View
104
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Biologie moléculaire - jour 2
Commentaires J1
biomol = réactifs toujours sur glace(sinon = "Deadzyme")
produits en dehors du -20C le moins possible
« quick spin » avant d'ouvrir un tube
bien lire les notes de cours % d'agarose chauffer le λH3 (ne pas chauffer la soln mère) utiliser le P20 pour charger les gels (P10)
Commentaires J1
organisation/efficacité/planification s'assurer que le gel soit prêt quand les digestions
terminent compte rendu/ménage/cahier durant la migration
Biologie moléculaire- organigramme
Purification d’ADN de 2 plasmides à partir de cultures bactériennes
Coupure des ADNpar les enzymes
de restriction
Polymérisation en cascade (PCR)
Analyse sur gels d’agarose (1%)
Préparation des cartes de restriction et compte rendu
Analyse sur gel d’agarose (0,8%) et
compte rendu
Analyse sur gel d’agarose (2%) et
compte rendu
Extraction et purification d’ARN de foie de lapin
Analyse sur gel d’agarose (1%) et compte rendu
digestion des plasmides + gels d'agarose (compte rendu) PCR
Plasmides
molécules d'ADN extrachromosomiques ADN double brin + circulaire répliquent de façon autonome encodent résistance à un antibiotique vecteurs de choix dans biologie moléculaire
Enzymes de restriction
clivent les 2 brins d’ADN à des séquences spécifiques (4-8 nt)
nommer pour l’organisme duquel c’était isolé(e.g. EcoRI est isolée d’Escherichia coli)
digestion produit 3 sortes de bouts
Enzymes de restriction
site de coupure = palindrome
5'-GGATCC-3'
3'-CCTAGG-5'
5’ 3’
3’ 5’ Extension 5’
site de coupure
(4-8 nt)
Enzymes de restriction
site de coupure = palindrome
5'-GGATCC-3'
3'-CCTAGG-5'
5’ 3’
3’ 5’
site de coupure
(4-8 nt)
Extension 3’
Enzymes de restriction
5’ 3’
3’ 5’
site de coupure
(4-8 nt)
Bouts francs
Enzymes de restriction
clivent les 2 brins d’ADN à des séquences spécifiques (4-8 nt)
nommer pour l’organisme duquel c’était isolé(e.g. EcoRI est isolée d’Escherichia coli)
digestion produit 3 sortes de bouts
1. extension 5’
2. extension 3’
3. bouts francs
Bouts cohésifs
Enzymes de restriction - exemples
BamHI
5'-G/GATCC-3'3'-CCTAG/G-5'
KpnI
5'-GGTAC/C-3'3'-C/CATGG-5'
convention biomol toujours 5' 3'
Enzymes de restriction - exemples
BamHI
5'-G/GATCC-3' 5'-G3'-CCTAG/G-5' 3'-CCTAG-5'
KpnI
5'-GGTAC/C-3' 5'-GGTAC-3'3'-C/CATGG-5' 3'-C
extension 5’
extension 3’
bouts cohésifs
Enzymes de restriction - bouts cohesifs
BamHI
5'-G/GATCC-3' 5'-G
3'-CCTAG/G-5' 3'-CCTAG
GATCC--------------
G--------------
Enzymes de restriction
gel d'agarose (attention: % d'agarose)
Analyse des digestions
Gel #1: plasmide A
1. EcoRI
2. HindIII
3. ScaI
4. 1 kpb ladder
5. EcoRI/ScaI
6. EcoRI/HindIII
7. HindIII/ScaI
8. Non-digeré
Gel #2: plasmide B non - digéré EcoRI + HindIII BamHI + HindIII BamHI + EcoRI 1 kpb ladder
HindIII EcoRI BamHI
gel d'agarose (attention: % d'agarose) graphique log taille vs distance (un par gel)
Analyse des digestions
gel d'agarose (attention: % d'agarose) graphique log taille vs distance (un par gel)
Analyse des digestions
M 2 3 4 5 6 7 Taille
(pb)
10000
8000
6500
4000
1500
1000
ligne des puits
Graphique - log taille vs distance
pas linéaire
pas de courbe de tendance (droite)
Graphique - papier semi-log
graphique de taille vs distance sur papier semi-log bandes de 250 à 10000pb
(1 kpb ladder)
100
1000
10000
taill
e (p
b)
distance (cm)
Graphique - log taille vs distance
pas linéaire
pas de courbe de tendance (droite)
Distance demigration=18cm
log10taille = 3,05taille = 1100 pb
gel d'agarose (attention: % d'agarose)
graphique log taille vs distance (un par gel)
résultats utilisés pour établir la carte de restriction du plasmide
Analyse des digestions
enzyme qui coupe 1 fois est utilisée pour estimer la taille du plasmide
Carte de restriction
4,5 kpb
23.1 9.4 6.6 4.4
2.3 2.0
0.6
Digestion H3
Gel d'agarose Carte de restriction
enzyme qui coupe un plasmide de 4,5 kpb deux fois séparées de 1,5 kpb (1000 pb = 1 kpb)
Carte de restriction
Gel d'agarose
23.1 9.4 6.6 4.4
2.3 2.0
0.6 0.6
Digestion H3
Carte de restriction
2 sites
2
bandes
Exercice: carte de restriction
Information: enzyme fragments # de sites
BamHI 9+6 kpb
EcoRI 10+5
SalI 15
BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp
BamHI / SalI 9, 5, 1
EcoRI / SalI 10, 3, 2
Information: enzyme fragments # de sites
BamHI 9+6 kpb
EcoRI 10+5
SalI 15
BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp
BamHI / SalI 9, 5, 1
EcoRI / SalI 10, 3, 2
Ier étape: nombre de site(s) par enzyme
Exercice: carte de restriction
N’oublier pas que le plasmide est circulaire!
2
2
1
Information: enzyme fragments # de sites
BamHI 9+6 kpb 2
EcoRI 10+5 2
SalI 15 1
BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp
BamHI / SalI 9, 5, 1
EcoRI / SalI 10, 3, 2
2ième étape: taille
Exercice: carte de restriction
15 kpb (±)
Exercice: carte de restrictionInformation: enzyme fragments # de sites
BamHI 9+6 kpb 2
EcoRI 10+5 2
SalI 15 1
BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp
BamHI / SalI 9, 5, 1
EcoRI / SalI 10, 3, 2
3ième étape: placer EcoRI
EcoRIEcoRI 5
10
Exercice: carte de restriction
EcoRIEcoRI
10
5
SalI
23
SalI
Information: enzyme fragments # de sites
BamHI 9+6 kpb 2
EcoRI 10+5 2
SalI 15 1
BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp
BamHI / SalI 9, 5, 1
EcoRI / SalI 10, 3, 2
4ième étape: placer SalI
Exercice: carte de restriction
EcoRIEcoRI
2
10
3
SalI
21
BamHI
BamHI
Information: enzyme fragments # de sites
BamHI 9+6 kpb 2
EcoRI 10+5 2
SalI 15 1
BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp
BamHI / SalI 9, 5, 1
EcoRI / SalI 10, 3, 2
5ième étape: placer les BamHI
Exercice: carte de restrictionInformation: enzyme fragments # de sites
BamHI 9+6 kpb 2
EcoRI 10+5 2
SalI 15 1
BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp
BamHI / SalI 9, 5, 1
EcoRI / SalI 10, 3, 2
5ième étape: placer les BamHI
EcoRIEcoRI
21
SalIBamHI2
7BamHI
3
10
6kpb
Exercice: carte de restrictionInformation: enzyme fragments # de sites
BamHI 9+6 kpb 2
EcoRI 10+5 2
SalI 15 1
BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp
BamHI / SalI 9, 5, 1
EcoRI / SalI 10, 3, 2
6ième étape: vérification
EcoRIEcoRI
2
7
1
SalIBamHI2
BamHI
3(15 kpb)
conçu en 1983 par Kary Mullis(prix Nobel en 1993)
changé le cours de la biologie moléculaire
PCR
produit, in vitro, des nombres gigantesques de copies d'une séquence d'ADN spécifique d'un mélange d'ADN
basé sur le fonctionnement cyclique d'un ADN polymérase
PCR
synthèse de l’ADN en ajoutant des nucléotides au bout 3'-OH d’un l'amorce hybridé à un brin d’ADN matrice
direction de synthèse est 5'→3'.
précurseur est un dNTP qui perd les deux phosphates en position terminale
ADN polymérases
ADN polymérases
matrice
amorce
ADN polymérases
matrice
amorce
PCR - étapes du cycle
PCR - étapes du cycle
N.B. La polymérase doit être thermostable.
PCR - étapes du cycle
Amorce 5'Amorce 3'
PCR - étapes du cycle
Amorce 5'Amorce 3'
nombre de copies = 2n (n = # de cycles)
PCR - une amplification
nombre de copies = 2n (n = # de cycles)
PCR - une amplification
Énorme!
Copies produites
PCR song
http://www.youtube.com/watch?v=x5yPkxCLads
http://www.youtube.com/watch?v=CQEaX3MiDow&feature=related
Enzymes-tampons-nucléotides-marqueurs
1 boîte/table à -20oC
gardez sur glace en tout temps
retournez les tubes à -20oC après l'utilisation (ne jeter pas les restants!)
courte centrifugation avant d'ouvrir un tube
Enzymes-tampons-nucléotides-marqueurs
1 boîte/table pour vos échantillons d'ADN(bien les identifier, ne pas jeter vos PCRs)
pas de réaction de PCR = perte de points
HindIII vs λH3
Point technique - volumes en biomol
biologie moléculaire = petits volumes (~10 μL) soyez prudent dans vos pipettages (P10) toujours sur glace vérifier le volume aspiré rentrer l'embout dans le liquide avant la livraison surveiller la livraison il faut mettre les tubes de 200 et de 500 μl
dans des tubes de 1,5 ml pour les centrifuger
Points techniques - digestions
Digestions
utilisez 6/12 μl d'ADN / digestion
- 6 μl pour les digestions simples
- 12 μl pour les digestions doubles
Points techniques - digestions
Digestions simples:10 μl volume final1 μl enzyme*
Digestions doubles:20 μl volume final1 μl de chaque enzyme* (i.e. 2 μl total d'enzyme)
*Seulement 10% du volume final peut être enzyme. Pourquoi?
Garder les enzymes en dehors du congélateur le minimum possible (quick spin avant d'ouvrir).
Points techniques - gel d'agarose
utilisez le peigne avec 8 (Pharmacia) ou 10 dents (Labnet)
préparer deux gels (1%) de 60 ml (Pharmacia) ou 100 ml (Labnet) / équipe
Gel #1: digestions de plasmide A
Gel #2: digestions de plasmide B
Points techniques - gel d'agarose
chargez
12 μl digestions simples
15 μl digestions doubles (pas les 24 μl)
N'OUBLIEZ PAS DE METTRE LE STANDARD (1KB LADDER) SUR LES DEUX GELS!!!!
Mise en garde...
aucun site
activité étoile et digestions partielles
Mise en garde...
aucun site
activité étoile et digestions partielles
superposition de fragments de même taille
Mise en garde - superposition de bandes
Ex. plasmide d'une taille 6,4 kpb qui donne seulement des bandes de 2,9 et de 0,75 kpb
3000
2000
1000
6,4 3,7 6,4Total (kpb):
Clairement, il y a 2 bandes ici (2,9 + 2,7 kpb).
Mise en garde...
aucun site
activité étoile et digestions partielles
superposition de fragments de même taille
fragments de restriction trop petits pour être visibles sur le gel (surexposer lors de la photographie)
Points techniques - PCR
amplification, alors il faut être en garde pour de la contamination
embouts avec barrières (attention: choisir les bons, uniquement pour les réactions de PCR, $$$)
soyez prudent de ne pas contaminer vos solutions (tampons, eau, nucléotides, etc.)
diluer votre ADN plasmidique 1/20
Points techniques - PCR contamination
amplification, alors il faut être en garde pour de la contamination
non-contaminé contaminép
lasm
ide
+ve
pla
smid
e –
ive
con
trô
le +
veco
ntr
ôle
-iv
e
Point technique - nucleases
embouts + tubes stériles
toujours portez des gants et changez-les souvent
remplir les boîtes uniquement quand vide(sinon, dans tiroir)
portez des gants quand vous remplissez les boîtes d’embouts
boîtes remplies à l'autoclave
solutions préparées semaine I
1.TAE 50X
Points techniques
Compte rendu - présentation des photos
à compléter au labo
sur les images des gels faire attention de:identifier les puitsindiquer les tailles des bandes du marqueurindiquer, si le marqueur est "synthétique", le
fournisseur
Marqueurs de taille
utiliser pour déterminer la taille de l’ADN
préparation de l'échantillonADN (=1 kpb ladder) 5 µl10X OPA 2 µlH2O 3 µl6X LB 2 µl
12 µl
Compte rendu - tailles des fragments
log taille vs distances de migration des bandes du marqueur
papier semi-log (alors taille vs distance)
à main
pas de courbe de tendance
un graphique pour chaque gel!
Biologie moléculaire - questions
ADN plasmidique superenroulé
Recommended