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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
JULIANA MARIA OLIVEIRA DE SOUZA
BIORREDUÇÃO DE CETONAS AROMÁTICAS
UTILIZANDO CÉLULAS ÍNTEGRAS DE HELIANTHUS
ANNUUS L. (GIRASSOL)
FORTALEZA-CEARÁ
2012
1
JULIANA MARIA OLIVEIRA DE SOUZA
BIORREDUÇÃO DE CETONAS AROMÁTICAS UTILIZANDO CÉLULAS
ÍNTEGRAS DE HELIANTHUS ANNUUS L. (GIRASSOL)
FORTALEZA-CEARÁ
2012
Dissertação de Mestrado submetida à
Coordenação do Curso de Pós-Graduação
em Química, da Universidade Federal do
Ceará, como requisito parcial para
obtenção do Título de Mestre em Química.
Área de Concentração: Química Orgânica
Orientadora: Telma Leda Gomes de Lemos
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências e Tecnologia
______________________________________________________________________ S715b Souza, Juliana Maria Oliveira de.
Biorredução de cetonas aromáticos utilizando células íntegras de Helianthus annuus L. (Girassol) /
Juliana Maria Oliveira de Souza. – 2012.
137 f. : il. color., enc. ; 30 cm.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Departamento de
Química. Programa de Pós-Graduação em Química, Fortaleza, 2012.
Área de concentração: Química Orgânica.
Orientação: Profa. Dra. Telma Leda Gomes de Lemos.
1. Biorredução-cetona. 2. Biocatálise. 3. Girassol. I. Título.
CDD 547
2
3
A Deus por toda graça.
A minha mãe e irmão por todo amor e dedicação.
Ao meu pai, meu herói.
A minha vó, Izaura (in memoriam), por todo exemplo.
Aos amigos por todos os momentos.
4
"Provai e vede como o Senhor é bom, feliz o homem que encontra nele o seu refúgio.”
Salmo 33
5
AGRADECIMENTOS
A Deus por todo amor e infinita misericórdia, por sustentar-me inúmeras vezes nessa
batalha tão difícil que a vida, por mostrar-me os caminhos certos a seguir e por nunca
desistir de mim, por ter me dado a oportunidade de ser apenas eu e poder estar ao lado
dessas pessoas aqui embaixo, agradecendo a elas também.
A minha mãe, razão de toda essa conquista, por sempre estar ao meu lado,
demonstrando infinito amor e compreensão, por fazer o seu melhor, para sempre ver o
meu melhor acontecer, obrigada por tudo.
Ao meu pai, por quem eu sempre busquei ser melhor nessa vida.
A minha vó (in memoriam), por ter me incentivado a ser uma pessoa guerreira e
batalhadora por aquilo que acredito, por ser meu maior exemplo e minha maior coragem
de viver. Saudades!
A minha orientadora, Profa. Telma Leda, por ter aceito mais esta filha de peito aberto na
família LBPN, por todos os conhecimentos repassados, por toda atenção,
disponibilidade e contribuição para a minha vida acadêmica e profissional.
Ao meu irmão, Rafael, por ser meu apoio, minha segurança, minha infância sempre
vivida e revivida a cada dia.
A Leila Parente, por ter me encaminhado nos primeiros experimentos do laboratório,
por ter me ensinado o “andar da carruagem” e assim contribuído com o
desenvolvimento deste trabalho e seu consequente sucesso.
A minha querida amiga Ayla, por sempre ter me ajudado nos momentos de sufoco,
pelas análises de RMN e ensinamentos experimentais, mas o que tenho de mais
importante a agradecer foi a oportunidade de tê-la feito presença marcante em minha
vida com sua amizade. Pessoa querida, que amo muito, sua amizade é dádiva de Deus.
Aos amigos Leo Alcântara, Bertini e Felipe, fiéis guerreiros de batalha. Obrigada pelo
apoio e pelos domingos, feriados e madrugadas em que podemos trabalhar juntos. Leo,
não esqueço, muito obrigada pela força durante a seleção do doutorado, mostrou-se um
verdadeiro amigo. Bertini muito obrigada pelo apoio.
6
Aos amigos irmãos do laboratório mais feliz da UFC: Ayla, Leo Alcântara, Bertini,
Luciana, Felipe, Cleane, Patrícia, André, Leila, Karina, Anderson, Allyson, Gisele e Leo
Carvalho. Os melhores dias são todos aqueles em podemos trabalhar juntos. Obrigada
por tudo, por me acolherem, por todo apoio, amizade, companheirismo e lealdade,
guardo-os em meu coração. Não esquecendo da amiga Daniele, pelos momentos de
descontração e fiel amizade.
A minha família tão querida e que sempre me apoiou, obrigada pelos sempre belos
gestos de amizade e pelas orações.
Aos meus amigos mais polares, Thays e Leo, por sempre estarem ao meu lado, por me
amarem tanto, amo-os muito, que a vida possa sempre dar oportunidade para eu declarar
minha felicidade por tê-los comigo sempre
A minha amiga mais irmã, Lilian, flor da minha vida, presente sempre nos momentos de
alegria e nos momentos de não tanta alegria, apoio certo e amizade eterna.
As minhas amigas, Pamella e Gliamici, lembrança sempre viva em meu coração, base
de tudo sou, pessoas mais que importantes são essenciais em minha vida.
Aos amigos de hoje e sempre, que levaram um pouco de mim e deixaram um pouco de
si, obrigada por me cativarem, e terem se tornado únicos no mundo.
Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Química pelos conhecimentos e apoio
durante o curso, obrigada por contribuirem de forma direta para minha formação.
A Caroline Lustosa do LABS por conceder, sempre com muita atenção, alguns dos
substratos investigados neste trabalho.
A Edilane pela compreensão nas análises de CG/EM.
A FUNCAP pela bolsa concedida.
7
RESUMO
O estudo da biocatálise tem se intensificado nos últimos anos devido à busca de rotas
sintéticas alternativas para a obtenção de compostos enantiomericamente puros. A
utilização de sementes de Helianthus annuus L. ainda não foi relatada na literatura em
reações de biorredução e diante dessa perspectiva, foram investigadas na biorredução de
cetonas aromáticas, para a obtenção de álcoois enantiomericamente puros. O teor de
proteínas das sementes foi determinado pelos métodos de Lowry e Bradford e
apresentaram valores correspondentes a 10,1 g/L e 8,8 g/L, respectivamente. As reações
de biorredução foram otimizadas utilizando acetofenona (1), e nestas foram avaliados os
fatores: quantidade de biocatalisador, meio tamponante (pH), co-solvente, germinação
de sementes e extrato bruto com polivilpirrolidona (PVP). Foram obtidos boas
conversões (56,9%) em meio aquoso e, excelentes excessos enantiómericos (ee),
(>99,0%) com o extrato bruto enzimático em PVP do enantiômero (S). Derivados da
acetofenona, uma cetona α-halogenada e duas outras cetonas aromáticas, α-tetralona e
α-indanona, foram submetidas às metodologias otimizadas de conversão e ee, obtendo-
se bons resultados, com produção do enantiômero S, exceto para a 3-metóxi-
acetofenona em meio aquoso, que apresentou o isômero R. A quantificação dos teores
de conversão foi realizada por intermédio da construção de curvas de calibração em
Cromatográfo Líquido de Alta Eficiência (CLAE), bem como a resolução dos álcoois
quirais utilizando coluna quiral OB-H.
Palavras-chave: biorredução, cetonas aromáticas, Helianthus annuus L, células
íntegras.
8
ABSTRACT
The study of biocatalysis has intensified in recent years due to the search for alternative
synthetic routes to obtain enantiomerically pure compounds. The use of seeds of
Helianthus annuus L. has not been reported in the literature and bioreduction reactions
at this point of view, were investigated in the bioreduction of aromatic ketones, to
obtain enantiomerically pure alcohols. The protein content of the seeds was determined
by Lowry and Bradford methods and gave values corresponding to 10,1g/L and 8,8g/L,
respectively. The bioreduction reactions were optimized using acetophenone (1), and
these factors were evaluated: the amount of biocatalyst, using buffer (pH), co-solvent,
seed germination and the crude extract with polyvinylpyrrolidone (PVP). Good
conversions were obtained (56,9%) in aqueous solution and excellent enantiomeric
excess (ee) (>99,0%) crude extract with the enzyme in PVP enantiomer (S). Derivatives
of acetophenone, an α-halogenated ketone and two other aromatic ketones, α-tetralone
and α-indanone were subjected to the methods of conversion and ee optimized to yield
good results, with production of the S enantiomer, except for the 3-methoxy-
acetophenone in aqueous media, which made the R isomer. Quantitation of the
conversion levels were determined by the construction of calibration curves in a High
Efficiency Liquid Chromatograph (HPLC) and the resolution of chiral alcohols using a
chiral column OB-H.
Keywords: bioreduction, aromatic ketones, Helianthus annuus L., whole cell.
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estruturas da Efedrina, Ampicilina e Cefadroxil obtidas por
biotransformações...........................................................................................
32
Figura 2 Álcoois quirais e produtos obtidos a partir de álcoois quirais........................ 34
Figura 3 Estruturas de terpenos quirais e produtos obtidos a partir deles..................... 35
Figura 4 Álcoois quirais de interesse industrial............................................................ 36
Figura 5 Redução assimétrica biocatálitica de compostos carbonílicos com NADPH
na presença de ADH.......................................................................................
37
Figura 6 Biorredução da acetofenona utilizando várias espécies de plantas................. 38
Figura 7 Cetonas utilizadas na biorredução com Arabidopsis thaliana........................ 39
Figura 8 Fotografia da flor de Helianthus annuus L. tendo como detalhe as sementes
utilizadas nas biotransformações....................................................................
41
Figura 9 Estruturas dos ácidos fenólicos presentes nas sementes de Helianthus
annuus L..........................................................................................................
43
Figura 10 Aminoácidos utilizados para biotransformação por Helianthus annuus
L......................................................................................................................
44
Figura 11 Esquema da reação de redução das cetonas pró-quirais por via química....... 46
Figura 12 Detalhe da reação do extrato enzimático das sementes de Helianthus
annuus L. com o íon cobre (II)....................................................................... 55
Figura 13 Detalhe da reação do extrato enzimático das sementes de Helianthus
annuus L. com o reagente de Folin-Ciocalteau.............................................. 55
Figura 14 Detalhe do método de Bradford para determinação de proteínas após a
adição do reagente Coomassie Brilliant Blue G-250...................................... 56
Figura 15 Esquema da reação de redução da acetofenona por via enzimática................ 58
Figura 16 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 5 g de
Helianthus annuus L....................................................................................... 59
Figura 17 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 10 g
de Helianthus annuus L.................................................................................. 59
Figura 18 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 20 g
de Helianthus annuus L.................................................................................. 59
Figura 19 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 1% de
isopropanol...................................................................................................... 61
Figura 20 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 2% de
isopropanol......................................................................................................
61
10
Figura 21 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 5% de
isopropanol...................................................................................................... 62
Figura 22 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 10%
de isopropanol................................................................................................. 62
Figura 23 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando
solução tampão pH 6,0.................................................................................... 64
Figura 24 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando
solução tampão pH 7,0.................................................................................... 64
Figura 25 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando
solução tampão pH 8,0.................................................................................... 65
Figura 26 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando
extrato bruto enzimático com PVP................................................................. 66
Figura 27 Estrutura monomérica do polímero PVP........................................................ 67
Figura 28 Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando
sementes germinadas de Helianthus annuus L............................................... 68
Figura 29 Cetonas selecionadas para a reação com as sementes de Helianthus annuus
L...................................................................................................................... 69
Figura 30 Produtos esperados da reação das cetonas -para substituídas utilizando a
metodologia G10 e Gpvp................................................................................ 70
Figura 31 Cromatograma de biorredução da 4-bromo-acetofenona utilizando a
metodologia G10............................................................................................. 71
Figura 32 Cromatograma de biorredução da 4-bromo-acetofenona utilizando a
metodologia Gpvp........................................................................................... 71
Figura 33 Cromatograma de biorredução da 4-fluoro-acetofenona utilizando a
metodologia G10............................................................................................. 73
Figura 34 Cromatograma de biorredução da 4-fluoro-acetofenona utilizando a
metodologia Gpvp........................................................................................... 73
Figura 35 Cromatograma de biorredução da 4-cloro-acetofenona utilizando a
metodologia G10............................................................................................. 74
Figura 36 Cromatograma de biorredução da 4-cloro-acetofenona utilizando a
metodologia Gpvp........................................................................................... 75
Figura 37 Cromatograma de biorredução da 4-metóxi-acetofenona utilizando a
metodologia G10............................................................................................. 76
11
Figura 38 Cromatograma de biorredução da 4-metóxi-acetofenona utilizando a
metodologia Gpvp...........................................................................................
76
Figura 39 Cromatograma de biorredução da 4-metil-acetofenona utilizando a
metodologia G10............................................................................................. 78
Figura 40 Cromatograma de biorredução da 4-metil-acetofenona utilizando a
metodologia Gpvp...........................................................................................
78
Figura 41 Cromatograma CG/EM da biorredução da 4-metil-acetofenona utilizando a
metodologia Gpvp...........................................................................................
79
Figura 42 Espectro de massa do 4-metil-feniletanol....................................................... 79
Figura 43 Espectro de massa da 4-metil-acetofenona..................................................... 79
Figura 44 Produtos esperados da reação das cetonas -meta substituídas utilizando a
metodologia G10 e Gpvp................................................................................
81
Figura 45 Cromatograma de biorredução da 3-bromo-acetofenona utilizando a
metodologia G10.............................................................................................
82
Figura 46 Cromatograma de biorredução da 3-bromo-acetofenona utilizando a
metodologia Gpvp...........................................................................................
82
Figura 47 Cromatograma de biorredução da 3-metóxi-acetofenona utilizando a
metodologia G10.............................................................................................
84
Figura 48 Cromatograma de biorredução da 3-metóxi-acetofenona utilizando a
metodologia Gpvp...........................................................................................
84
Figura 49 Produtos esperados da reação das cetonas -orto substituídas utilizando a
metodologia G10 e Gpvp................................................................................
85
Figura 50 Cromatograma de biorredução da 2-bromo-acetofenona utilizando a
metodologia G10.............................................................................................
86
Figura 51 Cromatograma de biorredução da 2-bromo-acetofenona utilizando a
metodologia Gpvp...........................................................................................
86
Figura 52 Cromatograma de biorredução da 2-cloro-acetofenona utilizando a
metodologia G10.............................................................................................
88
Figura 53 Cromatograma de biorredução da 2-cloro-acetofenona utilizando a
metodologia Gpvp...........................................................................................
88
Figura 54 Cromatograma de biorredução da 2-metóxi-acetofenona utilizando a
metodologia G10.............................................................................................
89
12
Figura 55 Cromatograma de biorredução da 2-metóxi-acetofenona utilizando a
metodologia Gpvp...........................................................................................
90
Figura 56 Cromatograma de biorredução da 2-hidróxi-acetofenona utilizando a
metodologia G10.............................................................................................
91
Figura 57 Cromatograma de biorredução da 2-hidróxi-acetofenona utilizando a
metodologia Gpvp...........................................................................................
91
Figura 58 Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) da 2-hidróxi-acetofenona.............. 92
Figura 59 Produto esperado da reação da 2,2,2-trifluoro-acetofenona utilizando a
metodologia G10 e Gpvp................................................................................
93
Figura 60 Cromatograma de biorredução da 2,2,2-trifluoro-acetofenona utilizando a
metodologia G10.............................................................................................
94
Figura 61 Cromatograma de biorredução da 2,2,2-trifluoro-acetofenona utilizando a
metodologia Gpvp...........................................................................................
94
Figura 62 Produtos esperados da reação da α-tetralona e da α-indanona utilizando a
metodologia G10 e Gpvp................................................................................
95
Figura 63 Cromatograma de biorredução da α-tetralona utilizando a metodologia
G10..................................................................................................................
96
Figura 64 Cromatograma de biorredução da α-tetralona utilizando a metodologia
Gpvp................................................................................................................
96
Figura 65 Cromatograma de biorredução da α-indanona utilizando a metodologia
G10..................................................................................................................
98
Figura 66 Cromatograma de biorredução da α-indanona utilizando a metodologia
Gpvp................................................................................................................
98
Figura 67 Detalhe da CCD da biorredução da acetofenona............................................ 101
Figura 68 Cromátografo Líquido de Alta Eficiência utilizado nas análises de
biorredução e em detalhe a coluna quiral OB-H.............................................
102
Figura 69 Detalhe do espectrofotômetro modelo Cary 50 Conc da Varian.................... 104
Figura 70 Reações de biorredução utilizando as sementes de girassol........................... 107
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Disposição cinética e efeitos estereosseletivos de alguns fármacos
quirais..........................................................................................................
31
Tabela 2 Rendimentos da obtenção dos álcoois padrões 1a-15a............................... 46
Tabela 3 Substratos utilizados para a obtenção das curvas de calibração para
análise do teor de conversão nas reações de biorredução...........................
47
Tabela 4 Resultados de biorredução da acetofenona utilizando 5 g, 10 g e 20 g de
Helianthus annuus L...................................................................................
58
Tabela 5 Resultados de biorredução da acetofenona com sementes de Helianthus
annuus L. utilizando isopropanol como co-solvente.................................. 61
Tabela 6 Resultados de biorredução da acetofenona com sementes de Helianthus
annuus L. utilizando diferentes soluções tampão....................................... 64
Tabela 7 Resultados de biorredução da acetofenona com sementes de Helianthus
annuus L. utilizando extrato bruto enzimático com PVP........................... 66
Tabela 8 Resultados de biorredução da acetofenona com sementes de Helianthus
annuus L. germinadas................................................................................. 67
Tabela 9 Resultados da biotransformação da 4-bromo-acetofenona com sementes
de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp......................... 71
Tabela 10 Resultados da biotransformação da 4-fluoro-acetofenona com sementes
de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp......................... 72
Tabela 11 Resultados da biotransformação da 4-cloro-acetofenona com sementes
de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp......................... 74
Tabela 12 Resultados da biotransformação da 4-cloro-acetofenona com sementes
de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp......................... 76
Tabela 13 Resultados da biotransformação da 4-metil-acetofenona com sementes
de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp......................... 77
Tabela 14 Resultados da biotransformação da 3-bromo-acetofenona com sementes
de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp......................... 81
Tabela 15 Resultados da biotransformação da 3-metóxi-acetofenona com sementes
de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp......................... 83
Tabela 16 Resultados da biotransformação da 2-bromo-acetofenona com sementes
de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp......................... 86
14
Tabela 17 Resultados da biotransformação da 2-cloro-acetofenona com sementes
de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.........................
87
Tabela 18 Resultados da biotransformação da 2-metóxi-acetofenona com sementes
de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp......................... 89
Tabela 19 Resultados da biotransformação da 2-hidróxi-acetofenona com sementes
de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp......................... 90
Tabela 20 Resultados da biotransformação da 2,2,2-trifluoro-acetofenona com
sementes de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp......... 93
Tabela 21 Resultados da biotransformação da α-tetralona com sementes de
Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.............................. 96
Tabela 22 Resultados da biotransformação da α-indanona com sementes de
Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.............................. 97
Tabela 23 Parâmetros de análise por CLAE dos substratos utilizados nas reações de
biotransformação......................................................................................... 103
15
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 Curva de calibração da acetofenona........................................................... 49
Gráfico 2 Curva de calibração do (±)-feniletanol....................................................... 49
Gráfico 3 Curva de calibração da 4-bromo-acetofenona............................................ 50
Gráfico 4 Curva de calibração do: (±) 1-(4-bromofenil)-etanol................................. 50
Gráfico 5 Curva de calibração da 4-fluoro-acetofenona............................................. 50
Gráfico 6 Curva de calibração do (±) 1-(4-fluorofenil)-etanol................................... 50
Gráfico 7 Curva de calibração da 4-cloro-acetofenona............................................... 50
Gráfico 8 Curva de calibração do (±) 1-(4-clorofenil)-etanol..................................... 50
Gráfico 9 Curva de calibração da 4-metóxi-acetofenona............................................ 51
Gráfico 10 Curva de calibração do (±) 1-(4-metóxifenil)-etanol.................................. 51
Gráfico 11 Curva de calibração da 4-metil-acetofenona............................................... 51
Gráfico 12 Curva de calibração do (±) 1-(4-metilfenil)-etanol..................................... 51
Gráfico 13 Curva de calibração da 3-bromo-acetofenona............................................ 51
Gráfico 14 Curva de calibração do (±)3-bromo-feniletanol......................................... 51
Gráfico 15 Curva de calibração da 3-metóxi-acetofenona............................................ 52
Gráfico 16 Curva de calibração do (±) 1-(3-metóxifenil)-etanol.................................. 52
Gráfico 17 Curva de calibração da 2-bromo-acetofenona............................................ 52
Gráfico 18 Curva de calibração do (±) 1-(2-bromofenil)-etanol................................... 52
Gráfico 19 Curva de calibração da 2-cloro-acetofenona............................................... 52
Gráfico 20 Curva de calibração do (±) 1-(2-clorofenil)-etanol..................................... 52
Gráfico 21 Curva de calibração da 2-metóxi-acetofenona............................................ 53
Gráfico 22 Curva de calibração do (±) 1-(2-metóxifenil)-etanol.................................. 53
Gráfico 23 Curva de calibração da 2,2,2-trifluoro-acetofenona................................... 53
Gráfico 24 Curva de calibração do 2,2,2-trifluoro-feniletanol..................................... 53
16
Gráfico 25 Curva de calibração da α-tetralona............................................................. 53
Gráfico 26 Curva de calibração do (±)-α-tetralol.......................................................... 53
Gráfico 27 Curva de calibração da α-indanona............................................................. 54
Gráfico 28 Curva de calibração do α-indanol............................................................... 54
Gráfico 29 Estudo comparativo das metodologias de Lowry e Bradford para a
determinação de proteínas solúveis totais...................................................
57
Gráfico 30 Perfil de conversão da biorredução da acetofenona utilizando diferentes
proporções de biocatalisador.......................................................................
60
Gráfico 31 Perfil do excesso enantiomérico da biorredução da acetofenona
utilizando diferentes proporções de biocatalisador.....................................
60
Gráfico 32 Perfil de conversão da biorredução da acetofenona utilizando diferentes
proporções de co-solvente: isopropanol......................................................
63
Gráfico 33 Perfil do excesso enantiomérico da biorredução da acetofenona
utilizando diferentes proporções de co-solvente: isopropanol....................
63
Gráfico 34 Perfil de conversão da biorredução da acetofenona utilizando soluções
tampão com diferentes valores de pH.........................................................
65
Gráfico 35 Perfil do excesso enantiomérico da biorredução da acetofenona
utilizando soluções tampão com diferentes valores de pH.........................
65
Gráfico 36 Perfil de biotransformação da 4-bromo-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp..........................................................................
72
Gráfico 37 Perfil de biotransformação da 4-fluoro-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp..........................................................................
73
Gráfico 38 Perfil de biotransformação da 4-cloro-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp..........................................................................
75
Gráfico 39 Perfil de biotransformação da 4-metóxi-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp..........................................................................
77
Gráfico 40 Perfil de biotransformação da 4-metil-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp..........................................................................
80
Gráfico 41 Perfil de biotransformação da 3-bromo-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp..........................................................................
82
Gráfico 42 Perfil de biotransformação da 3-metóxi-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp..........................................................................
84
17
Gráfico 43 Perfil de biotransformação da 2-bromo-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp..........................................................................
87
Gráfico 44 Perfil de biotransformação da 2-cloro-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp..........................................................................
88
Gráfico 45 Perfil de biotransformação da 2-metóxi-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp..........................................................................
90
Gráfico 46 Perfil de biotransformação da 2,2,2-trifluoro-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp..........................................................................
94
Gráfico 47 Perfil de biotransformação da α-tetralona utilizando as metodologias
G10 e Gpvp.................................................................................................
97
Gráfico 48 Perfil de biotransformação da α-indanona utilizando as metodologias
G10 e Gpvp.................................................................................................
98
18
LISTA DE ABREVIATURAS
AcOEt Acetato de Etila
BSA Albumina Bovina
CC Coluna Cromatográfica
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CENAUREMN Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética
Nuclear
CG/EM Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
ee Excesso Enantiomérico
IV Infravermelho
iPrOH Isopropanol
NADH/NAD+ Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
NADP/NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleótideo Fosfato
pH Potencial Hidrogeniônico
RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
r.p.m Rotação por minuto
Tr Tempo de retenção
UV-Vis Ultravioleta Visível
Ф Diâmetro
19
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS........................................................................................... 9
LISTA DE TABELAS..........................................................................................
LISTA DE GRÁFICOS........................................................................................
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS..........................................................
13
15
18
1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 23
2. BIOCATÁLISE................................................................................................. 28
2.1 Quiralidade e Biocatálise.................................................................................. 30
2.2 Álcoois Quirais................................................................................................. 33
2.2.1 Obtenção de álcoois a partir de cetonas via enzimática................................. 37
3. CONSIDERAÇÕES SOBRE Helianthus annuus L....................................... 41
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES.................................................................... 46
4.1 Obtenção dos álcoois padrões por via química................................................. 46
4.2 Curvas de calibração dos substratos.................................................................. 47
4.2.1 Acetofenona e (±)-1-feniletanol..................................................................... 49
4.2.2 4-bromo-acetofenona e (±) 1-(4-bromofenil)-etanol..................................... 50
4.2.3 4-fluoro-acetofenona e (±) 1-(4-fluorofenil)-etanol....................................... 50
4.2.4 4-cloro-acetofenona e (±) 1-(4-clorofenil)-etanol.......................................... 50
4.2.5 4-metóxi-acetofenona e (±) 1-(4-metóxifenil)-etanol.................................... 51
4.2.6 4-metil-acetofenona e (±) 1-(4-metilfenil)-etanol.......................................... 51
4.2.7 3-bromo-acetofenona e (±) 1-(3-bromofenil)-etanol..................................... 51
4.2.8 3-metóxi-acetofena e (±) 1-(3-metóxifenil)-etanol........................................ 52
4.2.9 2-bromo-acetofenona e (±) 1-(2-bromofenil)-etanol..................................... 52
4.2.10 2-cloro-acetofenona e (±) 1-(2-clorofenil)-etanol........................................ 52
4.2.11 2-metóxi-acetofenona e (±) 1-(2-metóxifenil)-etanol.................................. 53
4.2.12 2,2,2-trifluoro-acetofenona e (±)-2,2,2-trifluoro-feniletanol....................... 53
4.2.13 α-tetralona e (±)-α-tetralol............................................................................ 53
4.2.14 α-indanona e (±)-α-indanol.......................................................................... 54
4.3 Determinação do teor de proteínas das sementes de Helianthus annuus L...... 54
4.3.1 Método de Lowry (modificado por Hartree).................................................. 54
4.3.2 Método de Bradford....................................................................................... 56
4.4 Processos biocatalíticos..................................................................................... 57
4.4.1 Quantidade de biocatalisador......................................................................... 58
20
4.4.2 Co-solvente: Isopropanol............................................................................... 60
4.4.3 Meio tamponante: tampão fosfato.................................................................. 63
4.4.4 Extrato enzimático bruto segundo Lupetti (2000)......................................... 65
4.4.5 Germinação das sementes de Helianthus annuus L....................................... 67
4.4.6 Reações de biotransformação utilizando derivados da acetofenona.............. 68
4.4.6.1 Cetonas -para substituídas.......................................................................... 70
4.4.6.2 Cetonas -meta substituídas.......................................................................... 80
4.4.6.3 Cetonas -orto substituídas........................................................................... 85
4.4.6.4 Cetona α-halogenada................................................................................... 92
4.4.6.5 Cetonas aromáticas..................................................................................... 95
5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................... 100
5.1 Material utilizado.............................................................................................. 100
5.2 Métodos de Análise........................................................................................... 100
5.2.1 Cromatografia em Camada Delgada (CCD).................................................. 100
5.2.2 Cromatografia de Adsorção........................................................................... 101
5.2.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)...................................... 101
5.2.4 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)....................................................... 103
5.2.5 Espectroscopia na Região do UV/VIS........................................................... 103
5.2.6 Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG/EM)....... 104
5.3 Determinação de Proteínas................................................................................ 104
5.3.1 Método de Lowry (modificado por Hartree).................................................. 105
5.3.2 Método de Bradford....................................................................................... 105
5.4 Processos Biocatalíticos.................................................................................... 106
5.4.1 Procedimento geral das biotransformações utilizando células íntegras de
vegetais.................................................................................................................... 106
5.4.1.1 Quantidade de biocatalisador...................................................................... 107
5.4.1.2 Uso de co-solvente: Isopropanol................................................................. 107
5.4.1.3 Meio tamponante: pH 6,0, 7,0 e 8,0............................................................ 108
5.4.1.4 Extrato bruto enzimático (LUPPETI, 2000)............................................... 108
5.4.1.5 Sementes de Helianthus annuus L. germinadas.......................................... 108
5.4.2 Obtenção dos álcoois padrões por via química........................................... 109
5.4.3 Substratos selecionados nas reações de biotransformação utilizando as
sementes de Helianthus annuus L...........................................................................
109
5.4.4 Cetonas........................................................................................................... 110
21
5.4.5 Obtenção dos excessos enantioméricos (ee).................................................. 110
5.4.6 Obtenção das curvas de calibração dos substratos e produtos esperados...... 110
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................... 112
7. REFERÊNCIAS................................................................................................ 115
ANEXO.................................................................................................................. 124
22
INTRODUÇÃO
23
1. INTRODUÇÃO
O termo biotransformação pode ser aplicado para descrever modificações
específicas ou interconversões de substâncias químicas catalisadas por células vegetais,
animais ou microbianas, ou ainda enzimas isoladas. É conhecido por apresentar um
grande potencial em gerar novos produtos ou, ainda, produzir mais eficientemente
produtos conhecidos.
Grande parte do interesse pelas biotransformações deve-se à habilidade de se
catalisar reações com regio-, quimio- e estereosseletividade, aliada a outros fatores
como a utilização de meios aquosos, biodegradabilidade e a não necessidade de
proteção de alguns grupos funcionais. A união destes fatores representa uma alternativa
sintética bastante viável e dentro dos princípios da química verde.
A área multidisciplinar da biocatálise encontra-se atualmente em amplo
desenvolvimento. Pesquisas realizadas em vários ramos da química e da biologia tem
como principal objetivo o desenvolvimento de novos catalisadores para uso industrial.
A biocatálise é hoje um dos campos mais promissores dentro das novas
tecnologias para síntese de compostos de alto valor agregado (CARVALHO et al.,
2005). O seu desenvolvimento pode ser relacionado com produção de novas drogas e
agrotóxicos, bem como o seu uso em outros processos industriais (ZAKS; DODDS,
1997). Várias reações foram introduzidas e aperfeiçoadas, especialmente em síntese de
moléculas quirais de interesse farmacológico (LUNA, 2004; SHARMA et al., 2005),
cosméticos e substâncias químicas indústrias (VEIT, 2004; LIU; WEIS; GLEIDER.,
2004).
Novas técnicas de biologia molecular, metodologias de seleção de
biocatalisadores e novas abordagens de pesquisa, foram desenvolvidas a fim de se obter
catalisadores com suas especificidades melhoradas bem como a exploração da
biodiversidade. Os catalisadores biológicos nativos atualmente disponíveis, em sua
maioria apresentam limitações quanto à utilização em processos industriais, sendo este
o maior desafio do campo. As limitações encontradas na aplicação sintética de enzimas
em sua forma nativa estão sendo contornadas atualmente através da alteração da
estereoespecificidade, termoestabilidade e atividade através de técnicas de biologia
molecular de mutações sítio dirigidas ou aleatórias (CONTI; RODRIGUES; MORAN,
2001).
24
Indústrias que adquiriram conhecimentos em síntese assimétrica, atualmente
apresentam grandes vantagens tecnológicas e industriais, comparadas com as que não se
encontram capacitadas para a produção de compostos enantiomericamente puros.
Também, a área de biocatálise emergiu como uma ferramenta poderosa para a chamada
química ecologicamente correta (green chemistry), a qual levará cada vez mais a
processos industriais comprometidos com a preservação ambiental (VIEIRA et al.,
2010).
Dentre as numerosas aplicações de reações enzimáticas em meio orgânico
destacam-se a síntese de produtos de interesse nas áreas clínica, nutricional, ambiental,
industrial e biotecnológica (REETZ, 2002).
Os processos mais estudados em reações enzimáticas utilizam bactérias e
fungos, mas também são relatados ensaios com enzimas isoladas e, mais recentemente,
com células íntegras e imobilizadas de vegetais. O uso de células íntegras significa a
utilização da biomassa da fonte enzimática nas reações em questão (VILELA;
SGARBIERI; ALVIM, 2000).
A incessante busca por compostos com atividade farmacológica os quais, em sua
grande maioria, são compostos quirais com pelo menos um centro estereogênico, o que
pode dificultar sua obtenção através de reações por via química, torna os estudos de
biocatálise e a procura de novas fontes biocatalíticas cada vez mais comuns. Em função
disto, as maiores aplicações da biocatálise são referentes a sua utilização em síntese
assimétrica, onde enzimas vêm sendo utilizadas em substituição dos processos químicos
clássicos (PANKE; HELD; WOBBOLTS, 2004). Outra realidade a ser apontada é o
fato de que o emprego de catalisadores naturais apresenta uma alternativa
ambientalmente mais correta em relação às rotas sintéticas convencionais.
Vários estudos relatam a relação da atividade biológica com a quiralidade
molecular. Um dos casos mais conhecidos é a talidomida, onde na década de 1960,
provocou a má formação fetal em várias gestantes. Descobriu-se que apenas o
enantiômero R era o responsável pelas funções biológicas do medicamento (SILVEIRA
et al., 2001).
A síntese de compostos orgânicos de origem sintética e natural na forma
opticamente ativa é um desafio em química orgânica, devido à sua importância em áreas
que vão deste a medicina à ciência dos materiais. No entanto, a natureza fornece apenas
um número limitado de fontes quirais, bem como de apenas um enantiômero. Em
muitos casos, isso tem forçado químicos orgânicos a desenvolverem catalisadores
25
eficientes e altamente seletivos para a síntese de enantiômeros puros através de reações
assimétricas (BALAKRISHNAN et al., 2011).
A produção de compostos quirais requer o uso de catalisadores específicos,
caros e tóxicos. Nessa perspectiva a biocatálise pode ser utilizada para minimizar esses
impactos. Dentre os compostos quirais que possuem grande importância nos processos
de síntese orgânica, destacam-se os álcoois.
A produção de álcoois enantiomericamente puros é de grande importância para a
química orgânica, pois estes são utilizados como intermediários na síntese de produtos
químicos para as indústrias agroquímicas e farmacêuticas, mais especificamente. Muitos
destes compostos são obtidos através de reduções assimétricas de cetonas pró-quirais
utilizando microorganismos, vegetais ou enzimas isoladas como biocatalisadores
(KURBANOGLU et al., 2010).
A redução assimétrica de cetonas é uma das reações mais importantes,
fundamentais e práticas para a produção de álcoois quirais, que podem ser
transformados em várias funcionalidades na sua forma enantiomérica pura (YANG et
al., 2006).
O emprego de células íntegras de vegetais na biorredução de cetonas para a
produção de álcoois vem aumentado atualmente em relação ao uso de enzimas isoladas,
pois não necessitam de co-fatores e sua regeneração não é necessária para a manutenção
de sua atividade catalítica. Destaca-se também, o fato que são de mais fácil obtenção,
baixo custo e mais estáveis (KURBANOGLU et al., 2010).
Em reações químicas e bioquímicas, o uso de enzimas puras pode ser
dispendioso e seu descarte após o uso é economicamente inviável. Além disso, a
recuperação do meio reacional pode ser difícil (FABER, 2000).
O uso de vegetais em reações de biocatálise, mesmo com todos os avanços e
investigações já realizados até o momento, ainda é um campo muito novo visto a
enorme diversidade de espécies vegetais existentes e ao pequeno número de espécies
investigadas. Só no Brasil, o número de espécies de plantas ultrapassa os 56.000
(cinquenta e seis mil), o que compreende quase 19% da flora mundial, sendo que o
conhecimento da biodiversidade no país ainda é muito incompleto (GIULIETTI et al.,
2005).
Nessa perspectiva o presente trabalho teve como objetivo ampliar os estudos
relacionados à biocatálise de compostos orgânicos, dando continuidade às pesquisas
nessa área desenvolvidas pelo nosso grupo, buscando a investigação de novas fontes
26
vegetais com potencial promissor para biotransformação de substratos, destacando-se as
sementes de Helianthus annuus L. na biorredução de cetonas aromáticas. O estudo se
inicia com a determinação protéica do material, seguida do estudo de parâmetros
reacionais para a otimização da biorredução para a acetofenona, dando continuidade
com a biorredução de seus derivados e outras cetonas aromáticas.
27
BIOCATÁLISE
28
2. BIOCATÁLISE
O estudo da biocatálise consiste na utilização de enzimas para promover a
catálise de reações químicas, onde esses biocatalisadores podem ser oriundos de fontes
vegetais, fúngicas, microbianas, bem como de animais. O emprego dos biocatalisadores
nas reações químicas pode ser feito na sua forma purificada, isolado de algum material,
e na sua forma imobilizada, onde se utiliza um suporte polimérico como matriz
imobilizadora das enzimas, bem como na sua forma íntegra, natural, onde são usadas as
fontes enzimáticas em si, como por exemplo, vegetais e células em crescimento de
microorganismos.
Segundo Faber (2004) a utilização dos materiais, fontes de enzimas, para as
reações de biocatálise, ocorre da seguinte forma:
Células em crescimento: os substratos são adicionados ao meio de cultura
simultaneamente à inoculação ou durante a fase de crescimento do micro-
organismo;
Células em repouso: o micro-organismo é cultivado até seu crescimento
ótimo, a biomassa é filtrada ou centrifugada e ressuspensa em soluções ou
solventes adequados, com posterior adição de susbtratos;
Enzimas imobilizadas: as enzimas estão ligadas a suportes inertes insolúveis
por meios físicos ou químicos;
Enzimas isoladas: as enzimas são adicionadas diretamente no meio
reacional, dependendo da enzima há necessidade da adição de co-fator.
A utilização de células vegetais na sua forma íntegra tem sido relatada na
literatura com frequência. A manipulação da fonte biocatalítica neste procedimento é
simples e consiste na desinfecção do material vegetal e adição deste, juntamente com o
substrato, em soluções ou solventes adequados.
A utilização de enzimas na transformação de compostos orgânicos é conhecida
há mais de cem anos (COSTA; AMORIM, 1999). A aplicação de biocatalisadores na
indústria é objeto de muitas investigações e a importância do uso de enzimas em
biocatálise tem se mostrado cada vez mais evidente por apresentar inúmeras vantagens.
Dentre as vantagens do uso de biocatalisadores em reações orgânicas destacam-se:
A eficiência catalítica, onde promovem reações com velocidades na ordem
de 106
– 1014
mais rápidas do que a correspondente reação não catalisada,
29
valor considerado muito acima dos promovidos por catalisadores comuns
(FERREIRA, 2002);
Não geram resíduos de alta toxicidade e são facilmente degradados pelo
meio ambiente;
Atuam sob condições brandas de reação como pH e temperatura.
Catalisam uma ampla faixa de reações químicas como reduções, oxidações,
glicosilações, hidroxilações, esterificações, hidrolises, entre outras.
São bastante específicos e catalisam reações com:
Quimiosseletividade: a enzima atua preferencialmente em grupos funcionais
específicos, mantendo as demais funcionalidades presentes nos substratos
intactas;
Regiosseletividade: a enzima atua diferenciando grupos funcionais idênticos
de acordo com o ambiente químico em que se encontram nos substratos;
Estereosseletividade: a enzima é capaz de diferenciar um enantiômero do
outro, produzindo com isso, compostos enantiomericamente puros, pois são
considerados catalisadores quirais e reconhecem em seu sítio ativo, moléculas
quirais ou pró-quirais (ARAÚJO, 2010).
A possibilidade da produção de compostos enatiomericamente puros pelas
enzimas em reações químicas motivaram uma ampla busca por novas fontes
biocatalíticas e a grande biodiversidade mundial, mais especificamente brasileira, tem
sido fator primordial.
A exploração da biodiversidade na busca de novos catalisadores por técnicas de
seleção de microrganismos, de plantas ou células animais representam os métodos
tradicionais de descoberta de novas enzimas para o desenvolvimento da biocatálise em
escala industrial e acadêmica (DEMIRJIAN; SHAH; MORIS-VAS, 1999).
A grande variabilidade de plantas taxionomicamente diferentes disponíveis e
com fácil acesso, associado aos fatores experimentais como fácil separação do produto
da mistura reacional, através de simples filtração ou centrifugação, somam pontos
positivos para a crescente busca de materiais vegetais como fontes biocatalíticas, além
de sua realização em meio aquoso e o restante do material descartado ser facilmente
degradado pelo meio ambiente, mostrando em contrapartida uma alternativa viável em
relação às reações químicas clássicas que requerem o uso de reagentes tóxicos e metais
pesados, onde sua eliminação ao meio ambiente geram grandes impactos (SALVANO
et al., 2011).
30
Segundo Takeda et al. (2011) a utilização de materiais vegetais como fontes de
enzimas são mais eficientes porque fornecem um ambiente mais favorável para a
biotransformação de substratos onde destacam-se a presença de numerosas enzimas e
em grande variedade e a presença de co-fatores, bem como as vias metabólicas
necessárias para a regeneração dos co-fatores. Ressalta-se ainda a facilidade de
obtenção desses materiais vegetais, o baixo custo apresentado e estabilidade por eles
garantida (KURBANOGLU et al., 2010).
Muitas transformações de diferentes substratos, tais como hidroxilação e reações
de oxidação (Gynostemma pentaphyllum), hidrólise de ésteres (Solanum tuberosum,
Helianthus tuberosus), bioredução de cetonas e aldeídos (Daucus carota, Foeniculum
vulgare, Cucurbita pepo, Phaseolus aureus, Cocos nucifera, Saccharum officinarum,
Manihot dulcis, Manihot esculenta), lactonização (Malus sylvestris, Helianthus
tuberosus) glicosilação, (Ipomoea batatas, Eucalyptus perriniana), etc, tem sido
realizadas, e produziram bons resultados usando plantas e suas células em cultura.
(SALVANO et al., 2011).
2.1 Quiralidade e Biocatálise
Compostos opticamente ativos são intermediários úteis para a síntese de
produtos farmacêuticos, agroquímicos e cristais líquidos. A necessidade de síntese
estereosseletiva de compostos opticamente ativos com atividades biológicas é
importante porque somente um isômero entre os muitos compostos opticamente ativos
disponível tem uma atividade biológica específica (GOTOR; ALFONSA; GARCIA-
URDIALES, 2008).
Em compostos bioativos, tais como, produtos farmacêuticos e agroquímicos, a
atividade biológica depende, em muitos casos de sua configuração absoluta.
Normalmente um dos estereoisômeros apresenta atividade biológica, enquanto o outro é
menos ativo, ou até mesmo tóxico ou inativo (BONATTO; JABOR; GAITANI, 2005).
Exemplos dessa relação atividade biológica e quiralidade para alguns fármacos,
encontram-se na Tabela 1 (p. 31), a seguir:
31
Tabela 1: Disposição cinética e efeitos estereosseletivos de alguns fármacos quirais
FÁRMACO QUIRAL Disposição cinética e efeito farmacológico dos
enantiômeros
Morfina (analgésico) O enantiômero (-)-(R)- é o único com atividade analgésica.
Propanolol (antiarrítimico) A forma enantiomérica (+)-(S)- é 100 vezes mais potente
que a (-)-(R)- e apresenta tempo de meia vida mais longo.
Ácido 1-metil-5-fenil-5-
propilbarbitúrico (sedativo)
Atividades opostas no sistema nervoso central. Um
enantiômero apresenta o efeito sedativo desejado
(hipnótico ou narcótico dependendo da dose) e o outro é
um convulsivante.
Ácido
2-bromofenoxipropiônico
(agente de crescimento)
Uma ação antagonista é evidenciada pela forma (-)-(R)-
enquanto o enantiômero (+)-(S)- é um estimulante de
crescimento.
Ibuprofeno (antinflamatório)
Este fármaco é administrado como racemato pois o
enantiômero inativo (-)-(R)- sofre inversão quiral para o
enantiômero ativo (+)-(S)- no organismo.
A utilização de biocatalisadores para o desenvolvimento de novos fármacos e
agrotóxicos é bem conhecida e, uma grande variedade de enzimas já está sendo usada
em processos industriais. A síntese do fármaco Efedrina, com atividade β-adrenérgica é
realizada com a utilização da levedura Saccharomyces cerevisae, enquanto os
antibióticos Ampicilina e Cefadroxil são sintetizados com o intermédio da enzima
penicilina acilase de acordo com Conti, Rodrigues e Mouran (2001). As estruturas dos
fármacos relatados encontram-se na Figura 1 (p. 32).
32
Figura 1: Estruturas da Efedrina, Ampicilina e Cefadroxil obtidas por
biotransformações.
NHCH3
OH
CH3
NH2
O
HO
N
O
S
COOH
H
NH2
O N
O
H
S
COOH
Ampicilina
Cefadroxil
Efedrina
Além de atuarem na preparação de fármacos como precursores, compostos
opticamente ativos são importantes na síntese de feromônios, aromas, fragrâncias,
cosméticos e pesticidas (UTSUKIHARA et al., 2007).
Plantas como fonte biocatalítica são encontradas na literatura sua aplicação na
fitorremediação de poluentes orgânicos (SINGH; JAIN, 2003), biorredução de cetonas
(NAOSHIMA; AKAKABE, 1991; YADAV et al., 2001; BASKAR et al., 2004)
lactonização enzimática (OLEJNICZAK; MIRONOWICZ; WAWRZENCZYK, 2003),
hidrólise de ésteres (MIRONOWICZ, 1998; MACZKA; MIRONOWICZ, 2002), adição
de hidrogênio cianídrico (HERNANDEZ et al., 2004), reações de hidroxilação e
oxidação (SAKAMAKI et al., 2005), e ainda o interesse na preparação de álcoois
quirais na redução de cetonas pelo uso de culturas de plantas (YADAV et al., 2002;
COMASSETO et al., 2004).
33
2.2 Álcoois Quirais
A produção de álcoois quirais enantiomericamente puros é relevante na química
orgânica, pois eles são importantes intermediários para a síntese de produtos químicos,
mais precisamente de fármacos, e também podem ser utilizados como blocos de
construção quiral (“chiral building blocks”) na produção de diversos compostos quirais
de importância biológica (ARAÚJO, 2010). Entre vários exemplos, o (S)-(-)-3-hidróxi-
butanoato de etila, oticamente ativo, é um dos álcoois quirais mais utilizados como
precursor quiral em síntese orgânica: o (S)-(+)-sulcatol, importante insumo para a
síntese de outros produtos naturais; (R)-lavandulol, importante aditivo na indústria de
perfumes; (R)-(+)-recifeiolídeo, macrolídeo natural isolado do Cephalosporum recifei;
(R,R)-(-)-grahamimicina, macrodiolídeo de atividade antibiótica reconhecida; (R,R)-
pirenoforina, um diolídeo representativo de ocorrência natural com atividade fungicida
obtido a partir de sulcatol e a carbomicina B, um outro antibiótico macrolídeo (Figura 2,
p. 34) (TEMBA; OLIVEIRA; DONNICI, 2003).
34
Figura 2: Álcoois quirais e produtos obtidos a partir de álcoois quirais.
OH O
O
OH
OH
O
CH3
O
(S)-(-)-3-hidróxi-butanoato de etila
(S)-(+)-sulcatol
(R)-lavandulol
(R)-(+)-recifeiolídeo
O
O
O
O O
OH3C
H3C
(R,R)-(-)-grahamimicina
O O
O
O
O
OH3C
CH3
(R,R)-pirenoforina
carbomicina B
OH3C
H3CO
OCOCH3
OR'
CH3
CHO
O
O
R' = desoxiaçúcar
Os terpenos incluem álcoois e derivados de grande importância em síntese
orgânica, quer como precursores, quer como auxiliares quirais, sendo vários de origem
natural. Existem exemplos destacáveis de síntese total partindo-se de terpenóides, por
exemplo, a síntese da milbemicina b3 a partir do (S)-(-)-citronelol e a síntese de
proxifomina a partir do (R)-(+)-citronelol (Figura 3, p. 35) (TEMBA; OLIVEIRA;
DONNICI, 2003).
35
Figura 3: Estruturas de terpenos quirais e produtos obtidos a partir deles.
O
O
O
OH3C CH3
OH
CH3
CH3
H3C
Milbemicina b3
CH3
O
HN
Bn
O
H3C
H3C
Proxifomina
HO
CH3
HO
CH3
(S)-(-)-citronelol
(R)-(+)-citronelol
O mentol, outro terpeno quiral, também é muito usado como insumo, natural ou
sintético, tendo a sua grande aplicação como aromatizante pelo efeito refrescante, tão
apreciado, apenas do enantiômero levógiro, o (1R,2S,5R)-(-)-5-metil-2-(1-metiletil)-
ciclo-hexanol, ou (1R,2S,5R)-(-)-mentol (a). Além disso, o mentol tem amplo uso como
auxiliar de quiralidade e várias outras aplicações sintéticas. Cabe lembrar que vários
feromônios de interesse são também álcoois quirais como o sulcatol, que tem sido muito
estudado como feromônio do besouro Gnathotrichus sulcatus e Gnathotrichus retusus e
outros vários, como os exemplos de b a f (Figura 4, p. 36) que também foram
36
sintetizados por vários métodos clássicos, de complexidade variável, envolvendo a-
aminoácidos, carboidratos e terpenos como material de partida. Um exemplo de álcool
quiral ainda mais notável é o 1-octen-3-ol (g) que é feromônio importante na atração de
mosquitos, tendo chamado muito a atenção de pesquisadores em todo o mundo e no
Brasil (TEMBA; OLIVEIRA; DONNICI, 2003).
Figura 4: Álcoois quirais de interesse industrial.
OH
OH
OH OH
OHOH
OH
(a) (b) (c) (d)
(e)
(f)
(g)
Nessa perspectiva a produção de álcoois quirais se torna um campo promissor de
estudo para vários setores estratégicos, como nas indústrias de medicamentos,
cosméticos, agrotóxicos, alimentícias, biotecnologias, entre outras, que buscam acima
de tudo metodologias capazes para sua obtenção de forma eficiente, através de rotas
alternativas, ambientamente favoráveis e economicamente mais atraentes.
Aliada a essa visão surge como ferramenta a biotransformação de compostos
orgânicos para a obtenção de álcoois quirais enantiomericamente puros.
37
2.2.1 Obtenção de álcoois a partir de cetonas via enzimática
A redução enzimática de grupos carbonila representa uma das reações
importantes mais empregadas na síntese de álcoois quirais. As enzimas responsáveis por
essa transformação são as oxidorredutases, mais precisamente as álcool desidrogenases
(ADH), que necessitam da presença de um co-fator (coenzima), como NADH ou
NADPH, que transfere o hidreto para o ânion do composto carbonílico, sendo formado
NAD+ ou NADP
+. O papel da álcool desidrogenase é proporcionar uma interação do
substrato com o co-fator de forma termodinamicamente favorável para que a reação
ocorra (Figura 5) (ARAÚJO et al., 2010).
Figura 5: Redução assimétrica biocatálitica de compostos carbonílicos com NADPH na
presença de ADH.
R
O
+ NADPH
ADH
R
OH
H
*
+ NADP+
Nos últimos anos, as culturas de células vegetais na sua forma íntegra, têm sido
investigados como potenciais agentes para reações de biotransformação.
Um dos primeiros trabalhos utilizando vegetais na forma de células íntegras foi
com as raízes de Daucus carota (cenoura). Este estudo alertou investigações no uso de
planta fresca, intacta como um reagente ao invés do uso de sistemas de células,
suspendida ou imobilizada, ou algumas enzimas derivadas. Estes investigadores
descreveram aspectos dos seus estudos em uma patente italiana (CORDELL et al.,
2007).
Yadav et al. (2002), utilizando como fonte de biocatalisador as raízes de Daucus
carota obteve álcoois secundários opticamente ativos através da redução de várias
cetonas proquirais tais como acetofenonas, cetonas α-azido aril, β-ceto-ésteres, cetonas
alifáticas cíclicas e acíclicas com rendimentos químicos de moderados a excelentes sob
condições extremamente suaves e aceitas ambientalmente em meio aquoso.
Recentemente, Comasseto et al. (2004), utilizando raízes de D. carota como
catalisador conseguiram reduzir organoseleno- e organotio-acetofenonas. Os
38
correspondentes álcoois quirais foram preparados conseguindo 99% de excesso
enantiomérico. Andrade et al. (2004), relatou as mesmas biorreduções utilizando células
íntegras de fungos. Andrade et al. (2006), realizou um estudo com acetofenona (Figura
6) utilizando espécies de plantas como biocatalisadores.
Figura 6: Biorredução da acetofenona utilizando várias espécies de plantas.
Machado et al. (2006) utilizando espécies de Manihot esculenta e Manihot
dulcis na redução de cetonas (alifáticas, cíclicas e α,β-insaturadas) obteve entre baixos
(12,5-14,9%) e altos (91,7-97,8%) de valores de conversão para o respectivo álcool,
apresentando também ótimos valores de excesso enantiómero 93-98%. Entretanto,
cetonas esteroidais não foram reduzidas.
Fonseca et al. (2008) avaliaram o potencial biocatalítico da água de côco do
Ceará (Cocos nucifera) na redução de cetonas alifáticas, cíclicas e aromáticas obtendo
ótimos valores de excesso enantiomérico (56-99%) dos álcoois correspondentes.
Destaca-se a redução da acetofenona e da 3-metóxi-acetofenona com valores de excesso
enantiomérico de 95% e 99%, respectivamente.
Assunção et al. (2008) investigaram o potencial do caldo de cana obtido da
moagem da cana-de-açúcar, Saccharum officinarum, como fonte enzimática para a
redução de uma série de cetonas com excelentes rendimentos e moderada
enantiosseletividade.
Bizerra et al. (2010) realizou o estudo de biorredução de cetonas aromáticas e
alifáticas utilizando feijão (Vigna unguiculata) onde obteve excelentes valores de
excessos enantioméricos dos produtos formados, variando entre 87% e acima de 99%,
entretanto os valores de conversão apresentaram-se entre baixos (5%) para os substratos
(2-metóxi-acetofenona e 4-metóxi-acetofenona) e ótimos (86%) para a 3-metóxi-
acetofenona.
O OH
39
Mais recentemente, Takeda et al. (2011) utilizando a espécie Arabidopsis
thaliana promoveu a biorredução de cetonas assimétricas (aromáticas e alifáticas)
obtendo valores moderados de conversão e excelentes excessos enantioméricos (Figura
7).
Figura 7: Cetonas utilizadas na biorredução com Arabidopsis thaliana.
O
R1 R2
Arabidopsis thaliana
OH
R1 R2
OH
R1 R2
+
1a-d
(1a) R1=CF3; R2=C6H5
(1b) R1=CH3; R2=CH2CO2Bu(1c) R1=CO2CH3; R2=C6H5
(1d) R1= 2-tienil; R2= CF3
(2a);(2c);(2d) 2b
40
CONSIDERAÇÕES
SOBRE Helianthus annuus L.
41
3. CONSIDERAÇÕES SOBRE Helianthus annuus L.
Helianthus annuus L., conhecido popularmente por girassol, é uma dicotiledônia
anual caracterizada por apresentar sistema radicular com raiz principal pivotante e
inflorescência conhecida como capítulo (Figura 8) (GONÇALVES; TOMICH, 1999),
pertencente à família Asteraceae (ROSSI, 1991). A própria planta do girassol, bem
como os grãos, os restos da cultura e os subprodutos gerados na extração do óleo podem
ser usados na alimentação animal. Na dieta de ruminantes o girassol pode ser utilizado
como alimento volumoso. Tem sua origem conhecida nas planícies da Mesoamérica
desde o século 26 a.C (POPE et al., 2001).
Figura 8: Fotografia da flor de Helianthus annuus L. tendo como detalhe as sementes
utilizadas nas biotransformações.
O cultivo de Helianthus annuus L. é promissor em todo mundo, por se tratar de
uma oleoginosa (PUTT, 1978; JONIC et al., 2000). O óleo de Helianthus annuus L.
possui altos valores nutricionais é praticamente livre de compostos tóxicos e tem alta
concentração de ácido linoléico. Este ácido graxo poliinsaturado essencial não é
sintetizado pelos seres humanos e é um precursor de outros ácidos graxos como o gama-
linolênico e o araquidônico (DORELL, 1978).
42
Nos últimos anos a produção mundial de sementes de girassol (Heliantus annuus
L.) tem aumentado significativamente em comparação com outras culturas de
produtoras de óleo (NIMET et al., 2011). Dentre as mais importantes culturas o girassol
encontrou-se em 6º lugar no ranking mundial das fontes de oleoginosas com a produção
de 30,4 milhões de toneladas em 2010, segundo dados da organização das nações unidas
para a alimentação em cultura (FAOSTAT, 2011). Devido à sua composição química e
valor nutritivo, as sementes de girassol são consideradas como grande fonte de lipídios
e proteínas e além de ser utilizada na produção de óleos comestíveis, também vem
sendo comercializada para alimentação animal (BRATFALEAN et al., 2008). O teor de
proteínas das sementes é de aproximadamente 50-60%. Além disso, o óleo de girassol
tem uma elevada quantidade de vitamina E natural oxidante em comparação com outros
óleos comestíveis (NIMET et al., 2011).
O girassol apresenta características agronômicas importantes, como maior
resistência à seca, ao frio e ao calor, que a maioria das espécies normalmente cultivadas
no Brasil. Apresenta ampla adaptabilidade a diferentes condições edafoclimáticas e seu
rendimento é pouco influenciado pela latitude, pela altitude e pelo fotoperíodo
(GOMES et al., 2006).
As sementes de girassol são ricas em compostos fenólicos, sendo estes
encontrados tanto na semente em si, quanto na casca. Dentre os compostos fenólicos
presentes nas sementes de girassol destacam-se os ácidos protocatequínico, clorogênico,
caféico, siríngico e felúrico (Figura 9, p. 43) (WEISZ; KAMMERER; CARLE, 2009).
Os ácidos fenólicos são algumas das substâncias que constituem o grupo dos compostos
fenólicos. Caracterizam-se por terem um anel benzênico, um grupamento carboxílico e
um ou mais grupamentos de hidroxila e/ou metóxila na molécula, conferindo
propriedades antioxidantes tanto para os alimentos como para o organismo, sendo, por
isso, indicados para o tratamento e prevenção do câncer, doenças cardiovasculares e
outras doenças (SOARES, 2002).
43
Figura 9: Estruturas dos ácidos fenólicos presentes nas sementes de Helianthus annuus
L.
OH
O
HO
HO
Ácido protocatequínico
OH
O
HO
H3CO
Ácido siríngico
OCH3
O
OH
O
HO
OH
OH
O
OH
OH
Ácido clorogênico
HO
OH
O
Ácido ferúlico
HO
OH
O
HO
Ácido caféico
Hartwell (1982) relata o uso das sementes de Helianthus annuus L. na medicina
popular onde são utilizadas no tratamento de doenças pulmonares, tosse, garganta,
constipações e expectorantes, bem como afirma o uso associado com as flores em
remédios populares na Venezuela para o tratamento de câncer.
Tishinov et al. (2009) utilizaram as sementes de girassol para um estudo cinético
de aminopeptidases através da hidrólise de aminoácidos e derivados, relatando pela
primeira vez a aplicação do material em processos de biotransformação.
Aminopeptidases isoladas das sementes foram utilizadas na hidrólise dos aminoácidos
apresentados na Figura 10 a seguir (p. 44).
44
Figura 10: Aminoácidos utilizados para biotransformação por Helianthus annuus L.
O2N
HN
O
R
NH2
(1) R=CH3
(2) R=CH2CH3
(3) R=(CH2)2CH3
(4) R=(CH2)3CH3
(5) R=(CH2)4CH3
O
R2R1
H2N
(6) R1=CH2C6H5; R2=NH2(7) R1=C6H5; R2=NH2(8) R1=CH2C6H5; R2=OCH3
O
O
NH2
(9)
O
HN
R1 R2
R3
H2N
(10) R1=R2=R3=H(11) R1=COOCH3; R2=R3=H(12) R1=H; R2= COOCH3; R3=H(13) R1=R2=H; R3=COOCH3
O
HN
H2N
(14)
O
HN
H2N O
(15) R1=CH3
(16) R1=CF3
O
R
Aminopeptidades das sementes de girassol foram empregadas com sucesso na
resolução de misturas racêmicas de amidas e aminoácidos, mostrando-se eficiência
catalítica e alta enantiosseletividade para o isômero S (TISHINOV et al., 2009).
O uso das sementes de Helianthus annuus L. em biorredução ainda não foi
relatado na literatura, possibilitando com que este trabalho seja um promissor processo
investigativo da atuação dessa classe de enzimas presentes neste material em processos
biocatalíticos.
45
RESULTADOS E
DISCUSSÕES
46
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Obtenção dos alcoóis padrões por via química
Os alcoóis padrões das respectivas cetonas pró-quirais utilizadas nos processo de
biorredução, foram obtidos por via química utilizando NaBH4/MeOH conforme Figura
11 e metodologia descrita no item 5.4.2 (p. 109). Os alcoóis 1a-15a (Tabela 2) foram
obtidos em bons rendimentos após purificação por cromatografia em coluna, sendo em
seguida analisados por RMN ¹H para a confirmação de suas estruturas (anexo). A
finalidade desta etapa foi a obtenção de padrões para a construção de curvas de
calibração e comparação com os produtos das biorreduções.
Figura 11: Esquema da reação de redução das cetonas pró-quirais por via química.
Tabela 2: Rendimentos da obtenção dos alcoóis padrões 1a-15a
Álcool padrão Rendimento (%)
(±)-1-feniletanol (1a) 89,8
(±) 1-(4-bromofenil)-etanol (2a) 89,7
(±) 1-(4-fluorfenil)-etanol (3a) 86,0
(±) 1-(4-clorofenil)-etanol (4a) 88,5
(±) 1-(4-metóxifenil)-etanol (5a) 79,9
(±) 1-(4-metilfenil)-etanol (6a) 81,4
(±) 1-(3-bromofenil)-etanol (7a) 85,0
(±) 1-(3-metóxifenil)-etanol (8a) 84,1
(±) 1-(2-bromofenil)-etanol (9a) 80,9
(±) 1-(2-clorofenil)-etanol (10a) 83,4
(±) 1-(2-metóxifenil)-etanol (11a) 86,2
(±) 1-(2-hidróxifenil)-etanol (12a) 72,5
(±)-2,2,2-trifluor-feniletanol (13a) 92,0
(±)-α-tetralol (14a) 61,3
(±)-α-indanol (15a) 70,0
R
O
R'
NaBH4
R
OH
R'MeOH
47
4.2 Curvas de calibração dos substratos
As análises do teor de conversão dos substratos 1-15 (cetonas) utilizados nas
reações de biorredução foram realizadas por intermédio de curvas de calibração. Os
respectivos padrões foram injetados em equipamento de Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE) e as curvas elaboradas em programa Origin 7.0. A obtenção das
curvas tanto do substrato, cetona, quanto do produto, álcool, fez-se necessária para
minimizar os erros de quantificação da conversão. As estruturas dos substratos
utilizados estão listadas na Tabela 3, bem como dos respectivos produtos.
Tabela 3: Substratos e produtos utilizados na obtenção das curvas de calibração para
análise do teor de conversão nas reações de biorredução.
SUBSTRATO PRODUTO
acetofenona (1)
(±)-1-feniletanol (1a)
4-bromo-acetofenona (2)
(±) 1-(4-bromofenil)-etanol (2a)
4-fluoro-acetofenona (3)
(±) 1-(4-fluorofenil)-etanol (3a)
4-cloro-acetofenona (4)
(±) 1-(4-clorofenil)-etanol (4a)
4-metóxi-acetofenona (5)
(±) 1-(4-metóxifenil)-etanol (5a)
OHO
O
Br
OH
Br
O
F
OH
F
O
Cl
OH
Cl
OH
H3CO
O
H3CO
48
4-metil-acetofenona (6)
(±) 1-(4-metilfenil)-etanol (6a)
3-bromo-acetofenona (7)
(±) 1-(3-bromofenil)-etanol (7a)
3-metóxi-acetofenona (8)
(±) 1-(3-metóxifenil)-etanol (8a)
2-bromo-acetofenona (9)
(±) 1-(2-bromofenil)-etanol (9a)
2-cloro-acetofenona (10)
(±) 1-(2-clorofenil)-etanol (10a)
2-metóxi-acetofenona (11)
(±) 1-(2-metóxifenil)-etanol (11a)
2-hidróxi-acetofenona (12)
(±) 1-(2-hidróxifenil)-etanol (12a)
O
H3C
OH
H3C
O
Br
OH
Br
O
OCH3
OH
OCH3
OH
Br
O
Br
O
Cl
OH
Cl
OH
OCH3
O
OCH3
O
OH
OH
OH
49
2,2,2-trifluor-acetofenona (13)
(±)-2,2,2-trifluor-feniletanol (13a)
α-tetralona (14)
(±)-α-tetralol (14a)
α-indanona (15)
(±)-α-indanol (15a)
A seguir são apresentadas as respectivas curvas de calibração para as cetonas
utilizadas no procedimento experimental e para os alcoóis obtidos (Gráficos 1-28, p. 49-
54). Os gráficos foram plotados em função das concentrações versus área, obtendo-se os
respectivos valores de “R” e equação da reta para cada composto.
4.2.1 Acetofenona e (±)-1-feniletanol
20 40 60 80 100
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
0 10 20 30 40 50
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
R = 0,99949
OH
CF3
OH
CF3
O
O OH
O OH
R = 0,99826
O
Áre
a Áre
a
Gráfico 2: Curva de calibração do (±)
1-feniletanol. Gráfico 1: Curva de calibração da
acetofenona.
50
4.2.2 4-bromo-acetofenona e (±) 1-(4-bromofenil)-etanol
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
0 20 40 60 80 100
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
4.2.3 4-fluoro-acetofenona e (±) 1-(4-fluorofenil)-etanol
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
20 40 60 80 100
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
4.2.4 4-cloro-acetofenona e (±) 1-(4-clorofenil)-etanol
0 20 40 60 80 100
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
0 20 40 60 80 100
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
R = 0,99962
O
Br
R = 0,99987
OH
Br
F
O
R = 0,99915
OH
F
R = 0,99947
O
Cl
OH
Cl
R = 0,99997 R = 0,99993
Áre
a
Áre
a
Áre
a
Áre
a Á
rea
Áre
a
Gráfico 3: Curva de calibração da 4-
bromo-acetofenona.
Gráfico 4: Curva de calibração do (±)
1-(4-bromofenil)-etanol.
Gráfico 5: Curva de calibração da 4-
fluoro-acetofenona.
Gráfico 6: Curva de calibração do (±)
1-(4-fluorofenil)-etanol.
Gráfico 7: Curva de calibração da 4-
cloro-acetofenona.
Gráfico 8: Curva de calibração do (±) 1-
(4-clorofenil)-etanol.
51
4.2.5 4-metóxi-acetofenona e (±) 1-(4-metóxifenil)-etanol
0 20 40 60 80 100
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
0 20 40 60 80 100
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
4.2.6 4-metil-acetofenona e (±) 1-(4-metilfenil)-etanol
0 20 40 60 80 100
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
0 20 40 60 80 100
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
4.2.7 3-bromo-acetofenona e (±) 1-(3-bromofenil)-etanol
0 20 40 60 80 100
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
0 20 40 60 80 100
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
O
H3CO
OH
H3CO
R = 0,99983 R = 0,99984
O
Br
R = 0,99954 R = 0,99975
OH
Br
O
H3C
OH
H3C
R = 0,99982 R = 0,99977
Áre
a
Áre
a
Áre
a
Áre
a
Áre
a
Áre
a
Gráfico 9: Curva de calibração da 4-
metóxi-acetofenona. Gráfico 10: Curva de calibração do (±)
1-(4-metóxifenil)-etanol.
Gráfico 11: Curva de calibração da 4-
metil-acetofenona.
Gráfico 12: Curva de calibração do (±)
1-(4-metilfenil)-etanol.
Gráfico 13: Curva de calibração da 3-
bromo-acetofenona.
Gráfico 14: Curva de calibração do
(±)3-bromo-feniletanol.
52
4.2.8 3-metóxi-acetofena e (±) 1-(3-metóxifenil)-etanol
0 20 40 60 80 100
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
0 20 40 60 80 100
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
4.2.9 2-bromo-acetofenona e (±) 1-(2-bromofenil)-etanol
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
10000000
20000000
30000000
40000000
50000000
Ab
sorb
ân
cia
Concentração em ppm
0 20 40 60 80 100
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
Ab
sorb
ân
cia
Concentração em ppm
4.2.10 2-cloro-acetofenona e (±) 1-(2-clorofenil)-etanol
0 20 40 60 80 100
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
Abso
rbânci
a
Concentração em ppm
0 20 40 60 80 100
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
Abso
rbânci
a
Concentração em ppm
O
Br
OH
Br
R = 0,9985 R = 0,99985
O
Cl
OH
Cl
R = 0,99966 R = 0,99916
O
OCH3
OH
OCH3
R = 0,99982 R = 0,99996
Áre
a
Áre
a
Áre
a
Áre
a
Áre
a
Áre
a
Gráfico 15: Curva de calibração da 3-
metóxi-acetofenona.
Gráfico 16: Curva de calibração do (±)
1-(3-metóxifenil)-etanol.
Gráfico 17: Curva de calibração da 2-
bromo-acetofenona.
Gráfico 18: Curva de calibração do (±)
1-(2-bromofenil)-etanol.
Gráfico 20: Curva de calibração do (±)
1-(2-clorofenil)-etanol.
Gráfico 19: Curva de calibração da 2-
cloro-acetofenona.
53
4.2.11 2-metóxi-acetofenona e (±) 1-(2-metóxifenil)-etanol
0 20 40 60 80 100
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
4.2.12 2,2,2-trifluoro-acetofenona e (±)-2,2,2-trifluoro-feniletanol
20ppm 40ppm 60ppm 80ppm 100ppm
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
0 20 40 60 80 100
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
4.2.13 α-tetralona e (±)-α-tetralol
0 20 40 60 80 100
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
18000000
Absorbância
Concentraçمo em ppm
R = 0,99953
O
R = 0,99978
OH
CF3
O
CF3
OH
R = 0,99993 R = 0,9968
O
OCH3
OH
OCH3
R = 0,99946 R = 0,99858
Áre
a
Áre
a
Áre
a Áre
a
Áre
a
Áre
a
Gráfico 21: Curva de calibração da 2-
metóxi-acetofenona.
Gráfico 22: Curva de calibração do (±)
1-(2-metóxifenil)-etanol.
Gráfico 23: Curva de calibração da
2,2,2-trifluoro-acetofenona.
Gráfico 24: Curva de calibração do
2,2,2-trifluoro-feniletanol.
Gráfico 25: Curva de calibração da α-
tetralona.
Gráfico 26: Curva de calibração do
(±)-α-tetralol.
54
4.2.14 α-indanona e (±)-α-indanol
0 20 40 60 80 100
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
Ab
sorb
ân
cia
Concentração em ppm
0 20 40 60 80 100
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
18000000
Ab
sorb
ân
cia
Concentração em ppm
4.3 Determinação do teor de proteínas das sementes de Helianthus annuus L.
A determinação do teor de proteínas das sementes de Helianthus annuus L. foi
realizada como estudo inicial para avaliar o seu possível potencial como fonte
biocatalítica em reações de biorredução. A medida do teor de proteínas serve de
estimativa da concentração de enzimas do material vegetal.
Vários métodos são encontrados na literatura relacionados com determinação da
concentração de proteínas, tais como: métodos do Biureto, de Lowry, de Bradford, entre
outros. Todos esses métodos baseiam-se na obtenção de compostos coloridos através da
reação de grupos presentes na molécula da proteína e substâncias específicas (MIWA,
2003).
No presente trabalho foram utilizados os métodos de determinação de proteínas
proposto por Lowry (modificado por Hartree, 1972), que determina a concentração de
proteínas solúveis e o proposto por Bradford. Estes métodos apresentam como principal
vantagem a alta sensibilidade (LUCARINI; KILIKIAN, 1999).
4.3.1 Método de Lowry (modificado por Hartree)
A determinação de proteínas proposta por Lowry (modificada por Hartree, 1972)
foi realizada no extrato aquoso da semente de Helianthus annuus L. O método consiste
na reação da proteína com íon cobre (II) em solução alcalina (reação do biureto) o que
resulta em uma coloração azul (Figura 12, p. 55).
O OH
R = 0,99975 R = 0,99972
Áre
a
Áre
a
Gráfico 27: Curva de calibração da α-
indanona.
Gráfico 28: Curva de calibração do α-
indanol.
55
Figura 12: Detalhe da reação do extrato enzimático das sementes de Helianthus annuus
L. com o íon cobre (II).
A utilização de reagente Folin-Ciocalteau, constituído de uma mistura de ácidos
fosfomolibdato-fosfotungstico (3H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10H2O e
3H2O.P2O5.14WO3.4MoO3.10H2O) é necessária para ampliar o sinal do Biureto, onde a
redução do reagente em questão com proteínas na presença de cobre em solução
alcalina, produz um complexo de coloração azul, como mostrado na Figura 13 (MIWA,
2003; OKUTUCU et al., 2007).
Figura 13: Detalhe da reação do extrato enzimático das sementes de Helianthus annuus
L. com o reagente de Folin-Ciocalteau.
O extrato aquoso das sementes de Helianthus annuus L. apresentou um teor de
proteínas bastante considerável, 10,1g/L, mostrando-se como uma fonte promissora de
enzimas, possibilitando sua utilização em processos biocatalíticos.
56
4.3.2 Método de Bradford
O método para determinação de proteínas totais de Bradford (1976) em
comparação com Lowry (modificada por Hartree, 1972) é mais sensível, mais rápido e
está sujeito a um número menor de interferentes, destaca Zaia et al. (1998).
O processo consiste na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de
proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas, como por
exemplo, arginina e histidina (Figura 14). No pH de reação, a interação entre a proteína
de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do
corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm (LUCARINI;
KILIKIAN, 1999; ZAIA et al., 1998).
A utilização do reagente de Bradford contendo o corante BG-250 modifica
instantaneamente o extrato enzimático a ser analisado, no caso o extrato aquoso das
sementes de Helianthus annuus L. como detalhado na Figura 14 .
Figura 14: Detalhe do método de Bradford para determinação de proteínas após a
adição do reagente Coomassie Brilliant Blue G-250.
Através deste método obteve-se um teor de proteínas de 8,8g/L. O resultado
apresentado, inferior em comparação com o obtido por Lowry, pode ser justificado pela
possível presença de enzimas com tamanhos pequenos, já que a interação com o
reagente de Coomassie Brilliant Blue G-250 não foi tão sensível, bem como a presença
resíduos de aminoácidos não aromáticos e não básicos nas enzimas presentes no extrato
57
aquoso das sementes de Helianthus annuus L. O Gráfico 29 apresenta o estudo
comparativo das metodologias de determinação de proteínas solúveis totais do material
vegetal em estudo.
Gráfico 29: Estudo comparativo das metodologias de Lowry e Bradford para a
determinação de proteínas solúveis totais
Os resultados apresentados pelo extrato aquoso das sementes de Helianthus
annuus L. foram bastante consideráveis, revelando uma promissora potencialidade deste
material como fonte biocatalítica.
4.4 Processos biocatalíticos
As sementes de Helianthus annuus L., mostradas em detalhe na Figura 8 (p. 41),
foram submetidas a reações de biorredução para avaliar seu potencial catalítico tendo
como substrato modelo, a acetofenona (1) (Figura 15, p. 58). Foram realizados
processos em diferentes condições reacionais buscando melhores conversões e excessos
enantioméricos (ee) através da variação de condições como: quantidade de
biocatalisador, co-solvente, meio tamponante (pH), obtenção do extrato bruto e
germinação de sementes. Os resultados obtidos foram apresentados e discutidos nos
itens a seguir.
8 8,5 9 9,5 10 10,5
Determinação de proteínas totais
g/L
Bradford
Lowry
58
Figura 15: Esquema da reação de redução da acetofenona por via enzimática.
O
Sementes
Helianthus annuus L.
OH
11a
4.4.1 Quantidade de biocatalisador
Inicialmente a quantidade de material vegetal (biocatalisador) foi investigada
para verificação do potencial biocatalítico frente à reação de biorredução da acetofenona
(1). O material vegetal foi previamente submetido à assepsia, utilizando-se solução de
hipoclorito de sódio (5%), em seguida lavado com água destilada e seco. Em cada
experimento utilizou-se 50 mg de substrato (1), 50 mL de água de destilada e a
quantidade de catalisador variou entre 5 e 20 g de sementes de Helianthus annuus L. As
reações foram realizadas sob agitação de 175 r.p.m., a temperatura ambiente e com 72
horas de tempo reacional. Os resultados de bioconversão, apresentados na Tabela 4,
mostraram-se moderados, sendo quase nulo quando utilizado 5 g de biocatalisador,
como mostra o Gráfico 30 (p. 60). Entretanto, os valores de excesso enantiomérico
obtidos apresentaram-se entre 88,0->99,0%, do enantiômero (S), conforme apresentado
no Gráfico 31 (p. 60). As Figuras 16-18 (p. 59) apresentam os cromatogramas obtidos
para cada análise realizada.
Tabela 4: Resultados de biorredução da acetofenona utilizando 5 g, 10 g e 20 g de
sementes Helianthus annuus L.
Sementes de
Helianthus annuus L. Conversão (%) ee (%)
5 g 0,9 > 99,0 (S)
10 g 56,9 92,3 (S)
20 g 40,7 88,0 (S)
ee – Excesso enantiomérico
59
Figura 16: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 5 g de
sementes de Helianthus annuus L.
Figura 17: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 10 g de
sementes de Helianthus annuus L.
Figura 18: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 20 g de
sementes de Helianthus annuus L.
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OH
60
A partir destas análises de biorredução da acetofenona (1) os demais parâmetros
verificados (co-solvente, meio tamponante (pH), extrato bruto enzimático e germinação
das sementes) foram estudados com 10 g de biocatalisador, visto que com essa
quantidade foram obtidos os melhores resultados de bioconversão e excesso
enantiomérico.
4.4.2 Co-solvente: Isopropanol
A classe de enzimas denominadas oxirredutases responsáveis pela
biotransformação da acetofenona (1) no respectivo álcool (1a) são dependentes de um
cofator (NAD+/NADH ou NADP
+/NADPH) para que possam desenvolver seus
processos adequadamente. Cofatores são pequenas substâncias que na sua ausência
provocam a inativação da enzima. O isopropanol atua no meio reacional reciclando o
cofator e concomitantemente, aumentando a solubilidade do substrato da reação
principal em água, facilitando a interação substrato enzima (BON et al., 2008). Nesse
contexto foram testados meios reacionais com diferentes proporções de isopropanol
(1%, 2%, 5% e 10%), para observação do comportamento da enzima visando obtenção
de melhores resultados de conversão e excessos enantioméricos. Os resultados
encontram-se na Tabela 5 (p. 61), bem como os cromatogramas das análises realizadas
para as biorreduções com o uso de co-solvente nas proporções estudadas apresentados
nas Figuras 19, 20 (p. 61), 21 e 22 (p. 62).
0
10
20
30
40
50
60
5g 10g 20g
Conversão: Quantidade de biocatalisador
Gráfico 30: Perfil de conversão da biorredução
da acetofenona utilizando diferentes
proporções de biocatalisador.
80
85
90
95
100
5g 10g 20g
Excesso enantiomérico: Quantidade de …
Gráfico 31: Perfil do excesso enantiomérico
da biorredução da acetofenona utilizando
diferentes proporções de biocatalisador.
61
Tabela 5: Resultados de biorredução da acetofenona com sementes de Helianthus
annuus L. utilizando isopropanol como co-solvente.
Co-solvente Conversão (%) ee (%)
iPrOH 1% 16,2 89,0 (S)
iPrOH 2% 19,8 90,7 (S)
iPrOH 5% 20,2 92,7 (S)
iPrOH 10% 12,0 88,2 (S)
iPrOH - Isopropanol
ee – Excesso enantiomérico
Figura 19: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 1% de
isopropanol.
Figura 20: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 2% de
isopropanol.
OH
O
OH
OH
O
OH
62
Figura 21: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 5% de
isopropanol.
Figura 22: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando 10% de
isopropanol.
Os Gráficos 32 e 33 (p. 63) mostram o perfil de atuação do complexo enzimático
das sementes de Helianthus annuus L. utilizando o isopropanol como co-solvente.
OH
O
OH
OH
O
OH
63
A utilização de isopropanol como co-solvente não possibilitou a melhoria da
conversão, pelo contrário, provocou drástico decréscimo. Entretanto, os valores de
excesso enantiomérico obtidos em todos os ensaios mostraram semelhantes aos obtidos
sem co-solvente, resultando como majoritário o enantiômero (S). Os melhores
resultados para a otimização com este parâmetro foram obtidos quando utilizou-se uma
proporção (v/v) de 5% de isopropanol.
4.4.3 Meio tamponante: tampão fosfato
As reações de biorredução da acetofenona (1), utilizando as sementes de
Helianthus annuus L., também foram avaliadas em meios tamponantes para verificação
da influência do pH na atuação da enzima, buscando melhores valores de conversão e
ee. Foram testadas soluções tampões fostato com os respectivos valores de pH 6,0, 7,0,
e 8,0. A Tabela 6 (p. 64) a seguir mostra os resultados obtidos nos ensaios. Os
cromatogramas das análises das reações apresentam-se nas Figuras 23, 24 (p. 64) e 25
(p. 65). Os Gráficos 34 e 35 (p. 65) mostram o perfil de conversão e do excesso
enantiomérico obtidos por esta metodologia.
Gráfico 32: Perfil de conversão da biorredução
da acetofenona utilizando diferentes
proporções de co-solvente: isopropanol.
Gráfico 33: Perfil do excesso enantiomérico
da biorredução da acetofenona utilizando
diferentes proporções de co-solvente:
isopropanol.
0
5
10
15
20
25
1% 2% 5% 10%
Conversão: Co-solvente (Isopropanol)
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
1% 2% 5% 10%
Excesso enantiomérico: Co-solvente (Isopropanol)
64
Tabela 6: Resultados de biorredução da acetofenona com sementes de Helianthus
annuus L. utilizando diferentes soluções tampão.
pH Conversão (%) ee (%)
6,0 8,4 84,8 (S)
7,0 4,1 48,6 (S)
8,0 17,3 43,4 (S)
ee – Excesso enantiomérico
Figura 23: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando solução
tampão pH 6,0.
Figura 24: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando solução
tampão pH 7,0.
OH
O
OH
OH
O
OH
65
Figura 25: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando solução
tampão pH 8,0.
4.4.4 Extrato enzimático bruto segundo Lupetti (2000)
A metodologia de Lupetti (2000) foi adotada para esse procedimento, porém,
com modificações. Triturou-se 10 g de sementes de Helianthus annuus L. e
acrescentou-se 1 g de polivinilpirrolidona (PVP), juntamente com 50 mL de solução
tampão fosfato pH 6,5. À mistura resultante foi adicionado 50 mg de substrato (1). A
reação foi processada em duplicata com velocidade de agitação de 175 r.p.m. e tempo
de 72 horas. Excelente valor de excesso enatiomérico, para o enantiômero (S), foi obtido
como mostra o cromatograma da Figura 26 (p. 66) e, em detalhe na Tabela 7 (p. 66). O
OH
O
OH
0
5
10
15
20
6,0 7,0 8,0
Conversão: Tampão fosfato
Gráfico 34: Perfil de conversão da biorredução
da acetofenona utilizando soluções tampão
com diferentes valores de pH.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
6,0 7,0 8,0
Excesso enantiomérico: Tampão fosfato
Gráfico 35: Perfil do excesso enantiomérico
da biorredução da acetofenona utilizando
soluções tampão com diferentes valores de pH.
66
valor de conversão obtido, entretanto, foi inferior a outros obtidos com outras
metodologias realizadas anteriormente.
Tabela 7: Resultados de biorredução da acetofenona com sementes de Helianthus
annuus L. utilizando extrato bruto enzimático com PVP.
Extrato enzimático bruto
com PVP Conversão (%) ee (%)
Gpvp 21,0 >99,0 (S)
ee – Excesso enantiomérico
Figura 26: Cromatograma do produto da biorredução da acetofenona utilizando extrato
bruto enzimático com PVP.
]
Segundo Zeraik et al. (2008), o papel do polímero é agir como um protetor,
removendo compostos fenólicos naturais dos extratos enzimáticos, evitando oxidações
pelas enzimas peroxidases, entretanto o objetivo da reação não foi a utilização desta
classe de enzimas, mas o excelente resultado para o excesso enantiomérico obtido fez-se
com que esta metodologia, fosse testada também com os derivados da acetofenona 4-
bromo-acetofenona (2), 4-fluoro-acetofenona (3), 4-cloro-acetofenona (4), 4-metóxi-
acetofenona (5), 4-metil-acetofenona (6), 3-bromo-acetofenona (7), 3-metóxi-
acetofenona (8), 2-bromo-acetofenona (9), 2-cloro-acetofenona (10), 2-metóxi-
acetofenona (11) e 2-hidróxi-acetofenona (12) foram submetidos as reações com as
sementes de Helianthus annuus L. Uma cetona α-halogenada, 2,2,2-trifluoro-
acetofenona (13), bem como duas outras cetonas aromáticas, α-tetralona (14) e α-
OH
O
67
indanona (15), também foram testadas para corroboração deste resultado. Zeraik et al.
(2008) salientam, ainda, que o bom desempenho deste agente protetor é atribuído à sua
baixa solubilidade em meio aquoso e à formação de ligação de hidrogênio entre os
substratos naturais e o polímero PVP. A Figura 27, a seguir, mostra a estrutura da
polivinilpirrolidona.
Figura 27: Estrutura monomérica do polímero PVP.
N O
*
* n
4.4.5 Germinação das sementes de Helianthus annuus L.
Segundo Beckert et al., (2000) a germinação pode ser definida como uma série
de processos metabólicos e morfogenéticos, que se inicia com a absorção de água pela
semente seca e quiescente, seguida da síntese e ativação de várias enzimas. Com essa
perspectiva buscou-se a otimização no processo de biorredução da acetofenona (1) com
sementes de Helianthus annuus L. germinadas. A germinação ocorreu em um período
máximo de 120 horas, onde as sementes foram deixadas em meio úmido até a abertura
dos cotilédones e surgimento das primeiras porções de raiz. As sementes foram
trituradas e, sob as mesmas condições reacionais descritas na metodologia 5.4.1.5 (p.
108), apresentaram baixos valores de conversão e bons resultados de excesso
enantiomérico, conforme a Tabela 8 mostrada a seguir, bem como o cromatograma na
Figura 28 (p. 68).
Tabela 8: Resultados de biorredução da acetofenona com sementes germinadas de
Helianthus annuus L.
Sementes germinadas de
Helianthus annuus L.
Conversão (%) ee (%)
28,7 83,8 (S)
ee – Excesso enantiomérico
68
Figura 28: Cromatograma do produto de biorredução da acetofenona utilizando
sementes germinadas de Helianthus annuus L.
O processo de germinação não possibilitou uma melhoria no teor de conversão,
obtendo-se valor inferior (28,7%) ao resultado em meio aquoso. O excesso
enantiomérico apresentou valor considerável de 83,8% para o isômero S, entretanto,
melhor resultado foi obtido anteriormente, no caso, utilizando o extrato bruto
enzimático com PVP de >99,0%.
4.4.6 Reações de biotransformação utilizando derivados da acetofenona
Após a obtenção dos resultados de otimização para a acetofenona (1) utilizando
sementes de Helianthus annuus L., procedeu-se as biotransformações com alguns de
seus derivados: 4-bromo-acetofenona (2), 4-fluoro-acetofenona (3), 4-cloro-acetofenona
(4), 4-metóxi-acetofenona (5), 4-metil-acetofenona (6), 3-bromo-acetofenona (7), 3-
metóxi-acetofenona (8), 2-bromo-acetofenona (9), 2-cloro-acetofenona (10), 2-metóxi-
acetofenona (11) e 2-hidróxi-acetofenona (12). Testou-se, ainda, uma cetona α-
halogenada, 2,2,2-trifluoro-acetofenona (13), e duas outras cetonas aromáticas, α-
tetralona (14) e α-indanona (15). As estruturas dos substratos encontram-se na Figura 29
(p. 69).
OH
O
OH
69
Figura 29: Cetonas aromáticas selecionadas para a reação com as sementes de
Helianthus annuus L.
O
Br
O
F
O
Cl
O
H3CO
O
H3C
O
Br
O
OCH3
O
Br
O
OCH3
O
Cl
O
OH
O
CF3
O O
(2) (3) (4) (5)
(9)
(8)(7)
(6)
(10)
(13)
(11)
(14)
(12)
(15)
O melhor resultado de bioconversão da acetofenona foi verificado com a
utilização de 10g de sementes de Helianthus annuus L. em meio aquoso (G10), 56,9%,
enquanto o melhor excesso enantiomérico foi encontrado quando utilizou-se o extrato
bruto enzimático com PVP (Gpvp), >99,0%. Baseando-se nesses resultados procedeu-
se as biotransformações das cetonas acima listadas utilizando ambas as metodologias.
Os resultados obtidos foram discutidos para os derivados em função do grupamento
substituinte nas diferentes posições do anel aromático (-para, -meta e -orto), e das
demais em função de suas particularidades, como descrito nos tópicos a seguir.
70
4.4.6.1 Cetonas -para substituídas
Observou-se, inicialmente, o efeito de grupos substituintes na posição -para da
acetofenona (1) através da biotransformação dos derivados 4-bromo-acetofenona (2), 4-
fluoro-acetofenona (3), 4-cloro-acetofenona (4), 4-metóxi-acetofenona (5) e 4-metil-
acetofenona (6), analisando-se a conversão e o excesso enantiomérico, por intermédio
de curvas de calibração já apresentadas neste capítulo (p. 49-54). Os produtos
esperados para a biorredução das acetofenonas –para substituídas encontram-se na
Figura 30 para as metodologia G10 e Gpvp.
Figura 30: Produtos esperados da reação das cetonas -para substituídas utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
O
R1
(2) R = Br
(3) R = F
(4) R = Cl
(5) R = OCH3
(6) R = CH3
OH
R1
(2a) R = Br
(3a) R = F
(4a) R = Cl
(5a) R = OCH3
(6a) R = CH3
G10 e Gpvp
As reações com o derivado 4-bromo-acetofenona (2) apresentaram ótimos
valores de excesso enantiomérico para as duas metodologias utilizadas, entretanto, os
valores de conversão foram baixos, inclusive quando se utilizou a metodologia de
melhor conversão para a acetofenona (1), como mostra a Tabela 9 (p. 71). As Figuras 31
e 32 (p. 71) apresentam os cromatogramas dos produtos da bioconversão deste derivado
em meio aquoso (G10) e em extrato bruto enzimático (Gpvp), respectivamente. O
Gráfico 36 (p. 72) apresenta o perfil do ensaio biocatalítico utilizando as duas
metodologias para o derivado em questão.
71
Tabela 9: Resultados da biotransformação da 4-bromo-acetofenona com sementes de
Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
Sementes de Helianthus annuus L.
4-bromo-acetofenona Conversão (%) ee (%)
G10 17,5 98,1 (S)
Gpvp 17,5 85,0 (S)
ee – Excesso enantiomérico
Figura 31: Cromatograma do produto da biorredução da 4-bromo-acetofenona
utilizando a metodologia G10.
Figura 32: Cromatograma do produto da biorredução da 4-bromo-acetofenona
utilizando a metodologia Gpvp
.
O
Br
OH
Br
O
Br
OH
Br
72
Gráfico 36: Perfil de biotransformação da 4-bromo-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
Utilizando-se o derivado 4-fluoro-acetofenona (3), obtiveram-se baixos valores
de conversão em comparação com a cetona não substituída (1) (Tabela 10), entretanto,
ótimos valores de ee foram observados de acordo com os cromatogramas das Figuras 33
e 34 (p. 73), em ambas as metodologias. O perfil do ensaio biocatalítico utilizando as
duas metodologias para o derivado em questão está representado pelo Gráfico 37 (p.
73).
Tabela 10: Resultados da biotransformação da 4-fluoro-acetofenona com sementes de
Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
Sementes de Helianthus annuus L.
4-fluoro-acetofenona Conversão (%) ee (%)
G10 8,4 92,0 (S)
Gpvp 9,8 90,2 (S)
ee – Excesso enantiomérico
17,5
98,1
17,5
85,0
0
20
40
60
80
100
120
Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)
4-b
rom
o-a
ceto
fen
on
a
G10
Gpvp
73
Figura 33: Cromatograma do produto da biorredução da 4-fluoro-acetofenona
utilizando a metodologia G10.
Figura 34: Cromatograma do produto da biorredução da 4-fluoro-acetofenona
utilizando a metodologia Gpvp.
Gráfico 37: Perfil de biotransformação da 4-fluoro-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
8,4
92,0
9,8
90,2
0
20
40
60
80
100
Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)
4-f
luo
r-ac
eto
fen
on
a G10
Gpvp
O
F
OH
F
O
F
OH
F
74
O derivado 4-cloro-acetofenona apresentou resultados não esperados em relação
ao contexto já relatado, pois a metodologia que apresentou melhor conversão foi aquela
com o polímero PVP (Gpvp). Os valores de conversão para este substrato em
comparação com a acetofenona (1) foram consideráveis em ambas as metodologias,
destacando-se 58,5% para Gpvp (Figura 36, p. 75) e 29,6% para G10 (Figura 35),
apresentando excessos enantioméricos de 91,0% e 65,0%, respectivamente, para o
isômero S (Tabela 11). O Gráfico 38 (p. 75) apresenta o perfil do ensaio biocatalítico
utilizando as duas metodologias para o derivado 4-cloro-acetofenona.
Tabela 11: Resultados da biotransformação da 4-cloro-acetofenona com sementes de
Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
Sementes de Helianthus annuus L.
4-cloro-acetofenona Conversão (%) ee (%)
G10 29,6 65,0 (S)
Gpvp 58,5 91,0 (S)
ee – Excesso enantiomérico
Figura 35: Cromatograma do produto da biorredução da 4-cloro-acetofenona utilizando
a metodologia G10.
OH
Cl
O
Cl
75
Figura 36: Cromatograma do produto da biorredução da 4-cloro-acetofenona utilizando
a metodologia Gpvp.
Gráfico 38: Perfil de biotransformação da 4-cloro-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
Avaliando o derivado 4-metóxi-acetofenona (5) na biorredução utilizando as
sementes de Helianthus annuus L. obteve-se bons resultados de excesso enantiomérico,
ressaltando-se >99,0% para o isômero (S) (Tabela 12, p. 76), utilizando metodologia
Gpvp, corroborando com os resultados obtidos com a acetofenona (1). Em relação os
valores de conversão, pouco satisfatórios, a metodologia que apresentou melhor
resultado foi Gpvp com 21,5%. Em contrapartida a metodologia G10 apresentou um
pobre valor de conversão 7,2% (Figuras 37 e 38, p. 76). Avalia-se nessas condições que
para biotransformação do derivado 4-metóxi-acetofenona (5), a utilização do meio
reacional Gpvp para obtenção do produto enantiomericamente puro é mais favorável. O
Gráfico 39 (p. 77) apresenta o perfil do ensaio biocatalítico utilizando as duas
metodologias para o derivado em questão.
29,6
65,0 58,5
91,0
0
20
40
60
80
100
Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)
4-c
loro
-ace
tofe
no
na
G10
Gpvp
OH
Cl
O
Cl
76
Tabela 12: Resultados da biotransformação da 4-metóxi-acetofenona com sementes de
Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
Sementes de Helianthus annuus L.
4-metóxi-acetofenona Conversão (%) ee (%)
G10 7,2 82,0 (S)
Gpvp 21,5 >99,0 (S)
ee – Excesso enantiomérico
Figura 37: Cromatograma do produto da biorredução da 4-metóxi-acetofenona
utilizando a metodologia G10.
Figura 38: Cromatograma do produto da biorredução da 4-metóxi-acetofenona
utilizando a metodologia Gpvp.
O
H3CO
O
H3COOH
H3CO
OH
H3CO
77
Gráfico 39: Perfil de biotransformação da 4-metóxi-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
Avaliou-se o desempenho do complexo enzimático das sementes de Helianthus
annuus L. utilizando um derivado com substituinte alquila, doador de elétrons por
indução, 4-metil-acetofenona, para comparação de resultados com a cetona não
substituída (1) (Tabela 13). Os valores de conversão apresentaram-se pouco
satisfatórios, obtendo-se 12,7% e 30,3%, utilizando-se G10 (Figura 39, p. 78) e Gpvp
(Figura 40, p. 78), respectivamente. Por outro lado, ótimos valores de excesso
enantiomérico foram encontrados sendo 82,0% para G10 e >99% para Gpvp.
Tabela 13: Resultados da biotransformação da 4-metil-acetofenona com sementes de
Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
Sementes de Helianthus annuus L.
4-metil-acetofenona Conversão (%) ee (%)
G10 12,7 82,4 (S)
Gpvp 30,3 >99,0 (S)
ee – Excesso enantiomérico
7,2
82,0
21,5
> 99,0
0
20
40
60
80
100
120
Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)
4-m
etó
xi-a
ceto
fen
on
a G10
Gpvp
78
Figura 39: Cromatograma do produto da biorredução da 4-metil-acetofenona utilizando
a metodologia G10.
Figura 40: Cromatograma do produto da biorredução da 4-metil-acetofenona utilizando
a metodologia Gpvp.
O cromatograma da análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE) da 4-metil-acetofenona apresentou um pico com tempo de retenção diferente
dos padrões anteriormente injetados para a metodologia Gpvp, evidenciando a formação
de um produto não esperado, entretanto foi realizada a análise em Cromatográfo Gasoso
acoplado a Espectrômetro de Massa (CG/EM) para confirmação da estrutura do produto
formado. O cromatograma CG/EM do produto reacional se encontra na Figura 41 (p.
79), bem como nas Figuras 42 e 43 (p. 79) os espectros de massa.
OH
H3C
OH
H3C
O
H3C
O
H3C
79
Figura 41: Cromatograma CG/EM do produto da biorredução da 4-metil-acetofenona
utilizando a metodologia Gpvp.
Figura 42: Espectro de massa do 4-metil-feniletanol.
Figura 43: Espectro de massa da 4-metil-acetofenona.
O grupamento metila na posição -para do anel aromático da acetofenona
interfere diretamente nos valores de conversão, em contrapartida os valores de excesso
enantiomérico se mantiveram em bons patamares, demonstrando que o complexo
enzimático do material em questão atua com alta estereosseletividade. O Gráfico 40
OH
H3C
O
H3C
OH
H3C
O
H3C
80
apresenta o perfil do ensaio biocatalítico utilizando as duas metodologias para o
derivado em questão.
Gráfico 40: Perfil de biotransformação da 4-metil-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
Os excessos enantioméricos dos substratos estudados apresentaram-se como
valores aproximados daqueles obtidos com acetofenona (1), mostrando que a adição
desses grupamentos na posição -para não interferem no acoplamento enzima-substrato,
sendo produzido apenas o enantiômero de configuração S.
4.4.6.2 Cetonas -meta substituídas
A redução de derivados da acetofenona -meta substituídos também foi avaliada,
no caso, a 3-bromo-acetofenona (7) e a 3-metóxi-acetofenona (8). A Figura 44 (p. 81)
apresenta os produtos esperados dos derivados em questão para as metodologias G10 e
Gpvp, respectivamente.
12,7
82,4
30,3
> 99,0
0
20
40
60
80
100
120
Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)
4-m
eti
l-ac
eto
fen
on
a G10
Gpvp
81
Figura 44: Produtos esperados da reação das cetonas -meta substituídas utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
O
(7) R = Br
(8) R = OCH3
OH
(7a) R = Br
(8a) R = OCH3
G10 e Gpvp
R R
O derivado 3-bromo-acetofenona (7) apresentou baixos valores de conversão
tanto para metodologia G10, quanto para a metodologia Gpvp, 11,8% e 11,7%,
respectivamente. Por outro lado os valores de excessos enantioméricos encontrados
foram ótimos, sendo 85,5% (G10) e >99,0% (Gpvp) (Tabela 14) como apresentado nos
cromatogramas das Figuras 45 (G10) e 46 (Gpvp) (p. 82), respectivamente. O Gráfico
41 (p. 82) apresenta o perfil do ensaio biocatalítico utilizando as duas metodologias para
o derivado em questão.
Tabela 14: Resultados da biotransformação da 3-bromo-acetofenona com sementes de
Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
Sementes de Helianthus annuus L.
3-bromo-acetofenona Conversão (%) ee (%)
G10 11,8 85,5 (S)
Gpvp 11,7 >99,0 (S)
ee – Excesso enantiomérico
82
Figura 45: Cromatograma do produto da biorredução da 3-bromo-acetofenona
utilizando a metodologia G10.
Figura 46: Cromatograma do produto da biorredução da 3-bromo-acetofenona
utilizando a metodologia Gpvp.
Gráfico 41: Perfil de biotransformação da 3-bromo-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
11,8
85,5
11,7
> 99,0
0
20
40
60
80
100
120
Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)
3-b
rom
o-a
ceto
fen
on
a
G10
Gpvp
O
BrOH
Br
O
Br
OH
Br
83
A 3-metóxi-acetofenona (8) foi reduzida ao correspondente álcool com
excelentes excessos enantioméricos >99,0% (Tabela 15) em ambas as metodologias
utilizadas. Ressalta-se a obtenção do isômero R utilizando a metodologia G10, fato
ainda não encontrado nesses estudos de biorredução. Diante deste resultado conclui-se
que a presença do grupo metoxila na posição -meta interfere na estereosseletividade das
oxirredutases presentes no complexo enzimático de Helianthus annuus L. Nesse
contexto, sugere-se que novos experimentos sejam feitos, utilizando-se outros tipos de
cetonas aromáticas, com este substituinte. Destaca-se também o fato das conversões
terem apresentado razoáveis valores, 31,4% (G10) e 25,3% (Gpvp), como mostrado nos
cromatogramas das Figuras 47 e 48 (p. 84). O Gráfico 42 (p. 84 ) apresenta o perfil do
ensaio biocatalítico utilizando as duas metodologias para o derivado em questão.
Tabela 15: Resultados da biotransformação da 3-metóxi-acetofenona com sementes de
Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
Sementes de Helianthus annuus L.
3-metóxi-acetofenona Conversão (%) ee (%)
G10 31,0 >99,0 (R)
Gpvp 25,3 >99,0 (S)
ee – Excesso enantiomérico
Figura 47: Cromatograma do produto da biorredução da 3-metóxi-acetofenona
utilizando a metodologia G10.
OH
OCH3
O
OCH3
84
Figura 48: Cromatograma do produto da biorredução da 3-metóxi-acetofenona
utilizando a metodologia G10.
Gráfico 42: Perfil de biotransformação da 3-metóxi-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
Os valores de conversão para os derivados em questão mostraram-se baixos, em
relação à cetona não substituída (1). Uma justificativa para tal fato deve ser o
impedimento estérico do grupo substituinte dificultando o acoplamento enzima-
substrato. Entretanto a classe de enzimas, oxirredutases, das sementes de Helianthus
annuus L. demonstraram alta estereosseletividade frente aos derivados –meta para a
metodologia Gpvp, formando o isômero S, com exceção para o derivado 3-metóxi-
acetofenona (8) utilizando a metodologia G10, com a formação do isômero R.
31,0
> 99,0
25,3
> 99,0
0
20
40
60
80
100
120
Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)
3-m
etó
xi-a
ceto
fen
on
a
G10
Gpvp
OH
OCH3
O
OCH3
85
4.4.6.3 Cetonas -orto substituídas
Acetofenonas, –orto substituídas, (9), (10), (11) e (12), também foram
investigadas nos processos de biorredução. A presença do grupamento nesta posição do
anel aromático da correspondente cetona pode atuar impedindo o acoplamento eficaz
com a enzima, diminuindo os valores de conversão. A Figura 49 apresenta os produtos
esperados pelas metodologias G10 e Gpvp, respectivamente, para as cetonas –orto
substituídas.
Figura 49: Produtos esperados da reação das cetonas -orto substituídas utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
O
(9) R = Br
(10) R = Cl
(11) R = OCH3
(12) R = OH
OH
G10 e Gpvp
R R(9a) R = Br
(10a) R = Cl
(11a) R = OCH3
(12a) R = OH
A 2-bromo-acetofenona (9) foi reduzida ao correspondente álcool, isômero de
configuração S, com excelentes valores de excesso enantiomérico >99,0%, em ambas as
metodologias (Figura 50 e 51, p. 86). Entretando apresentaram baixos valores de
conversão 23,5% (G10) e 21,4% (Gpvp) conforme apresentado na Tabela 16 (p. 86). O
Gráfico 43 (p. 87) apresenta o perfil do ensaio biocatalítico utilizando as duas
metodologias para o derivado 2-bromo-acetofenona.
86
Tabela 16: Resultados da biotransformação da 2-bromo-acetofenona com sementes de
Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
Sementes de Helianthus annuus L.
2-bromo-acetofenona Conversão (%) ee (%)
G10 23,5 >99,0 (S)
Gpvp 21,4 >99,0 (S)
ee – Excesso enantiomérico
Figura 50: Cromatograma do produto da biorredução da 2-bromo-acetofenona
utilizando a metodologia G10.
Figura 51: Cromatograma do produto da biorredução da 2-bromo-acetofenona
utilizando a metodologia Gpvp.
OH
Br
OH
Br
O
Br
O
Br
87
Gráfico 43: Perfil de biotransformação da 2-bromo-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
A redução da 2-cloro-acetofenona (10) ocorreu com excelente conversão
utilizando-se a metodologia Gpvp, onde obteve-se 94,6% do produto, bem acima do
ocorrido com a cetona não substituída (1) e com a metodologia G10, obteve-se valor de
conversão igual a 61,4% (Tabela 17). Os valores de excessos enantioméricos
encontrados correspondentes a 5,4% e 5,3% para as metodologias Gpvp e G10,
respectivamente, são insatisfatórios, uma vez que o presente trabalho tem como objetivo
a produção de substâncias enantiomericamente puras. Os cromatogramas obtidos do
produto reacional do derivado em questão estão apresentados nas Figuras 52 e 53 (p.
88) para as metodologias Gpvp e G10, respectivamente. O Gráfico 44 (p. 88) apresenta
o perfil do ensaio biocatalítico utilizando as duas metodologias para o derivado em
questão.
Tabela 17: Resultados da biotransformação da 2-cloro-acetofenona com sementes de
Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
Sementes de Helianthus annuus L.
2-cloro-acetofenona Conversão (%) ee (%)
G10 61,4 5,3 (S)
Gpvp 94,6 5,4 (S)
ee – Excesso enantiomérico
23,5
> 99,0
21,4
> 99,0
0
20
40
60
80
100
120
Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)
2-b
rom
o-a
ceto
fen
on
a G10
Gpvp
88
Figura 52: Cromatograma do produto da biorredução da 2-cloro-acetofenona utilizando
a metodologia G10.
Figura 53: Cromatograma do produto da biorredução da 2-cloro-acetofenona utilizando
a metodologia Gpvp.
Gráfico 44: Perfil de biotransformação da 2-cloro-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
61,4
5,3
94,6
5,4
0
20
40
60
80
100
Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)
2-c
loro
-ace
tofe
no
na
G10
Gpvp
OH
Cl
OH
Cl
O
Cl
O
Cl
89
A diferença do tamanho relativo do átomo de halogênio entre os derivados -orto
halogenados estudados proporcionou uma mudança acentuada na atuação das enzimas
responsáveis pelo processo de biorredução. A conversão ao correspondente álcool para
o derivado 2-cloro foi bastante superior a aquele apresentado pelo derivado 2-bromo,
onde provavelmente o fator estérico foi preponderante para este resultado. Entretanto os
melhores resultados de excesso enantiomérico foram encontrados para o derivado 2-
bromo em relação ao quase nulo encontrado para o 2-cloro. Uma possível justificativa
para tal fato seria a melhor interação, da enzima com o substrato 2-bromo, formando
apenas o estereoisômero, demonstrando nesse caso sua estereosseletividade.
O derivado 2-metóxi-acetofenona (11) apresentou baixos valores de conversão,
como mostrado na Tabela 18 a seguir, sendo para a metodologia Gpvp o melhor
resultado de 22,8%. Os álcoois formados pelas duas metodologias apresentaram
configuração S, e foi obtido com valores de 92,5% (Figura 54) para G10 e >99,0% para
Gpvp (Figura 55, p. 90), sendo considerados ótimos resultados. O Gráfico 45 (p. 90)
apresenta o perfil do ensaio biocatalítico utilizando as duas metodologias para o
derivado em questão.
Tabela 18: Resultados da biotransformação da 2-metóxi-acetofenona com sementes de
Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
Sementes de Helianthus annuus L.
2-metóxi-acetofenona Conversão (%) ee (%)
G10 14,0 92,5 (S)
Gpvp 22,8 >99,0 (S)
ee – Excesso enantiomérico
Figura 54: Cromatograma do produto da biorredução da 2-metóxi-acetofenona
utilizando a metodologia G10.
OH
OCH3
O
OCH3
90
Figura 55: Cromatograma do produto da biorredução da 2-metóxi-acetofenona
utilizando a metodologia Gpvp.
Gráfico 45: Perfil de biotransformação da 2-metóxi-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
A redução do derivado 2-hidróxi-acetofenona (12) não foi obtida. Os
cromatogramas das reações com metodologia G10 (Figura 56, p. 91) e Gpvp (Figura 57,
p. 91) apresentam somente o pico correspondente à cetona, substrato inicial (Tabela 19).
Tabela 19: Resultados da biotransformação da 2-hidróxi-acetofenona com sementes de
Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
Sementes de Helianthus annuus L.
2-hidróxi-acetofenona Conversão (%) ee (%)
G10 NR -
Gpvp NR -
NR – Não reagiu; ee – Excesso enantiomérico
14,0
92,5
22,8
> 99,0
0
20
40
60
80
100
120
Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)
2-m
etó
xi-a
ceto
fen
on
a G10
Gpvp
OH
OCH3
O
OCH3
91
Figura 56: Cromatograma do produto da biorredução da 2-hidróxi-acetofenona
utilizando a metodologia G10.
Figura 57: Cromatograma do produto da biorredução da 2-hidróxi-acetofenona
utilizando a metodologia Gpvp.
A posição do grupamento hidroxila na posição -orto favorece a formação de
ligação de hidrogênio intramolecular tornando a carbonila pouco reativa. O espectro de
RMN ¹H sugere o fato acima discutido com o aparecimento de um sinal em δH 12,26
ppm (s, 1H) correspondente à hidroxila quelada (Figura 58, p. 92).
O
OH
O
OH
92
Figura 58: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) da 2-hidróxi-acetofenona.
4.4.6.4 Cetona α-halogenada
2,2,2-trifluoro-acetofenona, um derivado α-halogenado da acetofenona, também
teve sua biorreatividade comparada com a acetofenona (1) frente às sementes de
Helianthus annuus L. O produto esperado pela biorredução deste substrato com as
metodologias G10 e Gpvp encontra-se na Figura 59, p. 93.
OO
H
93
Figura 59: Produto esperado da reação da 2,2,2-trifluoro-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
CF3
O
CF3
OH
G10 e Gpvp
(13) (13a)
A substituição dos hidrogênios alfa pelos átomos de flúor, retiradores de elétrons
por efeito indutivo, acarretaram uma diminuição na densidade eletrônica da carbonila,
tornando-a mais eletrofílica e com isso mais reativa.
As conversões obtidas foram excelentes para ambas as metodologias >99,0%
(Tabela 20), em contrapartida baixos valores de excesso enantiomérico foram
encontrados, sendo o maior deles apresentado pela metodologia G10 18,1% (Figura 60,
p. 94) em comparação com Gpvp onde se obteve um valor quase nulo 3,9% (Figura 61,
p. 94). A configuração do álcool obtido não foi determinada. O Gráfico 46 (p. 94)
apresenta o perfil do ensaio biocatalítico utilizando as duas metodologias para o
derivado em questão.
Tabela 20: Resultados da biotransformação da 2,2,2-trifluoro-acetofenona com
sementes de Helianthus annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
Sementes de Helianthus annuus L.
2,2,2-trifluoro-acetofenona Conversão (%) ee (%)
G10 >99,0 18,1
Gpvp >99,0 3,9
ee – Excesso enantiomérico
94
Figura 60: Cromatograma do produto da biorredução da 2,2,2-trifluoro-acetofenona
utilizando a metodologia G10.
Figura 61: Cromatograma do produto da biorredução da 2,2,2-trifluoro-acetofenona
utilizando a metodologia Gpvp.
Gráfico 46: Perfil de biotransformação da 2,2,2-trifluoro-acetofenona utilizando as
metodologias G10 e Gpvp.
> 99,0
18,1
> 99,0
3,9
0
20
40
60
80
100
120
Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)
2,2
,2-t
rifl
uo
race
tofe
no
na
G10
Gpvp
CF3
OH
CF3
OH
95
4.4.6.5 Cetonas aromáticas
A biotransformação da α-tetralona (14) tendo como objetivo a obtenção do α-
tetralol (14a), foi investigada devido este álcool ser considerado um intermediário muito
utilizado em sínteses (FERRAZ et al., 2008). A redução da α-indanona (15) também foi
investigada. Segundo Polo et al. (2008) o anel indânico está presente em uma série de
produtos naturais e fármacos com atividade farmacológica, tais como o Indinavir® –
um inibidor da HIV-protease; o Aricept® – utilizado no tratamento do mal de
Alzheimer; o mutisiantol; o taiwaniaquinol B e a (+)-indacrinona – fármaco contra
hipertensão, sendo também encontrado em várias formulações de fragrâncias. Os
produtos esperados das reações da α-tetralona e da α-indanona, utilizando as
metodologias G10 e Gpvp, encontram-se na Figura 62.
Figura 62: Produtos esperados da reação da α-tetralona e da α-indanona utilizando a
metodologia G10 e Gpvp.
G10 e Gpvp
(14) n = 2(15) n = 1
O
(14a) n = 2(15a) n = 1
n
OH
n
Os resultados de excesso enantiomérico encontrados para a α-tetralona
utilizando as metodologias G10 e Gpvp foram excelentes, >99,0%, mostrando uma alta
estereosseletividade da enzima das sementes de Helianthus annuus L. frente a esse
substrato (Tabela 21, p. 96).
A conversão detectada para a metodologia G10 foi 23,4% (Figura 63, p. 96), e
para Gpvp foi 21,6% (Figura 64, p. 96), através da análise dos cromatogramas por
intermédio de curva de calibração apresentada neste capítulo (4.2 p. 49-54).
96
Um comparativo dos meios reacionais utilizados para a investigação da
biotransformação da α-tetralona está representado no Gráfico 47 (p. 97).
Tabela 21: Resultados da biotransformação da α-tetralona com sementes de Helianthus
annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
Sementes de Helianthus annuus L.
α-tetralona Conversão (%) ee (%)
G10 23,4 >99,0 (S)
Gpvp 21,6 >99,0 (S)
NQ – Não quantificado; ee – Excesso enantiomérico
Figura 63: Cromatograma do produto da biorredução da α-tetralona utilizando a
metodologia G10.
Figura 64: Cromatograma do produto da biorredução da α-tetralona utilizando a
metodologia Gpvp.
O
OH
O
OH
97
Gráfico 47: Perfil de biotransformação da α-tetralona utilizando as metodologias G10 e
Gpvp.
A redução da α-indanona (15) foi considerada satisfatória quando utilizou-se a
metodologia G10, sendo obtido 23,5% de conversão (Tabela 22) ao correspondente
álcool, α-indanol (15a) com excelente excesso enantiomérico para o isômero S,
conforme cromatograma apresentado na Figura 65 (p. 98). A metodologia Gpvp
apresentou valor de conversão muito baixo 4,3%, entretanto apenas um enantiômero
formado de configuração S (Figura 66, p. 98). O gráfico 48 (p. 98) apresenta o perfil do
ensaio biocatalítico utilizando as duas metodologias para o derivado em questão.
Tabela 22: Resultados da biotransformação da α-indanona com sementes de Helianthus
annuus L. pelas metodologias G10 e Gpvp.
,
Sementes de Helianthus annuus L.
α-indanona Conversão (%) ee (%)
G10 2,0 >99,0 (S)
Gpvp 4,3 >99,0 (S)
ee – Excesso enantiomérico
23,4
> 99,0
21,6
> 99,0
0
20
40
60
80
100
120
Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)
α-t
etr
alo
na
G10
Gpvp
98
Figura 65: Cromatograma do produto de biorredução da α-indanona utilizando a
metodologia G10.
Figura 66: Cromatograma do produto da biorredução da α-indanona utilizando a
metodologia Gpvp.
Gráfico 48: Perfil de biotransformação da α-indanona utilizando as metodologias G10 e
Gpvp.
Os resultados semelhantes de conversão e excesso enantiomérico entre as duas
cetonas acima destacadas, α-tetralona e α-indanona, mostram a compatibilidade de
interação entre enzima-substrato independente da cadeia cíclica conjugada ao anel
aromático que faz parte do esqueleto dessas cetonas.
2,0
> 99,0
4,3
> 99,0
0
20
40
60
80
100
120
Conversão (%) Excesso enantiomérico (%)
α-i
nd
ano
na
G10
Gpvp
OH
OH
O
O
99
PROCEDIMENTO
EXPERIMENTAL
100
5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
5.1 Material utilizado
As determinações de massas foram realizadas utilizando balança analítica Ohaus
Analytical Plus.
As reações enzimáticas foram realizadas em uma mesa agitadora modelo CT-
165 da fabricante CIENTEC.
Os solventes utilizados nas reações, tratamento de reações e colunas
cromatográficas são de qualidade P.A. e de procedência comercial da Synth. O reagente
Folin-Ciocalteau utilizado na determinação de proteínas dos vegetais estudados tem
procedência comercial da marca QEEL – Química Especializada Erich LTDA e o
reagente de Bradford da Sigma Aldrich. Tartarato duplo de sódio e potássio
(KNaC4H4O6.4H2O), carbonato de sódio (Na2CO3), hidróxido de sódio (NaOH), sulfato
cúprico (CuSO4.5H2O) são de procedência VETEC.
Borohidreto de sódio (NaBH4) tem procedência comercial da PROSYNTH.
5.2 Métodos de Análise
As análises necessárias para obtenção dos espectros e cromatogramas, incluindo
técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e ressonância magnética
nuclear (RMN) foram realizadas na Central Analítica do Departamento de Química
Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará.
5.2.1 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Para cromatografia em camada delgada (CCD) foram utilizadas cromatoplacas
de gel de sílica 60 (Ф = 2-25μm) sobre poliéster T-6145 provenientes da marca SIGMA
CHEMICAL CO com camada de 250 μm de espessura e dimensões de 10x5 cm.
Também foram utilizadas placas de vidro revestidas com uma camada de
aproximadamente 0,5 mm de espessura de sílica gel 60 (Ф = 0,004-0,005 mm) código
1094 da marca VETEC.
Após eluição das substâncias nas cromatoplacas, as mesmas foram reveladas
através de pulverização com solução de vanilina (C8H8O3, 5,0 g) e ácido perclórico
(HClO4, 0,75 mol/L, 100 mL) em etanol (C2H5O, 100 ml) seguida de aquecimento a
101
100ºC com pistola aquecedora da marca Steinel, modelo HL500, por aproximadamente
1 min (Figura 67).
Figura 67: Fotografia da CCD da biorredução da acetofenona.
5.2.2 Cromatografia de Adsorção
Os produtos reacionais, após extração, foram purificados em coluna
cromatográfica utilizando como adsorvente gel de sílica 60 (Ф = 0,025-0,020mm),
código 45 337, de procedência VETEC. O comprimento e diâmetro das colunas
variaram de acordo com a quantidade de amostra a ser cromatografada e de sílica
utilizadas. Como eluente foi usado diclorometano de qualidade PA da marca Synth
puro.
5.2.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A conversão e o excesso enantiomérico dos produtos de biorredução da
acetofenona (1), de seus derivados, 4-bromo-acetofenona (2), 4-fluoro-acetofenona (3),
4-cloro-acetofenona (4), 4-metóxi-acetofenona (5), 4-metil-acetofenona (6), 3-bromo-
acetofenona (7), 3-metóxi-acetofenona (8), 2-bromo-acetofenona (9), 2-cloro-
acetofenona (10), 2-metóxi-acetofenona (11) e 2-hidróxi-acetofenona (12). Uma cetona
α-halogenada, 2,2,2-trifluoro-acetofenona (13), bem como duas outras cetonas
aromáticas, α-tetralona (14) e α-indanona (15), foram determinados por Cromatógrafo
102
Líquido de Alta Eficiência Shimadzu LC-20AT, com coluna quiral OB-H de dimensões
150 x 4,6 mm e detector UV-Vis Shimadzu SPD-M20A (Figura 68). Os resultados
foram obtidos mediante curvas de calibração, apresentadas no capítulo 4, tópico 4.2 (p.
49-54). As análises foram realizadas a 30 °C e conforme parâmetros destacados na
Tabela 23 (p. 103), a seguir.
Figura 68: Fotografia do Cromátografo Líquido de Alta Eficiência utilizado nas
análises de biorredução e em detalhe a coluna quiral OB-H.
103
Tabela 23: Parâmetros de análise por CLAE dos substratos utilizados nas reações de
biotransformação.
Entrada Substrato/Produto Fase móvel
Hex:iPrOH
Fluxo
(mL/min)
Tr (min)
(Cetona/Alcoóis)
1 (1)/(1a) 95:5 0,5 13,5/9,9 (S) - 14,5 (R)
2 (2)/(2a) 95:5 0,3 17,3/16,0 (S) - 18,3 (R)
3 (3)/(3a) 95:5 0,3 20,1/15,3 (S) - 16,6 (R)
4 (4)/(4a) 92:8 0,8 5,8/4,4 (S) - 4,9 (R)
5 (5)/(5a) 92:8 0,8 20,1/10,2 (S) - 13,3 (R)
6 (6)/(6a) 98:2 0,5 13,9/16,6 (S) - 19,3 (R)
7 (7)/(7a) 95:5 0,5 12,1/10,3 (S) - 13,7 (R)
8 (8)/(8a) 92:8 0,8 9,8/8,9 (S) - 11,3 (R)
9 (9)/(9a) 95:5 0,5 12,9/7,2 (S) - 9,8 (R)
10 (10)/(10a) 92:8 0,8 11,9/6,8 (R) - 8,4 (S)
11 (11)/(11a) 95:5 0,5 23,0/10,5 (S) - 18,8 (R)
12 (12)/(12a) 95:5 0,5 9,4/ND
13 (13)/(13a) 95:5 0,5 5,3/8,3 (X) - 9,1 (X)
14 (14)/(14a) 98:2 0,5 17,2/13,1 (R) - 23,4 (S)
15 (15)/(15a) 95:5 0,5 22,2/9,8 (R) – 16,1 (S)
Tr – Tempo de retenção
ND – Não detectado
5.2.4 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Os espectros de RMN 1H foram obtidos no Centro Nordestino de Aplicação e
Uso da Ressonância Magnética Nuclear da Universidade Federal de Ceará
(CENAUREMN/UFC), utilizando-se Espectrômetros de Bruker, modelo Avance DPX –
300 e modelo Avance DRX-500, que operam na frequência de 300 e 500 MHz para
hidrogênio, respectivamente.
A dissolução das amostras analisadas foi realizada utilizando clorofórmio
deuterado (CDCl3) como solvente.
5.2.5 Espectroscopia na Região do UV/VIS
As medidas de absorbância na região do ultravioleta-visível foram obtidas
utilizando-se um espectrofotômetro modelo Cary 50 Conc da Varian (Figura 69). As
104
leituras foram realizadas no comprimento de onda determinado para cada análise, todas
no mínimo em triplicata.
Figura 69: Fotografia do espectrofotômetro modelo Cary 50 Conc da Varian.
5.2.6 Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG/EM)
Os produtos reacionais obtidos foram analisados e quantificados por CG-EM
(Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa) QP2010 da SHIMADZU,
usando coluna capilar RTX-5MS (30,0m x 0,25mm x 0,30mm), com dois gradientes de
temperatura, um de 10°C/min (40-180°C) e de 40°C/min (180°-300°C), e outro com
temperatura de 10ºC/min (100-180ºC), com a temperatura de injetor de 250°.
O espectrômetro de massa foi usado para registrar espectros de massa (EM), dos
substratos e produtos, sendo realizado em um cromatógrafo da Hewlett Packard 1100
(APCI+) e detector (EI
+) Hewlett Packard 5973.
5.3 Determinação de Proteínas
A determinação de proteínas do extrato aquoso das sementes de Helianthus
annuus L. foi realizada como estudo preliminar da sua utilização como biocatalisador.
As sementes foram primeiramente lavadas com solução de hipoclorito de sódio 5%
durante 20 minutos e posteriormente com água destilada. Para obtenção dos extratos
aquosos das sementes de Helianthus annuus L. 10,0 g de sementes foram trituradas e 50
mL de água destilada foram adicionados em erlenmeyers de 125 mL, sendo a mistura
mantida sob agitação constante em mesa agitadora por 72 h a 175 r.p.m. O extrato foi
105
filtrado e submetido as metodologias de determinação de proteínas solúveis descrita na
literatura por Lowry (modificada por HARTREE, 1972) e por Bradford (1976).
5.3.1 Método de Lowry (modificado por Hartree)
Para a realização da determinação de proteínas das sementes de Helianthus
annuus L. pelo método de Lowry foi necessário o preparo das seguintes soluções:
Solução A: Foram pesados 50,0 g de Na2CO3 que foi dissolvido em 250 mL de
solução de NaOH 1M, seguida da adição de 1,0 g de tartarato duplo de sódio e potássio
(KNaC4H4O6.4H2O). O volume foi aferido para 500 mL de água destilada.
Solução B: 1,0 g de tartarato duplo de sódio e potássio (KNaC4H4O6.4H2O) e 0,5
g de CuSO4.5H2O dissolvidos em 45 mL de água, seguido da adição de 5 mL de NaOH
1M.
Solução C: 1 mL do reagente de Folin-Ciocalteau 2M diluído em 15 mL de
água.
A quantificação da concentração de proteínas solúveis nos extratos vegetais foi
feita através de curva de calibração usando solução aquosa de BSA (Albumina Bovina).
Procedimento geral: 0,9 mL de solução A foi adicionado em um tubo de ensaio
contendo 1,0 mL de amostra de extrato vegetal diluído (1,0 mL de amostra para 10,0
mL de solução). A mistura reacional foi aquecida em banho-maria a 50 ºC durante 10
minutos. Após esse período, o material foi resfriado a temperatura ambiente e
adicionados 0,1 mL de solução B que foi deixado em repouso durante 10 minutos. Em
cada tubo de ensaio acrescentou-se 3,0 mL de solução C seguida de aquecimento
durante 10 minutos a 50 ºC em banho-maria. Após resfriamento o material foi analisado
em espectrofotômetro em um comprimento de onda de 650 nm. O branco foi realizado
com 1,0 mL de água destilada. A análise foi realizada no mínimo em triplicata para cada
amostra de extrato vegetal.
5.3.2 Método de Bradford
A determinação de proteínas nesta metodologia foi realizada segundo Bradford
(1976) e fez se necessário o preparo da seguinte solução:
106
- Solução de Bradford: 50 mg de Comassie G 250 foram dissolvidos em 25 mL
de Álcool Etílico. Essa solução foi agitada durante 1 hora em um erlenmeyer envolto
com papel alumínio. Em seguida, foram adicionados 50 mL de ácido fosfórico 85%. O
volume foi aferido para 500 mL com água destilada. A solução resultante foi filtrada
três vezes com papel de filtro e acondicionada em frasco âmbar a temperatura ambiente.
Procedimento geral: 0,1 mL de amostra de extrato vegetal foi diluído
adicionando-se 2,9 mL de água destilada, retirou-se alíquotas de 0,1 mL e adicionou-se
2,5 mL do reagente de Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250) e após 10 minutos
foi realizada a leituras das amostras em espectrofotômetro no comprimento de onda de
595 nm. Os ensaios foram realizados em triplicata e o branco feito com a mesma
quantidade de água destilada. A quantificação foi realizada utilizando solução aquosa de
BSA como padrão da curva de calibração.
5.4 Processos Biocatalíticos
5.4.1 Procedimento geral das biotransformações utilizando células íntegras de
vegetais
Nas reações de biotransformação realizadas, usou-se metodologia proposta por
MACHADO et al., (2006), com modificações. As sementes de Helianthus annuus L.
utilizadas como fonte biocatalítica foram adquiridas em comércio local. Buscou-se a
otimização dos teores de conversão e de excesso enantiomérico para a acetofenona (1)
através dos parâmetros: quantidade de biocatalisador, uso de co-solvente, solução
tamponante, extrato bruto enzimático com pvp e germinação das sementes (Figura 70,
p. 107).
107
Figura 70: Fotografia das reações de biorredução utilizando as sementes de Helianthus
annuus L.
5.4.2.1 Quantidade de biocatalisador
As sementes de Helianthus annuus L. foram trituradas e lavadas com solução de
hipoclorito de sódio 5 % por 20 minutos e em seguida com água destilada. Foram
pesados 5,0 g, 10,0 g e 20,0 g das sementes de Helianthus annuus L. em erlenmeyers de
125 mL, 50 mg de substrato e adicionado 50 mL de água destilada. Os frascos foram
lacrados e submetidos à agitação em mesa agitadora a uma velocidade de 175 r.p.m.
durante um período de 72 h. Todas as reações foram realizadas no mínimo em duplicata.
5.4.2.2 Uso de co-solvente: Isopropanol
As sementes de Helianthus annuus L. foram trituradas e lavadas com solução de
hipoclorito de sódio 5 % por 20 minutos e em seguida com água destilada. Foram
pesados 10,0 g das sementes de Helianthus annuus L. em erlenmeyers de 125 mL,
juntamente com 50 mg de substrato e adicionado a cada erlenmeyer, juntamente com
50 mL de água destilada, proporções de isopropanol nas seguintes relações (v/v) em
água destilada: 1%, 2%, 5% e 10%. Os frascos foram lacrados e submetidos à agitação
em mesa agitadora a uma velocidade de 175 r.p.m. durante um período de 72 h. Todas
as reações foram realizadas no mínimo em duplicata.
108
5.4.2.3 Meio tamponante: pH 6,0, 7,0 e 8,0
As sementes de Helianthus annuus L. foram trituradas e lavadas com solução de
hipoclorito de sódio 5 % por 20 minutos e em seguida com água destilada. Foram
pesados 10,0 g das sementes de Helianthus annuus L. em erlenmeyers de 125 mL,
juntamente com 50 mg de substrato e adicionado a cada erlenmeyer 50 mL de soluções
tampões previamente preparadas a partir de sais ácidos (Na2HPO4/KH2PO4) com os
valores de pH 6,0, 7,0 e 8,0. Os frascos foram lacrados e submetidos à agitação em
mesa agitadora a uma velocidade de 175 r.p.m. durante um período de 72 h. Todas as
reações foram realizadas no mínimo em duplicata.
5.4.2.4 Extrato bruto enzimático (LUPPETI, 2000)
A metodologia de Lupetti (2000) adotada para esse procedimento foi
modificada. Triturou-se 10 g de sementes de Helianthus annuus L., após lavagem com
solução de hipoclorito de sódio 5 %, e acrescentou-se 1 g de polivinilpirrolidona (PVP)
juntamente com 50 mL de solução tampão fosfato pH 6,5, à mistura resultante foi
adicionado 50 mg de substrato (1). Os frascos foram lacrados e submetidos à agitação
em mesa agitadora a uma velocidade de 175 r.p.m. durante um período de 72 h. Todas
as reações foram realizadas no mínimo em duplicata.
5.4.2.5 Sementes de Helianthus annuus L. germinadas
As sementes de Helianthus annuus L. lavadas com solução de hipoclorito de
sódio 5 % por 20 minutos e em seguida com água destilada, foram deixadas em meio
aquoso por aproximadamente 120 h. Durante este período a água era substituída
diariamente para não acarretar no aparecimento de fungos. Foram pesados e triturados
10,0 g das sementes de Helianthus annuus L. germinadas em erlenmeyers de 125 mL,
juntamente com 50 mg de substrato (1) e adicionado a cada erlenmeyer 50 mL água
destilada. Os frascos foram lacrados e submetidos à agitação em mesa agitadora a uma
velocidade de 175 r.p.m. durante um período de 72 h. Todas as reações foram realizadas
no mínimo em duplicata.
109
5.4.3 Obtenção dos alcoóis padrões por via química
Os alcoóis padrões racêmicos 1a-15a foram obtidos a partir da redução dos
respectivos aldeídos e cetonas através da reação com NaBH4 utilizando metodologia
descrita por Vogel (1974) com algumas modificações. Em um balão de fundo redondo
de 125 mL foram adicionados 3 mmol de cada substrato carbonílico dissolvidos em
10,0 mL de metanol. Para cada reação foram adicionados 6 mmol de borohidreto de
sódio sob banho de gelo. A mistura foi deixada sob agitação durante 1 hora. Em
seguida, o metanol foi evaporado sob pressão reduzida, o material foi dissolvido em
água e o respectivo álcool foi extraído com AcOEt. A fase orgânica foi seca com sulfato
de sódio anidro e o solvente evaporado sob pressão reduzida.
Os alcoóis racêmicos 1a-15a foram purificados em coluna cromatográfica de gel
de sílica utilizando como fase móvel mistura binária de hexano/AcOEt (8:2) e
identificados através de RMN 1H.
5.4.3 Substratos selecionados nas reações de biotransformação utilizando as
sementes de Helianthus annuus L.
Após a otimização dos valores de conversão e de excesso enantiomérico
utilizando como substrato a acetofenona, alguns de seus derivados disponíveis 4-bromo-
acetofenona (2), 4-fluoro-acetofenona (3), 4-cloro-acetofenona (4), 4-metóxi-
acetofenona (5), 4-metil-acetofenona (6), 3-bromo-acetofenona (7), 3-metóxi-
acetofenona (8), 2-bromo-acetofenona (9), 2-cloro-acetofenona (10), 2-metóxi-
acetofenona (11) e 2-hidróxi-acetofenona (12) foram submetidos às reações com as
sementes de Helianthus annuus L.. Uma cetona α-halogenada, 2,2,2-trifluoro-
acetofenona (13), bem como duas outras cetonas aromáticas, α-tetralona (14) e α-
indanona (15), também foram selecionadas e submetidas à biotransformação. As
metodologias selecionadas para a biotransformação dos substratos acima citados estão
destacadas a seguir.
Metodologia G10: As sementes de Helianthus annuus L. foram trituradas e
lavadas com solução de hipoclorito de sódio 5 % por 20 minutos e em seguida com
água destilada. Foram pesados 10,0 g das sementes de Helianthus annuus L. em
erlenmeyers de 125 mL, 50 mg de substrato e adicionado 50 mL de água destilada. Os
frascos foram lacrados e submetidos à agitação em mesa agitadora a uma velocidade de
110
175 r.p.m durante um período de 72 h. Todas as reações foram realizadas no mínimo em
duplicata.
Metodologia Gpvp: A seguinte metodologia está descrita conforme item
5.4.1.4 deste capítulo.
5.4.4 Cetonas
Uma série de derivados da acetofenona (1) foram selecionados como substratos
nas biorreduções com as sementes de Helianthus annuus L., pelas metodologias acima
destacadas. Os derivados selecionados foram: 4-bromo-acetofenona (2), 4-fluoro-
acetofenona (3), 4-cloro-acetofenona (4), 4-metóxi-acetofenona (5), 4-metil-
acetofenona (6), 3-bromo-acetofenona (7), 3-metóxi-acetofenona (8), 2-bromo-
acetofenona (9), 2-cloro-acetofenona (10), 2-metóxi-acetofenona (11) e 2-hidróxi-
acetofenona (12). Uma cetona α-halogenada, 2,2,2-trifluoro-acetofenona (13), bem
como duas outras cetonas aromáticas, α-tetralona (14) e α-indanona (15).
5.4.5 Obtenção dos excessos enantioméricos (ee)
A análise do excesso enantiomérico dos produtos da biorredução a partir de
cetonas pró-quirais, foi realizada através do cromatograma obtido por CLAE, mais
precisamente das áreas dos picos observados para cada álcool, conforme equação
abaixo:
ee (%) = Área do enantiômero majoritário – área do enantiômero minoritário x 100%
Área do enantiômero majoritário + área do enantiômero minoritário
A razão dos picos fornece uma medida da composição enantiomérica da amostra
precisa e quantitativa com alto grau de precisão (± 0,05%) (PILISÃO, 2006).
5.4.6 Obtenção das curvas de calibração dos substratos e produtos esperados
Padrões dos substratos (cetona) e dos produtos (alcoóis) com concentração entre
5-100 ppm foram injetados em equipamento de CLAE, cuja descriminação está no item
5.2.3 (p. 100) deste capítulo, para obtenção dos valores de área correspondente a cada
concentração. Os dados analisados foram organizados em software Origin 7.0 para a
construção das respectivas curvas de calibração (item 4.2, p. 49-54) e obtenção dos
dados de coeficientes da reta.
111
CONSIDERAÇÕES FINAIS
112
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
As sementes de Helianthus annuus L. nos ensaios biocatalíticos realizados neste
trabalho mostraram-se bastante eficientes nos processos de biorredução de cetonas
aromáticas.
A determinação do teor de proteínas pelo método de Lowry, modificado por
Hartree (10,1g/L), bem como de Bradford (8,8g/L), descritos na literatura, revelou
valores consideráveis para o extrato aquoso das sementes de Helianthus annuus L., fator
este confirmado pelas boas conversões do substrato acetofenona (1).
Os parâmetros de otimização analisados para a biorredução da acetofenona tais
como, quantidade de biocatalisador, co-solvente, uso de tampões (pH), obtenção do
extrato bruto e germinação de sementes, permitiram um detalhado estudo do
comportamento das enzimas, oxidorredutases, das sementes de Helianthus annuus L.,
onde independente do meio reacional, demonstraram alta estereosseletividade para
obtenção do estereoisômero majoritário (S). Em contrapartida, os valores de conversão
obtidos apresentados para as mesmas condições descritas mostraram-se dependentes
diretamente da condição reacional.
As reações de biotransformação dos derivados da acetofenona (2-12), da cetona
α-halogenada (13) e das outras cetonas aromáticas, α-tetralona (14) e α-indanona (15)
apresentaram resultados distintos para os excessos enantioméricos obtidos, com valores
variando de 4% à >99,0%. Ressalta-se a alta estereosseletividade do complexo
enzimático das sementes de Helianthus annuus L. utilizando a metodologia com o
polímero PVP (Gpvp) evidenciada nos estudos destes substratos, obtendo-se sempre
como produto majoritário o enantiômero (S) e com excelentes excessos enantioméricos
(>99,0%), com exceção para os substratos 2,2,2-trifluoro-acetofenona (13) com 4,0% e
2-cloro-acetofenona com 5,4%.
As metodologias selecionadas G10 e Gpvp não apresentaram grandes
divergências entre os resultados esperados pelos substratos citados quando em
comparação com a acetofenona, mostrando que independente da utilização de
metodologias distintas, as enzimas atuantes do material vegetal confirmaram sua alta
estereosseletividade, obtendo-se sempre o enantiômero de configuração S, exceto para o
derivado 3-metóxi-acetofenona com metodologia G10, onde foi obtido o respectivo
álcool com configuração R com >99,0% de excesso enatiomérico.
113
As sementes de Helianthus annuus L. mostraram-se, frente ao trabalho
realizado, um material promissor para os processos de biotransformação de cetonas
aromáticas, devido aos excelentes resultados de excessos enantioméricos encontrados,
fator primordial para o emprego nos estudos de biocatálise, onde busca-se a produção de
compostos enantiomericamente puros. Vale ressaltar que o material vegetal possui um
fácil acesso e um baixo custo, proporcionando também neste âmbito meios satisfatórios
para continuidade da pesquisa.
O estudo do complexo enzimático das sementes de Helianthus annuus L. pode
ser dado continuidade com a biorredução de outras cetonas aromáticas, bem como de
cetonas alifáticas, buscando-se sempre a obtenção de alcoóis enantiomericamente puros,
ressalta-se ainda a possibilidade da avaliação do potencial de outras classes de enzimas
possivelmente presentes no material vegetal, como por exemplo, as lipases, em reações
de hidrólise e acetilação de substratos.
114
REFERÊNCIAS
115
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123
ANEXO
124
Anexo: Álcoois padrões
Figura 1: Cromatograma obtido por CLAE do feniletanol (1a)
Figura 2: Espectro de RMN ¹H (500 MHz, CDCl3) do feniletanol (1a)
125
Figura 3: Cromatograma obtido por CLAE do 4-bromo-feniletanol (2a)
Figura 4: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 4-bromo-feniletanol (2a)
126
Figura 5: Cromatograma obtido por CLAE do 4-fluoro-feniletanol (3a)
Figura 6: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 4-fluoro-feniletanol (3a)
127
Figura 7: Cromatograma obtido por CLAE do 4-cloro-feniletanol (4a)
Figura 8: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 4-cloro-feniletanol (4a)
128
Figura 9: Cromatograma obtido por CLAE do 4-metóxi-feniletanol (5a)
Figura 10: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 4-metóxi-feniletanol (5a)
129
Figura 11: Cromatograma obtido por CLAE do 4-metil-feniletanol (6a)
Figura 12: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 4-metil-feniletanol (6a)
130
Figura 13: Cromatograma obtido por CLAE do 3-bromo-feniletanol (7a)
Figura
14: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 3-bromo-feniletanol (7a)
131
Figura 15: Cromatograma obtido por CLAE do 3-metóxi-feniletanol (8a)
Figura 16: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 3-metóxi-feniletanol (8a)
132
Figura 17: Cromatograma obtido por CLAE do 2-bromo-feniletanol (9a)
Figura 18: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 2-bromo-feniletanol (9a)
133
Figura 19: Cromatograma obtido por CLAE do 2-cloro-feniletanol (10a)
Figura 20: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 2-cloro-feniletanol (10a)
134
Figura 21: Cromatograma obtido por CLAE do 2-metóxi-feniletanol (11a)
Figura 22: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 2-metóxi-feniletanol (11a)
135
Figura 23: Cromatograma obtido por CLAE do 2,2,2-trifluor-feniletanol (13a)
Figura 24: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do 2,2,2-trifluoro-feniletanol (13a)
136
Figura 25: Cromatograma obtido por CLAE do α-tetralol (14a)
Figura 26: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do α-tetralol (14a)
137
Figura 27: Cromatograma obtido por CLAE do α-indanol (15a)
Figura 28: Espectro de RMN ¹H (300 MHz, CDCl3) do α-indanol (15a)
Recommended