Biologie Moléculaire Travailler avec lADN. Sujets ADN Genomique vs. Vecteur ADN Genomique vs....

Biologie Moléculaire

Travailler avec l’ADNTravailler avec l’ADN

SujetsSujets

ADN Genomique vs. VecteurADN Genomique vs. Vecteur Purification d’ADN plasmidiquePurification d’ADN plasmidique Enzyme de restrictionEnzyme de restriction Essentielle de la cartographie de Essentielle de la cartographie de

restriction restriction

ADNADN

GenomiqueGenomique Prokaryote vs. eukaryoteProkaryote vs. eukaryote Circulaire ou linéaireCirculaire ou linéaire Un ou plus dUn ou plus d’un’un chromosomes chromosomes

Extra-genomiqueExtra-genomique VecteursVecteurs PlasmidesPlasmides

Vecteurs Vs PlasmidesVecteurs Vs Plasmides

Vecteur: Vecteur: Véhicule d’ADN permettant le clonage, Véhicule d’ADN permettant le clonage,

maintien et amplification d’une maintien et amplification d’une séquence d’ADNséquence d’ADN

PlasmidesPlasmides VirusVirus ChromosomesChromosomes

Tous les plasmides sont des vecteursTous les plasmides sont des vecteurs Pas tous les vecteurs sont des plasmides Pas tous les vecteurs sont des plasmides

PlasmidesPlasmides

Petites molécules d’ADN circulaires Petites molécules d’ADN circulaires maintenues et amplifiées chez des maintenues et amplifiées chez des cellules eucaryotes ou procaryotescellules eucaryotes ou procaryotes

Amplification chez les bactériesAmplification chez les bactéries

Utilisé en tant que vecteur pour le Utilisé en tant que vecteur pour le clonage ou l’expression d’ADN clonage ou l’expression d’ADN d’intérêtd’intérêt

Caractéristiques des Caractéristiques des Vecteurs PlasmidiquesVecteurs Plasmidiques

Sites de restrictions Sites de restrictions uniques pour le uniques pour le clonageclonage

Origine de réplication Origine de réplication (Ori)(Ori)

Marqueur de Marqueur de sélectionsélection Gènes de résistance Gènes de résistance

aux antibiotiques aux antibiotiques

Isolation d’ADNIsolation d’ADN

ButsButs Isolation de l’ADN désiréIsolation de l’ADN désiré

Chromosomique ou plasmidique?Chromosomique ou plasmidique? Retirer les autres composantesRetirer les autres composantes

ADN chromosomique ou plasmidique?ADN chromosomique ou plasmidique? ProtéinesProtéines ARNARN Produits chimiquesProduits chimiques

Sels, détergents, etc.Sels, détergents, etc.

Lyse cellulaireLyse cellulaire Paroi et membraneParoi et membrane

EnzymatiqueEnzymatique ChimiqueChimique MécaniqueMécanique

Isolation de l’ADN désiréIsolation de l’ADN désiré Sédimentation différentielleSédimentation différentielle ChromatographieChromatographie

Retirer les autres composantesRetirer les autres composantes EnzymatiqueEnzymatique Sédimentation différentielleSédimentation différentielle ChromatographieChromatographie

Isolation d’ADN Isolation d’ADN (suite)(suite)

Isolation d’ADN Isolation d’ADN Plasmidique par Lyse Plasmidique par Lyse Alcaline (Alcaline (E.coli E.coli ))

Solutions UtiliséesSolutions Utilisées

Sol. I – Tampon de suspensionSol. I – Tampon de suspension Tris HCl - Tampon, protège les acides Tris HCl - Tampon, protège les acides

nucléiques nucléiques EDTA - Chélates Mg++, empêche les EDTA - Chélates Mg++, empêche les

nucléases de fonctionner nucléases de fonctionner Sol. II – Solution de lyseSol. II – Solution de lyse

NaOH - ^pH lyse cellulaire, dénature NaOH - ^pH lyse cellulaire, dénature ADN ADN

SDS - dissous membranes, denture et lie SDS - dissous membranes, denture et lie protéines protéines

Solutions Utilisées Solutions Utilisées (suite)(suite)

Sol. III- Acétate de potassiumSol. III- Acétate de potassium Renaturation de l’ADNRenaturation de l’ADN Précipite SDSPrécipite SDS Précipite ADN génomique et protéinesPrécipite ADN génomique et protéines

Isopropanol / Éthanol Isopropanol / Éthanol Précipite acides nucléiques (plasmide Précipite acides nucléiques (plasmide

et ?) et ?) Sels demeurent solubles Sels demeurent solubles

TE-RNase - Tris & EDTA encore; TE-RNase - Tris & EDTA encore; RNase??RNase??

Quantification de l’DNAQuantification de l’DNA

Déterminer la Conc. d’DNADéterminer la Conc. d’DNA A260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µLA260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µL

Déterminer la quantité d’DNADéterminer la quantité d’DNA 1mL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg DNA1mL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg DNA 1µL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng DNA1µL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng DNA

Ne pas oublier de prendre en considération le Ne pas oublier de prendre en considération le FACTEUR DE DILUTIONFACTEUR DE DILUTION

Enzymes de RestrictionEnzymes de Restriction

Clive les liens phosphodiester Clive les liens phosphodiester internesinternes

Reconnaissent des séquences Reconnaissent des séquences doubles brins spécifiquesdoubles brins spécifiques

Différentes endonucléases Différentes endonucléases reconnaissent différentes séquencesreconnaissent différentes séquences

Reconnaissent des séquences Reconnaissent des séquences palindromespalindromes

PalindromesPalindromes

La même séquence est lue dans la La même séquence est lue dans la direction 5’» 3’ sur les deux brinsdirection 5’» 3’ sur les deux brins

5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

Les mêmes liens phosphodiesters Les mêmes liens phosphodiesters sont clivés sur les deux brins!sont clivés sur les deux brins!

5’-G

3’-C C T A G

G A T C C-3’

G-5’

Différentes Extrémités Différentes Extrémités sont Généréessont Générées

5’-G

3’-C C T

G A

A G

T C C-3’

G-5’Extrémités franches

Différentes Extrémités Différentes Extrémités sont Généréessont Générées

Extrémités 5’ protubérantes5’-G

3’-C C T A G

G A T C C-3’

G-5’

Différentes Extrémités Différentes Extrémités sont Généréessont Générées

Extrémités 3’ protubérantes3’-C

5’-G G A T C C-3’

C T A G G-5’

Compatibilité des Compatibilité des ExtrémitésExtrémités

OPO

P

Extrémités franches

HOPOH

P

Compatible

Compatibilité des Compatibilité des ExtrémitésExtrémités

Extrémités Protubérantes

HOPOH

P

HOPO

P

Incompatible

Compatibilité des Compatibilité des ExtrémitésExtrémités

Extrémités Protubérantes

HOPOH

P

HOPO

P

Incompatible

Compatibilité des Compatibilité des ExtrémitésExtrémités

Extrémités Protubérantes

P-CTAGHOGATC-P

OH

Compatible

P-CTAGOGATC-P

O

Appariement

Compatibilité des ExtrémitésCompatibilité des Extrémités

Extrémités protubérantes

P-TCCAHOGATC-P

OH

Incompatible

P-TCCAHO

GATC-POH

Appariement

Cartographie des Sites Cartographie des Sites de Restrictionsde Restrictions

L’ADN est-il digéré?L’ADN est-il digéré?

Doit comparer à un témoin non digéré

D1ND D2

La digestion est-elle La digestion est-elle complète?complète?

Doit comparer à un témoin non-digéré

Partiel

Complet

Digestion partielleDigestion partielle

Toutes les molécules cibles ne sont Toutes les molécules cibles ne sont pas coupées à toutes les sites pas coupées à toutes les sites possibles!possibles! Génère différents produits Génère différents produits

intermédiairesintermédiaires

1 2 3

1 Produit d’une digestion complète

Produit d’une digestion partielle (intermédiaire)1 + 2

Produit d’une digestion partielle (intermédiaire)

2 + 3

Digestion partielleDigestion partielle

Complète Vs PartielleComplète Vs Partielle

Une digestion complète donne une Une digestion complète donne une stoechiométrie de 1:1:1…stoechiométrie de 1:1:1… Le nombre de molécules de chacun Le nombre de molécules de chacun

des différents fragments est le même!des différents fragments est le même!

La stoechiométrie d’une digestion La stoechiométrie d’une digestion partielle est variable:partielle est variable: Ex. 1:3:2…Ex. 1:3:2…

Ex.Ex.1 2 3

Combien de molécules de chacun des fragments seraient générées suite à une digestion complète?

3; donc une stœchiométrie de 3:3:3 =1:1:13; donc une stœchiométrie de 3:3:3 =1:1:1

Combien de molécules de chacun des fragments seraient générées suite à une digestion partielle?

Évaluer la Stœchiométrie Évaluer la Stœchiométrie sur Gel d’Agarosesur Gel d’Agarose

PrincipePrincipe La quantité de bromure d’éthidium qui lie La quantité de bromure d’éthidium qui lie

l’ADN est proportionnelle à la taille de l’ADNl’ADN est proportionnelle à la taille de l’ADN La quantité de bromure d’éthidium qui lie La quantité de bromure d’éthidium qui lie

l’ADN est proportionnelle à la quantité d’ADNl’ADN est proportionnelle à la quantité d’ADN Dans le cas d’une digestion complète, la quantité Dans le cas d’une digestion complète, la quantité

de bromure d’éthidium qui lie l’ADN est seulement de bromure d’éthidium qui lie l’ADN est seulement proportionnelle à la taille de l’ADNproportionnelle à la taille de l’ADN

Pourquoi?Pourquoi?

Ex.Ex.

Stœchiométrie pas respectée

Stœchiométrie respectée

Stœchiométrie pas respectée

Stœchiométrie respectée

ExemplesExemples

ExemplesExemples

11ièreière étape: étape: Déterminer le nombre de Déterminer le nombre de coupurescoupures

Est-ce que l’ADN a été digéré? Est-ce que l’ADN a été digéré? Non- Aucune cartographie requiseNon- Aucune cartographie requise OuiOui

La digestion est-elle complète?La digestion est-elle complète? La digestion est-elle partielle?La digestion est-elle partielle?

Quels produits sont des intermédiairesQuels produits sont des intermédiaires

Combien de fois l’ADN a-t-il coupéCombien de fois l’ADN a-t-il coupé Les coupures sont dans le vecteurLes coupures sont dans le vecteur

Aucune cartographie requiseAucune cartographie requiseLes coupures sont dans l’insertionLes coupures sont dans l’insertion

Cartographie requiseCartographie requise

Combien de Sites de Combien de Sites de Restriction est-ce qu’il y a?Restriction est-ce qu’il y a?

ADN linéaire (ex. Chromosome ADN linéaire (ex. Chromosome humain)humain) Le nombre de coupures est égal au Le nombre de coupures est égal au

nombre de fragments moins unnombre de fragments moins un

ADN circulaire (ex. Plasmide)ADN circulaire (ex. Plasmide) Le nombre de coupures est égal au Le nombre de coupures est égal au

nombre de fragmentsnombre de fragments

Les coupures sont-elles Les coupures sont-elles dans l’insertion ou le dans l’insertion ou le vecteur?vecteur?

B coupe 2 fois dans le vecteur et 0 fois dans l’insertion E coupe 1 fois dans le vecteur et 1 fois dans l’insertionP coupe 1 fois dans le vecteur et 2 fois dans l’insertion

insertB BE ?

S

Taille du vecteur2.5kpb

P

22ee Étape: Quelles sont les Étape: Quelles sont les positions des sites de positions des sites de restrictions? restrictions?

Cartographie relative est faiteCartographie relative est faite Les sites de restriction sont Les sites de restriction sont

cartographiés en relation en un point cartographiés en relation en un point de référencede référence

La position du point de référence doit La position du point de référence doit être connueêtre connue

Dois Déterminer la Taille de Dois Déterminer la Taille de l’Insertion l’Insertion

1. Déterminer la taille des fragments issus d’une digestion complète2. Déterminer la taille totale du plasmide (Somme des tailles)3. Déterminer la taille de l’insertion (Taille du plasmide - Taille du vecteur)

insertB BE ?

S

Taille du vecteur2.5kpb

P

Déterminer les TaillesDéterminer les Tailles

Enz Distance (cm)Tailles

pb

P0.60.92.1

30001100900

E0.31.9

45001000

Donc : Taille du plasmide 5KpbTaille de l’insertion 5000pb – 2500pb = 2500pb

Cartographie du Site PCartographie du Site P

Insertion (2.5kpb)P

1.1kbpouP

1.1kbpP

Impossible puisque le second site doit être dans l’insert!

Insertion (2.5kpb)P

0.9kbpouP

0.9kbpP

Impossible puisque le second site doit être dans l’insert!

Cartographie du Site P Cartographie du Site P (Suite)(Suite)

Insertion (2.5kpb)P

1.1kbpP

0.9kbpP

Insert (2.5kpb)P

0.9kbpP

1.1kbpP

Ou

Déterminer l’OrientationDéterminer l’Orientation

Insertion (2.5kpb)P1.0kbpE E

Déterminer l’OrientationDéterminer l’Orientation

Insertion (2.5kpb)P

1.1kbpP

0.9kbpP

Insert (2.5kpb)P

0.9kbpP

1.1kbpP

Or

1.0kbpE E

1.0kbpE E

Déterminer l’OrientationDéterminer l’Orientation