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BioanalyzerとqPCRを使用した
ライブラリの定性・定量評価
酒井名朋子
イルミナ株式会社
テクニカルサポート
2
Libraryの定性・定量評価
ゲル泳動
Agilent
Bioanalyzer
定性評価 定量評価
qPCR
ライブラリ調製後の手順
3
Libraryの10%を2%Agarose gelにロードする
確認項目:
– Libraryサイズが予想通りかどうか
– Adapter Ligation後の想定DNAサイズと同程度かどうか
– 126bpに強いバンドが存在しないか(アダプターダイマー)
存在する場合はGel Purificationのステップを繰り返す
Library QCの手段:
Gel visualization
500bp
400bp
4
Library QCの手段:
Agilent 2100 Bioanalyzer
ターゲットサイズ・量によりチップを使い分け
Bioanalyzer トレースはサイズ分布を知る目的で利用、定量結果は不確か
トラブルシューティングの際に必要
Image from www.genomics.agilent.com
http://www.chem.agilent.com/Library/flyers/Public/5990-5056JAJP_NGS-BioA.pdf
5
Agilent Bioanalyzer 2100:
概要
6
Agilent Bioanalyzer Workflow
手順
ゲルとDyeを混ぜる
*
チップを準備する
サンプルとラダーをチップに乗せる
チップを
Voltexする
Bioanalyzerにチップをセットし泳動を開始す
る
Data評価
*if first time using kit
7
Bioanalyzer用チップの準備
1. ゲルとDyeを混ぜ、30分室温に置く
2. チップを用意し、Chip Priming
Stationに置く
3. 9uLのゲルDye混合液を該当Well
におく
– 泡が入らないように注意すること
4. 付属シリンジで圧をかけ,ゲルをチップに注入する
– シリンジを押し込み60秒間ホールドする留め具をつける
– プランジャーをリリースし、5秒間待つ
– Chip Priming Stationから外す
5. 次のスロットにゲルDye混合物をロードする.
9uL gel-dye mix 9uL gel-dye mix
ゲルとDyeを混ぜる*
チップを準備する
8
Loading Agilent chips
6. 5uLのマーカーをすべてのWellに注入する
7. 該当箇所にDNAラダーを入れる
8. 必要のある場合はLibraryを希釈する
9. 1uLのサンプルとDNAマーカーをロードする
1uL DNA ladder
1uL sample or DNA ladder per well
ゲルとDyeを混ぜる*
チップを準備する
サンプルとラダーをチップに乗せる
チップをVoltexする
Bioanalyzerにチップをセットし泳動を開始す
る
9
Bioanalyzerトレースを理解する
Lower Marker
Upper Marker
Sample Peaks
理想的なBioanalyzer結果とは:
サンプル由来のピークが二つのマーカー(35bpと10Kbp)のピークの間に存在する
ベースラインが安定して低い
マーカーのIntensityがベースラインより十分大きい
マーカーのピークがサンプルピークと被っていないこと
Data評価
10
Bioanalyzerレポートを理解する
チェック項目
• ピークは1本か
• Adapter Dimer、ビーズの持越しがないか
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TruSeq DNA libraryの理想的なBioanalyzerトレース
Gel
Gel-free
12
サンプルをオーバーロードすると定量結果が不正確
Bioanalyzerの定量結果が正確でない理由
1:5 希釈の場合16ng/uL と表示 1:20 希釈の場合36ng/ulと表示
定量にはQubitやqPCRをご使用ください。
13
Gel Images ゲル電気泳動結果
Libraryが期待したサイズであること Adapter dimerが存在しないこと
Agilent BioAnalyzer 2100
Libraryが期待したサイズであること Adapter dimerが存在しないこと ピークが1本であること – ビーズの持越し – PCRでのOveramplification由来の産物
Library QC:
Summary
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qPCRを使用したLibraryの定量
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最適クラスター数はデータ量を増やす
20pM 10pM 5pM 1pM
Optimized flow cell clustering determines
data quality and overall data yield
Over clusterになってしまうと・・
• Quality とYieldが下がる
• Focusが合わなくなる
• Runの失敗
Cluster 数が少ないと・・
• Data量が少ない
• サンプルが無駄になる
• Focusが合わなくなる
• Runの失敗
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最適クラスター数
Sequencing Platform Raw Cluster Density in Kcluster/mm2
GAII and GAIIx 700,000 to 800,000
HiSeq v3 750,000 to 850,000
MiSeq v1 750,000 to 850,000
MiSeq v2 ~1500,000
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
0 5 10 15 20 25
Clusters
線形 (Clusters)
pM
Clu
ste
r D
en
sit
y
17
MultiplexでサンプルをPoolする際には特に注意!
ライブラリの一つが10倍高く濃度が見積もられていた場合
ライブライの一つが10倍低く見積もられていた場合
Sample Expected
Output
Actual
Output
1 16% 66%
2 16% 6%
3 16% 6%
4 16% 6%
5 16% 6%
6 16% 6% Sample
Expected
Output
Actual
Output
1 16% 20%
2 16% 20%
3 16% 20%
4 16% 20%
5 16% 20%
6 16% 2%
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Flow Cell のTitration
85
90
95
100
20pM 10pM 5pM 1pM
>=
Q30 (
%)
20pM 10pM 5pM 1pM
Cluster Density Q30 Score
Flow Cell Titration
どの程度のLibrary 濃度でどの程度のクラスター数が出るか
FCの3-4レーンを
使用
Libraryによってはデータを使用可能
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Flow Cell Titrationにおける注意事項
使用するqPCR装置、Sequence装置、試薬のバージョンは一定にする
Titration結果に影響を及ぼすParameter
– Sequencer(GA、HiSeq、MiSeq)
– クラスター形成装置(Cluster Station、cBot、MiSeq)
– Denatureの方法
– Library 長とGC含量
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• 核酸以外の物質も検出
• Contaminants が値を左右する
• Sample prepのInputやvalidationには使用不可
UV- 吸光 Nanodrop
•希釈とサンプルのHandlingによりAccuracyが変わる
•Qualityのチェックにのみ使用
Bioanalyzer 2100
• ds DNAを特定的に検出
•不完全なLibraryも検出
蛍光ベースの ds-DNA assay
Qubit or PicoGreen
•完全なLibraryのみを検出
•検出限界が低い qPCR
Libraryの定量方法
21
qPCRの原理
1. Sybr GreenがPCR Mixに含まれる
2. PCR Primerがアニーリングし、
3. 伸長反応が起こるとSybr Greenが取り込まれる
4. 取り込まれたSybr
Greenが発光する
5. 蛍光を検出
6. その後のサイクルでは1-4を繰り返す
22
qPCR Amplification Curve
検量線
Threshold
Cq :Thresholdに達した際のサイクル数、
立ち上がりサイクル、quantifictaion cycle
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qPCRではクラスター形成可能なLiraryのみを検出
– FC上のオリゴP5 とP7 配列の一部に該当するPCR Primerを使用
– Adapterが両端についたLibraryのみを検出
qPCR Overview
24
検量線用のDNAを準備
検量線用DNAの希釈
Libraryの希釈
qPCR試薬の準備、装置の運転
qPCRデータの解析
qPCRでの定量の準備
Step 1
Step 2
Step 3
Step 4
Step 5
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1.検量線用のDNAを準備
検量線にふさわしいDNA
– P5 P7配列を両端に持ったIlluminaシーケンサー用Library
– サンプルと同様の長さ、GC含量のもの
– サンプルと同様の種類のLibrary(gDNA, RNA, small RNA)
– 分注して保存されているもの
– 2-20pMの範囲でCluster 数が適正に検出されるもの
qPCR 用キット
– KAPA Library Quantification Kit
– http://www.n-genetics.com/product_detail.html?item_id=4332
– KK4824、4835、4844、4854
26
2.検量線用DNAの希釈
2nM程度のLibrary原液から調製
– 20pM まで100倍希釈 (0.1% Tween 20もしくはMilliQ水)
2倍希釈を 0.1% Tween 20で行う
しっかりVoltexしたのち分注する
20pM 10pM 5pM 2.5pM 1.25pM 0.625pM 0.3125pM
Final Concentrations
1 3 4 5 6 7 2
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サンプルの希釈
Bioanalzyerトレースより大まかな濃度の予想
~2nM のQiagen EB Bufferに保持したサンプルより開始
500倍希釈し、~ 4pM程度に調製する
– 2倍希釈をTriplicate になるように調製する
– しっかりVoltexしたのち分注する
3.サンプルの希釈
2nM 4pM
2µL unknown
+
998µL 0.1% Tween 20
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PCRMixはキットに沿って調製
– Primerは10uMになるように調製する
Thermal cycling conditions の例
4.qPCR Runの開始
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4.qPCR Runのレイアウト(例)
Unknown
Standard
Non-Template Control
検量線
– 7 点
– 2-fold dilution factor
サンプル – 8 samples
– Technical triplicates
Negative control
– 1点
SBS Library Quantification Template
30
検量線の評価:
– Efficiency(増幅効率)は +/- 10% from 100%
Efficiency= 10^(-1/Slop)
– Slope :-3.60 to -3.10
検量線の傾き
– R2 > 0.99
– Outlierをはずす(replicate でCq の違いが 0.5以上あるもの)
サンプルが検量線の中に入っているかどうか
– Outlierをはずす(replicate でCq の違いが 0.5以上あるもの)
5.結果の評価
Slope -3.278
R2 0.997
Efficiency 101.86%
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5.結果の評価
検量線の濃度計算
– DNA定量値(ng/uL)より、DNAの平均分子量、検量線サンプルの長さより濃度(nM)
を計算
– 希釈倍率を考慮に入れる
Bioanalyzer、Qubitと比較してqPCRの定量結果と大幅にずれる場合
– 一つの方法からの結果を採用する
– qPCRが最も正確
定量されたサンプルを希釈し、Cluster Generation進んでください。
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ご清聴ありがとうございました。
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