr~ngtom JB, Sobin LH. ids). Laboratory methods in histotechnology. Washington : Armed Forces Institute of Pathology, pp 53- 58.
Allen TC, 1994. Mountlng media. In (Prophd EB. Mills B, Aningtom JB, Sobin LH, eds). Laboratory methods in histotechnology. Washington . Armed For- Institute of Pathology, pp 59- 81.
Aulanni'am. 2005. Protein & Analisisnya. Citra Mentari Group, Malang. ISBN 976508423-X
Ausubel FM. Brent R. Kingston, Moore DD, Se~dman JG, Smith JA. Struhl K. 1995 Short protocol in molecular b~ology. Third edition, John Willcy & Sons, lnc : 10.1-10.48, 11.511.7.
Chen W.Y., Wang M.14.. Chen S E., Poh H.C., Liu W.B.. Yu T.C., Huang M C., Chen M T , Nagahata H., and Chang C.J. 2007. Profile of Gelatinolytic Capacity of Raw Goat Milk and the Implications for Milk Quality. J. dairy Sci. 90:4954- 4965.
Clare D.A., and Swaisgood H.E. 2000. Bioactive Milk Peptides a Prospectus, J Dairy Sci, 83, 1187-1 195.
Cross M.L. and Gill H.S 2000. lmmunomodulatory Properties of Milk. British Journal of Nutrition, 84. Suppl. 1. S81-S89
Dinarello CA. Moldawer LL, 2000. Proidlamatory and anti-innamatory cytokines in rheumatold arthritis Second edition, Thousand Oaks : Amgen, pp 111.118.
Fiat A.M., Samour D M and Jolles P. 1993 Biologically Active Peptides from Milk Proteins with Emphas~s on two Examples Concerning Antithrombotlc and lmmunomodulating Activities. J. Da~ry SCI 76:301-310
FitzGerald RJ, and Meisel H. 2003. Caseinophosphopeptides (CPPs) as functional lngedients, In Functional dairy products Edited by Tiina Mattila- Sandholm and Maria Saarela. Woodhead Publishing Ltd and CRC Press LLC
Identification and Charactenzatron of Novd Angiotensin-Converting Enzyme lnh~bitors Obtained from Goat Mllk. J Dalry Sci. 89: 3326-3335.
Gill H.S.. Cross kl.L., Rutherfurd KJ. and Gopal, P.K. 2001a Dietary Probiotic Supplementation to Enhance Cellular Immunity in the Elderly. Bril J B~omed Sci, 58. 94-96.
Gill H.S.. Darragh A.J. and Cross M.L. 2001 b. Optimising lmmunity and Gut Function in the Elderly. J Nutr, Health Ageing, 5, 80-91.
Glll H.S., Poull F.. Rutherfurd K,J, and Cross M.L 2000, lrnmunoregulatory Peptic's in Milk. Br J Nutr, 84 (supplement I ) , 111-117.
Gill H.S., Doull F., Rutherfurd K.J., and Cross M L. 2000. lrnrnunoregulatory Peptides in Bovine Milk British Journal of Nutriiion, 84. Suppl. 1, S81-S89
Gill H.S.. Rutherfurd K.J. and Cross M L 2001 c. Dietary Probiotic Supplementat~on Enhances Natural Killer Cell Activity in the Elderly. an lnvest~gat~on of Age-Related Immunological Changes. J Clin Immunol. 21,264-271.
Gill H.S., Rutherfurd K.J., Cross M L and Gopal P.K. 2001d. Enhancement of Immunity in the Elderly by Dietary Supplementabon wlth the Probiobc Bfidobacterium ladis HN019. Am J CCn Nulr, 74,833-839.
Gill H.S., Rulherfurd. K.J , and Cross. M L. 2009, bovine milk . A Unique Source of lmmunomodulatory lngredlents for Functional Foods. In Funtional Foods II - Claims and Evidence Pp 82-90, Cabrldge: Royal Soclety of Chemistry Press.
Geerlings A, Wliar LC., Zarco F.H., Sanchez M., Vera R., Gomez A.Z. 2006.
Goldsby RA. Kindl TJ. Osborne BA, 2000. Kuby Immunology. Fourth edltlon, New York : W.H. Freeman and Company, pp 1-514.
Haenle~n G.F.W. 200t. The Many Medicinal Benefits of Goat Milk. Countrys~de and Small stock journal; NovIDec 2001; 85, 6
Hall J, 1994. Embodding In (Prophat €6, Mills B, Arnngtom JB, Sobin LH, eds). Laboratory mothods ~n h~stotechnology. Washington : Armed Forces lnstltute 07 Pathology, pp 39- 43
Haryono D. 2008. Mekanisme lmmunoneuromodulasi Teknlk 'Assited Drainage" pada Reaksr T~kus Alergi yang Terpapar Lipapolisakarida Phorpyromonas glngivalls Dlsertasl
Korhonen H , Pihlanto-LeppBl'd A,, Rantarnaki P. and Tupasela T. 1998. Impact of Processing on Bloactlve Protans and Peptides. Trends Food Sci Technol, 8, 307-31 9.
Lamothe S. Robitaille G, St-Gelais D, and Britten M. 2007. Short Communication: Extraction of 8-casoln from Goat Milk. J. Dairy Sci. 90:53805382.
Leporanta K. 2001. Developing Fermented Milks into Fu~ctional Fwds. Innov Food Technol. 10,4647.
Mamot B.M. 2000. Functional foods : an ecological peffipectlve. Am J Clln.Nutr. 71 (suppl):l728s-1734s.
McCullough F.S.W. 2003. Nutritional Evaluation of Goat's Milk. British Food Journal; 2003: 105, 415
London, New York, Washington DC, CRC Press.
Pins J. and Ueenan J.M. 2002 The Antlhypertenslve Effects of a Hydrolysed Whey Protein Isolate Supplement (BloZatel@). Cardlovasc Drugs Ther, 16 (Suppl I), 68.
Saxelin M.. Korpela R , and Maklnen A.M., 2003. Classifying Functional Dalry Products. In Functional dalry products Edited by Tlina Mattila-Sandholm and Maria Saarela. Woodhead Publishing Ltd and CRC Press LLC
Tabatabal L 6. 2004 Food News for Goat's Milk Drinkers. Agri Research; 52. 10.
Tornotake H., Okuyama R., Katagiri M., Fuzita M., Yamato M., and Ota F. 2006. Comparison Between Holstein Cow's Milk and Japanese-Saanen Goat's milk in Fatty Acid Composition, Lipid Digestibility and Protein Profile. Biosci, Biotechnol. Biochem.. 70 ( I?), 2771- 2774.
Xi-Ming Xu. Jie-Ping yu, Xiao-fei he. Jun-Hua LI, Liang-Liang Yu, Hong-Gang Yu. 2005. Effects of Garlicin on Apoptosls In Rat Model of Collbs. World Journal of Gastroenterology ISSN 1007-932
Young A,. dan R.J. Lovi. 1990. Diarrhoea of Famine and Malnutritioo-l~vestigat~ons Using a Rat Model. 2-Ileal hypersecretion Induced by Starvation Pubmed Central February (21):16'?- 169
Millar Q.D., JaNis J.K., and Mchan L.D. 2000. Handbook of Dairy Foods and Nutr~tion second edit~on. Boca Raton,
SlNOPSlS PENELITIAN TAHAP II HlBAH BERSAING TAHUN ANGGARAN 2009
Potensi Protein Spesifik Susu kambing sebagai lmmunomodulator dan lmmunogen :
Upaya Pengembangan Pangan Nutrasetika
Ketua : drh.Masdiana Ch. Padaga. M.App.Sc. Anggota : I. Ir.Manik Eirry Sawitri. MS
2. Dr. Sri Murwani. drh.MP
Dibiayai Oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional, sesuai dengan Surat Perjanjian
Pelaksanaan Hibah Kornpetitif Penelitian Untuk Publikasi Internasionel Batch ll, Tahun Anggaran 2009 Nomor : 660/SP2HIPPIDP2MN1112009
tanggal 30 Juli 2009
UNlVERSlTAS BRAWIJAYA NOVEMBER 2009
1. Judul Usulan : Potensi Protein Spesifik Susu kambing sebagai
lmmunornodulator dan lmrnunogen : Upayli Pengembangan Pangan
Nutrasetika.
2. Ketua Penelilj
(a) Nama Lengkap : drh.Masdiana Padaga. MApp.Sc
(b) Bidang Keahlim : Teknologi dan Mikrobiologi Pangan
Anggota Peneliti:
2.
I FKUB
Institusi
3
Alokasi waktu (j am/Minggu)
10
Keahlian No
1r.Manik Einy Sawitri. Ms
4. Tema Peneli tian : Ketahanan Pangan
Nama dan Gelar
Dr. Sri Murwani, drh. MP
5. Obyek Penelitian
Penelitian yang akan dilaksanakan pada tahun 2 untuk mempelajh
potensi protein spesifik yang terkandung dalam susu kambing sebagai bahan
irnmnomodulator dan irnmunogen cialam upaya mengembangkan pangan
nutmwtika berbahan baku lokal. Untuk itu maka pokok kegiatan pada
Teknologi susu
Biomedik
penelitan ini adalah :
a. Melakukan konfirmasi potensi PSI sebagai bahan immunomodulator dalam
meningkatkan sistem immun pada hewan coba.
b. Melakukan konfirmasi te rjadinya perubahan immunologis pada hewan model
tikus (Rams norvegicus, galur wistar) yang diberi perlakuan h t i s dan asma
melalui kajian histopatologis, imunohistokiia, dan profil radikal bebas
Fapet UB
c. Mengembangkan kit diagnostik berbasis immunologi yang akan digunakan
sebagai dasar penentuan kualitas pangan nutrasetika.
6. Lokasi penelitian :
Laboratorium susu, PS Teknologi Ifasil Temak, Fapet UB,
Laboratonurn Sentral Ilmu Hayati, 1,aboratorium biokimia, Jurusan Kimia
FMIPA UB dan Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran UB, Malang.
7. Hasil yang ditargetkan :
a. Mendapatkan antibodi terhadap Psl susu kambing yang &pat bereaksi silang
dengau produk rmsu non kambiig
b. Mendapatkan kit diagnostik untuk deteksi immunomodulator dan penentuan
kualitas pangan nutrasetika.
8. lnstitusi lain yang ierlibat:
Laboratorium biokimia, Jurusan Kimia FMIPA UB dan Laboratorium
Biomedii Fakultas Kedokteran UB, Malang
9. Sumber biaya selain Dikti : tidak ada
10. Keterangan lain yang dianggap perlu : - Ketua peneliti telah banyak melakukan penelitian dalam hal rekayasa
produk pangan nutrasetika berbasis susu diantaranya pemanfaatan whey sebagai
limbah proses pembuatan keju untuk menghasilkan minuman kesehatm,
pernbuatan es krim sinbiotik berbahan baku lokal. Memberikan pelatihan tentang
pernbuatan produk susu terfementasi. Penelitian ini akan melibatkan mahasiswa
S1 Teknologi Hasil Ternak Fapet UB dan mahasiswa SI Kimia sebagai bahan
tugas akhir.
I 1. Rancangan (Desain Riset) :
Pada pnelilian tahun 2 akan dilakukan 2 tahap percobaan yaitu (1) kajian
PSI susu kambing sebagai bahan induksi antibodi terhadap PSI ymg akan
dipnakan sebagai reagen deteksi immunomodulator pada produk pangan berbasis
susu, dan (2) Penyiapan kit diagnostik untuk pengujian kualitas pangan
nutrasetika. Skema mncangan penelitian tahun kedua dapat dilihat pada gambar di
bawah.
Rancangan (Desah Riset) :
immunogenisitas u Antibodi PSI <r>
Uji spesifisitas dan reaksi sileng immunogenisitas
Western blot +-rF+ Penylapan kit
diagnostik
KIT DIAGNOSTIK c l r > Gambar I. Skerna uji PSI susu kambing sebagai immunogen untuk menghasilkan
kit deteksi immunomodulator pada produk olahan susu
Rangkaian percobaan pada penelitian yang akan dilakukan pada tahun
kedua ini akan menjawab beberapa pertanyaan sebagai berikut :
1. Apakah antibodi hadl induksi PSI dari susu kambing bersifat spesifik dan dapar
bereaksi silang dengan protein spesiiik yang ada pada susu sapi dan produk
olahan susu?
2. Apakah antibodi terhadap Psl dapat dikembangkan sebagai reagensi untuk
deteksi bahan immunomodulator untuk pengembangan pangan nutrasetika ?
Untuk menjawab pertanyaan tersebut diatas maka pada penelitian ini akan
dilakdan 2 tahap percobaan yaitu (1) kajian PSI susu kambing sebagai bahan
induksi antibodi terhadap PSI yang akao digunakan sebagai reagen deteksi
immunomodulator pada produk pangal berbasis sum, clan (2) Penyiapan kit
diagnostik untuk pengujian kualitas pangan nutrasetika
Metoda Percobaan Tahun 2
Bahan dan Pemlatan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: hewan coba
kelinci jantan, PBS, CFA, SAS 5096, IFA, buffer fosfat pH 7, enzim alkalin
phosphatase.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Kandang atau bak
pemeliharaan hewan coba (Lab Biologi Molekuler Seluler F.MlPA Malang),
Neraca analitik (Sartorius), Mikropipet (Eppendofl, Yellow Tip, Tube 1.5 ml
(Eppendorf), Dispossable syringe 29.9 G 1 ml (Terumo syringe), sentrifuge,
staining jar, blok parafin, mikrotom, cover glass, obyek glas, mikroskop cahaya
(Nicon), incubator, hot plate, Staining Jar, Dissecting set, Mortal.
Percobaan Tahep 1
Uji Protein spesifk susu kambing hasil purifikasi sebagai immmogen
1. Imunisasi hewan coba
Imunisasi kelinci jantan secara subcutan pada kelompok kontrol dengan
PBS + CFA, sedangkan untuk kelompok PI di imunisasi dengan PSI susu + CFA
(perbandingan 1 : I) masing-masing dengan dosis 150 p1/ subkutan, kelompok P2
diimunisasi dengan PSI susu+ CFA (perbandingan 1 : 1) masing-masing dengan
dosis 100 pl! subkutan.
- Semua kelompok hewan coba diimmsasi ulang (booster) dengan penyuntikan
PSI susuditambah denga IFA dengzin dosis yang sama dengan imunisasi
pertam. - Imwisasi ulang (booster) dilakukan IPA dengan dosis yang sama.
- Pengambilan sampel darah di lakukan pada minggu ke-3 dan minggu ke-7
dengan penambahan IFA dengan dosis yang sama.
- Pengambilan sampel darah dari masing-masing kelinci sebanyak 3 cc melalui
vena auricularis dilakukan pada ~ninggu ke-l 3,4,5,6,7,8,9,10 dan 11
selanjutnya purifkasi serum dan analisis titer antibodi PSI susu dengan elisa
indirect.
2. Preparasi Serum
Pengambilan darah untuk memperoleh anti-PSI susu dilakukan melalui
vena auricularis pada kelompok kelinci lokal jantan yang telah di induksi dengan
isolat PSI susu masing-masing pada minggu ke-l sampai minggu ke-1 l setelah
imnnisasi, kemudian dilakukan pemisahan serum dengan rneroda senrrfugasi
(1500 rpm selama 20 menit). Presipitat dibuang, supemataunya dipindahkan ke
dalam microtube dan disimpan pada suhu - 2 0 ' ~ ttntuk selanjutnya dilakukan
purifikasi.
3. Purifikasi Anti PSI Susu dari Serum
Serum ditambah dengan SAS 50% dengan perbandingan 1:1, kemudian
dihomogenkan dengan mengpakan vortex. Selanjutnya diinkubasi pada suhu
4 ' ~ selama beberapa menit. Serum disenbifugasi dengan kecepatan 3000 rpm
pada suhu 4 ' ~ selama 30 menit. Supernatan dibuang, presipitat dicuci dengan
SAS 50% (lox volume pelet), kemudian dihomogenkan deogau menggunakan
vortex. Selanjutnya disentrikgasi dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4 ' ~
selama 30 menit. Prcsipitat ditambah denyan 0,05 M buffer fosfat pH 7 sampai
volume 1 rnl. Diiarjutkan dialisis dalam 0.01 M buffer fosfat pH 7, semaIam pa&
suhu 4Oc . 4. Uji spesifisitas anti-PSI susu hasil induksi isolat PSI susu melalui metode dot
blot. Kmakterisasi anti PSI susu juga dilakukan berdasarkan spesifisitas reaksi
dengan isolat Psl. Analisis melalui metode dot blotting.
e. Uji spesifisitas anti-PSI susu hasil ~nduksi iwlat PSI sum melahi metode
Western blot.
Western Blot dilakukan dengan lnenggunakan fiagmen pita PSI yang telah
di-g dalarn SDS- PAGE ditrar~sfcrkan pada membran nitrosellulosa.
Membm diblok dengau larutan 3 % BSA dengan anti-PS. sebagai antibodi
primer. Kemudian dicuci dalam Tris- C1 yang mengandung 0,05 % Tween 20.
SeIaujufnya membm diinkubasi dengan antibodi sekunder ( anti-Rabbit IgG
label AP, pengencerdn 1 : 1000 ) dan d~tambahkan substrat western blue.
Percobnan Tahap 2
Pada tahap kedua akan dilakukan penyiapan Kit Diagnostik berbasis
immunologi dengan teknik direct immunobloting (Aulani'am 2004).
Antibodi yang sudah diuji spesifisifasnya dan ada reaksi silang dengan
produk olahan susu dilakukan labeling dengan enzim allcalk phosphatase (Ap).
Produk akhir adalah antibodi terhadap protein spesifik yang berlabel enzim Ap
yang secara langsung dapat digunakan sebayai perangkat deteksi kualitas pangan
nutrasetika.
Recommended