biotek avermectin

Optimasi produksi avermectin B1a olehStreptomyces avermitilis metodologi 14-12A respon menggunakanpermukaan

1. PengantarAvermectins diproduksi oleh avermitilis Streptomyces adalahkelasagen anathematic dan insektisida secara luas digunakan (Burget al, 1979;. Ikeda dan Omura, 1995). Mereka adalah serangkaian16 -beranggota pentasiklik senyawa dengan disakarida daripoliketida deoxysugar alkohol L-oleandrose (Knight et al, 2003;.Yoon et al, 2004.). Avermectins kegiatan pameran antelmintikyang sangat baik terhadap berbagai nematoda dan parasitarthropoda dengan rendahnya efek samping pada organismeinang. Delapan besaravermectin senyawa hasil dari perbedaan struktural diC5, C22-C23 dan C26 (Ikeda dan Omura, 1997). Dari delapansenyawa, avermectin B1a adalah komponen yang paling efektif.Sifat dan aplikasi avermectins telah dipromosikanproduksi komersial senyawa ini. Oleh karena itu,investigasi terhadap peningkatan produksi tersebutproduk penting komersial di pestisida hayatipasar.

Merancang media fermentasi yang tepat adalah pentingpenting karena komposisi medium dapat secara signifikanmempengaruhiproduk hasil. Namun, metode konvensional mengoptimalkanKomposisi media melalui manipulasi urutan parameter tunggal;ini sering gagal untuk mengidentifikasi kondisi yang optimal untukbioproses dalamkarena interaksi antara faktor yang berbedadiabaikan. Selain itu, mereka memerlukan sejumlah besarpekerjaandan waktu (Xiong et al, 2008.). Jadi, metode pemecahan masalah yang efektiflebih disukai.

Metodologi permukaan Respon telah menghilangkan kelemahanklasik metode dan telah terbukti menjadi kuat dan berguna untukoptimalisasi target produksi metabolit (Deepak et al.,2008; Liu dan Wang, 2007; Sayyad et al, 2007).. Hal ini juga dapatdigunakanuntuk mengevaluasi arti penting relatif dari beberapa variabelsecara bersamaan(Li et al, 2008.).Tujuan pekerjaan ini adalah untuk menerapkan rancangan Plackett-Burmandesain, diikuti oleh jalan pendakian curam dan responpermukaan metodologi untuk komposisi budaya mengoptimalkanmediauntuk avermectin B1a produksi oleh avermitilis S. 14-12A.Variabel utama yang mempengaruhi kinerjabudaya dalam hal produksi avermectin B1a jugadiselidiki.

2. Metode2.1. MikroorganismeStrain S. avermitilis 14-12A yang digunakan dalam penelitian ini adalah disimpandalam gliserol 20% pada 80 C. Itu adalah tinggi memproduksimutan terisolasidan diidentifikasi setelah N-metil-N0-nitroso-N-nitrosoguanidine(NTG)pengobatan suatu € 3a strain industri "115 di laboratorium kami(tidak diterbitkandata). Kultur dipertahankan pada 4 C pada extractmalt ragiekstrak-glukosa (YMG) miring agar.

2.2. Medium Benih media disesuaikan dengan pH 7,0 yang terdiri dari (g / l): jagung pati 30; kedelai tepung 8; kacang tanah makan 10; ekstrak ragi 4, CoCl2 0,03, dan sebuah-amilase 0,04. Non-dioptimalkan media fermentasi disesuaikan dengan pH 7,5 adalah terdiri dari (g / l): pati jagung 140, sebuah-amilase 0,1; tepung kedelai 28; ekstrak ragi 10; Na2MoO4? 2H2O 0,022; MnSO4? H2O 0,0023; (NH4) 2SO4 0,25; CoCl2 0,02, dan CaCO3 0,8. Dalam semua kasus, media disterilisasi dengan autoklaf selama 25 menit pada 121? C. Setelah sterilisasi, pH benih dan media fermentasi adalah 6,8 dan 7,2 masing-masing. 2.3. Budaya kondisi Fermentasi dilakukan dalam dua tahap: pertumbuhan bibit dan avermectin B1a produksi. Untuk tahap pertumbuhan bibit, miselium dari budaya piring diinokulasikan ke dalam 40 ml media biji dan tumbuh pada 28 C dengan 220 rpm? pada sebuah inkubator shaker (5 cm gemetar diameter, XWW 50/300, Long March, Cina) untuk 40 h.Kemudian, 5% (v / v) kultur benih diinokulasi ke dalam media fermentasi. strain diinkubasi pada 28 C dengan 220 rpm selama 10 hari?. 2.4. Metode analitis Untuk ekstraksi avermectins, 9 ml metanol ditambahkan ke 1 ml fermentasi kaldu dalam tabung 20 ml dan dirawat di sebuah ultrasonik bersih selama 20 menit. Setelah pemusingan (5000 rpm, 10 menit), supernatannya dianalisa dengan performa tinggi kromatografi cair (HPLC, 1200, Agilent, USA) menggunakan reverse C18 Waters tahap kolom, metanol-air (85:15, v / v) sebagai mobile tahap, 1 ml / menit laju alir dengan deteksi pada 245 nm (Curdova et al, 1989).. 2.5. Rancangan percobaan dan analisis data Dalam percobaan awal, berbagai karbon dan nitrogen sumber, dan garam anorganik yang dievaluasi untuk kesesuaian mereka untuk avermectin mempertahankan produksi B1a baik oleh strain 14-12A (WH, 2008). Hasil penelitian menunjukkan bahwa variabel utama yang mempengaruhi budaya kinerja dalam hal hasil avermectin B1a adalah pati jagung, sebuah amilase-, tepung kedelai, ekstrak ragi, Na2MoO4? 2H2O, MnSO4 H2O,? (NH4) 2SO4, CoCl2 dan CaCO3. Komponen ini adalah 

dipilih untuk optimasi lebih lanjut. 2.5.1. Rancangan-rancangan Plackett Burman (PBD) PBD dipekerjakan untuk screening fermentasi yang paling signifikan parameter yang mempengaruhi produksi avermectin B1a oleh avermitilis S. 14-12A (Sastry dan Khan, 1998). Setiap variabel independen diuji pada dua tingkat, tinggi dan rendah, yang dilambangkan dengan (+) dan (?), masing-masing. Rancangan percobaan dengan nama, kode simbol, dan tingkat sebenarnya dari variabel ditampilkan pada Tabel 1, sedangkan Tabel 2 menunjukkan detail dari desain. Dua variabel dummy dipelajari dalam 12 percobaan untuk menghitung standard error. Avermectin B1a produksi dilakukan di duplikasi dan nilai rata-rata diambil sebagai respon. Variabel dengan tingkat kepercayaan di atas 90% dianggap untuk memiliki pengaruh yang signifikan terhadap produksi avermectin B1a dan dengan demikian digunakan untuk optimasi lebih lanjut.

2.5.2. Jalur percobaan pendakian curamUntuk bergerak cepat menuju lingkungan dari respon optimal,kami menggunakan metode pendakian curam. Percobaanyang diadopsi untuk menentukan arah yang sesuai denganmeningkatkan ataumengurangi konsentrasi variabel menurut hasildari PBD (Gheshlaghi et al, 2005.).

2.5.3. Central komposit desain (CCD) dan permukaan responmetodologiUntuk menggambarkan sifat permukaan respon optimumdaerah, desain pusat-komposit dan metodologi responpermukaandilakukan. Tingkat setiap faktor dan desain matriksdiberikan dalam Tabel 3. Rendah, menengah, dan tinggi tingkatdari tiap variabelditetapkan sebagai 1,41421,?? 1, 0, dan 1, 1,41421,masing.2.5.4. Analisis statistikMinitab 15,0 (Minitab Inc, Pennsylvania, USA) digunakan untukeksperimental desain dan analisis regresional berikutnya darieksperimental data. Analisis statistik model dilakukanuntuk mengevaluasi analisis varians (ANOVA). Kualitasmodel persamaan polinomial dinilai secara statistik dengankoefisiendeterminasi R2, dan signifikansi statistik yang ditentukandengan uji-F. Arti penting dari koefisien regresitelah diuji dengan uji-t.3. Hasil dan diskusi3.1. Optimasi oleh PBDPentingnya sembilan komponen, yaitu, pati jagung, aamylase,tepung kedelai, ekstrak ragi, Na2MoO4? 2H2O, MnSO4? H2O,

(NH4) 2SO4, CoCl2 dan CaCO3 untuk produksi B1a avermectinadalahdiselidiki oleh PBD. Tabel 1 menunjukkan dampak dari komponenpada respon dan tingkat signifikan.Berdasarkan analisis statistik, efek dari pati jagung danekstrak ragi (+) 1.378,3 dan (?) 981,8, masing-masing, dankeduanyamemiliki tingkat kepercayaan di atas 90%. Jadi, merekadiidentifikasi sebagai influ-

encing avermectin B1a produksi secara signifikan. Lainnya tidak memiliki jelas dampak dan tingkat kepercayaan yang rendah, sehingga mereka dianggap signifikan. Pada hasil, R2 ditemukan menjadi 0,945, yang berarti model yang dapat menjelaskan 94,5% dari total variasi sistem. Dalam tabel Pareto (Gbr. 1), efek maksimal disajikan dalam bagian atas dan kemudian kemajuan ke efek minimal. Dalam Selain itu, secara langsung menunjukkan bahwa faktor yang paling penting menentukan avermectin produksi B1a adalah jagung pati dan ragi ekstrak .. 3.2. Optimasi dengan jalan percobaan pendakian curam Hasil PBD menunjukkan bahwa pengaruh pati jagung adalah positif, sedangkan ekstrak ragi negatif. Dengan demikian, peningkatan jagung pati konsentrasi dan penurunan konsentrasi ekstrak ragi harus menghasilkan produksi yang lebih tinggi avermectin B1a.Pusat titik PBD telah dianggap sebagai asal jalan. The titer produksi avermectin B1a diperoleh; percobaan ini (Tabel 4) menunjukkan produksi maksimum avermectin B1a. Ini diperoleh ketika parameter 168 g / l jagung pati dan 9,2 g / l ekstrak ragi. Hal ini menunjukkan bahwa hal ini mungkin berada di dekat daerah respon avermectin B1a maksimum. Ini Titik dipilih untuk optimasi lebih lanjut. 3.3. Optimasi dengan metode respon permukaan Data ditunjukkan pada Tabel 3 dianalisis dengan menggunakan Minitab 15.0 perangkat lunak. T-test dan nilai-P digunakan untuk mengidentifikasi efek masing-masing faktor terhadap produksi avermectin B1a (Tabel 5). A P-nilai

kurang dari 0,05 menunjukkan bahwa istilah model yang signifikan.Dalam hal ini, pati jagung dan ekstrak ragi mempunyai pengaruh yang signifikanterhadap hasil B1a (P <0,05), serta persyaratan kuadrat patijagungdan ekstrak ragi. Kesesuaian model diperiksa olehkoefisien determinasi R2, yang ditemukan menjadi 0,9904,menunjukkan bahwa variasi sampel 99,04% disebabkanvariabel dan hanya kurang dari 1% dari total varian bisatidak dijelaskan oleh model. Sebuah model regresi memiliki R2-nilai yang lebih tinggi dari 0,9 dianggap sebagai memiliki korelasi yang sangat tinggi(Chen et al, 2009.). Oleh karena itu, nilai R2-sekarang tercerminkecocokan yang sangat baik antara respon yang diamati dandiprediksi, dan

tersirat bahwa model ini dapat diandalkan untuk produksiavermectin B1a dipenelitian ini. Penentuan disesuaikan koefisien (R-Sq = 98,35%) juga memuaskan untuk mengkonfirmasi pentingnyamodel. Model ini dapat ditampilkan sebagai berikut:Y ¼ 5165:00? 336:01 X1? 84:19 X2? 281:76 X1? X1? 266:46 X2? Þ 15:5522 X2 X1? X2; ð1Þdimana Y adalah avermectin diperkirakan B1a hasil, X1 adalahpati jagung, danX2 adalah ekstrak ragi.Selanjutnya, analisis varians (ANOVA) untuk tanggapanpermukaan model kuadrat disajikan pada Tabel 6, yang jugamembuktikanbahwa regresi ini signifikan secara statistik (P <0.0001) pada95%tingkat kepercayaan. Model ini juga menunjukkan secara statistiktidak signifikankurangnya fit (P = 0,358), sehingga model itu seharusnya ade-

yang memadai untuk prediksi dalam berbagai variabel yang digunakan. Dalam rangka untuk mendapatkan pemahaman yang lebih baik dari efek variabel pada produksi avermectin B1a, model prediksi disajikan sebagai grafik 3D permukaan respon (Gbr. 2). 3.4. Validasi kondisi dioptimalkan Atas dasar optimasi medium, model kuadrat diprediksi bahwa produksi maksimum avermectin B1a adalah 5273 mg / l, ketika tingkat kode X1 adalah 0,614 dan? Bahwa X2 itu? 0,186, yang 149,57 g / l pati jagung dan 8,92 g / l ragi ekstrak, masing-masing. Untuk memverifikasi hasil validasi, diperkirakan Percobaan dilakukan dalam tes rangkap tiga. Di bawah dioptimalkan kondisi, titer eksperimental diamati B1a rata-rata 5128 ± 144 mg / l, menunjukkan bahwa nilai-nilai eksperimental dan diprediksi (5273 mg / l) dari hasil avermectin B1a berada dalam perjanjian baik. Dan titer adalah 3528 mg / l dalam media non-optimal, meningkatkan 1,45 kali lipat telah diperoleh, sedangkan pertumbuhan strain dalam dua medium sebanding (data tidak ditampilkan). Hasil ini oleh karena itu menguatkan nilai-nilai diprediksi dan efektivitas model, menunjukkan bahwa media dioptimalkan nikmat produksi dari avermectin B1a. persyaratan gizi Streptomyces memainkan peran penting selama proses sintesis metabolit (Yu et al, 2008.). Di antara berbagai persyaratan nutrisi, sumber karbon dan sumber nitrogen umumnya dianggap sebagai faktor penting dari metabolisme, dan beberapa contoh dari produksi metabolit di media dengan isi dioptimalkan komponen ini juga dijelaskan dalam literatur (Purama dan Goyal, 2008; Yuan et al, 2008.). Ketika memberikan campuran sumber energi karbon, mikroorganisme preferentially memanfaatkan orang yang mereka dapat memetabolisme paling efektif. Sebanyak 21 contoh metabolit sekunder dilaporkan dapat ditekan dengan kehadiran glukosa selama 

mereka produksi. Karbohidrat lain seperti gliserol, maltosa, mannose, xylose sukrosa dan juga telah dilaporkan untuk mempengaruhi produksi metabolit sekunder negatif (Jonsbu et al., 2002). Mekanisme untuk penindasan katabolit di Streptomyces belum terurai, namun tampaknya menjadi unik dalam cara mengatur tingkat konsumsi karbon (Paulsen, 1996). Untuk mayoritas Streptomyces, sumber karbon disukai adalah pati, khususnya untuk produksi metabolit sekunder (Gupte dan Naik, 1998; Jia et al, 2008; Syed et al, 2009)... Oleh karena itu, tidak mengherankan yang pati jagung adalah faktor yang signifikan, seperti yang ditunjukkan oleh PBD hasil. Sama seperti mikroorganisme memiliki pilihan sumber energi karbon, mereka juga memiliki sumber nitrogen yang disukai. Dilaporkan bahwa sumber nitrogen yang kompleks dapat meningkatkan produksi antibiotik oleh Streptomyces. Sumber-sumber bisa mempertahankan titer antibiotik tinggi dan properti ini seharusnya terkait dengan pelepasan lambat komponen nitrogen selama fermentasi. Secara umum, beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa asimilasi nitrogen sangat penting untuk pengaturan produksi antibiotik tetapi mekanisme yang terlibat tidak jelas dipahami (Voelker dan Altaba,2001). Dalam sumber nitrogen kompleks, ekstrak ragi telah dibuktikan untuk mendukung biosintesis miselium terbesar dan bantuan cepatpertumbuhan (Suutari et al, 2002.). Dalam percobaan sebelumnya, ditemukan bahwa ekstrak ragi merupakan sumber nitrogen disukai Streptomyces strain (Gill et al, 2003;. Lazim et al, 2009;. Tuncer et al, 2004.). Namun, setiap koin memiliki dua sisi, hal ini juga berlaku untuk ekstrak ragi di beberapa strain Streptomyces (Niladevi et al, 2009.). Dalam penelitian ini, sebagai ditunjukkan oleh PBD dan hasil RSM, ekstrak ragi sebagai faktor penting memiliki efek negatif, dan ekstrak ragi berlebihan dapat menghalangi avermectin sintesis. Berdasarkan analisis data, kita tepat menurunkan jumlah ekstrak ragi dan akhirnya diperoleh hasil yang memuaskan. RSM Desain diterapkan dalam penyelidikan ini telah berhasil diterapkan dalam banyak penelitian baru-baru ini bioteknologi (Guo et al, 2009; Jo et al, 2008;.. Lotfy, 2007; Mu et al, 2009.).Namun, sejauh pengetahuan kami, tidak ada laporan tunggal diperoleh pada avermectins atau avermectin B1a optimasi produksi dengan menggunakan yang RSM desain. 4. Kesimpulan Studi ini membuktikan bahwa desain eksperimen statistik menawarkan efisien dan layak pendekatan untuk fermentasi avermectin B1a media optimasi. Sebuah avermectin maksimum B1a produksi 5316 mg / l dicapai dengan faktor-faktor dioptimalkan sebagai berikut: 

149,57 g / l pati jagung, dan 8,92 g / l ekstrak ragi. Validasi eksperimen juga dilakukan untuk memverifikasi kecukupan dan ketepatan model, dan hasil menunjukkan bahwa nilai prediksi setuju dengan nilai-nilai eksperimental dengan baik, dan 1,45 kali lipat meningkat dibandingkan dengan media aslinya diperoleh. Hasil ini juga memberikan dasar untuk penelitian lebih lanjut dengan fermentasi skala besar untuk produksi dari avermectin B1a.