View
2
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Materiales Poliméricos
EFECTO DE LA MODIFICACIÓN QUÍMICA Y TÉRMICA EN LAS PROPIEDADES DE
ANDAMIOS DE QUITOSANO PARA REGENERACIÓN ÓSEA
Tesis que presenta
M. I.S MARTHA GABRIELA CHUC GAMBOA
En opción al título de
DOCTOR EN CIENCIAS
(MATERIALES POLIMÉRICOS)
Mérida, Yucatán, México. Mayo de 2020
i
CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCATÁN, A. C. POSGRADO EN CIENCIAS MATERIALES POLIMÉRICOS
RECONOCIMIENTO
Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis de Martha Gabriela
Chuc Gamboa titulado “Efecto de la modificación química y térmica en las
propiedades de andamios de quitosano para regeneración ósea” fue realizado en la
Unidad de Materiales del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C., bajo
la dirección del Dr. Juan Valerio Cauich Rodríguez, y pertenece al Programa de
Posgrado en Materiales Poliméricos de este Centro.
Esta tesis tiene orientación al desarrollo socioeconómico de la región en el área de
Biomateriales.
Atentamente.
Mérida, Yucatán, México, a 23 de mayo de 2020.
Dra. Cecilia Hernández Zepeda
Directora de Docencia
ii
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C., y en el mismo tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o desarrollos tecnológicos, en lo especial, estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo expuesto en la presente Declaración.
Firma:
Nombre: M.I.S Martha Gabriela Chuc Gamboa
iii
DEDICATORIA
A mis padres y hermanos.
Porque de él, y por él, y para él, son todas las cosas. A él sea la gloria por los siglos Romanos 11:36
iv
AGRADECIMIENTOS
A mi director de tesis, Dr. Juan Valerio Cauich Rodríguez por las enseñanzas, paciencia y guía durante la realización de este proyecto. A mi comité tutorial, Dr. José Manuel Cervantes Uc, Dr. Amaury Pozos Guillén, Dr. Fernando Hernández Sánchez, Dr. Julio San Román por sus excelentes sugerencias y aportaciones. Al Dra. Diana María Escobar García de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí por su apoyo en los ensayos de biocompatibilidad. A la I.Q.I. Rossana Faride Vargas Coronado, por el valioso apoyo técnico logístico. Al Dr. Alejandro May Pat y el Proyecto 268595 por su colaboración con el análisis de AFM A la Dra. Patricia Quintana Owen, al Mtro. Daniel Aguilar, y al Ing. Wilian Cauich del CINVESTAV-Mérida del Instituto Politécnico Nacional. A mis maestros y al Coordinador del Posgrado en Materiales Poliméricos Dr. Francis Avilés Cetina. A mis compañeros de laboratorio: José Tec, Omar Castillo, Fernando Aguilar, David Aguilar, Marcos Bonilla, Guido Zapata, Beatriz Maldonado, Carlos Díaz. Al Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Al Laboratorio Nacional de Nano y Biomateriales (LANBIO), Cinvestav-IPN, Unidad Mérida. Proyecto FOMIX-Yucatán 2008-108160 and CONACYT LAB-2009-01 No. 12391, CONACYT 1360 (Fronteras de las Ciencia) y 248378 (Atención a Problemas Nacionales). Al Laboratorio de Ciencias Básicas de la Facultad de Estomatología de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí. En especial a mis compañeros Abraham Muñoz, Vicente Esparza, Josué Bermeo, Noé Carreón, Claudia Castorena, Alba García, Magdalena Hernández, Areli Limón. A los directivos de la Facultad de Odontología de la Universidad Autónoma de Yucatán, Dr. Fernando Aguilar Ayala, MIE. Celia Godoy Montañez, MOI. Marina E. Rejón Peraza, Dr. Mauricio Escoffie Ramírez. Así como a mis alumnas Paola Azueta y Carolina Cámara. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca otorgada número 339277, y por los apoyos otorgados a través de los proyectos que hicieron posible esta tesis.
i
ÍNDICE DEDICATORIA ....................................................................................................................... iii
LISTA DE FIGURAS............................................................................................................... iii
LISTA DE TABLAS ................................................................................................................. vi
I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1
II. HIPÓTESIS ........................................................................................................................ 5
III. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 5
Objetivo general .................................................................................................................. 5
Objetivos particulares ......................................................................................................... 5
CAPITULO 1. ANTECEDENTES ............................................................................................ 6
1.1 Ingeniería Tisular .......................................................................................................... 6
1.2 Soportes o andamios .................................................................................................... 8
1.3 Quitosano ................................................................................................................... 11
1.4 Polietilenglicol Diglicidil Éter ........................................................................................ 17
1.5 Ácido hialurónico ......................................................................................................... 18
CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................... 24
2.1 Materiales ................................................................................................................... 24
2.2 Métodos ...................................................................................................................... 24
2.2.1 Preparación de películas de quitosano sin agente entrecruzante, entrecruzadas con GA (glutaraldehído) y polietilenglicol diglicidil éter (PEGDE) secas 25°C y 150°C .. 24
2.2.2 Preparación de espumas de quitosano sin agente entrecruzante, entrecruzadas con GA y PEGDE .......................................................................................................... 25
2.2.3 Preparación de películas de quitosano y hialuronato de sodio, quitosano-ácido hialuronato de sodio entrecruzado con glutaraldehído y quitosano-hialuronato de sodio entrecruzados con polietilenglicol diglicil éter ................................................................ 25
2.2.4 Caracterización fisicoquímica de las películas de quitosano, quitosano-GA, quitosano-PEGDE, quitosano-HNa, quitosano-HNa-GA, quitosano-HNa-PEGDE ......... 26
Determinación de grupos de amino libres ...................................................................... 26
2.2.7 Estudios de viabilidad y proliferación celular ......................................................... 31
CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN....................................................................... 35
3.1 Andamios de quitosano, quitosano entrecruzado con glutaraldehído o polietilenglicol diglicil éter en forma de película ........................................................................................ 35
ii
3.1.1 Caracterización fisicoquímica de las películas de quitosano sin agente entrecruzante, entrecruzadas con GA (glutaraldehído) y polietilenglicol diglicidil éter (PEGDE) secas 25°C y 150°C....................................................................................... 35
3.2 Andamios de quitosano-hialuronato de sodio, quitosano- hialuronato de sodio entrecruzado con glutaraldehído y quitosano- hialuronato de sodio entrecruzados con polietilenglicol diglicil éter .................................................................................................. 76
3.2.1 Caracterización fisicoquímica de las películas de quitosano- hialuronato de sodio, quitosano- hialuronato de sodio entrecruzado con GA y quitosano- hialuronato de sodio entrecruzados PEGDE .................................................................................................. 76
3.2.2 Estudios de viabilidad celular y proliferación de los andamios de quitosano/AH, quitosano/AH entrecruzado con glutaraldehído y quitosano/AH entrecruzado con PEGDE ......................................................................................................................... 91
4. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 98
REFERENCIAS .................................................................................................................. 100
ANEXOS ............................................................................................................................ 117
Anexo 1 .......................................................................................................................... 117
Anexo 2 .......................................................................................................................... 118
Anexo 3 .......................................................................................................................... 119
Anexo 4 .......................................................................................................................... 120
Anexo 5 .......................................................................................................................... 121
Anexo 6 .......................................................................................................................... 122
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura. 1.1. Estructura molecular de la quitina y el quitosano .............................................. 12
Figura. 1.2. Estructura molecular del ácido hialurónico ........................................................ 19
Figura. 2.1. Caja de 24 pozos con películas y lisozima para degradación enzimática ......... 31
Figura 3.1. Espectros de FTIR del quitosano en polvo de peso molecular medio, película de quitosano ácida y película de quitosano neutra. ................................................................... 36
Figura 3.2. a) Espectros de FTIR de las películas de quitosano secas a 25°C y b) secas a 150°C. CHT: películas de quitosano, CHT-GA: quitosano entrecruzado con glutaraldehído, CHT-PEGDE, quitosano entrecruzado con PEGDE 1,2,3. ................................................... 38
Figura 3.3. Espectro de FTIR del Polietilenglicol diglicidil éter (PEGDE). ............................. 39
Figura. 3.4. a) Película de quitosano seco a 25ºC en solución de HCl, b) Película de quitosano seco a 150ºC en solución de HCl ......................................................................... 41
Figura 3.5. Termograma DSC de la primera (a) y de la segunda (b) corrida de las películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), quitosano entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 25°C. .......................................... 43
Figura 3.6. Termograma DSC (a) y de la segunda (b) corrida de las películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), quitosano entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 150°C ...................................................................... 43
Figura 3.7. Análisis termogravimétrico (TGA) (a, b) y DTGA (c, d) de termogramas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y entrecruzado con PEGDE 1,2,3 (CHT-PEGDE) ................................................................................................ 45
Figura 3.8. Difractograma del polvo de quitosano ................................................................ 49
Figura 3.9. Difractograma de (a) películas de CHT, CHT entrecruzado con GA (CHT-GA), CHT entrecruzado con PEDGE 1,2,3 (CHT-PEDGE) secas a 25°C y (b) a 150°C. .............. 50
Figura 3.10. Espectros de inspección (survey) por XPS del quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), y quitosano entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 25°C (a) y a 150°C (b) ..................................................................... 54
Figura 3.11. Morfología de la superficie por MEB de las películas de CHT secas a 25°C (a) y 150°C (b) .............................................................................................................................. 57
Figura 3.12. Topografía 2D y Ra (nm) de las películas de quitosano secas a 25°C (superior, a - e) y con secado adicional a 150°C (inferior, f – j); a: CHT, b: CHT/PEDGE1, c: CHT/PEDGE2, d: CHT/PEDGE3, e: CHT/GA, f: CHT, g: CHT/PEDGE1, h: CHT/PEDGE2, i: CHT//PEDGE3, j: CHT/GA ................................................................................................. 58
Figura 3.13. Imágenes de los ángulos de contacto en H2O (a) y DMEM (b) de las películas de quitosano secas a 25°C y con secado adicional a 150°C ................................................ 60
Figura 3.14. Curvas esfuerzo-deformación típicas de películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), y quitosano entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 25°C. .................................................................................... 62
iv
Figura 3.15 Degradación enzimática con lisozima de películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con GA (CHT/GA) y quitosano entrecruzado con PEGDE 1,2,3, (CHT/PEGDE) secas a 25°C (TA) y 150°C (S), en (a) PBS y (b) BES. ................................. 65
Figura. 3.16 (a) Viabilidad de osteoblastos en contacto directo (D) e indirecto (I) en películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y quitosano entrecruzado con PEDGE 1,2,3 (CHT-PEDGE) secas a 25°C y (b) 150°C. .......................... 69
Figura 3.17. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS a) Secado 25°C contacto directo, b) Secado 25°C contacto directo, c) Secado 150°C contacto directo, d) Secado 150°C contacto indirecto .................. 70
Figura 3.18. Imágenes por MEB de osteoblastos cultivados en andamios de CHT en contacto directo e indirecto, secados a 25°C y a 150°C. ...................................................... 71
Figura 3.19. (A-J) Imágenes de fluorescencia de osteoblastos cultivados en andamios de CHT marcados con vinculina (7F9): sc-73614, durante 48 h. (K-T) Imágenes de fluorescencia de osteoblastos cultivados en andamios de CHT marcados con intregrina 1β (A-4) durante 48 ............................................................................................................................................. 73
Figura 3.20 (a) Viabilidad de osteoblastos en contacto directo (D) e indirecto (I) en espumas quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y quitosano entrecruzado con PEDGE 1, 2, 3 (CHT-PEDGE) ................................................................. 74
Figura 3.21. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS de espumas de quitosano en a) contacto directo, b) contacto indirecto................................................................................................................................ 75
Figura 3.22. Espectro FTIR del hialuronato de sodio en polvo (HA-p) y de las películas de hialuronato de sodio con ácido acético (HA-f)....................................................................... 76
Figura 3.23. Espectros de FTIR de las películas de a) CHT/HA15%, CHT/HA15% entrecruzadas con glutaraldehído (CHT- HA15%-GA) y entrecruzadas con PEDGE (CHT-HA15%-PEDGE1, 2, 3) y b) de las películas de CHT/ HA30%, CHT/ AH30% entrecruzadas con glutaraldehído (CHT- HA30%-GA) y entrecruzadas con PEDGE (CHT-HA30%-PEDGE1, 2, 3) ...................................................................................................................................... 77
Figura 3.24. Espectro Raman de películas hialuronato de sodio en polvo ........................... 80
Figura 3.25. Espectros Raman de películas de quitosano a) CHT/HNa15% y entrecruzadas con PEDGE (CHT-HA15%-PEDGE 1, 2, 3) y b) de las películas de CHT/ HNa 30%, CHT/ HNa 30% entrecruzadas con PEGDE (CHT-PEGDE 1,2,3) .................................................. 81
Figura 3.26. Análisis termogravimétrico (a, c) y DTGA (b, d) de termogramas (superior) quitosano/HNa 15% (CHT-HA15%), (inferior) quitosano/ HNa 30% (CHT-HA30%), quitosano / HNa 15% y 30% entrecruzado glutaraldehído (CHT-HA 15% y 30%-GA) y quitosano HNa 15% y 30% entrecruzado con polietilenglicol diglicidil éter (CHT-HA 15% y 30%-PEGDE)... 82
Figura 3.27. Difractograma del ácido hialurónico ................................................................. 84
Figura 3.28. Difractogramas de las películas de (a) quitosano-HNa 15%, (CHT-HA15%), CHT-AH15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA15%GA), CHT/HNa entrecruzado con PEDGE (CHT-HA15%PEDGE 1,2,3) (b) quitosano-HNa 30% (CHT-HA30%), CHT-
v
HNa15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA30%GA), CHT/HNa entrecruzado con PEDGE (CHT-HA30%PEDGE 1,2,3) .................................................................................... 85
Figura 3.29. Espectros de inspección (survey) de XPS de (a) quitosano- NHa 15%, (CHT-HA15%), CHT- NHa 15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA15%GA), CHT- NHa entrecruzado con PEDGE (CHT-HA15%PEDGE 1,2,3) (b) quitosano-AH 30% (CHT-HA30%), CHT- NHa 15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA30%GA), CHT- NHa entrecruzado con PEDGE (CHT-HA30%PEDGE 1,2,3) ....................................................... 87
Figura 3.30. Imágenes y valores obtenidos de las películas de quitosano modificadas con HNa al 15% y 30%, y de las películas de quitosano modificadas con HNa entrecruzadas con PEGDE 1, 2 y 3 y con GA..................................................................................................... 88
Figura 3.31. Topografía 2D de las películas de quitosano con HNa al 15% (superior, a - e) y al 30% (inferior, f – j); a: CHT, b: CHT/PEDGE1, c: CHT/PEDGE2, d: CHT/PEDGE3, e: CHT/GA, f: CHT, g: CHT/PEDGE1, h: CHT/PEDGE2, i: CHT/PEDGE3, j: CHT/GA. .......... 90
Figura 3.32. (a) Viabilidad de osteoblastos en contacto directo en películas de quitosano (CHT) con ácido hialurónico (AH) al 15% y 30%, y de quitosano- ácido hialurónico entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y quitosano-ácido hialurónico entrecruzado con PEDGE (CHT-PEDGE) a 0.114 mM (1), 0.228 mM (2) y 0.342 mM (3) ................................ 92
Figura 3.33. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS de los andamios de quitosano con HNa al 15% y 30%. .......... 93
Figura 3.34. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS de andamios de quitosano con HNa a) 15% b) 30% .............. 95
Figura. 3.35. Imágenes por MEB de osteoblastos cultivados en andamios de CHT/AH en contacto directo e indirecto. .................................................................................................. 97
vi
LISTA DE TABLAS
Tabla 1.1 Ejemplos de andamios a base de quitosano, ácido hialurónico y quitosano/ácido hialurónico para ingeniería tisular ósea reportados en la literatura ....................................... 23
Tabla 3.1. Porcentaje de grupos amino en películas de quitosano y películas de quitosano entrecruzado, secadas a 25ºC y a 150ºC ............................................................................. 41
Tabla 3.2 Entalpía de evaporación de la primera corrida de películas de quitosano y películas de quitosano entrecruzado, secas a 25ºC y a 150ºC ............................................................ 44
Tabla 3.3 Temperaturas máximas y pérdida de peso de las películas CHT .......................... 47
secas a 25°C y 150°C. ......................................................................................................... 47
Tabla 3.4. Porcentaje de cristalinidad de películas CHT secas a 25°C y 150°C. .................. 52
Tabla 3.5 Resultados de la distancia intermolecular (d) de las películas de quitosano secadas a 25°C obtenidos mediante la Ley de Bragg ......................................................................... 53
Tabla 3.6. Porcentaje atómico por EDX de C, O, N de películas de quitosano entrecruzadas con GA y PEGDE secas a 25 ° C y 150 ° C. ......................................................................... 53
Tabla 3.7. Porcentaje atómico por XPS de C, O, N de películas de quitosano entrecruzadas con GA y PEGDE secas a 25°C y 150°C.............................................................................. 55
Tabla 3.8. Propiedades mecánicas de películas de quitosano sin entrecruzante, quitosano entrecruzado con glutaraldehído, quitosano entrecruzado con PEGDE ............................... 62
Tabla 3.9. Masa perdida después de la degradación química de películas de quitosano entrecruzado secado a 25℃. ................................................................................................ 63
Tabla 3.10. Porcentajes de pérdida de masa obtenidos de la degradación enzimática de las películas de quitosano .......................................................................................................... 65
Tabla 3.11 Valor de p (ANOVA-Tukey) de las medias de películas de quitosano con secado a 25°C vs secado adicional a 150°C en contacto directo (C.D) y contacto indirecto (C.I) ........ 70
Tabla 3.12 Temperaturas máximas y pérdida de peso de las películas de quitosano/AH 15%/PEGDE entrecruzadas con glutaraldehído y con PEGDE. ........................................... 84
Tabla 3.13 Porcentaje de cristalinidad de películas CHT-HNa al 15% y 30% ....................... 86
Tabla 3.14 Porcentaje atómico por XPS de C, O, N de películas de quitosano/AH 15% entrecruzadas con GA y PEGDE .......................................................................................... 87
Tabla 3.15 Rugosidad de las superficies de las películas de quitosano y ácido hialurónico entrecruzado con PEGDE y GA ........................................................................................... 89
vii
RESUMEN
El quitosano (CHT) es un polisacárido catiónico natural con múltiples propiedades antimicrobianas, antimicóticas, etc. y excelente biocompatibilidad que ha sido ampliamente usado como biomaterial en numerosas aplicaciones biomédicas. Estas propiedades son generalmente atribuidas a la presencia de grupos amino protonables que, sin embargo, pueden ser afectados durante sus distintas modificaciones. Por lo tanto, el efecto de la temperatura (25℃ o 150℃), el agente de entrecruzante (PEGDE o GA) y la adición de hialuronato de sodio (HNa) al quitosano fue estudiado para determinar su impacto en varias propiedades fisicoquímica y su biocompatibilidad. El CHT entrecruzado con PEGDE mostró una reducción en los grupos amino libres y la relación amida I / II, la cual se redujo aún más con el secado adicional a 150°C. En el análisis de difracción de rayos X (DRX), el CHT entrecruzado con PEGDE mostró múltiples picos, mientras que el porcentaje de cristalinidad se redujo con un aumento en la concentración de PEGDE y tratamientos térmicos a 150°C. En los ensayos celulares por contacto directo se observó una alta viabilidad de osteoblastos a concentraciones bajas y medias de PEDGE, la cual aumentó cuando los andamios entrecruzados se trataron térmicamente a 150°C. Esto se atribuyó a su hidrofilia parcial, baja cristalinidad y rugosidad de la superficie a pesar de la pequeña reducción en la cantidad de grupos amino libres, inducida durante el secado a 150°C. Además, los andamios de CHT entrecruzados con PEGDE mostraron una fuerte expresión de vinculina e integrina 1β, lo que los hace adecuados para aplicaciones óseas. Los andamios de quitosano modificados con HNa mostraron una disminución de la banda 1650 cm-1 (amida I) y un desplazamiento de la banda 1561 cm-1 (N-H2) a 1550 cm-1 la cual se observó más intensa cuando la concentración de HNa fue mayor. En las películas de CHT/HNa/PEGDE al 15% y 30% de HNa, la banda ubicada a1640 cm-1 aumentó de intensidad conforme incrementó la concentración de PEGDE. En el análisis por DRX se observa una disminución del pico ubicado a 2θ = 9.5° conforme aumenta la cantidad de PEGDE. Mediante TGA se observó un aumento de la Td2 para PEGDE1 registrando valores de 298°C (CHT puro) a 344°C (HNa15%) y 285°C (HNa 30%), observando que a concentraciones mayores de HNa cuando se entrecruza con PEGDE, disminuye la estabilidad térmica de las películas. La modificación de quitosano/HNa con PEGDE permitió la obtención de andamios con propiedades biocompatibles para el crecimiento de osteoblastos. En los ensayos de biocompatibilidad, las películas de CHT-HNa que mostraron una mejor adhesión y viabilidad celular fueron las entrecruzadas con PEGDE. Sin embargo, un exceso de HNa (30%) no mejora su viabilidad celular. En contraste, muestras entrecruzadas con glutaraldehído si son beneficiadas con la adición del hialuronato de sodio.
viii
ABSTRACT
Chitosan (CHT) is a natural cationic polysaccharide with excellent biocompatibility and multiple properties, such as antimicrobial and antifungal agents, among others. Thus, it has been widely used as a biomaterial for numerous biomedical applications. Chitosan’s properties are generally attributed to the presence of protonable amino groups, which, nonetheless, can be affected during their various modifications. Therefore, this study assessed the effect that the change of temperature (25℃ or 150℃), the crosslinking agent (PEGDE or GA), and the addition of sodium hyaluronate (HNa) on chitosan to determine the impact on its various physicochemical properties and its biocompatibility. CHT crosslinked with PEGDE showed a reduction in free amino groups and the amide I / II ratio, which was further reduced with exhaustive drying at 150°C. Additionally, X-ray diffraction (DRX), showed multiple peaks and crystallinity reduction with an increase in the concentration of PEGDE and thermal treatment at 150°C. In the cytotoxicity test by direct contact, high viability of osteoblasts was observed at low and medium concentrations of PEDGE, which also improved when cross-linked scaffolds were heat treated at 150°C. This outcome was attributed to its partial hydrophilicity, low crystallinity and low surface roughness, even though a small reduction in the amount of free amino groups was induced during the drying at 150°C. Furthermore, CHT scaffolds crosslinked with PEGDE showed a strong expression of vinculin and integrin 1β, which made them suitable for bone applications. Chitosan scaffolds modified with HNa showed a reduction of the band 1650 cm-1 (amide I), a shift of the band from1561 cm-1 (N-H2) to 1550 cm-1 which was more intense when the concentration of HNa was higher. In CHT/HNa/PEGDE films with 15% and 30% HNa, the band located at 1640 cm-1 increased in intensity as the concentration of PEGDE increased, as well. The DRX analysis showed a peak intensity reduction at 2θ = 9.5° as the amount of PEGDE increased. An increase in Td2 for PEGDE1 was observed by TGA recording values from 298°C (pure CHT) to 344°C (HNa15%) and 285°C (HNa 30%). It was also observed that when high concentrations of HNa were used in the presence of PEGDE, the thermal stability of the films decreased. Chitosan/HNa crosslinked with PEGDE also rendered osteoblasts compatible scaffolds exhibiting good adhesion and increased viability; yet, an excess of HNa (30%) did not improve the cell viability. In contrast, glutaraldehyde crosslinked chitosan showed improved cytotoxicity by adding sodium hyaluronate.
1
I. INTRODUCCIÓN
La incidencia mundial de trastornos y afecciones óseas ha aumentado considerablemente
y se espera que se duplique para el presente año, especialmente en poblaciones donde el
envejecimiento se combina con obesidad y una deficiente actividad física [1].
En la cavidad bucal se presentan diversas situaciones y/o enfermedades las cuales
ocasionan un daño permanente a los tejidos óseos como son: la enfermedad periodontal
[2], cirugías de terceros molares retenidos, tratamientos de ortodoncia, trastornos de la
articulación mandibular, así como labio y paladar hendido.
Con respecto a la práctica clínica, la reparación de defectos del tejido óseo se considera un
desafío importante [1]. Este problema se puede tratar mediante trasplantes, sin embargo,
el principal inconveniente asociado a dicha terapéutica es la escasez de donadores. Esta
circunstancia demanda la necesidad de un soporte (andamio) adecuado, en el cual las
células autólogas puedan cultivarse en condiciones óptimas in vitro y posteriormente
trasplantarse nuevamente al cuerpo humano; esto obviará la necesidad de esperar a un
donante [3].
Los injertos óseos se utilizan en una amplia gama de entornos clínicos para mejorar la
reparación y regeneración ósea [4]. La reparación de defectos óseos mediante ingeniería
de tejidos se presenta como una mejor alternativa a esto, debido a que el proceso de
reparación puede continuar con el propio tejido del paciente para cuando se complete la
regeneración. Sin embargo, las prácticas de ingeniería del tejido óseo no se han llevado a
la práctica clínica a causa de varias limitaciones o desafíos. La ingeniería de los tejidos
óseos apunta a inducir una nueva regeneración ósea funcional a través de la combinación
sinérgica de biomateriales, células y factores de crecimiento [3].
Los elementos clave de la ingeniería tisular son: las células, la presencia de moléculas de
señalización que induzcan la morfogénesis, la matriz extracelular o los soportes/andamios
(scaffolds) [5]–[7].
El andamio, por definición, es una estructura de soporte temporal para el crecimiento de
células y tejidos. También se llama matriz extracelular sintética y desempeña un papel
crítico en el apoyo de las células. Luego, estas células experimentan proliferación,
migración y diferenciación en tres dimensiones, lo que conduce a la formación de un tejido
específico con las funciones apropiadas que se encontrarían en el cuerpo humano. Así
mismo, el andamio debe ser capaz de degradarse a una velocidad controlable cercana a la
2
tasa de regeneración del tejido de interés con una inflamación mínima [8]–[11]. También
deben interactuar con las células circundantes y mantener el fenotipo del tejido regenerado,
así como ser biocompatible, biodegradable, promover la adhesión celular, la proliferación y
mantener la actividad metabólica de las células [12].
Los materiales que se emplean en la elaboración de andamios pueden ser polímeros
naturales, polímeros sintéticos o cerámicos. Los polímeros naturales han llamado la
atención de varios investigadores debido a sus excelentes propiedades de
biocompatibilidad [13].
Los polímeros naturales como el quitosano, el alginato y el ácido hialurónico contienen
grupos funcionales ionizables que pueden ser fácilmente utilizados con el fin de
proporcionar factores bioactivos tales como proteínas, fármacos y ácidos nucleicos [14]. En
las últimas dos décadas se ha publicado aceleradamente artículos acerca de las
aplicaciones de la quitina y quitosano en la liberación de medicamentos, la ingeniería de
tejidos, la piel e injertos óseos [15].
El principal derivado de la quitina: el quitosano, ha adquirido atención como andamio para
regeneración de tejidos debido a la posibilidad de producción a gran escala y bajo costo;
sus grupos funcionales reactivos y cargados positivamente le permiten formar complejos
con polímeros aniónicos, incluidas proteínas que ayudan a regular la actividad celular;
adicionalmente, este policatión natural exhibe propiedades antibacterianas. La presencia
de grupos amino en la estructura de quitosano diferencia a éste de la quitina, y le da a este
polímero muchas propiedades peculiares [16].
Algunas de las propiedades funcionales del quitosano son: biocompatibilidad,
mucoadhesión, capacidad filmogénica, hemostático, promotor de absorción, actividad
antimicrobiana, anticolesterolémica y antioxidante; se degrada en oligosacáridos no tóxicos
dentro del cuerpo debido a la acción de las lisozimas [17]. Se ha reportado que los
biomateriales basados en quitosano no desencadenan reacciones inflamatorias o alérgicas
después de su implantación, inyección, aplicación tópica, o ingestión en el cuerpo humano
[13]. Las propiedades de adherencia celular, proliferación y diferenciación del quitosano se
atribuyen a su naturaleza hidrófila, y sus cadenas poliméricas agregadas compactas, las
cuales son útiles para proporcionar estabilidad a los andamios, en términos de tamaño y
morfología, durante el cultivo celular [18]. Sin embargo, una de sus desventajas es que
carece de la resistencia a la tensión necesaria para que coincida con la de algunos tejidos
del cuerpo humano [19], [20].
3
El ácido hialurónico (AH), otro polímero natural, es un glucosaminoglicano que consiste en
unidades repetitivas de ácido D-glucurónico y N-acetil D-glucosamina [21], [22]. Se
encuentra en la MEC de todos los tejidos vivos, en diferentes concentraciones y pesos
moleculares, estando presente de forma más abundante en los tejidos sometidos a cargas
mecánicas, como cartílagos, dermis y cuerdas vocales [23]. El AH realiza un papel clave en
la división y migración celular, la angiogénesis, la cicatrización de heridas y la regeneración
de tejidos. Debido a su biocompatibilidad, biodegradabilidad y susceptibilidad para
modificarse químicamente, es de gran interés por su potencial en el campo de la ingeniería
de tejidos [23].
El AH posee la capacidad de interactuar con los receptores en la superficie de células
troncales, induciendo la transducción de señales intracelulares y afectando actividades
como proliferación, supervivencia, movimiento y diferenciación celular [24]. Los materiales
basados en ácido hialurónico se han utilizado como andamios para ingeniería de tejidos y
se ha demostrado por medio de pruebas in vitro e in vivo que favorecen la regeneración de
tejidos [23]. En la presente investigación se propone el empleo de andamios a base de
quitosano, modificados con hialuronato de sodio con la finalidad de mejorar sus
propiedades de biocompatibilidad.
Cuando las células se cultivan en andamios elaborados a partir de polímeros naturales,
éstos proporcionan una gran cantidad de señales biológicas, pero a menudo sus
propiedades fisicomecánicas se ven afectadas [25]. Como alternativa, los andamios
formados a partir de macromoléculas de origen biológico se emplean en conjunto con
polímeros sintéticos para poder modificar algunas de sus propiedades, tales como la
mecánica y la degradación, pero por lo general dichos polímeros no son biocompatibles con
las células. Por lo tanto, existe un interés creciente para desarrollar estrategias en la
preparación de andamios que integren los beneficios de ambos materiales (naturales y
sintéticos). El quitosano es un candidato para soporte celular con un gran potencial ya que
posee propiedades biológicas únicas, las cuales posibilitan el desarrollo de materiales en
una gran variedad de formas.
La novedad de esta investigación radica en el hecho de poder desarrollar un material de
soporte celular a base de quitosano y quitosano/ácido hialurónico, entrecruzado con
polietilenglicol diglicidil éter (PEGDE), el cual posea las características requeridas para ser
empleado en ingeniería tisular ósea. Adicionalmente, se estudió el efecto de la temperatura
de secado (25 ℃ o 150 ℃) en las propiedades del quitosano puro.
4
En el capítulo 1 de este trabajo se mencionan los conceptos de ingeniería tisular ósea, así
una revisión bibliográfica de los materiales con los que se elaboran los andamios, en
específico el quitosano, hialuronato de sodio, y el PEGDE. En el capítulo 2 se presentan los
materiales y la metodología utilizada para la elaboración y caracterización de los andamios.
En el capítulo 3 se presentan los resultados y discusión de la caracterización fisicoquímica
y biológica de los andamios fabricados. Para finalizar se presentan las conclusiones
obtenidas con base en el análisis de los resultados.
5
II. HIPÓTESIS
La modificación del quitosano y quitosano/AH con PEGDE permitirá obtener andamios con
las propiedades fisicoquímicas adecuadas para permitir la proliferación de osteoblastos.
III. OBJETIVOS
Objetivo general
Determinar las propiedades de andamios de quitosano entrecruzados con PEGDE,
sometidos a diferentes tratamientos térmicos, y andamios de quitosano y hialuronato de
sodio entrecruzados con PEGDE.
Objetivos particulares
1. Obtener películas de quitosano entrecruzado con PEGDE a distintas
concentraciones.
2. Modificar el quitosano con hialuronato de sodio y entrecruzarlo con PEGDE a
distintas concentraciones.
3. Caracterizar los andamios obtenidos a partir de la determinación de sus propiedades
fisicoquímicas (FTIR, DSC, TGA, DSC, DRX, MEB, XPS, EDX, MEB, AFM) ángulo
de contacto y propiedades mecánicas de tensión en películas de quitosano secas a
25℃ y a 150ºC
4. Realizar estudios de degradación acelerada y enzimática
5. Determinar la adhesión y proliferación de osteoblastos sobre el andamio de
quitosano entrecruzado con PEGDE seco a 25°C y a 150°C (películas y espumas),
y sobre andamios de quitosano/hialuronato de sodio.
6
CAPITULO 1. ANTECEDENTES
1.1 Ingeniería Tisular
En los últimos años se han logrado avances significativos para tratar la pérdida o falla de
tejidos óseos mediante estrategias basadas en la ingeniería de tejidos [26].
La ingeniería de tejidos óseos (ITO) posee la habilidad de suministrar materiales
osteoinductivos y osteoconductivos. Los primeros estimulan a las células osteoprogenitoras
para diferenciarse en osteoblastos los cuales inician la formación de tejido óseo. Mientras
que los segundos sirven como andamios para el crecimiento de nuevo tejido óseo
proveniente de tejido óseo original [27]. Por lo tanto, la ITO se basa en la comprensión de
la estructura ósea, la mecánica ósea y la formación de tejido, ya que su objetivo es inducir
nuevos tejidos óseos funcionales. En otras palabras, para regenerar o reparar con éxito el
hueso, es esencial el conocimiento de la biología ósea y su desarrollo [1].
El hueso posee la capacidad de realizar una amplia gama de funciones, y responde a una
variedad de estímulos metabólicos, físicos y endocrinos. Los huesos representan la base
de nuestra locomoción corporal, proporcionan capacidad de carga a nuestro esqueleto y
protección a nuestros órganos internos; albergan los elementos biológicos necesarios para
la hematopoyesis, atrapan metales peligrosos (por ejemplo, plomo), y mantienen la
homeostasis de electrolitos clave a través del almacenamiento de iones de calcio y fosfato,
e incluso se ha sugerido que participa en la regulación del azúcar. Además, el hueso
participa en un ciclo constante de reabsorción y renovación, experimentando un intercambio
químico continuo y remodelación estructural debido a mediadores internos y demandas
mecánicas externas. La ingeniería funcional del tejido óseo requiere que el hueso
recientemente restaurado se integre completamente con el hueso huésped vecino y, lo que
es más importante, realice las funciones mencionadas anteriormente [1].
El hueso es un tejido altamente vascularizado, consiste en 60% de minerales, 30% de
matriz extracelular y 10% de agua. El tejido óseo puede clasificarse en dos formas: (a)
hueso cortical, que proporciona una función mecánica y protectora, y (b) hueso trabecular,
que es más metabólicamente activo y facilita el movimiento de las articulaciones y las
extremidades. En el proceso de osificación, se produce la formación de hueso nuevo por
7
células llamadas osteoblastos. Estos osteoblastos, y la matriz ósea, son los dos elementos
esenciales involucrados en la formación de hueso [28].
Actualmente, es reconocido el hecho de las considerables deficiencias, limitaciones y
complicaciones de los tratamientos clínicos convencionales para la reparación y
regeneración ósea; éstas incluyen trasplantes autólogos y alogénicos utilizando autoinjertos
y aloinjertos. En el presente, los autoinjertos se emplean como el estándar de oro para los
injertos óseos porque son histocompatibles, no inmunogénicos, y ofrecen las propiedades
requeridas de un material para ser utilizado como injerto óseo. Específicamente, los
autoinjertos poseen los componentes esenciales para lograr la osteoinducción (es decir,
proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y otros factores de crecimiento), la osteogénesis (es
decir, células osteoprogenitoras) y la osteoconducción (es decir, matriz tridimensional y
porosa). Sin embargo, los autoinjertos implican la extracción de hueso de la cresta ilíaca
del paciente y, por lo tanto, requieren una segunda operación en el sitio de extracción del
tejido. Adicionalmente, los trasplantes óseos autólogos son procedimientos muy costosos
y pueden provocar lesiones y morbilidad significativa en el sitio de donación, deformidad,
cicatrización y también están asociados con riesgos quirúrgicos, como son sangrado,
inflamación, infección y dolor crónico [1].
Los aloinjertos representan la segunda opción de injerto óseo más común; implican el
trasplante de tejido óseo de un donante, a menudo de un cadáver. El hueso alogénico
también es considerado histocompatible, y está disponible en varias formas, incluyendo
matriz de hueso desmineralizado (DBM), esponjoso, injertos cortico-cancerosos, corticales,
y segmentos osteocondrales y de hueso entero. En comparación con los autoinjertos, los
aloinjertos están asociados con riesgos de inmunorreacciones y transmisión de infecciones.
Tienen propiedades osteoinductoras reducidas y no poseen componentes celulares, debido
a que los injertos de los donantes se desvitalizan mediante irradiación (esterilización) o
liofilización. Pese a que son menos costosos que los autoinjertos, los injertos alogénicos
tampoco son económicos. Además, el mercado de injertos óseos está experimentando una
gran demanda y actualmente existe una escasez de varios de estos productos comerciales.
Otras técnicas de reparación ósea comúnmente utilizadas incluyen rellenos de cemento
óseo y proteínas morfogénicas óseas. Aunque se ha demostrado que las intervenciones
clínicas mencionadas anteriormente mejoran la reparación del hueso, ninguna posee todas
las características ideales: alto potencial osteoinductivo y angiogénico, seguridad biológica,
8
baja morbilidad del paciente, sin restricciones de tamaño, fácil acceso a los cirujanos y larga
vida útil [1].
El objetivo de la ingeniería tisular ósea es inducir la regeneración de nuevo hueso funcional,
y es una alternativa potencial al injerto óseo convencional, debido a la fuente ilimitada de
materia prima y a la baja incidencia de transmisión de enfermedades. Para la preparación
de hueso artificial se deben considerar los siguientes criterios: morfología, estructura,
porosidad, suficiente resistencia mecánica, biocompatibilidad y biodegradabilidad. Desde
un punto de vista clínico, el uso de andamios artificiales puede ser atractivo para minimizar
la incomodidad del paciente, evitar la transmisión de infecciones, la formación de heridas y
reducir el costo del tratamiento [29].
En la ingeniería de tejidos óseos la osteogénesis se inicia por los osteoblastos, que son, en
su mayoría, células diferenciadas de células madre proporcionadas por el material de
injerto. Después del inicio de la osteogénesis, las células madre locales y también los
osteoblastos serán atraídos al material participando en la regeneración ósea. La aplicación
de diferentes tipos de células, tales como células madre embrionarias, células fetales, de
placenta, células de líquido amniótico, células de cordón umbilical, células madre
hematopoyéticas de médula ósea, células madre mesenquimales, células derivadas de
tejido adiposo y células madre derivadas de tejido dental han sido investigadas en
ingeniería tisular ósea [30].
El paradigma clásico de la ITO consta de los siguientes elementos clave: (1) un andamio
biocompatible que imite la matriz extracelular ósea natural, (2) células osteogénicas para
formar la matriz de tejido óseo, (3) señales morfogénicas que ayudan a dirigir a las células
al fenotipo deseable, y (4) vascularización suficiente para satisfacer las necesidades de
suministro y eliminación de nutrientes del tejido en crecimiento [3].
1.2 Soportes o andamios
Los andamios se utilizan para proporcionar un sustrato temporal para que las células
formadoras de hueso se unan, proliferen y formen tejido nuevo. Para mantener el fenotipo
celular adecuado que dé lugar a la formación ósea funcional, el andamio debe ser capaz
de guiar la diferenciación osteogénica de los preosteoblastos a través de la interacción
apropiada célula-material [17]. La matriz extracelular (MEC) que rodea las células en el
cuerpo regula la proliferación y diferenciación celular. En consecuencia, los andamios
9
deben ser sintetizados para producir in vitro la reconstrucción de tejidos, así como para la
regeneración mediada por células in vivo [17], [31].
El andamio ideal permitirá la fijación, la proliferación, la diferenciación celular y el
almacenamiento de la matriz extracelular, la neovascularización para que el oxígeno y los
nutrientes puedan alcanzar el centro del andamio y facilitar la eliminación de toxinas. El
constructo implantado debe activar los mecanismos de curación innatos y degradarse a una
tasa proporcional al crecimiento de nuevo tejido sin la producción de subproductos tóxicos.
El andamio se debe preparar estratégicamente de manera que posea la geometría y el
tamaño de poro adecuado para la difusión de las células y los nutrientes, debe permitir la
diferenciación adecuada de las células sin afectar a su progenie, así como imitar el
ambiente natural de los tejidos y ser biocompatible; el grado de biocompatibilidad de un
material depende de propiedades tales como la forma, el tamaño, la química de superficie,
porosidad, la esterilidad, la duración de contacto y la degradación [31]. El andamio debe
tener la resistencia mecánica requerida, apoyar la unión de células in vitro, y poseer
propiedades biodegradables. La velocidad de degradación debe coincidir con la velocidad
de formación de tejido [14].
Estudios recientes han demostrado que las propiedades del material como la topografía de
la superficie, la rigidez, la hidrofilicidad y la composición química juegan un papel importante
en la diferenciación osteogénica de las células madre [32]. La biocompatibilidad y
biodegradabilidad de un biomaterial son dos parámetros cruciales para las aplicaciones
exitosas, tanto en sistemas biomédicos, como en andamios de ingeniería de tejidos [33],
[34].
Acerca de la regeneración ósea del hueso alveolar, el primer objetivo del andamio debe ser
contribuir al mantenimiento del espacio para los tejidos periodontales. Otro punto para el
éxito de la regeneración es proteger el tejido en formación de posibles infecciones por
microorganismos orales. El tejido periodontal es el único tejido en el cual los tejidos blandos
y duros están expuestos al ambiente exterior. Se han desarrollado materiales poliméricos
con nanofibras para liberar agentes antibacterianos de bajo peso molecular durante la
regeneración ósea guiada (GBR) los cuales fracasaron cuando las membranas se
expusieron a la cavidad oral y se infectaron. Para evitar la contaminación, se llevaron a
cabo varios estudios para incorporar agentes antibacterianos, tales como hidróxido de
tetraciclina y metronidazol. Sin embargo, no se ha llevado a cabo el desarrollo de un
andamio antiinfeccioso especialmente diseñado para la regeneración periodontal. La
10
exploración adicional de los métodos para el control de la infección mediante los andamios
puede contribuir a la eliminación de las bacterias, lo que resultaría en la generación de
nuevo tejido [5].
Los materiales biodegradables han ganado atención debido a que poseen la ventaja de
permitir que los nuevos tejidos asuman su carga u otras funciones sin crear problemas
crónicos asociado a la presencia de éstos. La biodegradación de los andamios también es
un fenómeno complejo, cuya tasa depende de varios factores intrínsecos y morfológicos
tales como el tamaño de poro, la composición química, la morfología, el área superficial, la
hidrofilicidad, entre otros.[35]
Entre los materiales sintéticos aprobados por la administración de drogas de los Estados
Unidos (FDA por sus siglas en inglés), para la elaboración de andamios, se encuentran la
poli(ε-caprolactona), el poli ácido(láctico-co-glicólico) (PLGA), el poli(ácido glicólico) (PGA)
y el poli(ácido-L-láctico) (PLA) [15], [36].
Los polímeros naturales han atraído la atención de varios investigadores debido a sus
excelentes propiedades de biocompatibilidad [13]. La mayoría de los biomateriales de
origen natural en uso hoy en día poseen la capacidad para interactuar con las células y
mediar la degradación. Los materiales en esta categoría incluyen colágeno, quitosano,
dextrano, alginato, y la fibrina [7].
Entre las limitaciones de los polímeros naturales se encuentra principalmente su baja
resistencia mecánica y la tasa de degradación. En contraste, los polímeros sintéticos
pueden ser diseñados para degradarse a una velocidad controlada y su resistencia
mecánica a la compresión puede llegar a ser similar a la del hueso. Sin embargo, debido a
que son sintéticos, pueden provocar una respuesta inmune y los subproductos de
degradación ácidos, en el caso del PCL, PLA y PGA, puede conducir a la inflamación [27].
Los polímeros naturales como el quitosano, el alginato y el ácido hialurónico contienen
grupos funcionales protonables que pueden ser fácilmente utilizados con el fin de
proporcionar factores bioactivos tales como proteínas, fármacos y ácidos nucleicos [36]. En
las últimas dos décadas, se ha publicado activamente acerca de las aplicaciones de la
quitina y quitosano en la liberación de medicamentos, la ingeniería de tejidos, la piel e
injertos óseos [14], [37].
11
1.3 Quitosano
La quitina es el segundo polímero más abundante en el mundo después de la celulosa. Se
encuentra principalmente en todas las conchas de crustáceos e insectos, así como en
ciertos hongos, algas y levaduras. Es químicamente inerte, con más del 90% de grado de
acetilación, altamente insoluble en agua y ácido. Eso hace que su forma hidrolizada, el
quitosano (CHT), sea un derivado importante para varios propósitos [38].
Comercialmente, la quitina y sus derivados se extraen de la cáscara del camarón, cangrejo,
cigalas y del krill. Algunos estudios han señalado que los huevos de insectos, hongos,
corales y crustáceos pueden ser fuentes alternativas de quitina. La quitina se encuentra en
la superficie externa del cuerpo de los terópodos y, en estructuras celulares de algas y
levaduras [39].
El quitosano, poli(1-4)-2-amino-2-desoxi-D-glucopiranosa, (figura 1.1) es un biopolímero
que se obtiene en medios alcalinos mediante la desacetilación completa de quitina [poli-1-
(1-4)-2-acetamida-2-desoxi-D-glucopiranosa], la cual es uno de los polisacáridos más
abundantes en la naturaleza, al igual que la celulosa [39]. El grado de N-desacetilación
(DD), que representa la fracción molar de unidades N-desacetiladas en la cadena
polimérica, se ha utilizado en gran medida como un parámetro para distinguir a la quitina
del quitosano [40]. Cada unidad desacetilada posee tres grupos funcionales reactivos: un
grupo amina y grupos hidroxilo primarios y secundarios. Los grupos amina tienen un valor
pKa de 6.5 dependiendo del peso molecular, por lo que lo convierte en un polímero sensible
al pH. A un pH de 7.4, la columna principal de amina del quitosano es neutra, mientras que
en un pH>5.5 90% de los grupos amina están protonados, haciendo al quitosano soluble
en ácidos orgánicos. Gran parte del atractivo de quitosano es debido a la presencia de
grupos amino primarios en sus unidades repetitivas, los cuales se protonan en condiciones
ácidas [38]. En una solución ácida, los grupos amino de quitosano se protonan a NH3+ por
lo tanto, las propiedades polielectrolíticas y quelantes del quitosano se rigen principalmente
por la acidez del NH3 [41], [42].
Los grupos químicamente activos en la estructura de quitosano son los grupos amina libres
y los grupos hidroxilo, que pueden modificarse y formar enlaces de hidrógeno o
electrostáticos. Los grupos amina pueden ser protonados fácilmente en un entorno ácido
que hace que el quitosano sea soluble en soluciones ácidas acuosas. Debido a los enlaces
β (1 ~ 4) entre los residuos que constituyen la cadena, el quitosano puede formar películas
12
las cuales se obtienen fácilmente por evaporación de soluciones ácidas diluidas del
polímero. [43], [44]
Figura. 1.1. Estructura molecular de la quitina y el quitosano
El quitosano posee múltiples propiedades, como antiinflamatorio, antimicrobiano [45], [46],
hipocolesterolémico [47], inmunoestimulante [48], y actividad antitumoral [49]; actividad
antifúngica y antimicrobianas [50], además de ser biocompatible, no tóxico y no alergénico
para los tejidos vivos, lo cual lo convierte en un candidato ideal para elaboración de
andamios en ingeniería de tejidos [51], [52], sustitutos óseos, así como para el transporte
de fármacos [53]–[56].
El quitosano es un producto disponible comercialmente. La FDA (Food and Drug
Administration) aprueba su uso como apósito para heridas ya que acelera el cicatrizado y
también se ha empleado como suplemento alimenticio, ya que su uso en alimentos se
considera seguro en los EE.UU. (GRAS: Generally Recognized As Safe) [37].
Se ha encontrado que la N-acetil-ᴅ-glucosamina, componente del quitosano, posee
propiedades anti-inflamatorias haciendo al quitosano adecuado para aplicaciones in vivo;
también puede interactuar con los receptores de superficie, como el receptor de manosa y
el receptor tipo Toll de macrófagos, induciendo respuestas inmunes innatas [57].
Una de las características más importantes del quitosano para aplicaciones en ingeniería
de tejidos es que se pueden fabricar estructuras de diversas formas; se puede utilizar para
hacer nano y micropartículas, esponjas, geles, membranas y andamios porosos. El
quitosano es degradable in vivo; cuando posee un mayor grado de desacetilación, se
degrada lentamente y puede durar varios meses in vivo [27].
13
La despolimerización del quitosano (CHT) puede ocurrir por enzimas como las
glucosaminidasas, lipasas y lisozima. El quitosano posee una semejanza estructural con
los glicosaminoglicanos (GAG), uno de los componentes de la MEC que interactúa con las
fibras de colágeno y desempeña un papel importante en la adhesión célula-célula [58]. El
quitosano, después de la despolimerización, produce quitooligosacáridos bioactivos con
propiedades antimicrobianas, y sus productos monoméricos (glucosamina) son
metabolizados y excretados del cuerpo. Por lo tanto, el quitosano es biodegradable y tiene
una excelente biocompatibilidad con casi todos los tejidos del cuerpo [59].
Gracias a sus grupos amino cargados positivamente en su estructura, el CHT es un
biomaterial hemostático autoadhesivo, con la capacidad de unirse a las membranas
celulares. En combinación con factores de crecimiento, el CHT puede usarse con éxito para
la curación de defectos óseos [60]. Puede usarse sólo o en combinación con otros
materiales en forma de nanofibras para proporcionar las señales estructurales y
bioquímicas, y promover la regeneración ósea [28].
Por medio de estudios in vivo e in vitro se ha demostrado que incrementa la osteogénesis,
y posee propiedades osteoconductivas. Su naturaleza catiónica también permite la
interacción electrostática con los glicosaminoglicanos (GAGs) y otros proteoglicanos, lo cual
es importante, ya que se sabe que los GAGs controlan las acciones de algunas citocinas y
factores de crecimiento [61].
Muzzarelli y col. fueron los primeros en reportar el uso del quitosano para regeneración
ósea in vivo. Implantaron un gel de quitosano ascorbatado y membranas de quitosano en
defectos craneales en gatos; reportando osteogénesis en el los andamios de quitosano [62].
Actualmente, existen varias investigaciones que indican el papel que desempeña el CHT
para mejorar la adhesión celular, la proliferación, la diferenciación de osteoblastos y la
mineralización ósea (Tabla 1.1).
A pesar de que en la literatura se cuenta con una gran cantidad de antecedentes que
señalan que el CHT es un biomaterial aceptable para aplicaciones de ingeniería de tejidos,
existen varios trabajos de investigación que reportan la ineficacia del CHT en la misma.
Dichos estudios sugieren que el potencial de reparación del CHT por sí solo es dudoso,
debido a su baja biodegradabilidad, osteoconductividad limitada y a la generación de tejido
conjuntivo fibroso y células inflamatorias en el neotejido formado [63]. Sin embargo, estos
estudios también señalan que al emplearlo en combinación con biomateriales más
biodegradables y biocompatibles, así como con factores de crecimiento, podría mejorar su
14
potencial de reparación y biocompatibilidad [60]. La aplicación del CHT como soporte
interno durante un largo período (generalmente de 2 a 6 meses) no ha sido fácil de llevar a
cabo, en comparación con otros polímeros biocompatibles como el colágeno y el poli(ácido
láctico-co-glicólico), una de las posibles razones es su grado de desacetilación, que se
cree, está directamente correlacionado con su propiedad de biocompatibilidad [57].
No obstante, los resultados obtenidos por los diferentes grupos de investigación no son
equiparables debido a la diversidad de derivados de quitosano, líneas celulares, métodos
utilizados, etc. [63].
Se han empleado esponjas de quitosano, en ingeniería de tejidos óseos, como material de
relleno. Las esponjas no son más que espumas con una porosidad abierta. Estas
estructuras sólidas pueden absorber una gran cantidad de fluidos (más de 20 veces su peso
seco), debido a su microporosidad. Por lo general, ofrecen una buena interacción celular,
siendo suaves y flexibles. Las esponjas de quitosano se utilizan principalmente como
materiales de curación de heridas, ya que pueden absorber los exudados de la herida, al
tiempo que ayudan a la regeneración del tejido [16]. Estas esponjas se obtienen,
principalmente, mediante liofilización, un proceso simple y eficaz que consiste en congelar
una solución de quitosano seguida de la sublimación del disolvente a presión reducida [16].
La técnica de liofilización es una de las más utilizadas para aplicaciones de ingeniería de
tejidos para obtener andamios [64]. Estas estructuras proporcionan un entorno apropiado
para la unión de las células, el crecimiento y la formación final de nuevos tejidos [65], [66].
A pesar de que el quitosano ha sido un polímero ampliamente estudiado, aún se
desconocen muchas de sus propiedades. Es importante conocer el comportamiento del
material en relación con sus propiedades térmicas debido a que podría someterse a altas
temperaturas; por ejemplo, para procesos de esterilización, en ocasiones la temperatura
programada llega a 120ºC, por lo que la temperatura no debe reducir la estabilidad de la
película [67]. Sin embargo, las propiedades de superficie que determinan la respuesta de
las células después de la implantación del material son las más importantes. Una superficie
hidrofílica permite la adhesión de las células y, como resultado, mejora la compatibilidad de
la película con los tejidos circundantes [68].
El quitosano y otros polímeros solubles acuosos, por ejemplo, alginato de sodio, gelatina y
poli(alcohol vinílico) han disminuido su solubilidad después de la interacción con
formaldehído o glutaraldehído; sin embargo, estos agentes entrecruzantes son tóxicos y los
residuos en el producto final pueden causar reacciones adversas en la piel y las membranas
15
mucosas. Un método alternativo para aumentar la resistencia al agua de los polímeros
solubles acuosos es someter los polímeros a tratamiento térmico [55].
1.3.1 Quitosano y tratamientos térmicos
Existen polisacáridos que forman complejos cristalinos con moléculas de agua debido a su
naturaleza anfifílica. Algunos polisacáridos tales como el almidón y la quitina se presentan
de forma natural como cristales hidratados. En estos cristales, se considera que las
moléculas de agua forman puentes de hidrógeno con las moléculas de polisacáridos [44].
La hidratación causa cambios en sus propiedades físicas y morfológicas; por lo tanto, es
importante entender sus roles biológicos in vivo, sus propiedades y procesabilidad como
materiales [69].
Los polisacáridos tienen afinidad por el agua y, dependiendo de su estructura, pueden
establecerse diferentes interacciones entre el agua y sus cadenas, por lo que pueden
perder agua a diferentes temperaturas dependiendo de las interacciones. Ostrowska-
Czubenko et al [70] reportaron que el quitosano existen tres tipos diferentes de agua
dependiendo de las interacciones: agua libre que se libera a aproximadamente 40–60°C;
agua unida a través de enlaces de hidrógeno, que se libera a 80-120°C, y; a temperaturas
más altas hasta 160°C se libera el agua más fuertemente unida a través de interacciones
polares con grupos carboxilo.
Cabe destacar que las propiedades físicas y químicas del quitosano pueden verse
significativamente alteradas por la presencia de pequeñas cantidades de agua [71].
Además, el quitosano es un material semicristalino; la estructura cristalina polimorfa del
quitosano fue reportada por primera vez por Sakurai; al calentar el quitosano, las formas
hidratadas se convirtieron en forma anhidra o “recocida”[72]. Estos cambios en la estructura
del quitosano durante el proceso de calentamiento pueden afectar las propiedades de
relajación del material [73].
El quitosano es un polisacárido semicristalino que contiene una fracción amorfa
considerable. Un parámetro importante del estado amorfo es la temperatura de transición
vítrea la cual se acompaña de cambios significativos en las propiedades físicas [74]. Existe
una controversia en la comunidad científica sobre si el quitosano exhibe una temperatura
de transición vítrea (Tg). Algunos autores, mediante el empleo de varias técnicas, incluida
la calorimetría diferencial de barrido (DSC) y el análisis térmico mecánico-dinámico (DMTA),
han reportado valores de Tg de 30 a 222ºC, mientras que otros no observan la transición
16
vítrea mediante DSC y DMTA. [74] Sakurai et al. por medio de DSC y DMTA asignaron
una Tg de 203ºC en películas no neutralizadas, sin embargo, otros estudios, basándose en
análisis de TGA, DSC y mediciones dieléctricas, señalan que este valor está muy cerca de
la degradación química. Realizaron dos ciclos de calentamiento y enfriamiento calentando
hasta 180ºC; sin embargo, la degradación del quitosano comienza a 170º C [75]–[77].
En algunos polímeros, el fenómeno de transición vítrea se ha relacionado con los procesos
de relajación dieléctrica a través de la ecuación de Vogel-Fulcher-Tammann (VFT). Las
propiedades físicas y químicas del quitosano pueden verse significativamente modificadas
por la presencia de pequeñas cantidades de agua. Los polisacáridos tienen una gran
afinidad por el agua y, por lo tanto, pueden hidratarse fácilmente formando macromoléculas
con estructuras bastante desordenadas [78]. Como se informa en la literatura, en estos
biopolímeros, el agua puede estar presente en tres estados: (1) agua que no puede
congelarse a 0°C, (2) agua enlazada pero congelable, y (3) agua libre, con comportamiento
normal (congelación a 0ºC) [79].
La degradación térmica del quitosano ocurre principalmente a través del mecanismo de
radicales libres. Los productos radicales intermedios pueden recombinarse
espontáneamente dando como resultado la formación de estructuras reticuladas. Tales
redes reticuladas son más estables que las cadenas lineales y, por lo tanto, pueden estar
presentes en el residuo carbonoso después de que el quitosano es expuesto a altas
temperaturas [80].
Los fuertes eventos exotérmicos en presencia de O2 indican que tiene lugar una oxidación
eficiente, seguida de una descomposición adicional del quitosano oxidado. Estas etapas
con alta pérdida de peso se atribuyen a una escisión de la cadena muy eficiente, con la
formación de productos de degradación volátiles. El primer pico exotérmico aparece a
282ºC, mientras que el pico principal, aparece alrededor de 430ºC, debido a una oxidación
eficiente. El rendimiento de la degradación térmica en condiciones oxidantes es muy alto,
ya que solo un 4% de residuo carbonoso se encontró a 600ºC [80].
El calor puede cambiar las propiedades físicas del quitosano afectando su solubilidad en
agua, reología y apariencia [81]–[83]. De acuerdo con Rivero et al [84] , el tratamiento
térmico de películas de quitosano conduce a un cambio estructural caracterizado por picos
situados en 2Ө a 15º y 20º [85].
En la presente investigación se llevó a cabo la caracterización del quitosano empleando 2
temperaturas de secado, 1) temperatura ambiente (TA) a 25ºC y 2) con un secado adicional
17
a 150ºC, dicha temperatura se seleccionó con base a la Tg reportada en estudios previos y
analizada en las muestras. La finalidad fue conocer cómo afectan estas variaciones de
temperatura en la cristalinidad y biocompatibilidad del polímero.
1.4 Polietilenglicol Diglicidil Éter
La interacción entre los materiales y las células huésped es un factor clave para determinar
la biocompatibilidad de un material, mientras que la elección del agente de
entrecruzamiento marca la diferencia en la citocompatibilidad del material [14]. Existe una
demanda creciente de un método de entrecruzamiento, que no sea no tóxico en
aplicaciones biomédicas y así mismo pueda mantener la biocompatibilidad, mejorar la
solubilidad en agua y las propiedades mecánicas de los materiales [86]. Cuando el
quitosano se entrecruza o se mezcla con otros polímeros, su comportamiento en el agua y
las propiedades fisicoquímicas pueden mejorar considerablemente [87].
El entrecruzamiento es un paso útil para preparar un andamio con mejor estabilidad y
degradación más prolongada. Se han utilizado varios agentes entrecruzantes en ingeniería
de tejidos, incluidos el formaldehído, el glutaraldehído, las carbodiimidas, la genipina y el
polietilenglicol diglicidil éter [88]. El poli (etilenglicol) diglicidil éter (PEGDE) se usa
ampliamente como entrecruzante de polímeros que contienen grupos amina, hidroxilo o
carboxilo [89].
El polietilenglicol (PEG) también conocido como poli (óxido de etileno), es un poliéter
sintético anfifílico y soluble en agua, así como en muchos disolventes orgánicos, incluyendo
etanol, acetona, tolueno y cloroformo. Se ha encontrado que este polímero no es tóxico y
es aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) de EE.UU., para su uso como
excipiente o como portador en diferentes formulaciones farmacéuticas, alimentos y
cosméticos. Además, se conoce que la mayoría de los PEGs con pesos moleculares (Mw)
<1,000 daltons pueden ser eliminados rápidamente del cuerpo humano después de su
consumo, lo que contribuye a su amplio uso en la investigación biomédica, administración
de fármacos, andamios para ingeniería de tejidos, entre otras aplicaciones [90], [91]. El
PEG posee un carácter muy hidrófilo lo que restringe la adhesión de proteínas y células,
pero mediante el uso de PEG en un copolímero, se mejora la biocompatibilidad de la
composición del polímero [92].
La amplia gama de grupos terminales disponibles, por ejemplo, azida, biotina, tiol, ácido
carboxílico, hidroxilo, y epoxi, también mejora el uso generalizado de los PEG en la
18
investigación biomédica y biomateriales. El PEG es conocido por su reactividad frente a
grupos hidroxilo y, por lo tanto, se ha empleado como un entrecruzante en oligosacáridos y
polisacáridos debido a su hidrofilicidad y biocompatibilidad con baja biodegradabilidad. Es
un material adecuado para aplicaciones biológicas debido a que generalmente no provoca
una respuesta inmune [90], [93], [94].
En el PEGDE es fácil de llevar a cabo la hidrólisis y la reacción de escisión del anillo en
solución acuosa para producir grupos hidroxi. Se emplea como entrecruzante y modificador
de superficies y posee una buena solubilidad en agua. El PEGDE posee una baja toxicidad
y es de bajo costo [89], [95].
El PEGDE puede emplearse como agente entrecruzante dependiendo de, si uno o ambos
de los grupos epóxidos funcionales reaccionan con los grupos amina libres y/o con los
grupos hidroxilo. Mediante el uso de PEGDE como entrecruzante, el quitosano puede
volverse insoluble en medios ácidos y su hinchamiento en agua se reduce. La modificación
química por entrecruzamiento o mezcla química mejora las propiedades de estabilidad y
mecánicas de dicho polímero [96], [97]. Se ha empleado como entrecruzante del quitosano
debido a que puede desempeñar una doble función: retención de agua y entrecruzante, lo
que da lugar a hidrogeles con diferente afinidad por el agua, dependiendo de la
concentración empleada de PEGDE [98].
Se ha reportado que los andamios de quitosano/PEGDE poseen actividad antimicrobiana
significativa contra Staphylococcus aureus así como actividad pro-angiogénica [98].
También se ha empleado PEGDE para inmovilizar proteínas en biosensores de
microelectrodos basados en glucosa oxidasa, d-aminoácido oxidasa y glutamato oxidasa.
Los biosensores hechos con PEGDE exhiben una alta sensibilidad y un tiempo de
respuesta del orden de segundos, que es suficiente para observar procesos biológicos in
vivo [89].
1.5 Ácido hialurónico
El ácido hialurónico, fue aislado por primera vez del humor vítreo de los ojos por Meyer en
1934 [99], [100]. Demostró que esta sustancia contenía un ácido urónico y un aminoazúcar,
por lo que se le otorgó el nombre de "ácido hialurónico" o “Hialuronato”, lo que refleja el
hecho de que existe in vivo como un polianión y no en forma de ácido protonado. Es un
glicosaminoglicano ya que cada unidad de glucuronato lleva una carga aniónica a pH
19
fisiológico; las cargas negativas asociada con su grupo carboxilato están equilibradas por
cationes móviles como el sodio [8].
El ácido hialurónico es un polisacárido mucoadhesivo natural, compuesto de unidades de
repetición alternadas de ácido d-glucurónico (GlcA) y N-acetil-d-glucosamina (GlcNAc)
unidas entre sí a través de enlaces β-(1,4) y β-(1,3) [101].
La estructura química del ácido hialurónico (figura 1.2) posee tres grupos funcionales que
pueden modificarse fácilmente por medio de reacciones covalentes: el ácido carboxílico de
la unidad GlcA, el grupo hidroxilo primario de GlcNAc (aunque los grupos hidroxilo
secundarios también pueden ser reactivos) y, el grupo amina de GlcNAc formado después
de una reacción de desacetilación. Los grupos hidroxilo pueden modificarse químicamente
mediante la formación de un enlace éter o éster, mientras que los grupos carboxilo y amina
pueden formar nuevos enlaces éster y amida respectivamente [102].
El ácido hialurónico está presente en el cuerpo, en la piel, humor vítreo, cartílago y líquido
sinovial. Se utiliza como factor de diagnóstico para muchas enfermedades, como tumores,
artritis reumatoide y enfermedades hepáticas [100], [103].
Figura. 1.2. Estructura molecular del ácido hialurónico
El ácido hialurónico desempeña un papel importante en el mantenimiento de la lubricación
de las articulaciones, en la hidratación de los tejidos, el movimiento, la diferenciación y la
división de las células. En comparación con otros polímeros naturales y polímeros
sintéticos, tiene mucha más capacidad de retención de agua, hasta mil veces su propio
volumen. Se ha demostrado que el ácido hialurónico desempeña un rol importante en la
realización de funciones biológicas, especialmente para células sin suministro sanguíneo
directo, como las células de cartílago [11].
Es un polímero natural biocompatible y biodegradable con un esqueleto lineal de agrecano
que es el proteoglicano predominante en el cartílago [104]. Recientemente, el AH ha sido
20
reconocido como un soporte importante para la creación de nuevos biomateriales con
utilidad en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa [52]
El ácido hialurónico puede modificarse de muchas maneras para alterar las propiedades de
los materiales resultantes, incluidas las modificaciones que conducen a la hidrofobicidad y
la actividad biológica. Las modificaciones químicas del ácido hialurónico se han revisado
exhaustivamente y se dirigen a los siguientes grupos funcionales: el ácido glucurónico,
ácido carboxílico, los grupos hidroxilo primarios y secundarios y el grupo N-acetilo (después
de la desamidación) [105]. La conformación del ácido hialurónico en solución se estabiliza
mediante enlaces de hidrógeno intramoleculares, lo que da como resultado una
conformación del polímero relativamente rígida. Los enlaces de hidrógeno intramoleculares
se rompen por la presencia de NaOH y/o por la temperatura, dando como resultado una
conformación más flexible.
Cuando el pH se reduce a 2.5, el ácido hialurónico forma un gel debido a la disminución en
la disociación de carboxilato que favorece la interacción intermolecular; sin embargo, una
disminución adicional del pH da como resultado una transición de gel a solución,
probablemente relacionada con la protonación de grupos acetamido que causa una
repulsión electrostática. Del mismo modo, un aumento del pH por encima de 3 convertirá el
gel débil formado a un pH 2.5, en una solución. Como el AH es un polímero natural, se
modifica químicamente o se entrecruza covalentemente para formar un gel menos
degradable para su uso en aplicaciones biomédicas [106].
Los derivados del ácido hialurónico se dividen en dos categorías principales: "monolítico" y
"vivo". Los derivados monolíticos del ácido hialurónico son formas de ácido hialurónico
"modificadas terminalmente" que no pueden formar nuevos enlaces químicos en presencia
de células o tejidos, y deben procesarse y fabricarse en diferentes formas. Por el contrario,
los derivados vivos de ácido hialurónico pueden formar nuevos enlaces covalentes en
presencia de células, tejidos y agentes terapéuticos. En la mayoría de los casos, se
requieren derivados de ácido hialurónico vivos para usos clínicos y preclínicos en cultivos
de células 3D y experimentos in vivo [107].
Entre las propiedades del ácido hialurónico destaca su viscoelasticidad, lo que permite su
uso en diversas aplicaciones biomédicas, tales como relleno de tejidos blandos,
regeneración de cartílago y tratamiento de osteoartritis.[108].
El ácido hialurónico, tiene una alta capacidad de absorción y retención de agua, lo que
influye en varias funciones celulares [88].
21
El ácido hialurónico ofrece muchas ventajas como andamio en ingeniería tisular entre las
que destacan: biodegradabilidad, biocompatibilidad, biodegradación propiedades
mucoadhesivas e hidrofílicas; es un componente intracelular importante de los tejidos
conectivos donde juega un papel importante en la lubricación, la diferenciación celular y el
crecimiento celular, y estas funciones pueden transferirse al andamio; contiene grupos
funcionales (ácidos carboxílicos y alcoholes) que pueden usarse para introducir dominios
funcionales o para formar un hidrogel [102].
Mediante el ácido hialurónico se pueden crear andamios para ingeniería de tejidos, que
sean bioactivos, tanto en su longitud total como en su forma degradada; además exhibe
una baja adsorción inespecífica de proteínas y las interacciones específicas entre el
andamio y las células en crecimiento se pueden adaptar utilizando receptores celulares
(CD44, RHAMM, ICAM-1) para mejorar el crecimiento y la reparación de los tejidos [8].
Dependiendo de la técnica de procesamiento, los andamios se pueden preparar en forma
de hidrogeles, esponjas, criogeles e hidrogeles inyectables [23]. Se ha reportado que los
andamios fabricados con ácido hialurónico pueden inducir o promover la diferenciación
celular de células troncales [109].
Una las desventajas del ácido hialurónico es que carecen de estabilidad mecánica contra
la degradación por hialuronidasa y especies reactivas de oxígeno (ROS) [110] Esta
limitación da como resultado una baja funcionalidad bioquímica para la unión y proliferación
celular [111].
También se han elaborado andamios de ácido hialurónico modificados con fosfatos de
calcio para obtener cementos óseos reforzados y / o inyectables [112]. Por ejemplo,
Subramaniam et al [113] demostraron que el ácido hialurónico combinado con hidroxiapatita
y con sulfato de calcio puede emplearse como sustituto del hueso alveolar.
El ácido hialurónico se usa ampliamente en el campo biomédico, por ejemplo, en cirugía
oftálmica, tratamiento artrítico y rellenos dérmicos, así como en ingeniería de tejidos. Sin
embargo, debido a su incapacidad para formar geles físicos en un amplio rango de pH y su
rápida degradación por las hialuronasas que existen en el cuerpo, se recomienda emplearlo
entrecruzado o en presencia de otro material. [106]
Los grupos funcionales disponibles para el entrecruzamiento son los grupos hidroxilo y
carboxilo. Se ha logrado el entrecruzamiento exitoso del ácido hialurónico en películas
usando, entre otros, 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), glutaraldehído
22
(GA), poli (etilenglicol) diglicidil éter (PEGDE) y divinil sulfonato (DVS) como entrecruzantes
[8].
Se ha demostrado la efectividad del ácido hialurónico entrecruzado con polietilenglicol
diglicidil éter (PEGDE) para fines biomédicos y de crecimiento celular [114], [115]. El
PEGDE contiene grupos epóxido en ambos extremos y se ha usado ampliamente con
entrecruzante con biopolímeros que poseen grupos hidroxilo y amino. Dado que los grupos
hidroxilo en las moléculas de ácido hialurónico pueden reaccionar con el PEGDE, se forman
entrecruzamientos intermoleculares durante la gelificación, lo que puede generar la
formación de una red de AH tridimensional [116].
El ácido hialurónico se ha empleado en andamios en ingeniería tisular para promover la
regeneración de tejido óseo [24]. Se ha investigado su aplicación para cráneo [117], [118]
y hueso alveolar [113], [119]. Diversos estudios (Tabla 1.1) han reportado mejoras en las
propiedades mecánicas y de biocompatibilidad cuando el quitosano se emplea en
combinación con ácido hialurónico [120].
En virtud de lo mencionado anteriormente, uno de los objetivos de este estudio fue
investigar la efectividad de los andamios fabricados de quitosano modificados con
hialuronato de sodio para la aplicación de ingeniería de tejidos.
23
Tabla 1.1 Ejemplos de andamios a base de quitosano, ácido hialurónico y quitosano/ácido hialurónico para ingeniería tisular ósea reportados en la literatura
Referencia Año Biomaterial Células-Tejido Principales resultados Yang [17] 2009 Nanofibras de
policaprolactona (PCL) y quitosano
Osteoblastos MC 3T3 E1
Adhesión y proliferación de células MC 3T3-E1, depósito de calcio, actividad de la fosfatasa alcalina (ALP), formación uniforme de tejido con mineralización significativa a los 21 días.
Patterson [118] 2010 Hidrogel de AH/BMP-2 Calota de rata Mineralización ósea en seis semanas. Park [121] 2011 Poli (ácido láctico-co-
glicólico) AH (HA-PLGA) BMP-2 / poli (etilenglicol).
Osteoblastos, defectos óseos de la calota de ratas Sprague Dawley (SD)
Proliferación de osteoblastos in vitro e in vivo, altos niveles de expresión génica de fosfatasa alcalina y osteocalcina.
Arakaw [122] 2014 Hidrogel de metacrilato glicol quitosano (MeGC) y colágeno
Células estromales de médula ósea (BMSC) de ratón
Unión celular, diseminación, proliferación y diferenciación osteogénica, actividad de la fosfatasa alcalina (ALP), mineralización.
Miranda [123] 2015 Hidrogel de CHT/AH NIH3T3 y MG63 Aumento significativo en la viabilidad celular y alta expresión de CD44
Do Yoon [124] 2016 Hidrogeles de AH con peryodato de sodio y quitosano
ATDC5 Viabilidad celular in vitro, biocompatibilidad y durabilidad en condiciones fisiológicas.
Hyun-Ji [119] 2016 Hidrogel de catecol/AH Células madre Angiogénesis y diferenciación osteogénica, formación ósea mineralizada, expresión de marcador osteogénico en defectos óseos.
Subramaniam [113]
2016 Hidroxiapatita, sulfato de calcio hemihidratado, AH y colagenasa (HAP/CS/HA-Col)
Hueso alveolar de rata
Neoformación ósea con morfología de hueso maduro.
Zhu [125] 2016 Hidrogeles de AH con N-Cadherina
Células madre mesenquimales humanas (hMSCs)
Promoción de la actividad de fosfatasa alcalina, la deposición de colágeno tipo I y la mineralización de la matriz, osteogénesis y adhesión celular de osteoblastos.
Demirtras [126] 2017 CHT/hidroxiapatita Osteoblastos MC3T3-E1
Viabilidad celular, niveles máximos de expresión para marcadores osteogénicos en etapas tempranas y tardías. Mineralización y diferenciación osteogénica después de 21 días de cultivo.
Kutlusoy [11] 2017 Criogeles de CHT-co-AH
Células 3T3 fibroblastos y SAOS-2.
Mejora en las propiedades mecánicas y biocompatibilidad del quitosano puro
Hamlet [127] 2017 Policaprolactona (PCL) con osteoblastos encapsulados en hidrogeles de AH
Osteoblastos humanos, BMP-7, rata atímica
Viabilidad celular, formación de matriz de colágeno mineralizada después de 6 semanas.
Chun Liu [128] 2018 Hidrogel de glicol CHT/AH oxidado
Células madre mesenquimales de médula ósea, defectos en cartílago de ratas
Reparación de defectos de cartílago de las ratas, formación de tejido con niveles altos de glucosaminoglucanos (GAG) y colágeno tipo II in vitro e in vivo.
Demir [129] 2018 Composite CHT/montmorillonite
Osteoblastos humanos (hOBs)
Proliferación de osteoblastos.
Sharif [130] 2018 Nanofibras PCL/carboximetil quitosano
Osteoblastos humanos MG63
Proliferación celular especialmente a concentraciones máximas de quitosano.
Ranganathan [131]
2019 CHT/ Gelatina Defectos óseos en cráneos de ratas
Neo-formación ósea. Regeneración ósea in vivo.
Koca [132] 2019 Hueso cortical humano liofilizado, AH
Calota de rata Mineralización en defectos óseos.
24
CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Materiales
Quitosano (CHT) con un peso molecular de 183,364 gmol-1, (determinado
experimentalmente [133]) y un grado de desacetilación del 84% (Número de lote:
STBF4197V proporcionado por el proveedor), polietilenglicol diglicidil éter (Mn promedio
500) y solución de glutaraldehído (GA) Grado II, 25% en H2O fueron adquiridos de Sigma-
Aldrich (Saint Louis, MO, EE. UU.). Hialuronato de sodio grado oral, peso molecular bajo,
fue adquirido de Bioibérica (Barcelona, España). El ácido acético, ácido clorhídrico y el
peróxido de hidrógeno fueron proporcionado por J.T. Baker. El hidróxido de sodio, la
lisozima, LZ (Catalogo No. L6876) y el BES (N, N-Bis(2-hydroxyethyl) taurina) se obtuvieron
de Sigma-Aldrich. El buffer fosfato salino PBS (PBP07-10LT), lote 11160007, de Caisson
labs.
Para los ensayos biológicos se emplearon MTS CellTiter 96® Proliferación celular acuosa
no radioactiva obtenida de Promega (Madison, WI, EE. UU.), medio de Eagle modificado
de Dulbecco (DMEM) de Biowest (Riverside, MO, EE. UU.), osteoblastos humanos
hFOB1.19 de ATCC® CRL-11372 ™ (Manassas, VA, EE. UU.), kit LIVE/DEAD™ Molecular
Probes™ ThermoFisher SCIENTIFIC. La Integrina β1 (A-4): sc-374429, vinculina (7F9)
sc-73614 y anticuerpos (IgG de ratón: sc-3891 SCBT) se adquirieron de Santa Cruz
Biotechnology (Dallas, TX, EE. UU.)
2.2 Métodos
2.2.1 Preparación de películas de quitosano sin agente entrecruzante, entrecruzadas
con GA (glutaraldehído) y polietilenglicol diglicidil éter (PEGDE) secas 25°C y 150°C
Se disolvió quitosano (200 mg) en 30 ml de en ácido acético 0.4 M. Esta solución se agitó
en una placa agitadora magnética a 100 rpm a 25°C, durante una hora hasta obtener una
solución clara. Posteriormente, se vertieron 25 ml de la solución en placas de Petri de
plástico, dejándolas secar a 25°C durante 7 días aproximadamente. Las películas
resultantes se neutralizaron con una solución de hidróxido de sodio (5% en peso), se
lavaron con agua destilada y se secaron a 25°C durante aproximadamente 24 h. Las
25
películas de quitosano entrecruzado se obtuvieron de manera similar, adicionando 0.3744
mmol (150 µL) de glutaraldehído ó 0.114 mmol (50 µL), 0,228 mmol (100 µL) y 0,342 mmol
(150 µL) de PEGDE. Esto se denominará PEGDE1, PEGDE2 y PEGDE3, respectivamente.
Dichas soluciones se mantuvieron en agitación durante 5 h hasta la completa
homogeneización de la mezcla. Después se vertieron las soluciones en placas de Petri de
plástico y se secaron a 25°C. Las películas obtenidas después de la evaporación del
disolvente se neutralizaron con NaOH al 5% en peso y se enjuagaron con agua destilada.
Otro lote de películas de quitosano con y sin entrecruzamiento fueron tratadas
térmicamente a 150°C durante 24 h en condiciones de vacío.
2.2.2 Preparación de espumas de quitosano sin agente entrecruzante, entrecruzadas
con GA y PEGDE
Se prepararon espumas para los estudios de citotoxicidad, debido a que por su porosidad
poseen una arquitectura similar a la del tejido a reparar. Para la preparación de las
espumas se siguió la misma metodología descrita en la sección 2.1.1 Las soluciones de
quitosano con y sin entrecruzante se secaron parcialmente a temperatura ambiente (25ºC
+/- 1) durante 5 días y se congelaron durante 48 horas, previas a la liofilización. Las
condiciones para la liofilización fueron 0.024 mBar a -52ºC. Se empleó una liofilizadora
FreeZone 4.5 litros -50C Benchtop, LABCONCO. Posterior a la liofilización, las espumas
se enjuagaron con NaOH al 5% y agua destilada para su neutralización.
2.2.3 Preparación de películas de quitosano y hialuronato de sodio, quitosano-ácido
hialuronato de sodio entrecruzado con glutaraldehído y quitosano-hialuronato de
sodio entrecruzados con polietilenglicol diglicil éter
Se estudiaron 2 concentraciones de hialuronato de sodio (HNa) 15% y 30%. Las películas
se obtuvieron mediante la disolución de 100 mg de quitosano en 20 ml ácido acético al 0.4
M. La solución se agitó durante una hora hasta obtener soluciones claras; a continuación,
se añadieron 30 mg y 60 mg de HNa correspondientes a concentraciones de 15% y 30%
respectivamente, dispersos en 10 ml de agua destilada. La solución se dejó en agitación
durante 1 hora, posteriormente se vaciaron en placas Petri de plástico, se secaron a
temperatura ambiente (25°C) durante aproximadamente 7 días, hasta la completa
evaporación del ácido acético. Las películas obtenidas fueron neutralizadas con NaOH al
5%. Se enjuagaron con agua destilada y dejaron secar a 25°C durante 24 horas.
26
Al igual que para la obtención de las películas sin entrecruzante, se probaron
concentraciones de HNa del 15% y 30%, siguiendo la misma metodología de la sección
2.2.1 variando únicamente la incorporación de las soluciones entrecruzantes (0.3744 mmol
(150 µL) de glutaraldehído ó 0.114 mmol (50 µL), 0,228 mmol (100 µL) y 0,342 mmol (150
µL) de PEGDE.). Las soluciones se vaciaron en placas Petri de plástico, se secaron a
temperatura ambiente (25°C) durante aproximadamente 7 días, hasta la evaporación del
ácido acético residual y la obtención de las películas. Dichas películas se lavaron con NaOH
al 5% para su neutralización y se enjuagaron con agua destilada. Para finalizar se secaron
a 25°C durante 24 horas.
2.2.4 Caracterización fisicoquímica de las películas de quitosano, quitosano-GA,
quitosano-PEGDE, quitosano-HNa, quitosano-HNa-GA, quitosano-HNa-PEGDE
Determinación de grupos de amino libres
Se depositó quitosano entrecruzado (0.125 g) en 25 ml de una solución acuosa de HCl 0,1
M y se dejó durante 20 h para permitir la protonación de los grupos amino. Posteriormente,
la solución se tituló con una solución de NaOH al 0.1M y se midió el pH con un medidor de
pH pH-Ion 510 (OAKTON Instruments, Vernon Hills, IL, EE. UU.). Se repitió el mismo
procedimiento con películas de quitosano puro. El porcentaje de grupos amino libres en la
muestra se calculó con las ecuaciones (1) y (2) [134].
���% = ���� � �� �.��� � ���������%���� � Ec. 1.
���% ���� = ��� %�.��%� � 100 Ec. 2.
Donde C1 es la concentración de HCl, C2 es la concentración de NaOH, V1 es el volumen
de la solución de HCl, V2 es el volumen de la solución de NaOH añadida durante la
valoración, 0.016 es el contenido de NH2 en g/mL de HCl al 0.1M, w es la masa de la
muestra (g). El porcentaje de contenido teórico de NH2 en el quitosano se consideró como
9.94% [34]. El contenido de agua (w) se calculó por la pérdida de masa de la muestra antes
y después del secado a 150°C utilizando el termograma de análisis termogravimétrico
(TGA) [135].
27
FTIR
Los espectros infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) de las películas se obtuvieron
utilizando el espectrómetro Thermo Scientific Nicolet 8700 FT-IR (Madison, WI, EE. UU.),
con cristal de seleniuro de zinc (ZnSe) para reflectancia total atenuada (ATR). Los espectros
se adquirieron en el intervalo espectral de 4000 y 650 cm-1 con un promedio de 100
exploraciones con una resolución de 4 cm-1 con corrección de H2O y CO2.
Raman
Cuando la muestra lo permitió (películas de CHT modificadas con AH), se obtuvieron los
espectros por Raman empleando un equipo InVia™ Raman microscope Renishaw (Wotton-
under-Edge, Gloucestershir). Se utilizó el láser de 633 nm a una potencia de 50% y se
analizó en el intervalo espectral de 100 a 3200 cm-1 con 2 acumulaciones, rejilla de 1800,
objetivo 50X, con un tiempo de exposición de 10 s.
DSC
El análisis de Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) se realizó para conocer el
comportamiento térmico del quitosano cuando ésta era calentada a una tasa específica,
para la posible observación de alguna transición de baja temperatura en los materiales La
prueba se llevó a cabo en un DSC Diamond Perkin Elmer (fig. 4). Las muestras de 5 mg de
peso fueron colocadas en una charola de aluminio y se sometieron a un programa de
calentamiento en un intervalo de 30 a 250 °C con una rampa de 10°C/min, en atmósfera de
nitrógeno.
TGA
El análisis termogravimétrico (TGA) se realizó en un TGA 8000™ de Perkin-Elmer
(Waltham, MA, EE. UU.) Se empleó una muestra de 5-10 mg por cada película. El intervalo
de la temperatura de calentamiento fue de 50 a 700°C a 10°C/min bajo flujo continuo de
nitrógeno seco. Se reporta la masa residual contra temperatura y la primera derivada de la
masa residual contra temperatura.
28
DRX
Los patrones de difracción de rayos X (DRX) de las películas se registraron utilizando un
difractómetro de rayos X avanzado Bruker D-8 (Karlsruhe, Alemania). El voltaje, la corriente
y el tiempo de paso fue de 40 mV, 55 mA y 6 s, respectivamente. El índice de cristalinidad
(CrI020) se calculó utilizando la siguiente ecuación:
CrI��� = [�I��� − I'(�/�I����]x100 Ec. 3.
Donde I020 es la intensidad máxima por debajo de 13° y Iam, la intensidad de difracción
amorfa a 16° [136].
Esta ecuación fue empleada ya que se intentó calcular la cristalinidad con la fórmula
reportada por Focher [137] pero debido a la presencia de múltiples picos, y a la baja
intensidad del pico Iam, los resultados no fueron concluyentes.
Se calculó la distancia intermolecular (d-spacing) de cada película a partir de la ley de Bragg
(ecuación 4):
nλ= 2d �sin� θ Ec. 4.
Donde:
n: número entero (n=1)
λ: constante de longitud de onda (1.54 Å) de la radiación
θ: es el ángulo de la difracción exhibido por el polímero
de donde d se obtiene como:
d = 34� 563 �7
� Ec. 6.
MEB
La morfología de las partículas fue definida mediante microscopía electrónica de barrido
(MEB). Las muestras se recubrieron con oro en un Denton Desk II Sputter Coater
(Moorestown, NJ, EE. UU.) (50 s, 40 mA). La morfología de la superficie de las películas se
examinó utilizando un microscopio JEOL, JMS 6360LV (Akishima Tokio, Japón) con un
voltaje de aceleración de 20 kV. Adicionalmente la composición elemental de las películas
fue obtenida mediante el microanálisis por energía dispersiva de Rayos X (EDX por sus
siglas en inglés), se empleó un equipo X-sight Model 7582 de Oxford Instruments
(Wycombe, Reino Unido), acoplado al MEB utilizando un haz de 20 keV.
29
XPS
Adicionalmente se realizó el análisis por espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS,
por sus siglas en inglés), para realizar dicho análisis se empleó un espectrómetro de
fotoelectrones de rayos X Thermo Scientific K-Alpha X-ray Photoelectron Spectrometer
(Waltham, MA, EE. UU.), con una fuente monocromática de Al Kα con una energía de
1486.6 eV sin erosión. El área elíptica de análisis tuvo un diámetro mayor de 0.4 mm. Los
espectros de inspección (survey) se adquirieron en un intervalo de energía de enlace de
0 a 1100 eV, utilizando una energía de paso de 50 eV. Se calculó la deconvolución de
los picos principales para la determinación de su composición elemental (at. %) mediante
el uso del programa es el avantage V 5.9902
AFM
La topografía de la superficie de las muestras se obtuvo mediante microscopía de fuerza
atómica utilizando un AFM de la marca Bruker modelo INNOVA SPM utilizando el modo
Tapping. Las imágenes se obtuvieron en aire a temperatura ambiente con una punta de
silicón comercial en forma de cantiléver, con una frecuencia de resonancia de 300 kHz. La
punta utilizada es la RTESP nanoprobe Bruker, con una constante de resorte de 40N/m y
8 nm de radio de la punta. La frecuencia de escaneo fue 0.5 Hz. Se llevó a cabo un análisis
estadístico para calcular la rugosidad de las muestras, el cual consistió en seccionar el área
escaneada de 100 µm x 100 µm en 4 subáreas de 50 µm x 50 µm, y la rugosidad fue
calculada para cada subárea usando el software Nanoscope Analysis. El promedio
estadístico y la desviación estándar de la rugosidad de cada tipo de muestra fue reportada
tomando en cuenta 12 mediciones.
Ángulo de contacto
Para la evaluación de los ángulos de contacto se usó un goniómetro / tensiómetro ramé-
hart modelo 250 con DROPimage Advanced v2.8 (Succasunna, NJ, EE. UU.). El ensayo se
realizó a temperatura ambiente (25°C). Se colocó una muestra de cada película, de 1cm x
6 cm, en un soporte móvil y se niveló horizontalmente. Se depositaron 5 µL de agua
destilada o medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) en la superficie de la película
usando una microjeringa. Se promediaron diez réplicas por muestra. La imagen de la gota
de agua o DMEM se capturó dentro de los 10 s posteriores al depósito.
30
Caracterización Mecánica
Las pruebas mecánicas de tensión se realizaron según la norma ASTM D882, usando una
máquina de pruebas universales MINI SHIMADZU con una celda de carga de 1 kN. La
prueba de tensión consistió en colocar la probeta entre dos mordazas, una fija y otra móvil
sujeta al cabezal de la máquina de pruebas universales, con una distancia entre mordazas
inicial de 25 mm. Se utilizaron probetas cortadas en forma de rectángulo, con un tamaño
de 5 mm de ancho, 50 mm de largo, y 0.1 mm de espesor, siguiendo las proporciones
indicadas en la norma, y se deformaron a una velocidad de 50 mm/min; la carga fue aplicada
hasta que el material falló. Las muestras fueron probadas por quintuplicado (n ≥ 5) para
cada material ensayado.
2.2.6 Pruebas de Degradación in vitro
Degradación química acelerada
Las pruebas de degradación in vitro se realizaron por reflujo a 100ºC durante 24 horas en
soluciones de H2O2 al 30%, HCl 2M, NaOH 5M, utilizando agua destilada como control. La
degradación química de las películas se llevó a cabo por triplicado para cada muestra
(quitosano, quitosano/GA, quitosano/PEGDE), siendo el peso inicial promedio de 50 mg.
Se emplearon 80 ml de cada una de las soluciones de estudio. Los residuos de la
degradación fueron lavados y secados a temperatura ambiente (25ºC) por un mínimo de 48
h; se realizó el cálculo de porcentaje de pérdida de masa mediante las ecuaciones 7 y 8.
%masa remanente = < =65> ?@3'A=65> @3@B@'AC 100 Ec. 7.
%masa perdida = <E'5' @3@B@'A�('5' ?@3'A('5' @3@B@'A C 100 Ec. 8.
31
Degradación enzimática
La degradación in vitro de la quitosana se estudió a 37ºC en PBS (pH 7.4) ya que es el
mismo que se encuentra en el suero humano [138], y BES (pH 6.4) por el pH salival (6.5 a
7), que contenían 1.5 mg/mL de lisozima (figura 2.1). Esta concentración fue elegida ya que
es la misma que se reporta para el suero humano. La solución de lisozima se cambió
diariamente para asegurar la actividad enzimática. Se colocaron andamios con una masa
aproximada de 10 mg en cajas de 24 pozos que contenían 1 mL de solución de lisozima y
se incubaron durante 21 días. Después de 7, 14 y 21 días, las muestras se retiraron del
medio y se enjuagaron con agua destilada. Los andamios se secaron a 60°C durante 24 h
y se pesaron. La degradación se expresó como pérdida de masa de los andamios mediante
la ecuación 8.
Figura. 2.1. Caja de 24 pozos con películas y lisozima para degradación enzimática
2.2.7 Estudios de viabilidad y proliferación celular
Cultivo celular (osteoblastos)
Para llevar a cabo este ensayo, se procedió en primer lugar a tripsinizar los cultivos
celulares (osteoblastos humanos ATCC hFOB1.19), agregando 2 ml de TrypLE™ Express
ThermoFisher Scientific, durante 10 min, y 2 ml de medio de cultivo DMEM (medio de Eagle
modificado por Dulbecco) Biowest adicionado con 10% Suero Fetal Bovino (SFB)
Biowest, antibióticos (500 U/ml Penicilina G, 500 mg/ml Estreptomicina), y antimicóticos
(1. 25 mg/ml Anfoterecina B), dentro de cajas Falcon de 25 ml. Seguidamente se decantó
la mezcla en tubos de ensayo estériles y se centrifugó para obtener un precipitado o pellet,
32
el cual se dispersó en una pequeña cantidad de medio de cultivo. A continuación, se
tomaron 50 μl de la suspensión celular obtenida, los cuales se incubaron en un tubo tipo
Eppendorf de 1.5 ml con un volumen equivalente (50 μl) de solución de azul tripán al 4%
durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se tomaron 10 μl de la mezcla
y se colocaron en la cámara de Neubauer.
La fórmula que se empleó para el calcular el número de células obtenidas fue la siguiente:
�F/4F̄10�10� Ec. 9.
Donde:
x̄= Promedio de las células contadas en la cámara de Neubauer
10= Dilución empleada entre las células y azul de tripán (10 μL de células, 90 μL azul de
tripán) 104= Constante (4 cuadrantes de la cámara)
Proliferación celular por MTS
Los estudios de viabilidad celular se realizaron usando el ensayo de proliferación celular
CellTiter 96® MTS. Se utilizaron muestras de 10 mg de peso de cada una de las películas
y de cada una de las espumas, para los ensayos de contacto directo. También se obtuvieron
extractos para los ensayos de contacto indirecto. La concentración de la muestra para la
obtención de los extractos fue de 2.5 mg/ml en medio de cultivo DMEM (medio de Eagle
modificado por Dulbecco) Biowest, según la guía práctica para preparación de muestras
y materiales de referencia, ISO 10993-12. [139] Se colocaron las muestras (por triplicado)
en cajas nuevas y estériles de 96 pozos, se esterilizaron con UV durante 15 minutos. Para
la prueba de contacto indirecto, los extractos reemplazaron el medio de cultivo en una placa
de 96 pocillos. Para ambas pruebas se emplearon osteoblastos, los cuales se sembraron
con una densidad de 2 x 103 células/andamios para contacto directo y 2 × 103 células/pocillo
para contacto indirecto. Las células sembradas se incubaron a 37°C, 5% de CO2 y 95% de
humedad durante 48 h. Para ambas técnicas (directa e indirecta) se incluyó un control
positivo que consistía en células con solo medio de cultivo (C+), un control negativo (C−) a
base de peróxido de hidrógeno, así como el blanco para la lectura el cual solo contenía
solución de MTS.
Posterior a las 48 horas, se añadieron a cada pozo 20 l de MTS CellTiter 96® AQueous
Non-Radioactive Cell Proliferation, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para las 34
muestras, se mezclaron 648 µL de MTS [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil)
-2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio] con 32 µL PMS (metosulfato de fenazina) previa
33
descongelación de dichos reactivos. Todo el procedimiento se realizó a 25 ° C y protegido
de la luz. Las soluciones de MTS se usaron inmediatamente después de la preparación. Se
dejó en incubación durante 3 horas. El valor de absorbancia se midió en un
espectrofotómetro de múltiples pozos (Thermo Scientific™) a 490 nm.
Análisis de adhesión celular mediante Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
En una placa de 24 pozos se sembraron 2 x 10^4células/ml (osteoblastos). Las células se
cultivaron sobre películas de 10 mg de peso para el análisis por contacto indirecto, o en 300
µL de los extractos obtenidos de cada muestra para el ensayo por contacto indirecto. Se
incubaron a 37°C, 5% de CO2 y 95% de humedad durante 48 h. Después del cultivo de
osteoblastos se lavaron las muestras dos veces con PBS, y fueron fijadas en glutaraldehído
al 25%, durante 2 horas. Posteriormente las muestras fueron lavadas tres veces por 10
minutos con PBS y deshidratadas en series graduales de etanol (70, 80, 90% y etanol
absoluto) durante 1 hora por cada porcentaje. Las células fijadas fueron observadas en un
Microscopio Electrónico de Barrido marca JEOL, JSM-6360 LV, a diferentes amplificaciones
(150X, 500X, 1500X, 5000X) utilizando un voltaje de 20 kV, en platina fría a -20°C.
Análisis de expresión de integrina y vinculina
Las alteraciones del citoesqueleto se midieron mediante la expresión de las proteínas de
adhesión integrina y vinculina. Para llevar a cabo estos ensayos, se utilizaron extractos
obtenidos de los andamios de quitosano, quitosano entrecruzado con PEGDE y GA. En una
placa de 24 pozos se sembraron 20 x 103 células / ml (osteoblastos ATCC hFOB1.19), se
añadieron 120 µL de cada muestra y se incubaron a 37°C, 5% de CO2 y 95% de humedad
durante 48 h. Pasado el tiempo de incubación, las muestras se enjuagaron con PBS, se
fijaron con formalina al 4% y se bloquearon con interpolación de ABS al 1%. Se añadió el
primer anticuerpo, Integrina β1 (A-4): sc-374429 (50 µL por placa, diluido con PBS-Tween
1: 150) y se incubó a 4°C durante la noche. Después de lavar con PBS, se añadió el
segundo anticuerpo (IgG de ratón: sc-3891 SCBT, (50 µL por placa diluida con PBS-Tween
1: 500) y se dejó durante 2 h. Las muestras se observaron en un microscopio de
fluorescencia marca Leica , equipado con una cámara digital, utilizando el software LAS
AF (Leica, Wetzlar, Alemania). Se realizó el mismo procedimiento para la vinculina (7F9 sc-
73614). Todos los anticuerpos fueron proporcionados por Santa Cruz Biotechnology
(Dallas, Texas, EE. UU.)
34
Ensayos de viabilidad y proliferación Vida/Muerte (LIVE / DEAD)
En la realización de este ensayo de viabilidad - citotoxicidad se empleó el kit LIVE/DEAD™
Molecular Probes™ ThermoFisher SCIENTIFIC. Para realizar este ensayo se colocaron
en una caja estéril de 24 pozos, 10 mg de cada muestra en forma de películas. Se
esterilizaron durante 15 min con luz UV. Posterior a la esterilización se agregaron 160 l de
osteoblastos, (osteoblastos humanos ATCC hFOB1.19), a una densidad celular de 2 x
10^4células/ml y 1 ml de medio de cultivo en cada pozo. Las células cultivadas se incubaron
en una atmósfera humidificada a 37°C y 5% de CO2 durante 48 horas. Posterior a las 48
horas se retiró el medio de cultivo, se lavó cada pozo 2 veces con PBS, y se añadieron a
cada pozo 200 l de reactivo (2.4 l de bromuro de etidio 0.6 l de calceina en 1 ml de
PBS). Después de 45 minutos, se realizaron 2 lavados adicionales con PBS. Las células se
examinaron con un microscopio de fluorescencia marca Leica equipado con una cámara
digital, empleando el software LAS AF.
2.3 Análisis de resultados
Los resultados obtenidos mediante las diferentes pruebas realizadas se registraron y
analizaron con Microsoft Excel (Microsoft Corporation) y Origin (Origin Lab), para ser
tabulados, graficados y realizar su análisis estadístico. Los resultados se reportan indicando
los valores de media y desviación estándar. Adicionalmente se le realizó a la prueba de
proliferación celular un análisis de la varianza (ANOVA, por sus siglas en inglés) de una vía,
con una prueba de Tukey para comparación entre grupos, utilizando el software Minitab
(Minitab Inc.). Para las pruebas estadísticas, fue utilizado un mínimo de n = 3, y un nivel de
significancia del 5% ( = 0.05), por lo que valores de p < 0.05 fueron considerados
significativos.
35
CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Andamios de quitosano, quitosano entrecruzado con glutaraldehído o
polietilenglicol diglicil éter en forma de película
3.1.1 Caracterización fisicoquímica de las películas de quitosano sin agente
entrecruzante, entrecruzadas con GA (glutaraldehído) y polietilenglicol diglicidil éter
(PEGDE) secas 25°C y 150°C
FTIR
Efecto de la neutralización en la quitosana pura
En la figura 3.1 se observan las bandas características del espectro de quitosano en polvo
con peso molecular medio, y el espectro de las películas de quitosano ácidas y
neutralizadas. En el espectro del quitosano en polvo se observa una banda a 3350 cm-1
correspondiente a los grupos O-H del polímero, una banda en 3280 cm-1 que es
característica de la vibración de tensión simétrica del grupo amida (N-H), en 2923 y 2850
cm-1 del grupo C-H, en 1647 cm-1 se localizó el grupo N-H de una amida primaria asociada
con los restos del grupo acetamida después de la desacetilación. En 1561 cm-1 aparece el
grupo amino N-H2, a 1420 cm-1 corresponde a vibraciones C-H, la banda de 1375 cm-1 se
atribuye a vibraciones de C-H3 en grupo acetamida. La banda ubicada a 1150 cm-1 se
asigna al C-O-C del enlace glucosídico, así como la de 1068 cm-1. Las vibraciones del
esqueleto propias de la estructura de quitosano aparecen en 1029 - 890 cm-1.
Debido a que se ha reportado la formación de sales entre los grupos amino protonados y
los iones provenientes del ácido utilizado para disolver a la quitosana, en la figura 3.1 se
observan los espectros de FTIR de las películas de quitosano ácidas (ácido acético) y
neutralizadas (NaOH). La banda a 1588 cm-1 (situada originalmente a 1561 cm-1) se
observa con mayor intensidad en la película ácida mientras que la absorción a 1647 cm-1
fue más intensa en el polvo y la quitosana neutralizada. Se observó una banda de absorción
a 1152 cm-1, la cual coincide con lo reportado por Correira et al [140], corresponde a la sal
formada durante la disolución del quitosano en ácido acético aunque esta banda estaba
originalmente presente debido al enlace glucosídico de la quitosana.
36
Figura 3.1. Espectros de FTIR del quitosano en polvo de peso molecular medio, película de quitosano ácida y película de quitosano neutra.
El polvo de quitosano se puede disolver en soluciones ácidas como son el ácidos acético,
cítrico, glicólico, láctico, málico y propiónico entre otros a causa de que el quitosano es una
polibase débil. Esto es considerablemente ventajoso ya que estos ácidos se clasifican como
inocuos, incluso algunos de ellos son productos comestibles o de degradación en el cuerpo
humano [141]. Cuando el quitosano se asocia a ácidos carboxílicos simples, como el
fórmico, el acético, etc., se producen interacciones electrostáticas que provocan la
formación de una sal, en mayor o menor grado [58].
A diferencia de las poliaminas clásicas como la polilisina, la función amino del quitosano es
de una base débil y, por lo tanto, está en equilibrio con una parte significativa de los ácidos
que quedan en la forma no disociada. Lo cual representa un gran interés para aplicaciones
biológicas ya que en este caso el quitosano se consideraría como un vector ácido para los
sistemas de liberación sostenida. Dado que el contraión afecta el pKa aparente de las sales
de quitosano, el pH de tales soluciones puede elevarse a 5 o más, simplemente por la
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
10
29
10
68
89
28
98
10
62
107
71
157
115
01
257
12
65
13
14
13
1713
19
13
75
137
61
420
15
58
15
61
285
02
86
7
33
78
CHT-película neutra
CHT-película ácida
CHT-polvo
328
0
891
102
5
137
9
156
91
647
286
02
923
335
0
Abs
orba
ncia
Numero de onda (cm-1)
37
protonación parcial del polisacárido con ácido butírico o valérico. Por lo que las reacciones
no deseadas en los medios biológicos debido a la acidez de algunas sales de quitosano,
pueden ser minimizadas [43].
La formación de la sal se da a partir de la interacción electrostática entre el grupo amino
protonado en el esqueleto del quitosano y el ion carboxilato del ácido carboxílico. Esto se
observa en nuestras muestras ya que las películas exhiben bandas correspondientes a los
grupos amino y carboxilato en el número de onda de 1647 y 1561 cm− 1 respectivamente.
La banda de amina se desplazó de 1561 cm-1 a 1569 cm-1. El cambio en el espectro de
quitosano puro indica que produjo alguna interacción entre el ácido acético y los grupos
amino del quitosano [142].
Efecto de la temperatura de secado en películas de quitosano sin entrecruzante
Los espectros de infrarrojo de las películas secas a 25℃ y 150°C de la quitosana pura se
presentan en la figura 3.2 (CHT). A 25°C se observa la banda de absorción a 1650 cm− 1
que se asocia a la vibración C = O en el grupo amida I N–H (acetamida), la banda a 1560
cm− 1 se atribuye a la flexión de C–N y N–H2 en la región de la amida II. Cuando la quitosana
fue calentada a 150°C la banda de la amida I se desplazó de 1650 cm-1 a1640 cm-1 y se
redujo significativamente, en comparación con la banda a 1560 cm− 1 (amida II).
El quitosano, debido a la gran cantidad de grupos polares que tiene, es un polímero
hidrofílico. El agua adsorbida provoca un aumento en la absorción a 3450 cm-1 asociado
con el aumento simultáneo de la absorbancia a 1640 cm-1, por lo que esta banda también
podría estar asociada al agua. La complejidad de los espectros de infrarrojo del quitosano
se debe a la complicada y específica red de enlaces de hidrógeno en la que están
implicados los grupos O-H, C -O y N-H. En la interpretación cuantitativa de bandas de
vibraciones de estiramiento O-H, se deben tener en cuenta varios valores de coeficiente de
absorción para formas particulares de H2O adsorbida [80].
El quitosano sin entrecruzante en forma de película neutralizada (CHT en la figura) (figura
3.2 ) exhibió una absorción amplia característica, entre 3677 cm − 1 y 3000 cm − 1 (con picos
máximos a 3360 cm − 1 y 3285 cm− 1) correspondiente al O–H (del quitosano y el agua) y la
vibración de N–H en los grupos amino. En 2920 cm−1 y 2850 cm− 1 se observaron las
absorciones correspondientes al estiramiento C–H en el metileno, C–H del anillo, CH2 del
quitosano no acetilado y acetilado, y metilos del quitosano acetilado). Mientras que la banda
de absorción a 1650 cm− 1 se asocia a la vibración C = O y N–H (acetamida) del grupo
38
amida I, la banda a 1560 cm− 1 se atribuye a la flexión de C–N y N–H2 en la región de la
amida II. A 1422 cm− 1 se observaron las bandas relacionadas con la flexión de los
metilenos. La absorción a 1380 cm−1 puede relacionarse con la vibración de CH3 y,
finalmente, a 1319 cm− 1, se observa la amida III. La amida III se usa comúnmente para
calcular el grado de acetilación. Las vibraciones características de la estructura de
quitosano aparecen a 1150 cm− 1 (C–O–C), 1080 cm − 1 y 1030 cm− 1 (anillo de piranosa).
Figura 3.2. a) Espectros de FTIR de las películas de quitosano secas a 25°C y b) secas a 150°C. CHT: películas de quitosano, CHT-GA: quitosano entrecruzado con
glutaraldehído, CHT-PEGDE, quitosano entrecruzado con PEGDE 1,2,3.
Efecto del agente entrecruzante y temperatura en películas de quitosano
Los espectros FTIR de las películas de quitosano entrecruzadas secas a 25°C y a 150°C
se presentan en la figura 3.2 a y b respectivamente.
Cuando el CHT se entrecruzó con GA, el espectro presentó una banda a 1650 cm− 1, la cual
en este caso se atribuyó a la amida I y a el enlace imina correspondiente [36,37] (–C=N–
típicamente observado a 1655 cm−1), sin embargo, la amida II (1560 cm-1) presentó mayor
intensidad que la amida I (1640 cm-1).
Los espectros de FTIR de las películas de quitosano entrecruzadas con PEGDE mostraron
una mayor intensidad de la amida I (1640 cm-1) en comparación con la amida II (1560 cm-
1). Esta diferencia fue aún más marcada a medida que aumentó la cantidad de PEGDE. Los
(a) (b)
3500 3000 2500 2000 1500 1000
Número de onda (cm-1)
1330
1420
1080
1150 10
30
1380
1560
1650
2850
29203
360
CHT-PEGDE3
CHT-PEGDE2
CHT-PEGDE1
CHT-GA
CHT
Abso
rban
cia
3500 3000 2500 2000 1500 1000
33
50
16
40
156
0
13
80
1070
Número de onda (cm-1)
CHT
CHT-GA
CHT-PEGDE1
CHT-PEGDE2
CHT-PEGDE3
Abs
orb
anci
a
103
0
39
grupos amino, ahora ubicados a 1577 cm− 1, son más reactivos que los grupos hidroxilo, y
pueden reaccionar con el anillo epoxi dando lugar a una estructura entrecruzada, por lo que
se observan intensidades menores a concentraciones más altas de PEGDE. Las bandas a
1030 cm-1 aumentan su intensidad conforme aumenta la concentración de PEGDE, en las
muestras secas a 150°C; estas absorciones se han asignado al estiramiento asimétrico del
enlace C-O -C de PEG. [143]. Las bandas más intensas en el espectro puro del PEGDE se
encuentran ubicadas a 1140 cm− 1 y 1103 cm− 1 como lo muestra la figura 3.3
El PEGDE puro exhibe bandas a 1350 cm− 1 y 1460 cm− 1, por lo que se esperaba
encontrarlas en los espectros del quitosano entrecruzado con el PEGDE, según lo
informado por Song et al [38]. Sin embargo, estas absorciones no se detectaron, o bien, los
picos de quitosano se superpusieron. Del mismo modo, aunque se esperaba una reducción
de las vibraciones asociadas con el enlace N -H, la introducción de nuevos grupos de O–H
enmascararon este efecto.
Figura 3.3. Espectro de FTIR del Polietilenglicol diglicidil éter (PEGDE).
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
1350
1460
1103
1140
1350
2865
Abso
rbanci
a
Número de onda (cm-1)
40
Los espectros infrarrojos de las películas secas a 150°C se presentan en la figura 3.2 (b).
La banda ubicada a 1640 cm− 1 (amida I) se redujo significativamente, en comparación con
la banda a 1560 cm− 1 (amida II). Con el entrecruzamiento con GA, la amida II se observó
de menor intensidad que la amida I, la absorción a 1380 cm− 1 permaneció sin cambios.
En las películas de CHT entrecruzado con PEGDE, se observó nuevamente una mayor
intensidad de la amida I, en comparación con la amida II. Esto indica que estas bandas no
son una buena referencia para estimar el grado de entrecruzamiento, o que el mecanismo
de entrecruzamiento es diferente para el GA en comparación con el PEGDE. Finalmente,
las absorciones a 1380 cm−1 y 1315 cm−1 exhibieron mayor intensidad en comparación con
la banda a 1418 cm− 1.
Lim et al. estudiaron los espectros IR de películas de quitosano antes y después del
tratamiento térmico a 150°C durante 1 hora, los resultados que obtuvieron fueron similares
para ambos tratamientos térmicos, excepto por un pico más agudo a 1652 cm-1 después
del tratamiento térmico. En ambos espectros, se observó una banda fuerte a 1560 cm-1 para
la amida II (N-H) y una a 1652 cm-1 correspondiente a la amida I (-C = O). La duración del
tratamiento térmico afectó la resistencia al agua de las películas de quitosano, haciéndolas
menos solubles [144].
Nuestro estudio demuestra que el secado a 150°C reduce la intensidad de O–H. Esto se
confirmó por el aumento en la intensidad de las absorciones de 2922 cm– 1 y 2850 cm− 1 con
respecto al quitosano seco a 25°C. Por lo tanto, no solo se eliminaría el agua adsorbida,
sino que también se puede esperar la ruptura de los puentes de hidrógeno dentro y/ o entre
las cadenas, de las moléculas de agua y los grupos N-H u O-H de la molécula de quitosano.
La reducción en la intensidad O–H y N–H también se observó en las películas
entrecruzadas, sin embargo, fue menos notoria en el CHT entrecruzado con PEGDE, ya
que es más hidrófilo. En cuanto a la banda correspondiente a la amida I, no se presentaron
cambios aparentes; sin embargo, exhibió una significativa reducción en su intensidad. Esto
concuerda con lo reportado por Zawadzki et al. [80], quienes encontraron no solo una
disminución en la intensidad de la banda amplia centrada aproximadamente a 3370 cm-1,
sino también una reducción en la absorción del grupo C=O de quitosano (es decir, la banda
de amida I). Este resultado muestra que la interacción de las moléculas de agua adsorbidas
se ve disminuida no solo en la región de 3400 cm−1 – 3200 cm−1, sino también en la región
del grupo carbonilo, lo que también implicaría que la deshidratación tiene lugar no solo a
nivel de la superficie, sino también en la estructura del quitosano.
41
Determinación de grupos de amino libres
En la Tabla 3.1 se presentan los valores obtenidos en el porcentaje de grupos amino libres,
de las películas de quitosano sin entrecruzante, de las películas de quitosano entrecruzadas
con glutaraldehído y PEGDE, a diferentes concentraciones, con secado 25°C y 150°C.
Como se observa en la tabla, es evidente que los grupos amino se reducen tanto por el
entrecruzamiento como por tratamiento térmico a 150°C, es decir, de 72.5% a 25°C pasa a
54.9% a 150°C para CHT sin entrecruzante y de 53.4% a 25°C a 49.9% a 150°C para CHT
con mayor concentración de PEGDE. A partir de estos resultados, también está claro que
el PEGDE puede ser un entrecruzante igual de efectivo que el GA, especialmente a
concentraciones más altas.
Tabla 3.1. Porcentaje de grupos amino en películas de quitosano y películas de quitosano entrecruzado, secadas a 25ºC y a 150ºC
Grupos amino (%) 25ºC 150ºC
CHT 72.5 + 3.8 54.9 + 7.1 CHT-PEGDE1 56.5 + 4.1 55.3 + 3.0 CHT-PEGDE2 55.4 + 5.6 52.3 + 2.2 CHT-PEGDE3 53.4 + 4.3 49.9 + 5.2 CHT-GA 51.5 + 2.5 47.7+ 1.9
El tratamiento térmico a 150°C genera andamios de quitosano insolubles cuando se tratan
con soluciones ácidas (ver figura 3.4). Después del tratamiento térmico a 150 ° C es posible
que algunas reacciones químicas que involucran grupos amino conduzcan al
entrecruzamiento del andamio de quitosano como, por ejemplo, la oxidación de alcoholes
podría generar la producción de aldehídos, que a su vez reaccionarían con los grupos
amino, lo que conduciría a la formación de iminas. Esto podría explicar porque el porcentaje
de los grupos amino cuantificados a 150°C fue muy bajo. Packer y Vaughan en 1958
reportaron que los ácidos, posterior a la deshidratación, producen ésteres (con alcoholes)
o amidas (con aminas) [145].
Figura. 3.4. a) Película de quitosano seco a 25ºC en solución de HCl, b) Película de
quitosano seco a 150ºC en solución de HCl
a b
42
El tratamiento térmico afecta la microestructura de las películas de quitosano como se
discute más adelante, pero la coloración amarilla de las películas se intensificó, y las
películas tratadas a 150°C se tornaron de color marrón amarillento. Este cambio de
coloración se ha reportado después de que el quitosano reaccione con el GA, y se ha
atribuido a la formación de enlaces entre las cadenas de ambos polímeros dando lugar a
las iminas [144].
Ogawa et al. [146] reportan resultados similares, señalando que la coloración de la película
de quitosano se intensificó con el aumento de la temperatura y la duración del tratamiento.
Sin embargo, estos resultados deben tomarse con precaución, ya que es posible que el
ácido acético no se haya eliminado completamente. El quitosano comercial empleado en
esta investigación fue disuelto en ácido acético. El ácido acético se clasifica como un ácido
carboxílico débil, cuando se emplea como disolvente del quitosano los iones en el grupo
amino del quitosano interactuarán fácilmente con el agua a través de puentes de hidrógeno.
La presencia de residuos de dicho ácido podría enmascarar los grupos amino durante la
titulación [147].
Balázs señala que el uso de concentraciones de quitosano de aproximadamente 1 g/L (y
alrededor de 0.010 M de concentraciones de ácido fuerte) parece ser la óptima para realizar
titulaciones de manera precisa. También menciona que concentraciones elevadas de ácido
dan como resultado puntos de equivalencia más distantes, esto a causa de la presencia de
ácido extra en el CHT seco (polvo). Por ejemplo, un poco de ácido acético residual, que a
menudo se usa en la purificación del producto durante el proceso de fabricación, puede
permanecer en la muestra, o el quitosano comercial empleado se encontraba en forma
parcialmente protonada durante la precipitación [148]. En la presente investigación, no se
observó evidencia por IR de sales de acetato residuales; sin embargo, en estado sólido, es
posible que no se puedan detectar rastros de ácido acético por FTIR.
La unión y el crecimiento de las células en sustratos de quitosano se ha atribuido a la
naturaleza catiónica de éste debido a la presencia de los grupos de amino. Los datos
sugieren que, a medida que aumenta el nivel de desacetilación, aumenta la densidad de
carga positiva en el quitosano y, en consecuencia, hay un aumento en la atracción de
células con carga negativa. Factores como el grado de desacetilación y las modificaciones
químicas influyen en las propiedades hidrofílicas de las películas de quitosano y sus
interacciones con el entorno biológico. Estos efectos se discutirán más a fondo en términos
de biocompatibilidad.
43
Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC)
En las figuras 3.5 y 3.6 se observan los termogramas obtenidos durante la primera y
segunda corrida de las películas de quitosano secas a 25°C y a 150°C. En la Tabla 3.2 se
presenta el cálculo del área correspondiente a la primera corrida en las películas secas a
25°C y a 150°C.
En la primera corrida, todas las películas, exhiben un amplio pico endotérmico en torno a
100ºC. Este pico se atribuye a la pérdida de agua asociada con los grupos hidrófilos del
polímero. En la segunda corrida no se observa el pico endotérmico a 100ºC en ninguna de
las muestras.
Figura 3.5. Termograma DSC de la primera (a) y de la segunda (b) corrida de las películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA),
quitosano entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 25°C.
Figura 3.6. Termograma DSC (a) y de la segunda (b) corrida de las películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), quitosano
entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 150°C
(a) (b)
40 60 80 100 120 140 160 180 2000.2
0.0
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
-1.0
-1.2
-1.4
-1.6
Flu
jo d
e ca
lor
(W/g
)
Temperatura T (°C)
CHT CHT-PEGDE 1 CHT-PEGDE 2 CHT-PEGDE 3 CHT-GA
40 60 80 100 120 140 160 180 200
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
Flu
jo d
e ca
lor
(W/g
)
CHT CHT-PEGDE 1 CHT-PEGDE 2 CHT-PEGDE 3 CHT-GA
Temperatura T (°C)
(a) (b)
40 60 80 100 120 140 160 180 2000.2
0.0
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
-1.0
-1.2
-1.4
-1.6
Flu
jo d
e ca
lor
(W/g
)
CHT CHT-PEGDE 1 CHT-PEGDE 2 CHT-PEGDE 3 CHT-GA
Temperatura T (°C)40 60 80 100 120 140 160 180 200
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Flu
jo d
e ca
lor
(W/g
)
CHT CHT-PEGDE 1 CHT-PEGDE 2 CHT-PEGDE 3 CHT-GA
Temperatura T (°C)
44
Tabla 3.2 Entalpía de evaporación de la primera corrida de películas de quitosano y películas de quitosano entrecruzado, secas a 25ºC y a 150ºC
En la Tabla 3.2 se puede apreciar que en todas las películas secadas a 25°C el área es
mayor a comparación de las secadas a 150°C, lo que indicaría que se pierde una mayor
cantidad de agua en las películas secas a TA (25°C). La película que exhibe una mayor
pérdida de agua (50) es la de quitosano sin entrecruzante, secada a 25°C, y la que presenta
una menor pérdida (26) corresponde a la película de quitosano entrecruzada con mayor
concentración de PEGDE (PEGDE 3), secada a 150°C.
Lim et al. informaron que una endoterma con una temperatura máxima cercana a los 100°C
representa la energía requerida para vaporizar el agua presente en las muestras de película
[144].
Ostrowska-czubenko et al. [70] estudiaron el efecto del entrecruzamiento iónico en
hidrogeles de quitosano, empleando un secado de 60°C en sus muestras. Reportaron una
endoterma debajo de 100°C y la asignan a la pérdida de agua que no se pudo eliminar por
completo al secarse. Los polisacáridos tienen una fuerte afinidad por el agua y sus
propiedades de hidratación dependen de sus estructuras primarias y supramoleculares.
Además, liberan agua a diferentes temperaturas, dependiendo de las diferentes
interacciones del agua con sus cadenas.
Como se puede observar, el calentamiento de la muestra hasta 150° C seguido de una
segunda corrida inmediata en el mismo intervalo de temperatura produjo un termograma
con un pico muy reducido comparado con el secado a 25°C. Este resultado respalda la
conclusión de que la evaporación del agua ocurrió durante la primera corrida [70].
Secado a 25°C Secado a 150°C J J CHT 50 + 6 41 + 2 CHT/PEGDE1 45 + 3 31 + 2 CHT/PEGDE2 35 + 5 30 + 3 CHT/PEGDE3 42 + 2 26 + 4 CHT/GA 37 + 4 34 + 1
45
Análisis Termogravimétrico (TGA)
La estabilidad térmica se evaluar determinando la temperatura de inicio de la etapa de
degradación, la temperatura máxima durante la cinética de descomposición y la
temperatura correspondiente al 50% de masa perdida. En este estudio utilizamos la
temperatura máxima y el 50% de masa perdida para comparar la estabilidad térmica. La
Figura 3.7 muestra los termogramas por TGA de las películas de quitosano sin
entrecruzante y entrecruzadas con GA y PEGDE tratadas a 25°C (Figura 3.7 a, c) y 150 °
C (Figura 3.7 b, d).
Figura 3.7. Análisis termogravimétrico (TGA) (a, b) y DTGA (c, d) de termogramas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y entrecruzado
con PEGDE 1,2,3 (CHT-PEGDE)
25°C 150°C
(b)
100 200 300 400 500 600 70010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CHT
CHT-GA
CHT-PEGDE1
CHT-PEGDE2
CHT-PEGDE3
Temperatura (°C)
Masa
(%
)
(a)
100 200 300 400 500 600 70010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CHT
CHT-GA
CHT-PEGDE1
CHT-PEGDE2
CHT-PEGDE3
Ma
sa (
%)
Temperatura (°C)
(d)
100 200 300 400 500 600 700
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
Temperatura (°C)
Prim
era
Deriva
da (
% T
)
CHT
CHT-GA
CHT-PEGDE1
CHT-PEGDE2
CHT-PEGDE3
100 200 300 400 500 600 700-8
-6
-4
-2
0
CHT
CHT-GA
CHT-PEGDE1
CHT-PEGDE2
CHT-PEGDE3
Temperatura (°C)
Prim
era
deriv
ada
(% T
)
(c)
46
El perfil de degradación consta de dos etapas principales; sin embargo, en el
entrecruzamiento de CHT con GA se puede apreciar una tercera etapa de degradación
según con lo reportado por López y et al. [149]. Esta tercera etapa también se observa en
el quitosano sin entrecruzante, seco a 150°C.
Las películas de CHT secas a 25°C exhibieron dos etapas de pérdida de masa, la primera
pérdida fue aproximadamente del 15% (65°C). Esta pérdida de masa se atribuye a la
eliminación de moléculas de agua que se adsorben en la superficie del quitosano [40].
Corazzari et al. reportaron que el quitosano con un grado de desacetilación de 78% exhibió
una pérdida de peso de aproximadamente 67% en un intervalo de temperatura de 30°C a
800ºC. En el intervalo de temperatura entre 30 y 150°C (tasa más alta a 76°C), se observó
una primera pérdida de masa de aproximadamente 5%. [40]
López et al. señalan que la degradación térmica del quitosano se produce en tres etapas,
pero estrictamente desde el punto de vista de la descomposición del polímero, la más
importante es la que se observa entre 268ºC y 312ºC, ya que está asociada con la
descomposición de la cadena polimérica [150].
En cuanto a las mediciones termogravimétricas en condiciones no oxidantes (atmósfera de
nitrógeno) Zawadzki et al. [80] indican que la muestra de quitosano contienen
aproximadamente 10% de agua adsorbida, que se evapora a temperatura relativamente
baja (por debajo de 100ºC); lo anterior significa que esta agua está unida débilmente a las
moléculas de quitosano. La descomposición que acompaña a la siguiente pérdida de peso
(10%) comienza alrededor de 100ºC y alcanza su tasa máxima a 168ºC. Es probable que
en esta etapa se libere el agua fuertemente ligada.
La etapa predominante de la degradación térmica aparece a un intervalo de 230-400ºC (con
un máximo a 274ºC) durante la cual se observa una caída de la masa de quitosano del
43%. Esta es causada por la despolimerización de las cadenas de quitosano, la
descomposición de los anillos de piranosa por deshidratación y desaminación y, finalmente
la reacción de apertura del anillo [151].
El análisis termogravimétrico permite concluir que el quitosano es térmicamente estable
hasta 230ºC en atmósfera de nitrógeno, mientras que es menos resistente al calentamiento
en oxígeno. Sin embargo, la evolución del agua enlazada comienza a temperaturas muy
bajas [80].
47
Zawadzki et al [80] demostraron un aumento de temperatura de hasta 200ºC conduce a la
eliminación de moléculas de H2O fuertemente unidas por puentes de hidrógeno. El
calentamiento adicional al vacío provoca la ruptura de las cadenas y la apertura de anillos
de piranosa con formación simultánea de residuo carbonoso poliaromático. El curso de la
degradación térmica en atmósfera de oxígeno está relacionado con la oxidación de
macromoléculas y la posterior descomposición de productos oxidados. Finalmente, a 600ºC
se encontraron residuos carbonosos del quitosano (alrededor del 4%). [80]
En la figura 3.7 se observa que el CHT previamente secado a 150°C muestra una pérdida
de masa menor que el seco a 25°C, esto como resultado del proceso de secado previo que
eliminó parte del agua adsorbida. En la segunda etapa, las muestras de quitosano seco a
25°C y 150°C mostraron un 50% (297°C) y un 72% (300°C) de pérdida de masa,
respectivamente. Esta pérdida de masa se puede atribuir a la descomposición parcial de la
estructura de CHT [136]. La pérdida de masa total para el CHT seco a 25°C fue del 65% y
para CHT seco a 150° C fue del 81%.
La mayor pérdida de masa registrada en el CHT seco a 150°C, en comparación con el seco
a 25°C, podría deberse al hecho de que el agua induce la formación de compuestos más
estables térmicamente, por lo que el proceso de secado podría verse afectado por la
estabilidad térmica del material [44]. Las temperaturas de descomposición y las pérdidas
de masa de las muestras de CHT entrecruzadas con glutaraldehído y con diferentes
concentraciones de PEGDE se resumen en la Tabla 3.3.
Tabla 3.3 Temperaturas máximas y pérdida de peso de las películas CHT
secas a 25°C y 150°C.
Películas Secas 25°C Secas 150°C Secas a 25°C Secas a 150°C Td (°C) T (°C) 50% pérdida de masa Td1 Td2 Td1 Td2
CHT 65 297 68 300 351 390 CHT-PEGDE 1 45 298 66 303 350 376 CHT-PEGDE 2 55 302 59 304 337 368 CHT-PEGDE 3 64 302 54 304 347 361 CHT-GA 68 272 55 292 333 392
48
Con relación al CHT entrecruzado con PEGDE con secado de 25°C, se observa una menor
pérdida de masa correspondiente al agua adsorbida en comparación con el quitosano puro.
No obstante, a concentraciones más altas de PEGDE, el agua adsorbida se mantiene igual.
Esto podría estar asociado con el entrecruzamiento entre el quitosano y PEGDE, lo que
disminuiría la absorción de agua en el material [45]. Además, se observa una estabilidad
térmica (Td2) ligeramente mayor en las muestras entrecruzadas con PEGDE, en contraste
con el CHT puro y el CHT/ glutaraldehído. También se observó que había más agua
presente en las muestras secadas a 25°C que en las tratadas a 150°C.
Sin embargo, la pérdida de masa en la segunda etapa de degradación fue similar. Para el
CHT seco a bajas temperaturas (25°C), la cantidad de agua retenida fue mayor en el CHT
entrecruzado con GA que en el CHT entrecruzado con PEGDE, lo que demuestra su mayor
eficiencia como entrecruzante para producir un hidrogel de baja absorción de agua.
En la segunda etapa de se esperaría la degradación de la cadena (despolimerización) y la
eliminación de productos volátiles, a partir de la destrucción y desaminación del anillo de
piranosa, según lo informado por Zawadski et al. [32].
Aunque, cuando el agente entrecruzante está presente, se deben esperar otros
compuestos. Finalmente, para todas las muestras de CHT entrecruzadas con PEGDE y
secas a 150°C, generalmente se observa que exhiben una mejor estabilidad térmica que el
quitosano puro y el quitosano entrecruzado con PEGDE a 25°C. Esto podría indicar que el
tratamiento de secado a 150°C promueve un mejor entrecruzamiento entre el quitosano y
el PEGDE, lo que genera muestras con mayor estabilidad térmica. En otras palabras, el
CHT-PEGDE secado a 150°C exhibió una menor pérdida de masa (53-54%) a intervalos
de 300-700°C en comparación con CHT (72%).
Del mismo modo, todas las muestras de CHT-PEGDE secadas a 150°C revelaron una
menor pérdida de masa que CHT-PEGDE a 25°C (58–70%). Petrova et al. reportaron una
pérdida de solubilidad de sus muestras, atribuida a la formación de entrecruzamientos
iónicos posterior a la deshidratación [46]. Observamos el mismo efecto en nuestras
películas después de secar a 150°C.
49
Difracción de rayos X (DRX)
En la figura 3.8 se presenta el patrón de difracción por rayos X (DRX) del polvo de
quitosano. Los picos característicos del quitosano se presentan en 2θ = 9.5 y 20º. El pico
de 9.5º es atribuido a la forma I y el pico en 20º es atribuido a la forma cristalina II, la cual
presenta cadenas menos hidratadas y más rígidas, dispersas en una fase amorfa
Figura 3.8. Difractograma del polvo de quitosano
La figura 3.9 muestra los difractogramas de las películas de quitosano secas a 25°C y
150°C.
El patrón de difracción de las películas de CHT neutralizadas secas a 25°C (figura 3.9 a)
presenta los dos picos característicos agudos a 2θ = 9.54° y 2θ = 20.3° típicos de la
conformación del quitosano [44], [152]. Esta estructura altamente ordenada surge de los
grupos hidroxilo y amino que pueden formar fuertes enlaces de hidrógeno intermoleculares
e intramoleculares. Dicha estructura se mantuvo a niveles bajos de entrecruzamiento (CHT
PEGDE1) pero dando lugar a picos adicionales a 2θ = 5.6° y 2θ =15° en las muestras más
entrecruzadas (CHT PEGDE2 y CHT PEGDE3).
Baroudi et al. atribuyen el pico ubicado a 2θ=15 ° a un cristal polimorfo de quitosano
hidratado debido a un complejo entre el agua y ácido [153]. Cuando se empleó el GA como
5 10 15 20 25 30 350
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
20
9.5
Inte
nsi
da
d (
U.A
.)
2q
50
entrecruzante, el estado amorfo se hizo más evidente (pico a 2θ= 19,7°), lo que indicaría la
pérdida de la estructura cristalina.
Figura 3.9. Difractograma de (a) películas de CHT, CHT entrecruzado con GA (CHT-GA), CHT entrecruzado con PEDGE 1,2,3 (CHT-PEDGE) secas a 25°C y (b) a 150°C.
La variación en el estado cristalino del quitosano entrecruzado con PEGDE, podría
atribuirse a los siguientes efectos del PEG: un debilitamiento de la interacción entre el
quitosano y el agua y, por lo tanto, permitir que el quitosano cristalice en forma de estructura
anhidra. Debido a que el PEG es una molécula soluble en agua, al aumentar la
concentración de PEG, éste podría atraer más agua a la membrana y por lo tanto hacer
que se forme la estructura cristalina hidratada.
La Figura 3.9-b corresponde al patrón de difracción de películas CHT secas a 150°C. Está
claro que el cambio en el proceso de secado de la estructura de CHT lo hace más amorfo,
es decir, aunque se observaron los mismos picos, exhibieron una menor intensidad.
También se encontró el pico máximo de intensidad corresponde a la reflexión 1 1 0 (2θ =
20) , el segundo pico máximo de intensidad en la reflexión 0 2 0 (2θ = 9.5), acorde a lo
encontrado en literatura [154].
5 10 15 20 25 30
Inte
nsi
dad
(U
.A.)
CHT
CHT-PEGDE 1
CHT-PEGDE 2
CHT-PEGDE 3
CHT-GA
2q
9.5°5.5°
14.9°20°
5 10 15 20 25 30
Inte
nsid
ad (
U.A
.)
CHT
CHT-PEGDE 1
CHT-PEGDE 2
CHT-PEGDE 3
CHT-GA
2q
9.515
19.5
(a) (b)
51
Con respecto a la película de CHT con menor cantidad de entrecruzante PEGDE (1), se
aprecia que el pico a 2θ = 20°disminuye en su intensidad, mientras que el pico a 2θ = 9.58°
no solo se reduce, sino que se desplaza a ángulos más bajos; este resultado sugiere un
aumento en la separación de las cadenas. Curiosamente, las películas de CHT PEGDE2
presentaron múltiples picos (2θ = 9.5°, 15° y 20.4°) que denotan una estructura
heterogénea; contrario a CHT PEGDE3, que corresponde a la muestra más entrecruzada,
se observan solamente dos reflexiones a 2θ = 9.68° y 2θ = 20.2° bien definidas.
Algunas investigaciones han sugerido que los tratamientos térmicos con quitosano pueden
cambiar sus propiedades físicas, afectando no solamente su apariencia sino también su
solubilidad acuosa y reología [81], [83].
Aunque el quitosano es un polisacárido semicristalino, éste no posee una estructura
cristalina única ya que se presentan estructuras de diferente estabilidad y nivel de
hidratación. Clark y Samuels [152] le asignaron una celda unitaria ortorrómbica con a= 8.9
Å, b= 10.25 Å y c= 17 Å, la cual contiene cuatro cadenas de quitosano con ocho moléculas
de agua [155]. Se sabe que el quitosano posee formas cristalinas hidratadas y anhidras.
[156] Demarger-andre et al. reportan tres estructuras cristalinas de quitosano: una forma
hidratada, independiente de la naturaleza química de la sal, y dos formas deshidratadas
que dependen de la estructura química del quitosano [43]. La transición del complejo de
quitosano / ácido acético a quitosano anhidro progresa con el aumento de la temperatura
[157], [158].
El quitosano hidratado es estable en condiciones de baja humedad relativa. Por lo tanto, la
deshidratación del quitosano hidratado no se logra mediante un simple secado, sino
mediante dos vías específicas. Una es el tratamiento hidrotérmico del quitosano hidratado
y el otro es el tratamiento del complejo quitosano/ácido monocarboxílico, bajo condiciones
de alta humedad relativa que causa la eliminación de las moléculas de ácido y agua del
complejo [159]. El quitosano anhidro producido a través de estas dos vías tiene una
estructura cristalina idéntica caracterizada por tener una célula unitaria ortorrómbica que
contiene dos cadenas moleculares [160]. Las transiciones del cristal hidratado al anhidro
son procesos irreversibles [44].
La presencia de moléculas de agua en la red cristalina aumenta considerablemente las
distancias entre las cadenas de quitosano. Por lo tanto, podemos entender parcialmente
por qué la estructura química del quitosano hidratado no influye en la estructura cristalina,
contrariamente al quitosano deshidratado, donde un cambio en la naturaleza química de
52
las moléculas, mucho más compactas, tendrá una gran influencia en los arreglos de la
cadena dentro de los cristales [44].
Nuestros resultados muestran claramente que la cristalinidad de la película disminuye con
el tratamiento térmico, es decir, los grupos amino aún disponibles, pueden ser usados en
la reacción con el grupo aldehído (GA) o el anillo epoxi (PEGDE) para la formación de un
CHT amorfo [ 53]. Para una comparación más precisa, la Tabla 3.4 resume los resultados
obtenidos del cálculo del índice de cristalinidad (CrI) de cada una de las películas.
Se observa cómo la cristalinidad disminuyó con el grado de entrecruzamiento y con el
secado a 150°C.
Tabla 3.4. Porcentaje de cristalinidad de películas CHT secas a 25°C y 150°C.
CrI%
Películas 25ºC 150ºC CHT 64.17+ 3.9 40.33 + 1.4 CHT-PEGDE 1 64.17+ 5.2 51.33 + 2.8 CHT-PEGDE 2 37.39 + 2.4 7.64 + 6.2 CHT-PEGDE 3 52.58 + 2.6 26.79 + 1.7 CHT-GA 21.59 + 3.8 8.36 + 3.6
En nuestros resultados, se esperaba que hubiera más agua presente en las muestras con
un índice cristalino más bajo (CrI), ya que el agua puede penetrar fácilmente en las regiones
amorfas. Esto no se observó, ya que Td1 fue del 15% cuando las muestra se secaron a
25°C, y solo del 9%, para el quitosano sin entrecruzante, cuando la muestra se secó a
150°C. La disminución en la cristalinidad en las películas tanto secas a 25° como a 150°C,
entrecruzadas con GA y PEGDE puede ser atribuida a la ruptura de los enlaces de
hidrógeno debido a la sustitución de los grupos amino por los agentes de entrecruzamiento,
dando lugar a la formación de una estructura amorfa en las películas de quitosano
entrecruzadas [161], [162].
Los valores del espaciamiento d para los distintos ángulos observados en los
difractogramas, se reportan en la Tabla 3.5. Raut et al. [154] reportan valores de
espaciamento d (2θ:9.68°= 8.41 y 2θ:20.2°= 4.48) para el quitosano puro, similares a los
encontrados en nuestras muestras. También se observó la presencia de ángulos (2θ) más
bajos cuando las películas se entrecruzan con PEGDE 1 y 2, generando un aumento de la
distancia intermolecular en 2θ=9.45.
53
Tabla 3.5 Resultados de la distancia intermolecular (d) de las películas de quitosano secadas a 25°C obtenidos mediante la Ley de Bragg
Película Ángulo (grados) d-espaciamiento (nm) 2θ d
Quitosano polvo 10
21
8.8
4.22 Película Quitosano 9.8 20 9.05
4.33
Q-Glutaraldehído
19.7
4.49
4.49 Q-PEGDE1 5.6 9.6 15 20 15.8 9.20 5.76 4.40 Q-PEGDE2 5.6 9.5 15 20 15.7 9.35 5.88 4.35 Q-PEGDE3 9.8 15.2 20.5
8.98 5.81 4.33
3.1.1.6 Composición elemental por EDX
En la Tabla 3.6 se presenta la composición elemental de las películas de quitosano, secas
a diferentes temperaturas. Como puede observarse, el análisis reveló que, en las muestras
secas a 25°C, el oxígeno tiende aumentar a medida que aumenta la cantidad de PEGDE
durante el entrecruzamiento del quitosano. Lo anterior puede deberse al oxígeno presente
en la estructura PEGDE. En el caso del nitrógeno, según lo esperado se observó una ligera
disminución a medida que las películas se entrecruzaban. Las películas de CHT sin
entrecruzante tratadas a 150°C también experimentaron un ligero aumento en el contenido
superficial de oxígeno con respecto a las muestras con secado de 25°C, pero
permanecieron constantes durante el entrecruzamiento con PEGDE o GA. En contraste, el
nitrógeno superficial tiende a reducirse con tratamiento el térmico y entrecruzamiento con
PEGDE, pero no con GA. Esto indica que hay más oxígeno que nitrógeno disponible en el
CHT entrecruzado con PEGDE.
Tabla 3.6. Porcentaje atómico por EDX de C, O, N de películas de quitosano entrecruzadas con GA y PEGDE secas a 25 ° C y 150 ° C.
CHT CHT-PEGDE1 CHT-PEGDE2 CHT-PEGDE3 CHT-GA % 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC
C 55+ 4 37+ 0 8+ 1
53+ 5 41+ 5 6+ 1
52+ 2 41+ 1 7+ 1
58+ 7 40+ 6 2+ 1
53+1 41+1 6+ 0
59+ 4 40+ 5 1+ 0
50+ 1 44+ 1 6+ 0
60+ 6 39+ 5 1+ 0
57+ 1 37+ 1 6+ 0
56+ 7 O 39+ 4 N 5+ 1
54
XPS
Los espectros de exploración por XPS de las películas de quitosano sin entrecruzante,
quitosano entrecruzado con GA, y quitosano entrecruzado con PEGDE, secas a 25°C y
150°C se muestran en la figura 3.10.
El porcentaje atómico obtenido por XPS se presenta en la Tabla 3.7. El análisis detectó
que, en las muestras secas a 25°C, el oxígeno aumenta a medida que la concentración de
entrecruzante es mayor (PEGDE), este efecto también se observó en las películas
entrecruzadas con GA. En las muestras secas a 150°C también se observó un ligero
aumento en el porcentaje de oxígeno. Estos resultados coinciden con los obtenidos
mediante EDX. Sin embargo, el contenido de nitrógeno permanece constante en todas las
muestras, tanto en las secas a 25°C como a 150°C. Con relación al carbono se observa un
ligero aumento en las muestras con mayor concentración de entrecruzante (PEGDE 3 y
GA) secas a 150°C.
Figura 3.10. Espectros de inspección (survey) por XPS del quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), y quitosano entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3
(CHT-PEGDE) secas a 25°C (a) y a 150°C (b)
Las posibles reacciones de entrecruzamiento entre el quitosano y glutaraldehído o el
PEGDE se muestran en la sección de anexos (Anexo 1). Como se esperaba, en los
espectros de XPS, solo se detectaron C1s, N1s y O1s. Sin embargo, una inspección
minuciosa (Anexo 2) del CHT puro seco a 25°C reveló al menos cuatro tipos de carbonos:
(a) (b)
1000 800 600 400 200
0
1
2
3
4
5
CHT
CHT-GA
CHT-PEGDE1
CHT-PEGDE2
CHT-PEGDE3
Inte
nsi
dad
(C
onte
o/ s
)
Energía de enlace (eV)
O1s
C1s
N1s
1200 1000 800 600 400 200 0
0
1
2
3
4
5
CHT
CHT-GA
CHT-PEGDE3
CHT-PEGDE1
Inte
nsi
da
d (C
onte
o/s)
Energía de enlace (eV)
O1s
C1s
N1s
CHT-PEGDE2
55
C – C (284.5 eV), C – O (286.4 eV), C = O y C – N (288.5 eV). Dado que la estructura del
quitosano parcialmente desacetilado es bastante compleja, una primera aproximación al
espectro XPS esperado para la región C1s es complicada porque se deben considerar los
segmentos de glucosamina y N-acetilglucosamina [163].
Tabla 3.7. Porcentaje atómico por XPS de C, O, N de películas de quitosano entrecruzadas con GA y PEGDE secas a 25°C y 150°C.
Además, de los tres posibles tipos de oxígeno: C – OH, C – O – C y C = O, solo se
detectaron dos a 532 eV y 533 eV, respectivamente, que producen un pico simétrico de
O1s después del secado a altas temperaturas. Finalmente, el nitrógeno debe exhibir al
menos dos tipos (–NH2 y O = C – N – H), pero solo se observó un pico a 399.5 eV, el cual
se ensancha durante su secado a 150°.
Las películas de quitosano entrecruzado con GA exhibieron tres tipos de carbonos a 25°C,
pero tienden a desaparecer con el secado a 150°C, es decir, la banda de C1s se ensancha.
El CHT entrecruzado con GA también presentó un pico de O1s simétrico tanto para
películas secas a 25°C como a 150°C. Finalmente, los N1s se amplían a medida que
aumenta el tratamiento térmico; sin embargo, se observaron tres picos (399 eV, 400.5 eV y
402.5 eV) con el secado a menor temperatura, lo cual evidenciaría la reacción de
entrecruzamiento.
Con relación a las muestras entrecruzadas con PEGDE, se observaron tres tipos de C1s,
pero cuando se empleó PEGDE a una concentración media y alta, el C – O (286.4 eV) se
observó con mayor claridad (mayor at. %) en las muestras tratadas a 25°C; sin embargo,
recuperó su intensidad original cuando se secó a 150°C. El CHT entrecruzado con PEGDE
mostró también un pico de O1s simétrico para películas secas a 25°C y 150°C. En el caso
de N1s, no se observaron cambios visibles a bajas concentraciones (PEGDE1) en ambas
condiciones de secado; sin embargo, se presenta (N1s) con picos más anchos o con dos
picos anchos (399 eV y 402.5 eV) a la concentración más alta (PEGDE 3) con el secado de
25°C.
CHT CHT-PEGDE1 CHT-PEGDE2 CHT-PEGDE3 CHT-GA % 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC
C 70+ 1 25+ 2 5+ 1
70+ 4 26+ 4 4+ 0
72+ 2 24+ 3 4+ 0
68+ 4 28+ 3 4+ 0
70+ 4 26+ 4 4+ 0
69+ 2 27+ 4 4+ 1
67+ 3 29+ 2 4+ 1
70+ 6 26+ 4 4+ 0
68+ 3 28+ 3 4+ 1
72+ 4 O 24+ 2 N 4+ 0
56
Topografía de superficie por MEB y AFM
Microscopia electrónica de barrido
La figura 3.11 se presentan las fotografías y las imágenes por microscopía de las películas
secas a diferentes condiciones. El único cambio evidente fue la coloración de las películas
las cuales cambiaron de amarillo claro a rojo/marrón con el tratamiento térmico a 150°C.
Sin embargo, por medio del MEB no se detectaron cambios en la morfología de la superficie
de las películas con secado adicional a 150°C, en contraste con Lewandowska et al.,
quienes informaron una estructura con forma de isla, bien definida que parece estar
asociada a la cristalinidad de la muestra [164].
Balau et al. compararon dos películas de quitosano con espesores diferentes, reportaron
que tiempos de secado prolongados a una temperatura de 50°C, produce la formación de
una película más delgada con una densidad más alta. Señalan que las películas delgadas,
con espesores inferiores a 20 µm, son transparentes, muy flexibles y de superficie lisa. Las
películas más gruesas son bastante rígidas, quebradizas y con superficie escamosa. El
cambio de la morfología de la superficie sugiere que las tensiones internas aumentan con
el espesor de la película [145].
57
Figura 3.11. Morfología de la superficie por MEB de las películas de CHT secas a 25°C
(a) y 150°C (b)
Microscopía de fuerza atómica (AFM)
La microscopía de fuerza atómica también se utilizó para evaluar la topografía de la
superficie de las películas. Al comparar la rugosidad superficial media (Ra) de las películas
secas a 25°C (figura 3.12), se observó que el CHT sin entrecruzante y el CHT entrecruzado
con PEGDE, a la concentración más baja (PEGDE1), mostraron valores bajos de Ra (44-
45 nm) la cual aumentó conforme aumentó la concentración de PEGDE (64.1 nm y 91.2 nm
para PEGDE 2 y PEGDE3 respectivamente). Sorprendentemente, la superficie más lisa se
obtuvo con el CHT entrecruzado con GA, ya que el valor de Ra fue de 26.3 nm.
58
Figura 3.12. Topografía 2D y Ra (nm) de las películas de quitosano secas a 25°C (superior, a - e) y con secado adicional a 150°C (inferior, f – j); a: CHT, b: CHT/PEDGE1,
c: CHT/PEDGE2, d: CHT/PEDGE3, e: CHT/GA, f: CHT, g: CHT/PEDGE1, h: CHT/PEDGE2, i: CHT//PEDGE3, j: CHT/GA
Cuando las películas se secaron a 150°C, la muestras que presentaron valores de Ra más
altos fueron la de CHT entrecruzado con GA, seguida del CHT sin entrecruzante con un
Ra=103.7 nm y Ra =75.9 nm, respectivamente. En contraste, el CHT entrecruzado con
PEGDE mostró una disminución en Ra en comparación con el secado a 25°C, es decir,
28.2 + 7.9 nm, 44.7 + 10.8 nm y 16.5 + 2.3 nm para PEGDE1, PEGDE2 y PEGDE3,
respectivamente. Aunque no hay una tendencia clara es posible cierta heterogeneidad en
las muestras a niveles nanométricos. Factores como la rugosidad, la porosidad y la
topografía de la superficie pueden influir en el comportamiento celular de un material. [165]
En este sentido, Croisier et al. [166] reportaron una disminución en la rugosidad en
superficies químicamente modificadas con PEG, las cuales se observan más uniformes.
Sugieren que el PEG parece suavizar la topografía de la superficie, lo que confirma la
presencia del PEG quimio-absorbido en la superficie, siendo las películas con PEG más
lisas e hidrófilas [51].
59
Medición del ángulo de contacto
En la figura 3.13 se presentan los valores de ángulo de contacto en agua destilada y DMEM,
de las películas de quitosano secas a diferentes temperaturas.
Deldritch et al. [167] proponen la siguiente clasificación en relación a los ángulos de
contacto obtenidos mediante la técnica de la gota depositada: las superficies
superhidrofílicas son aquellas en las que el agua se extiende completamente, visualmente
"ángulo de contacto cero" (0); hidrofílicas con valores de 0 a 56°, débilmente hidrofílicas
(56°-65°) > Θ > 0 y las débilmente hidrófobas 90° > Θ > (56°–65°) son aquellas en las que
las películas al contacto con agua son inestables; y por último las superficies hidrofóbicas
son aquellas con ángulos de contacto 120° > Θ > 90° [55].
El ángulo de contacto con el agua es un buen indicador del grado de hidrofilia de las
películas. El estado final de una gota de agua sobre la superficie de la película se toma
como un indicador de la humectabilidad de la superficie por el agua. Es bien sabido que el
ángulo de contacto con el agua disminuye cuando la hidrofilia de la superficie es mayor. En
este sentido, se han reportado valores hasta de 105° en ángulos de contacto con agua en
películas de quitosano [83].
La hidrofilia de la superficie de las películas CHT entrecruzadas, con los diferentes
tratamientos de secado (25°C y 150°C), se presentan en la figura 3.13. Las películas CHT
mostraron, en general, ángulos de contacto con el agua inferiores a 72°, lo que las clasifica
como débilmente hidrofílicas [168]. Sin embargo, el tratamiento térmico a 150°C aumentó
ligeramente el ángulo de contacto para el quitosano sin entrecruzante, y en las muestras
de PEGDE 2 y PEGDE 3 (media y mayor concentración), pero no se observó un efecto en
las muestras entrecruzadas con GA. Cuando se empleó DMEM, se observaron ángulos de
contacto más bajos en las muestras entrecruzadas con PEGDE y GA.
Los grupos polares introducidos por diferentes procedimientos tienden a “enterrarse” en
conjunto cuando entran en contacto con el aire durante un período prolongado; sin
embargo, permanecen en la superficie cuando están en contacto con agua o cualquier otro
ambiente polar [169]. En nuestro estudio, los grupos aceptores de enlaces de hidrógeno (a
saber, átomos de O) como las unidades de etilenglicol o como los O-H producidos durante
la apertura del anillo epoxi aumentaron la afinidad del agua de la superficie amino-PEGDE
[169] .
60
Figura 3.13. Imágenes de los ángulos de contacto en H2O (a) y DMEM (b) de las películas de quitosano secas a 25°C y con secado adicional a 150°C
Romero-Vargas et al. reportan que la funcionalización de la superficie con PEG inhibe la
adsorción de biomoléculas, una propiedad que se debe en parte a la capacidad del PEG de
participar en interacciones de enlaces de hidrógeno con las moléculas de agua
circundantes, es decir, la hidrofilia de la superficie [170]. Señalan que las películas con
PEGDE posee una capa activa más hidrofílica reflejándose con un ángulo de contacto
menor. Los grupos aceptores de enlaces de hidrógeno (a saber, átomos de O) en
monómeros de etilenglicol refuerzan la afinidad del agua de las superficies de amino-
PEGDE [170].
Estos resultados concuerdan con la composición de la superficie de oxígeno obtenida por
EDX, ya que está claro que los grupos que contienen oxígeno se encontraban en la
superficie haciéndola más hidrofílica.
Zhang et al. [171] reportan resultados similares con PEG, señalando que el ángulo de
contacto se redujo ligeramente al agregar PEG pero no varió considerablemente o incluso
61
aumentó ligeramente cuando aumentó la proporción de PEG al quitosano. En contraste,
estos resultados fueron inesperados ya que un valor Ra más alto debería haber llevado a
un ángulo de contacto más bajo. Por lo tanto, parece que la composición química de la
superficie juega un papel más importante en la determinación del comportamiento del
ángulo de contacto.
En general, la humectabilidad de la superficie está fuertemente asociada no solo con el
ángulo de contacto sino también con la energía libre superficial, y se ve afectada por
diversos aspectos como la composición elemental de la superficie y la rugosidad. La
humectabilidad es quizás el factor más importante para determinar la cantidad y calidad de
las proteínas adsorbidas, lo que a su vez afecta la adhesión celular [171].
Yinghui et al. [165] señalaron que la alta biocompatibilidad del quitosano se debe a su alta
hidrofilia y a la carga superficial positiva que promueve el crecimiento celular. Además,
algunos estudios han indicado que los ángulos de contacto más pequeños en los materiales
pueden aumentar la afinidad celular [172], [173]. Sin embargo, algunos investigadores han
demostrado que, en lugar de una correlación directa entre el ángulo de contacto y la unión
celular, parece haber un ángulo de contacto ideal que permite a una mejor proliferación y
comportamiento celular, esto ocurre alrededor de 60°- 80° [68], [174]. Aun así, existe
evidencia por parte de varios autores que indican que esto no es necesariamente cierto y
que el ángulo de contacto no es un buen predictor de la unión celular y el comportamiento
[68].
3.1.2 Propiedades mecánicas de tensión
En la figura 3.14 se presentan los resultados de la caracterización mecánica a tensión de
las películas de quitosano. Como se observa en la Tabla 3.8, la película con mayor valor de
módulo elástico fue la de quitosano con mayor concentración de PEGDE (18.9 MPa), y la
que registró menor valor fue la de quitosano sin entrecruzante. La película en la que se
registró menor valor de esfuerzo máximo fue la de quitosano entrecruzado con GA (29
MPa), y la de mayor esfuerzo fue la de quitosano con mayor concentración de PEGDE (42
MPa). Como puede observarse, el esfuerzo a la tensión aumentó con la adición del
entrecruzante. En cuanto a la deformación máxima se obtuvieron los valores más altos en
la muestra correspondiente al quitosano con PEGDE 2 (7%) y la de menor valor fue la de
62
quitosano con glutaraldehído (1.66 MPa). La diferencia entre las películas entrecruzadas
puede deberse a los enlaces que se forman con cada entrecruzante (GA y PEGDE).
Figura 3.14. Curvas esfuerzo-deformación típicas de películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), y quitosano entrecruzado con
PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 25°C.
Tabla 3.8. Propiedades mecánicas de películas de quitosano sin entrecruzante, quitosano entrecruzado con glutaraldehído, quitosano entrecruzado con PEGDE
Material
(MPa) max (MPa)
ԑ último (%)
Quitosano 11.1 ± 0.9 30.5 ± 0.8 6 ± 0.5 Quitosano/GA 14.1 ± 0.1 29 ± 0.3 1.7 ± 0.1
Quitosano/PEGDE1 12.9 ± 0.2 34.3 ± 0.1 5.8 ± 02 Quitosano/PEGDE2 16.5 ± 0.1 38.6 ± 0.2 7 ± 0.1 Quitosano/PEGDE3 18 ± 5.2 42 ± 2.9 4.6 ± 2.3
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50 CHT
CHT-PEGDE 1
CHT-PEGDE 2
CHT-PEGDE 3
CHT-GA
Deformación (%)
Esf
uerz
o (M
Pa)
63
3.1.3 Pruebas de Degradación in vitro
Degradación química acelerada
En la Tabla 3.9 se presentan los resultados de la degradación química de las películas de
quitosano sin entrecruzante y entrecruzadas con glutaraldehído y con PEGDE1, 2 y 3.
Tabla 3.9. Masa perdida después de la degradación química de películas de quitosano entrecruzado secado a 25℃.
La mayor pérdida de masa que se registró en agua destilada (H2O d) fue en la película de
CHT sin entrecruzante (20%) seguida de las entrecruzadas con PEGDE 1 y PEGDE2. La
menor pérdida de masa se registró en las muestras entrecruzadas con GA y PEGDE3 i.e.
12.4% y 11.4% respectivamente. En la degradación con HCl las películas entrecruzadas
con PEGDE se degradaron en su totalidad al igual que para el H2O2. Sin embargo, la
película con GA solo se degrado 65.3%, lo que podría indicar un mayor entrecruzamiento
en dicha película. Finalmente, en hidróxido de sodio, el quitosano entrecruzado con
glutaraldehído exhibió la mayor pérdida de masa mientras que el quitosano puro presentó
la menor pérdida de masa.
Ritthidej et al. [141] reportan resultados similares en películas de citrato de quitosano y
malato. Todas las películas fueron solubles en agua desionizada y HCl. Esto se debió a la
ionización de la sal de quitosano en las soluciones.
La presencia de grupos hidrofóbicos e hidrofílicos, especialmente el grupo carboxilo en la
molécula de ácido, afectó profundamente la absorción de agua y la disolución de la película
tratada. La inmersión en agua destilada hizo que las películas de quitosano se hincharan y
se disolvieran. Sin embargo, la disolución total de las películas no se completó en las
primeras 24 horas de inmersión.
Películas Masa perdida (%) H2O HCl H2O2 NaOH
CHT 20.3 + 5.3 96.18+ 3.9 100 18.1+ 1.2
CHT/PEGDE1 13.8 + 3.5 100 100 37.9 + 2.9 CHT/PEGDE2 11.7 + 3.2 100 100 21.16+ 4.2 CHT/PEGDE3 11.4 + 4.1 100 100 28.8+ 2.4 CHT/GA 12.4 + 4.7 65.3 + 5.5 100 79.5+ 6.1
64
Al igual que en nuestras muestras también observaron pequeños trozos de gel
transparente en el medio, pero estos eran demasiado blandos para ser recuperados para
mediciones de peso [144].
La diferencia en la solubilidad de una película de quitosano en los diferentes medios puede
atribuirse a la ionización de grupos amino en las moléculas de quitosano. En un medio
ácido, la protonación de los grupos amino aumenta la densidad de carga a lo largo de la
cadena molecular, lo que hace que las cadenas se desplieguen y asuman una conformación
alargada.
Las moléculas de quitosano en la película aún pueden protonarse en agua destilada debido
a la presencia de ácido acético residual en la película. Por lo tanto, es posible que se
observen grados considerables de hinchamiento y disolución tras la inmersión de la película
de quitosano en agua destilada. El tratamiento térmico mejoró la resistencia al agua de las
películas de quitosano [144].
Degradación enzimática
En la figura 3.15 y en la Tabla 3.10 se presentan los resultados de la degradación
enzimática de las películas de quitosano a diferentes temperaturas de secado y con
diferentes medios, PBS (pH 7.4) y BES (pH 6.4).
La mayor pérdida de masa se registró en las películas de quitosano sin entrecruzante seca
a 25°C, siendo similar para ambas soluciones (47% PBS y 44% BES). Las películas de
quitosano con secado adicional presentaron una menor pérdida de masa (28% para PBS y
29 para BES), esto puede deberse a que el secado adicional promueve el entrecruzamiento.
En relación con las películas entrecruzadas se observó una disminución en la degradación
a medida que aumentó la concentración de PEGDE, registrándose la menor pérdida a
PEGDE 2 y 3. Al igual que en las películas sin entrecruzante, la degradación disminuyó con
el tratamiento térmico a 150°C.
65
Figura 3.15 Degradación enzimática con lisozima de películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con GA (CHT/GA) y quitosano entrecruzado con PEGDE 1,2,3,
(CHT/PEGDE) secas a 25°C (TA) y 150°C (S), en (a) PBS y (b) BES.
Tabla 3.10. Porcentajes de pérdida de masa obtenidos de la degradación enzimática de las películas de quitosano
Ritthidej et al., [141] reportaron que la solubilidad de las películas de quitosano difiere
según el medio de disolución utilizado. Las películas son más solubles en HCl y menos
solubles en soluciones mayores a pH de 7.4. Las películas sumergidas durante 24 horas
en PBS mantuvieron su integridad mientras que las películas en el medio ácido se hincharon
considerablemente, se suavizaron y finalmente se disolvieron dentro del mismo período de
Película Pérdida de masa (%) PBS BES
CHT-25°C 47 + 1.5 44 + 3.6 CHT-150°C 28 + 4.1 29 + 5
CHT-PEGDE1-25°C 37 + 1.5 36 + 4.7 CHT-PEGDE1-150°C 28 + 3.7 33 + 2.9 CHT-PEGDE2-25°C 29 + 3.8 33 + 3
CHT- PEGDE2-150°C 19 + 2.6 30 + 2 CHT-PEGDE3-25°C 27 + 1.5 29 + 2
CHT-PEGDE3-150°C 18 + 1.5 27 + 2.5 CHT-GA-25°C 22 + 3 28 + 1.7
CHT-GA-150°C 17 + 2.6 32+ 1
0 5 10 15 20
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
CHT-TA
CHT-PEGDE1-TA
CHT-PEGDE2-TA
CHT-PEGDE3-TA
CHT-GA-TA
CHT-S
CHT-PEGDE1-S
CHT-PEGDE2-S
CHT-PEGDE3-S
CHT-GA-S
Pér
dida
de
mas
a (%
)
Tiempo de degradación (días)
0 5 10 15 20
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50 CHT-TA
CHT-PEGDE1-TA
CHT-PEGDE2-TA
CHT-PEGDE3-TA
CHT-GA-TA
CHT-S
CHT-PEGDE1-S
CHT-PEGDE2-S
CHT-PEGDE3-S
CHT-GA-S
Pé
rdid
a d
e m
asa
(%
)
Tiempo de degradación (días)
(a) (b)
66
tiempo. Las diferencias de peso, antes y después de la inmersión, mostraron que el 30%
de las películas de quitosano se habían disuelto en PBS con pH de 7.4.
Lin et al. obtuvieron de su degradación [144] restos de película recuperados del medio; (los
medios de disolución utilizados fueron HCl, agua destilada y buffer fosfato). Los residuos
que obtuvieron del agua destilada presentaron un índice de hinchamiento el cual le indicó
a los autores que las películas poseen la capacidad para absorber 3.5 veces su peso de
agua. La inmersión en agua destilada hizo que las películas de quitosano se hincharan y
se desintegraran. Sin embargo, la disolución total de las películas no se completó hasta
después de 24 horas de inmersión.
Lim et al. reportan que el tratamiento térmico a 90 ° C redujo notablemente la solubilidad de
las películas de quitosano en agua destilada; este mismo efecto se observó en nuestras
muestras. La solubilidad de las películas en medios ácidos, así como en PBS, disminuyó
proporcionalmente con temperaturas más altas de tratamiento térmico. Sin embargo, el
grado de disminución de la solubilidad en PBS fue menor que en el medio ácido. El
tratamiento térmico también redujo las diferencias en la solubilidad de la película en los tres
medios. Las películas no tratadas tenían solubilidades dispares, mientras que las películas
tratadas térmicamente a 150 ° C se disolvieron en la misma medida (15%) en los tres
medios [144].Estas observaciones indican que los cambios inducidos por el calor en las
cadenas de quitosano obstaculizaron la capacidad de las moléculas de desplegarse tras la
ionización en un medio adecuado. Consecuentemente, se redujeron los grados de
hinchamiento y disolución de las películas de quitosano. Cuando se evitó que las moléculas
de quitosano se desplegaran después del tratamiento a una temperatura suficientemente
alta, las películas de quitosano mostraron grados similares de resistencia al agua en los
tres medios de pH diferente [144].
Los resultados de la presente investigación concuerdan con los reportados por Reyna et al.
[138], quienes reportan que el entrecruzante juega un papel importante en el
comportamiento de degradación de los andamios de quitosano, debido a que en sus
muestras se registró una menor pérdida de masa en los andamios entrecruzados con GA.
67
3.1.4 Caracterización biológica de los andamios
Proliferación celular con osteoblastos determinada con MTS
Los andamios de quitosano deben ser capaces de permitir la adhesión celular, así como el
crecimiento y desarrollo de la matriz extracelular. La adhesión celular y la proliferación en
sustratos de quitosano se ha atribuido a la naturaleza catiónica de los grupos amina de
quitosano [175].
En la Figura 3.16-a se presenta la viabilidad celular en contacto directo (D) y en contacto
indirecto (I) en andamios de CHT sin entrecruzar y entrecruzados, secos a 25°C. En la figura
3.17 se presentan las gráficas de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de
proliferación celular por MTS.
Como se puede apreciar en la figura 3.16, los osteoblastos en contacto con extractos
producen una viabilidad celular similar o mayor que cuando se prueban en contacto directo.
También queda claro que el mayor porcentaje de viabilidad celular, en contacto directo e
indirecto, se observó en los andamios de quitosano entrecruzados con PEGDE (CHT-
PEGDE) en la concentración mínima (PEGDE1), sin existir una diferencia estadísticamente
significativa entre las tres concentraciones empleadas (p=0.999). De todas las muestras
estudiadas, las entrecruzadas con GA exhibieron la viabilidad celular más baja, con un valor
de p=0.001 para los ensayos de contacto directo e indirecto.
En la Figura 3.16b se muestra el análisis de la viabilidad celular correspondiente a los
andamios tratados a 150°C, en los que también se observó una mayor viabilidad celular en
los andamios de CHT-PEGDE1 y CHT-PEGDE2, con un valor de p=0.001, en comparación
con las muestras de CHT puro y CHT/GA; lo mencionado anteriormente se observó en los
ensayos en contacto directo e indirecto.
En contraste con los andamios secos a 25°C, se registró una diferencia estadísticamente
significativa (p=0.005) en los andamios entrecruzados con mayor concentración de PEGDE
(PEGDE3) en comparación con las concentraciones menores (PEGDE 1 y 2), lo que nos
indica que una mayor concentración de PEGDE disminuyó considerablemente la
proliferación celular en las muestras secas a 150°C; este efecto solo se hizo presente en
los ensayos en contacto indirecto.
68
De nuevo las muestras que exhibieron menor proliferación celular fueron las entrecruzadas
con GA (p=0.000) para ambos ensayos (directo e indirecto).
La viabilidad celular en contacto directo disminuyó en los andamios secos a 150°C para
CHT sin entrecruzar (menor absorbancia), a pesar de eso, la diferencia no fue
estadísticamente significativa (Tabla 3.11).
Al comparar el efecto de la temperatura de secado en la viabilidad celular de los andamios
estudiados, solo se presentó una diferencia estadísticamente significativa en los andamios
de CHT/PEGDE 2 y CHT/GA en los ensayos en contacto indirecto (Tabla 3.11). En los
primeros (PEGDE2) la proliferación celular aumento cuando los andamios se sometieron al
secado adiciona a 150°C; a diferencia de los andamios de CHT-GA en los cuales la
proliferación celular disminuyo con el secado adicional.
Esto significa que se logró una alta viabilidad celular en contacto directo en el CHT
semicristalino puro (CrI = 64.1%) con secado a 25°C, 72.5% de grupos amino libres, Ra =
45.8 , 72° de ángulo de contacto en DMEM, siendo semicristalino y en el CHT – PEGDE1
con secado a 150°C, a pesar de las siguientes diferencias: CrI = 51.3%, menor porcentaje
de grupos amino libres (55.3%), menor rugosidad (Ra = 28.2 ) y menor ángulo de contacto
en DMEM (57°). Lo que también significa que, para una menor cantidad de grupos amino,
una mayor hidrofilia hace que la viabilidad sea mayor en presencia de una estructura menos
semicristalina. Sin embargo el CHT entrecruzado con GA seco a 25°C exhibió la viabilidad
celular más baja en contacto directo con 51.5% de grupos amino libres, Ra = 26.3, y un
ángulo de contacto en DMEM de 56°. A pesar de que el ángulo de contacto es menor que
en el CHT puro, hay menos grupos amino disponibles, lo que resulta en una viabilidad más
baja. Además, el glutaraldehído se considera un agente de entrecruzamiento tóxico que
produce una superficie de CHT amorfa (CrI = 21.5%) y lisa, lo que conlleva a una pobre
unión celular.
69
Figura. 3.16 (a) Viabilidad de osteoblastos en contacto directo (D) e indirecto (I) en películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y quitosano entrecruzado con PEDGE 1,2,3 (CHT-PEDGE) secas a 25°C y (b) 150°C.
(a)
(b)
70
Figura 3.17. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de
proliferación celular por MTS a) Secado 25°C contacto directo, b) Secado 25°C contacto directo, c) Secado 150°C contacto directo, d) Secado 150°C contacto indirecto
Tabla 3.11 Valor de p (ANOVA-Tukey) de las medias de películas de quitosano con
secado a 25°C vs secado adicional a 150°C en contacto directo (C.D) y contacto indirecto (C.I)
Películas Valor p
C.D C.I CHT-25°C /CHT-150°C 1.000 0.581 CHT/PEGDE1-25°C - CHT-PEGDE1/150°C 0.437 0.224 CHT/PEGDE2-25°C - CHT-PEGDE2/150°C 0.997 0.003* CHT/PEGDE3-25°C - CHT-PEGDE3/150°C 0.982 0.840 CHT/GA-25°C - CHT-GA/150°C 1.000 0.002*
(b)
(c) (d)
(a)
71
Análisis de la adhesión celular mediante microscopía electrónica de barrido (MEB)
La distribución de las células en andamios secos a 25°C y 150°C se observó después de
48 h de incubación por contacto directo e indirecto (figura 3.18). Se observa una mejor
interacción y morfología de los osteoblastos en contacto directo, en los andamios de
quitosano entrecruzados con PEGDE tratados térmicamente a 150°C. La presencia de
osteoblastos redondeados en el CHT entrecruzado con GA en lugar de células poligonales
sugiere una respuesta a estímulos. Jayakumar et al. [176] evaluaron la citotoxicidad con
fibroblastos (L929) en andamios de quitosano/polietilenglicol diacrilato (PEGDA) e informan
que el material no mostró citotoxicidad y presentaba biocompatibilidad in vitro. La
observación mediante MEB indicó que la estructura superficial microporosa de los
andamios quitosano / PEGDA permite el crecimiento, la proliferación y la diferenciación
célular [176].
Figura 3.18. Imágenes por MEB de osteoblastos cultivados en andamios de CHT en contacto directo e indirecto, secados a 25°C y a 150°C.
CONTACTO DIRECTO CONTACTO INDIRECTO
72
Análisis de expresión de vinculina e integrina
La vinculina es una proteína del citoesqueleto asociada con las uniones célula-célula y
célula-matriz, así como con las interacciones célula-biomaterial. La Figura 3.19 presenta la
expresión de vinculina en andamios de CHT entrecruzado con tratamientos de secado a
25°C y 150°C. Como puede observarse, el CHT con menor concentración de entrecruzante
(PEGDE1 y PEGDE2) seco a 150°C exhibió una fuerte expresión de proteínas en múltiples
células alargadas, incluso mejor que en el CHT sin entrecruzar. Esto implica que las fuerzas
contráctiles aumentan debido a la presencia de vinculina. Por el contrario, los andamios con
GA mostraron una forma celular irregular.
La capacidad de generar y transmitir fuerzas depende de la fuerza de la conexión entre los
receptores de adhesión de integrina y el citoesqueleto de actomiosina mediado por
proteínas de adhesión focal. La vinculina conecta el citoesqueleto de actomiosina con las
subunidades de integrina β mediante la unión a la talina, o con las subunidades de integrina
α4 y α9 mediante la unión a la paxilina, respectivamente. En la figura 3.19 se presentan las
imágenes obtenidas de la prueba de adhesión, usando el anticuerpo de integrina.
Se observó un mayor número de células en los andamios de CHT con PEGDE en
comparación con CHT sin entrecruzante y CHT-GA. Estos hallazgos indican que el PEGDE
mejora la adhesión celular. Se observó una morfología celular más definida en los andamios
con secado adicional de 150°C. Esto fue más evidente en el CHT entrecruzado con PEGDE,
cuando se empleó a la concentración más baja.
Las características de la superficie del polímero podrían afectar las cantidades y los tipos
de proteínas adheridas, así como la conformación, orientación o fuerza de unión de la
proteína adsorbida. Zhang et al. [171] informaron que los grupos hidroxilo y las cadenas de
PEG hidrófilas mejoran significativamente la adsorción de proteínas y el crecimiento celular.
El quitosano es un polisacárido con una carga positiva que promueve el crecimiento celular
y la adsorción de proteínas, a diferencia de la mayoría de las proteínas que tienen puntos
isoeléctricos por debajo de 7.4 y una carga negativa. La introducción de la cantidad
apropiada de PEG puede no influir en esta propiedad, pero las altas concentraciones de
PEG pueden reducir la carga positiva, debido al entrecruzamiento [57].
Saladino et al. [177] analizaron por fluorescencia hidrogeles de quitosano con PEGDE,
empleando condrocitos. Observaron un núcleo verde bien definido, en las muestras de
CHT/PEGDE, por lo que sugieren que dichas formulaciones no producen genotoxicidad.
73
En el análisis de la morfología celular por medio del microscopio confocal se observaron
células con una forma redondeada, similar a la del tejido del cartílago, siendo más evidente
en las muestras de quitosano/PEGDE. Dichos resultados concuerdan con los encontrados
en nuestro estudio.
Figura 3.19. (A-J) Imágenes de fluorescencia de osteoblastos cultivados en andamios de CHT marcados con vinculina (7F9): sc-73614, durante 48 h. (K-T) Imágenes de
fluorescencia de osteoblastos cultivados en andamios de CHT marcados con intregrina 1β (A-4) durante 48
Aunque todos los andamios de CHT entrecruzados con PEGDE sustentan la adhesión
celular, vale la pena tener en cuenta que ésta, como se demostró en este estudio, no es
indicativa de qué tan favorable es un sustrato para la proliferación celular y que la
proliferación celular no se correlaciona con la formación de contactos focales [178].
VINCULINA (7F9) INTEGRINA 1β
74
Biocompatibilidad andamios de quitosano en forma de espuma
En las figuras 3.20 y 3.21 se presentan los resultados obtenidos de los ensayos de
biocompatibilidad por MTS, de las espumas en contacto indirecto (D) e indirecto (I).
En el caso de las espumas, en ensayos por contacto directo, la muestra que presentó una
mayor proliferación celular fue la de quitosano con menor cantidad de entrecruzante
(PEGDE1), sin embargo, las diferencias entre las muestras de CHT sin entrecruzante y
entrecruzadas con PEGDE no fue estadísticamente significativa (p=0.078). Los andamios
de CHT/GA exhibieron menor proliferación celular por contacto directo (p=0.001). Para
contacto indirecto, la espuma que mostró una mayor viabilidad celular fue la de quitosano
sin entrecruzante, no obstante, solo se registró una diferencia estadísticamente significativa
(p=0.030) entre los andamios de CHT sin entrecruzante y de CHT/GA.
En las imágenes de MEB (Anexo 3) se observa la morfología de la microestructura de las
espumas CHT, CHT/GA y CHT/PEGDE, liofilizadas, previo secado y congelación. Se
puede apreciar una superficie irregular y porosa en todas las muestras debido a la
liofilización la cual es una buena para aplicación de ingeniería tisular.
Figura 3.20 (a) Viabilidad de osteoblastos en contacto directo (D) e indirecto (I) en espumas quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y
quitosano entrecruzado con PEDGE 1, 2, 3 (CHT-PEDGE)
75
Figura 3.21. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS de espumas de quitosano en a) contacto directo, b) contacto
indirecto
(a)
(b)
76
3.2 Andamios de quitosano-hialuronato de sodio, quitosano- hialuronato de sodio
entrecruzado con glutaraldehído y quitosano- hialuronato de sodio entrecruzados
con polietilenglicol diglicil éter
3.2.1 Caracterización fisicoquímica de las películas de quitosano- hialuronato de sodio, quitosano- hialuronato de sodio entrecruzado con GA y quitosano- hialuronato de sodio entrecruzados PEGDE
Espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR)
Se obtuvieron los espectros del hialuronato de sodio (HNa) en polvo y en forma de película
(figura 3.22). Así como el de las películas de quitosano con HNa al 15% y 30% sin
entrecruzante, y de las películas de quitosano con HNa al 15% y 30% entrecruzadas con
PEGDE en concentraciones de 0.114 mM (50 µL), 0.228 mM (100 µL) y 0.342 mM (150 µL)
y entrecruzadas con glutaraldehído, 0.3744 mM (150 µL), (figura 3.23).
En el espectro del hialuronato de sodio en polvo (figura 3.20), la banda ubicada 1033 cm-1
se asigna al estiramiento C-O-C, la banda en 1076 cm-1 se atribuye al estiramiento C-O, la
banda en 2876 cm-1 corresponde al estiramiento C-H y la banda ubicada en 3300 cm-1 se
asigna al estiramiento O-H. La banda ubicada a 1615 cm-1 corresponde a la amida I.
Figura 3.22. Espectro FTIR del hialuronato de sodio en polvo (HA-p) y de las películas de hialuronato de sodio con ácido acético (HA-f)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
Número de onda (cm-1)
Ab
sorb
anci
a
1734
2920
1380
14
05
10
36
1081
1322
10
33
107
6
1615
2890
3300
HA-F
HA-P
77
En la figura 3.22 también se observa del espectro de infrarrojo de la película obtenida con
HNa y ácido acético. La banda ubicada a 1734 cm-1 la cual correspondería al grupo
carboxilo, se observa con mayor intensidad. También se observa un aumento en la
intensidad de las bandas a 2920 cm-1 a 2890 cm-1. La aparición de la banda del carbonilo a
1734 cm-1, el incremento de las bandas de correspondientes al estiramiento C-H, podría ser
atribuido ácidos carboxílicos del HNa ya una vez neutralizado (utilizado durante la
elaboración de la película).
En la figura 3.23 se presentan los espectros de FTIR del quitosano puro y de las películas
de quitosano/HNa 15% (a) y al 30% (b), entrecruzadas con PEGDE y GA a diferentes
concentraciones.
Figura 3.23. Espectros de FTIR de las películas de a) CHT/HA15%, CHT/HA15% entrecruzadas con glutaraldehído (CHT- HA15%-GA) y entrecruzadas con PEDGE (CHT-
HA15%-PEDGE1, 2, 3) y b) de las películas de CHT/ HA30%, CHT/ AH30% entrecruzadas con glutaraldehído (CHT- HA30%-GA) y entrecruzadas con PEDGE (CHT-
HA30%-PEDGE1, 2, 3)
Con respecto al quitosano puro se observan varios cambios cuando se mezcla con HNa:
las bandas a 3350 cm-1 (O-H) y 3291 cm-1 (N-H) desaparecen, observándose una sola
banda amplia a 3320 cm-1. También se observa un desplazamiento de la banda 2851 cm-1
(estiramiento C-H2) a 2862 cm-1 en la película con AH al 15% y 2870 cc-1 con AH al 30%.
Adicionalmente se observa una disminución de la banda 1650 cm-1 (C=O, banda amida I) y
un desplazamiento de la banda 1561 cm-1 (N-H2) a 1550 cm-1 en las películas con AH en
ambas concentraciones. En las muestras con HNa no se observa la banda correspondiente
(a)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
33
50
329
1
CHT
89
5
CHT-HA30%
CHT-HA30%-GA
CHT-HA30%-PEGDE1
CHT-HA30%-PEGDE2
CHT-HA30%-PEGDE3
138
01
37
513
701
410
107
01
02
0
137
0
116
0
13
00
15
50
16
50
28
70
29
20
333
0
Ab
sorb
an
cia
Número de onda (cm-1)
28
50
15
61
13
75
13
14
12
57
11
50
10
68
102
9
892
(b)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
16
50
894
CHT
CHT-HA15%-PEGDE3
CHT-HA15%-PEGDE2
CHT-HA15%-PEGDE1
CHT-HA15%-GA
10
70
10
26
14
10
11
50
13
80
15
50
16
40
28
62
29
20
332
0
CHT-HA15%
Ab
sorb
an
cia
Número de onda (cm-1)
33
50
32
91
28
50
15
61
13
75
131
41
25
7
10
68
10
29
78
al grupo amida ubicada a 1375 cm-1. La banda a 1640 cm-1 se asigna al estiramiento C=O
de la amida I, a 1550 cm-1 (amida II), la de 1380 cm-1 corresponde a la amida III (estiramiento
C-N) [11]. La banda ubicada a 895 cm−1 en los espectros CHT y CHT/HNa se atribuye al
enlace beta-glucosídico del quitosano [179].
Entre las principales diferencias observadas en estos espectros (quitosano/HNa al 15% y
30%) destaca que la banda de 2890 cm-1 del HNa fue desplazada a 2862 cm-1 cuando el
HNa se mezcló con el CHT. Por otro lado, la banda ubicada 1550 cm−1 en los espectros de
CHT/HNa aumentó cuando la concentración de HNa fue mayor, debido a la presencia de
más grupos amida provenientes de la interacción entre el quitosano y el HNa [179].
El ácido hialurónico y el quitosano son polisacáridos, por lo que ambos poseen espectros
similares. La naturaleza catiónica del quitosano le permite interactuar con polímeros
cargados negativamente para formar un complejo de polielectrolítico (CPE) a través de
enlaces iónicos. Se podría esperar que el grupo amino cargado positivamente, del
quitosano, (1650 cm-1) interactuará con el COO con carga negativa de ácido hialurónico
(1734 cm-1) [180].
La formación de CPE y el entrecruzamiento dan como resultado una disminución de la
absorción en las bandas características a la vibración de estiramiento O-H y N-H.
En los espectros de IR de las películas de CHT/HNa/PEGDE al 15% y 30% de HNa (figura
3.23), las bandas a 2890 cm-1 y 2863 cm-1 disminuyen de intensidad cuando aumenta la
concentración de HNa (30%). La banda ubicada a 1640 cm-1 aumenta de intensidad
conforme la aumenta la concentración de PEGDE en las películas con HNa al 15%, dicho
efecto también se observa en las películas con HNa al 30%. En contraste, la banda a 1550
cm-1 disminuye de intensidad cuando aumenta la concentración de PEGDE. Las vibraciones
de deformación de la amina usualmente producen bandas bien definidas en la región de
1638–1575 cm-1. En consecuencia, la banda ubicada a 1550 cm− 1 también puede ser
asignada a la vibración de deformación de la amina. La disminución en la intensidad de
dicha banda, cuando aumenta la concentración de PEGDE, podría deberse a que los
grupos epoxídicos del PEGDE reaccionan con los grupos amino del quitosano y con los
grupos carboxilo de las moléculas de HNa, disminuyendo la concentración de grupos
amino.
Las bandas a 1410 cm-1 y 1370 cm-1 se observan más intensas en las películas de
CHT/HNa30%/PEGDE 1 y 2, en comparación con las de 15% de HNa. También se observa
79
una disminución de las bandas a 1070 cm-1 y 1026 cm-1, atribuidas al estiramiento simétrico
C-O-C, conforme aumenta la concentración de PEGDE.
Las interacciones iónicas entre el quitosano y el ácido hialurónico pueden darse tanto en
los grupos amina del quitosano como en los grupos hidroxilo del ácido hialurónico. Cuando
se emplea GA. En las muestras entrecruzadas con GA la banda ubicada a 1630 cm-1 se
observa con menor intensidad en comparación con la de 1550 cm-1 atribuida a N-H. Al igual
que en las muestras entrecruzadas con PEGDE se observa una diminución de las bandas
a 1070 cm-1 y 1026 cm-1 conforme aumenta la concentración de PEGDE.
La interpretación de los resultados obtenidos es difícil debido a la complejidad de los
polisacáridos y a la superposición de las bandas características de los polímeros en la
misma región. La formación de puentes de hidrógeno entre dos macromoléculas diferentes
compite con la formación de este tipo de enlaces entre moléculas del mismo polímero. La
influencia del HNa en los espectros de CHT-HNa puede verse minimizada debido a la
diferencia en la concentración entre el quitosano y el HNa.
Kutlusoy et al [11]. reportaron espectros de FTIR de criogeles de quitosano-ácido
hialurónico. Encontraron bandas amplias a 3272 cm-1 y 3266 cm-1, las cuales fueron
atribuidas a grupos hidroxilo, mientras que en nuestras muestras solo se observa la banda
ubicada a 3320 cm-1. También encontraron bandas de flexión del C-H a 1405 cm-1 y 1374
cm-1 y una banda del estiramiento C-N a 1248 cm-1. Estos resultados concuerdan con los
obtenidos en nuestro análisis.
Hwang et al. [181] analizaron el espectro de FTIR de una matriz de HNa entrecruzadas con
PEGDE; indicaron que el grupo epóxido de PEGDE puede reaccionar con los grupos –
COOH (1035 cm-1) y –OH (3200–3600 cm-1) en el HNa para formar enlaces éster y éter
después de reaccionar con el PEGDE. Sin embargo, tanto en su estudio como en el nuestro,
no se observaron bandas representativas de la formación de enlaces tipo éster (1730 cm-
1), lo que es consistente con lo reportado acerca de que la relación de formación de enlaces
éster es bastante baja. Hwang et al sugieren que el entrecruzamiento del HNa y PEGDE,
se basa principalmente en la formación de enlaces de éter entre el grupo hidroxilo del HNa
y el grupo epóxido de PEGDE. En nuestras películas de quitosano/HNa/PEGDE las bandas
características del PEGDE, a 1300 cm-1y 1370 cm-1, se desplazan cuando la concentración
de PEGDE aumenta, lo que confirmaría en entrecruzamiento del PEGDE con AH [181].
80
Espectroscopía Raman
Se presentan los espectros Raman del hialuronato de sodio en polvo (figura 3.24), así como
de las películas de quitosano modificadas con HNa a diferentes concentraciones y PEGDE
(figura 3.25).
Figura 3.24. Espectro Raman de películas hialuronato de sodio en polvo
Los espectros Raman pueden dividirse en varias subregiones: (1) vibraciones de
estiramiento de compuestos de carbonilo (1800–1500 cm− 1), (2) modos de deformación de
CH2 y C – OH (1500–1200 cm −1), (3) vibraciones de estiramiento de C-O y C-C (1200–950
cm − 1) y (4) vibraciones complejas esqueléticas fuera del plano (950–600 cm − 1) [182].
Las bandas características del CHT (figura 3.22) puro se observan 1100 cm-1 indican el
estiramiento de banda ẟ (C-C). La banda a 1370 cm-1 corresponde a la amida III. La banda
ubicada a 2830 cm-1 se asigna al C-CH3 [183].
En la figura 3.23 se presentan los espectros obtenidos de las películas de quitosano con
hialuronato de sodio al 15% (figura 3.22-a) y al 30% (figura 3.22-b), entrecruzadas con
PEGDE a diferentes concentraciones. Las principales señales que se observaron en las
películas de CHT/HNa/PEGDE fueron 2940 cm1, atribuida enlaces C-H y CH3. La banda a
1370 cm-1 fue asignada a vibraciones combinadas de flexión en el plano de varios grupos
(CH2), (CH), (OH). También se observa un aumento de intensidad de la banda de 2890
cm-1 al aumentar la concentración de PEGDE en las películas con 30% de HNa.
500 1000 1500 2000 2500 30000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1048
2900
1645
2934
1130 1360
In
tensi
dad
Ram
an (
u.a
)
Número de onda (cm-1)
2940
81
Figura 3.25. Espectros Raman de películas de quitosano a) CHT/HNa15% y entrecruzadas con PEDGE (CHT-HA15%-PEDGE 1, 2, 3) y b) de las películas de CHT/
HNa 30%, CHT/ HNa 30% entrecruzadas con PEGDE (CHT-PEGDE 1,2,3)
Análisis Termogravimétrico (TGA)
En la figura 3.26 y la Tabla 3.12 se presentan los resultados obtenidos del análisis
termogravimétrico (TGA) y la primera derivada de la pérdida de masa (DTG) de las películas
de quitosano con hialuronato de sodio a 15%y 30%, entrecruzado con PEGDE a distintas
concentraciones y quitosano con hialuronato de sodio entrecruzado con glutaraldehído.
Los polisacáridos son generalmente altamente afines al agua, por lo que pueden hidratarse
rápidamente debido a estructuras irregulares en sus macromoléculas; por lo tanto, las
películas pueden presentan una degradación térmica a varias temperaturas cuando se
agrega ácido hialurónico o algún entrecruzante [11].
Se puede observar que el perfil de degradación (Tabla 3.12) para todas las películas
presenta dos etapas: la primera ubicada entre 56 y 70°C (Td1) y la segunda de 285 a 300ºC
(Td2) para la concentración de HNa 15%, y de 60-63°C (Td1) y de 272 a 300°C (Td2) para
la concentración de 30% de HNa. La primera pérdida de masa para todas las películas de
las muestras investigadas se situó entre 7-12%. Esta etapa se relacionó con la pérdida de
agua y ácido residual por evaporación, lo que significa que el agua es retenida físicamente
por los débiles enlaces de hidrógeno al quitosano.
500 1000 1500 2000 2500 3000
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
Inte
nsi
da
d R
am
an
(u
.a)
Desplazamiento Raman (cm-1)
1377
28822935
1110
CHT-HA15% -PEGDE1
CHT-HA15%
CHT-HA15% -PEGDE2
CHT-HA15% -PEGDE3
1000 2000 3000
0
1
2
3
4
Inte
nsi
dad
Ra
ma
n (u
.a)
Desplazamiento Raman (cm-1)
1373
28822930
1110
CHT-HA30% -PEGDE1
CHT-HA30%
CHT-HA30% -PEGDE2
CHT-HA30% -PEGDE3
(a) (b)
82
Figura 3.26. Análisis termogravimétrico (a, c) y DTGA (b, d) de termogramas (superior) quitosano/HNa 15% (CHT-HA15%), (inferior) quitosano/ HNa 30% (CHT-HA30%),
quitosano / HNa 15% y 30% entrecruzado glutaraldehído (CHT-HA 15% y 30%-GA) y quitosano HNa 15% y 30% entrecruzado con polietilenglicol diglicidil éter (CHT-HA 15% y
30%-PEGDE)
La segunda pérdida de masa se situó entre 52-66%. Dicha pérdida de masa se atribuyó a
la degradación (térmica) del quitosano, vaporización y eliminación de productos volátiles.
La descomposición térmica de la estructura del quitosano tiene lugar después de su
calentamiento a 200-300°C. Réef et al. reportan que la degradación del ácido hialurónico se
produce entre la temperatura ambiente y 200°C, con una pérdida de aproximadamente
16%, la cual corresponde a la evaporación del agua libre y estructural y una pronunciada
(b)
100 200 300 400 500 600 700-12
-11
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
Q-AH15%
Q-AH15%-PEGDE1
Q-AH15%-PEGDE2
Q-AH15%-PEGDE3
Q-AH15%-GA
AH
Pri
me
ra d
eri
vad
a (
% T
)
Temperatura (°C)
(d)
100 200 300 400 500 600 700-12
-11
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
Q-AH30%
Q-AH30%-PEGDE1
Q-AH30%-PEGDE2
Q-AH30%-PEGDE3
Q-AH30%-GA
AH
Prim
era
deriva
da (
% T
)
Temperatura (°C)
(a)
100 200 300 400 500 600 700
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 Q-AH15%
Q-AH15%-PEGDE1
Q-AH15%-PEGDE2
Q-AH15%-PEGDE3
Q-AH15%-GA
AH
Ma
sa (
%)
Temperatura (°C)
100 200 300 400 500 600 700
0
20
40
60
80
100 Q-AH30%
Q-AH30%-PEGDE1
Q-AH30%-PEGDE2
Q-AH30%-PEGDE3
Q-AH30%-GA
AH
Mas
a (
%)
Temperatura (°C)
(c)
83
pérdida de masa a 210°C que atribuyen la degradación del propio ácido hialurónico [184].
En nuestro estudio el HNa presentó una Td de 220°c similar a la reportada en la literatura.
Al comparar la Td1 de las películas de quitosano puro sin entrecruzantes (secas a 25°C), no
se observan cambios importantes para ambas concentraciones de HNa. Para la Td2 se
observa un aumento de la temperatura en la película con HNa al 15% (386°C) en
comparación con el quitosano puro (297°C), mientras que la temperatura para el HNa al
30% se mantienen similares (292°C). Esto indica que al aumentar la concentración de HNa,
no disminuye la estabilidad térmica del material.
Cuando las películas se entrecruzan con PEGDE se observan un aumento de la Td1 y Td2
(Tabla 3.12) con ambas concentraciones de HNa, siendo más evidente en las películas de
HNa al 15%. Mientras que para las películas entrecruzadas con PEGDE3 solo se observa
un ligero incremento de la Td2 en las películas con HNa al 15%. Esto concuerda con lo
observado para la Td1 que al aumentar la concentración de AH en presencia del PEGDE,
disminuye la estabilidad térmica del material y se asemeja más a los valores registrados
para el quitosano puro.
En las películas con 15% de HNa, la que exhibió una pérdida de masa de 50% a
temperaturas menos elevadas corresponde a la de quitosano entrecruzada con GA (276°C),
y la que presentó una mejor estabilidad térmica fue la de quitosano entrecruzado con mayor
concentración de PEGDE (PEGDE3) (298°C). En contraste en las películas con 30% de
HNa la que presentó una mayor estabilidad térmica fue la película de quitosano
entrecruzado con GA (348°C) debido a que la densidad del entrecruzamiento con GA, así
como las interacciones secundarias entre las cadenas de quitosano y hialuronato de sodio
son las más altas en esta composición [11].
Esto indicaría que una mayor concentración de HNa cuando se entrecruza con PEGDE
disminuye la estabilidad térmica de las películas.
Kutlusoy et al. [11], reportan que a medida que aumenta la cantidad de ácido hialurónico,
la estabilidad térmica y la cantidad de carbón disminuyen, este efecto lo notamos en
nuestras películas ya que se observó que una disminución de Td1 y Td2 cuando la
concentración de HNa fue mayor (30%).
84
Tabla 3.12 Temperaturas máximas y pérdida de peso de las películas de
quitosano/AH 15%/PEGDE entrecruzadas con glutaraldehído y con PEGDE.
La pérdida de masa al 50% de las películas de CHT/HNa15% es mayor en comparación
con las películas de CHT seco a 25°C dicho efecto se observa en todas las películas con
HNa al 15%, registrándose un descenso de la temperatura de aproximadamente 50°C. Sin
embargo, al incrementar la concentración de AH al 30%, la temperatura aumenta, llegando
a niveles muy parecidos a los del quitosano sin hialuronato de sodio.
Difracción de Rayos X (DRX)
En la figura 3.27 se observa el patrón por difracción de rayos X, del ácido hialurónico
empleado en la presente investigación. Como puede apreciarse es mucho más amorfo que
la quitosana pura. En la Tabla 3.13 se presenta el porcentaje de cristalinidad de las películas
de CHT con hialuronato de sodio.
Figura 3.27. Difractograma del ácido hialurónico
Películas HA 15 % HA 30% HA 15% HA 30%
Td (°C) T (°C) a 50% pérdida de masa
Td1 Td2 Td1 Td2
CHT-HNa 68+ 2 386+ 1 60+ 4 292+ 1 295+ 3 360+ 4
CHT- HNa -PEGDE 1 70+ 1 344+ 2 63+ 2 285+ 1 295+ 5 349+ 1
CHT- HNa -PEGDE 2 70+ 2 348+ 3 63+ 5 295+ 3 290+ 2 340+ 2
CHT- HNa -PEGDE 3 64+ 2 338+ 3 62+ 2 300+ 2 298+ 1 340+ 2
CHT- HNa -GA 56+ 1 354+ 1 61+ 2 272+ 1 276+ 2 358+ 1
85
Acerca de la difracción de rayos X del ácido hialurónico, Meyer sugirió que los hialuronatos
de alto peso molecular pueden contener algunos enlaces no glucosídicos que actúan como
puntos de ramificación. La eliminación de estas ramas mediante tratamiento ácido puede
causar despolimerización y al mismo tiempo permitir la organización cristalina [185].
Sheehan et al. reportaron que la conformación de las cadenas de hialuronato en estado
sólido es dependiente de la naturaleza de los cationes presentes, del pH y de la temperatura
a la que se realiza la cristalización, pero no a la fuerza iónica de la solución a partir de la
cual se moldean las películas. Dependiendo del catión presente, la cristalización exitosa de
estas conformaciones requiere la presencia de varias moléculas de agua [186]. Sin
embargo, el hialuronato de sodio empleado en nuestras muestras fue amorfo. Se han
reportado picos de hialuronato aproximadamente a 2θ= 26° y 32°, sin embargo, estos no
se observaron en nuestras muestras [187].
Los estudios de difracción de rayos X han demostrado, hasta ahora, que las películas o
fibras de ácido hialurónico son de naturaleza amorfa [188]. En la figura 3.28 se presentan
los difractogramas de las películas de quitosano con HNa al 15% y 30%, entrecruzadas con
PEGDE y GA.
En todos los difractogramas se observa el patrón de difracción característico del quitosano
con picos ubicados a 2θ = 9.5 y 20º.
Figura 3.28. Difractogramas de las películas de (a) quitosano-HNa 15%, (CHT-HA15%), CHT-AH15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA15%GA), CHT/HNa entrecruzado con PEDGE (CHT-HA15%PEDGE 1,2,3) (b) quitosano-HNa 30% (CHT-HA30%), CHT-
HNa15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA30%GA), CHT/HNa entrecruzado con PEDGE (CHT-HA30%PEDGE 1,2,3)
(a) (b)
5 10 15 20 25 30
Inte
nsi
dad
(U.A
.)
CHT-HA30%
CHT-HA30%-GA
CHT-HA30% -PEGDE1
CHT-HA30% -PEGDE2
CHT-HA30% -PEGDE3
2q
9.5°
5.6°
20°
5 10 15 20 25 30
Inte
nsid
ad (
U.A
.)
CHT-HA15%
CHT-HA15%-GA
CHT-HA15% -PEGDE1
CHT-HA15% -PEGDE2
CHT-HA15% -PEGDE3
2q
9.5°
5.6°
20°
86
En los difractogramas de las película de quitosano con ácido hialurónico sin entrecruzante,
se observan un pico adicional en la región de 5º, similares a los reportados por Nath et al.
[88] quienes señalan que puede atribuirse a la formación de complejos más ordenados,
induciendo un cambio en la cristalinidad. En la película con 30% de HNa, la intensidad del
pico a 2θ = 20º aumenta ligeramente en las muestras entrecruzadas con PEGDE3.
Las películas entrecruzadas con PEGDE a diferentes concentraciones se exhiben picos
similares a los de las películas sin entrecruzante, es decir, la formación de una estructura
más amorfa donde, por ejemplo, se observa una disminución del pico ubicado a 2θ = 9.5°
conforme aumenta la cantidad de PEGDE. No se observan cambios evidentes en los
difractogramas de las películas de HNa al 15% en comparación con las de 30%. Las
muestras entrecruzadas con GA fueron amorfas para ambas concentraciones de HNa.
La cristalinidad de las muestras de quitosana con ácido hialurónico disminuyó con la
presencia de este último y cuando la muestra fue entrecruzada; es decir, una forma de
modificar la cristalinidad sin recurrir a tratamientos térmicos o entrecruzamiento es mediante
la adición de una segunda fase polimérica.
Tabla 3.13 Porcentaje de cristalinidad de películas CHT-HNa al 15% y 30%
XPS
En la figura 3.29 se muestra el espectro de inspección de las películas de CHT/ NHa con
y sin entrecruzante mediante espectroscopia fotoelectrónica de rayos X. Los elementos
presentes en todas las muestras fueron carbono, oxígeno y nitrógeno. El contenido de
dichos elementos se resume en la tabla 3.14
CrI%
Películas 15% 30% CHT 60.76 46.05 CHT-PEGDE 1 42.12 43.24 CHT-PEGDE 2 31.56 46.66 CHT-PEGDE 3 19.5 27.86 CHT-GA 25.66 16.88
87
Figura 39. Espectros de inspección (survey) de XPS de (a) quitosano- NHa 15%, (CHT-HA15%), CHT- NHa 15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA15%GA), CHT- NHa
entrecruzado con PEDGE (CHT-HA15%PEDGE 1,2,3) (b) quitosano-AH 30% (CHT-HA30%), CHT- NHa 15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA30%GA), CHT- NHa
entrecruzado con PEDGE (CHT-HA30%PEDGE 1,2,3)
Tabla 3.14 Porcentaje atómico por XPS de C, O, N de películas de quitosano/AH 15%
entrecruzadas con GA y PEGDE
Debido a que el AH y el quitosano son polisacáridos, sus estructuras moleculares son muy
similares y su única diferencia radica en el grupo carboxilo en el AH y los grupos amino en
quitosano [179].
En las muestras de quitosano/NHa 15% el contenido de oxígeno aumento cuando se
entrecruzaron PEGDE (28%). Mientras que el del nitrógeno disminuyó de 5% a 3%. Sin
embargo, la presencia de NHa no fue fácilmente detectada ni como un aumento en oxigeno
o disminución de nitrógeno ni como aumento en la concentración de sodio.
En la sección de anexos (Anexo 4 y 5) se presentan las deconvoluciones de C, O, y N de
cada una de las muestras analizadas, con HNa al 15% y 30%.
CHT CHT-PEGDE1 CHT-PEGDE2 CHT-PEGDE3 CHT-GA
AH 15% 30% 15% 30% 15% 30% 15% 30% 15% 30%
%C 69.14+ 3 76.6+ 5 76.2+ 2 74.93 + 4 69.3+ 1 75.22+ 2 66 + 5 74 + 3 75.5+ 1 75+ 2 %O 24.67+ 2 18.4+ 1 20.56+ 1 20.11 + 2 25.67+ 3 22 + 1 27.8+ 3 20 + 2 21.2+ 2 22 + 3 %N 4.79+ 2 3+ 0.2 2.72+ 0.9 3.21+ 0.8 3.7+ 0.9 1.85+ 1 4.10+ 1 3.9 + 1 2.62+ 0.8 3 + 1 %Na 0.27+ 0.2 1.26+0.5 0.52+ 0.4 0.73+ 0.1 0.8+ 0.2 0.9+ 0.3 0.83+ 0.2 0.96+ 0.1 0.68+ 0.2 - %Si 0.88+ 0.8 0.74+0.3 - 1.02+ 0.9 - - 1.27+ 1 0.79+ 0.3 - - %Ca 0.25+ 0.1 - - - 0.5+ 0.2 - - 0.35+ 0.5 - -
1400 1200 1000 800 600 400 200
CHT-HA30%-GA
CHT-HA30%-PEGDE3
CHT-HA30%-PEGDE2
CHT-HA30%-PEGDE1
CHT-HA30%
Inte
nsi
dad (
Conte
o/ s)
Energía de enlace (eV)
O1sC1s
N1s
1400 1200 1000 800 600 400 200 0
CHT-HA15%-GA
CHT-HA15%-PEGDE3
CHT-HA15%-PEGDE2
CHT-HA15%-PEGDE1
CHT-HA15%
Inte
nsid
ad (
Con
teo/ s
)
Energía de enlace (eV)
O1s C1s
N1s
(a) (b)
88
Ángulos de contacto
En la figura 3.30 se presentan las fotografías y los valores obtenidos de la medición de
ángulos de contacto en películas de quitosano con HNa al 15% y 30%, entrecruzadas con
PEGDE y GA. Las mediciones se llevaron a cabo utilizando H2O destilada y DMEM bajo
en glucosa.
La humectabilidad de una superficie está determinada por la química de la superficie y la
topografía de esta. En una superficie para una película ideal, que es plana, lisa y
químicamente homogénea, el ángulo de contacto disminuirá a medida que aumente la
polaridad de la superficie. Como se observa en los resultados obtenidos de la medición de
ángulos de contacto, la incorporación de una mayor concentración de HNa, disminuye los
ángulos de contacto, esto concuerda con lo reportado en la literatura [179].
Por lo que se puede sugerir que la humectabilidad y la hidrofilia de las películas CHT-HNa
mejoraron notablemente con la incorporación de HNa. Este efecto también puede
explicarse debido a que las películas de quitosano con ácido hialurónico poseen una
estructura química compleja con grupos amida, amina y carboxilo, y el ángulo de contacto
en una superficie CHT-AH debe reflejar la integración de estos grupos. Quizás esta
integración da como resultado una mayor polaridad en la superficie de la película de CHT-
HNa, reflejándose como un menor ángulo de contacto.
Figura 4 Imágenes y valores obtenidos de las películas de quitosano modificadas con HNa al 15% y 30%, y de las películas de quitosano modificadas con HNa entrecruzadas
con PEGDE 1, 2 y 3 y con GA.
89
Todas las películas se mostraron hidrofílicas, cuando se empleó H2O; la película que
presentó más hidrofilia fue la de CHT/HNa 30% con mayor concentración de PEGDE
(PEGDE3) con un ángulo de 7°, seguida de la película de CHT/AH 30% entrecruzada con
GA, presentando un ángulo de 12°. Las películas menos hidrofílicas fueron las de quitosano
sin entrecruzante.
Cuando se empleó DMEM, se observó una mayor hidrofilia en las muestras de CHT/HNa
30% entrecruzada con GA (18°), y al igual que en las muestras donde se utilizó H2O las
películas menos hidrofílicas fueron las de quitosano sin entrecruzante (74°).
La mejora de la hidrofilia cuando se incorpora ácido hialurónico al quitosano puede tener
efectos positivos en la citocompatibilidad [170].
Análisis de microscopía de fuerza atómica (AFM)
Se empleó microscopía de fuerza atómica (AFM) para evaluar la topografía de la superficie
de las películas de quitosano con ácido hialurónico entrecruzadas con glutaraldehído y
PEGDE a diferentes concentraciones. En la Tabla 3.15 se presentan los cálculos de
rugosidad obtenidos. En la figura 3.31 se observan las micrografías de cada tipo de
muestra.
Tabla 3.15 Rugosidad de las superficies de las películas de quitosano y ácido
hialurónico entrecruzado con PEGDE y GA
Tipo de muestra Rugosidad (nm) Q-AH15 150.5 + 16.8* QP1-AH15 85.3 + 9.6 QP2-AH15 56.8 + 5.8 QP3-AH15 61.2 + 5.2 QGA-AH15 44.6 + 5.9 Q-AH30 31.7 + 2.6 QP1-AH30 106.2 + 8.9* QP2-AH30 87.8 + 6.9 QP3-AH30 134.3 + 14.2* QG-AH30 52.6 + 7.2 Q50-AH50 64.7 + 7.3
90
Figura 3.31. Topografía 2D de las películas de quitosano con HNa al 15% (superior, a - e) y al 30% (inferior, f – j); a: CHT, b: CHT/PEDGE1, c: CHT/PEDGE2, d: CHT/PEDGE3,
e: CHT/GA, f: CHT, g: CHT/PEDGE1, h: CHT/PEDGE2, i: CHT/PEDGE3, j: CHT/GA.
Las películas que exhibieron mayor rugosidad fueron las de quitosano con ácido hialurónico
al 15%, con un valor de Ra de 150.5, seguida de las películas de CHT/HNa30%/PEGDE3
y CHT/HNa30%/PEGDE1 con valores de 134.3 y 106 respectivamente. La muestra de
CHT/HNa30% presentó una superficie relativamente plana y lisa.
Estos valores son importantes cuando se relacionan con el efecto que puedan tener sobre
la adhesión celular [189]. La adhesión celular y la proliferación en soportes poliméricos se
pueden modular por muchos factores relacionados con los parámetros de la superficie y la
respuesta mecánica, como la hidrofilia, la rugosidad, la carga o la rigidez. Se considera que
una carga positiva en la superficie polimérica tiene un impacto positivo en la adhesión y
proliferación celular ya que las membranas celulares tienen carga negativa.[190]
La topografía superficial de las películas de quitosano exhibe una estructura de bien
definida que podría estar relacionada con la cristalinidad de la muestra. En el caso de las
películas de CHT/HNa, los parámetros de rugosidad cambian de manera no uniforme y son
visiblemente mayores a comparación con las películas de quitosano sin HNa.
Lewandowska [191] señala que las fuerzas de repulsión y/o las interacciones electrostáticas
entre los componentes de este tipo de mezclas pueden llevar a un aumento en el tamaño
del microdominio. Estas interacciones juegan un papel importante en la estructura y
propiedades de las mezclas de polímeros binarios y ternarios. Los biopolímeros usados, es
91
decir, el ácido hialurónico y el quitosano son polielectrolitos, en los cuales las propiedades
están fuertemente asociadas con las interacciones electrostáticas que determinan la forma
de la macromolécula. En la solución acuosa de un polielectrolito, las macromoléculas se
estiran debido a las fuerzas repulsivas electrostáticas entre las cargas en los grupos
funcionales. Por lo que, en estas mezclas, predominan principalmente las interacciones
por enlaces de hidrógeno y las fuerzas repulsivas. Estos factores pueden conducir a la
disminución de la homogeneidad de la superficie y aumentar la rugosidad en estas
composiciones [191].
3.2.2 Estudios de viabilidad celular y proliferación de los andamios de quitosano/AH,
quitosano/AH entrecruzado con glutaraldehído y quitosano/AH entrecruzado con
PEGDE
Proliferación de osteoblastos determinada con MTS
Cuando se desarrollan materiales para aplicaciones biomédicas un factor muy importante
a considerar es la toxicidad. Los estudios de citotoxicidad pueden realizarse mediante la
determinación de la viabilidad celular por medio de ensayos como MTS [192]. La ausencia
de efectos citotóxicos hace que el material se considere un candidato adecuado para
futuras investigaciones biomédicas. En el presente estudio, se realizó la prueba de
citotoxicidad por MTS, de las películas de quitosano con hialuronato de sodio al 15% y 30%,
entrecruzadas con glutaraldehído y con diferentes concentraciones de PEGDE. En la figura
3.32 se presentan los resultados obtenidos de la viabilidad celular de las muestras antes
mencionadas.
92
Figura 3.32. (a) Viabilidad de osteoblastos en contacto directo en películas de quitosano (CHT) con ácido hialurónico (AH) al 15% y 30%, y de quitosano- ácido hialurónico
entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y quitosano-ácido hialurónico entrecruzado con PEDGE (CHT-PEDGE) a 0.114 mM (1), 0.228 mM (2) y 0.342 mM (3)
Los resultados nos muestran que la viabilidad celular de los andamios de quitosano con
HNa fue mayor cuando se empeló una concentración del 15%, ya que se puede observar
una ligera disminución de la viabilidad, en todos los andamios (CHT sin entrecruzante y
entrecruzados con PEGDE1,2,3 y con GA) cuando se aumenta la concentración de HNa a
30%. Esto se confirma con el análisis estadístico arrojando un valor de p=0.004, al comparar
los andamios con 15% y 30% de HNa (figura 3.33).
93
Figura 3.33. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS de los andamios de quitosano con HNa al 15% y 30%.
Los andamios de quitosano sin hialuronato manifestaron un aumento en el porcentaje de
viabilidad con la adición de HNa, siendo estadísticamente significativo (p=0.000) para
ambas concentraciones, 15% y 30. Al realizar la comparación de la proliferación celular de
los andamios de CHT/PEGDE con los de CHT/PEGDE/HNa se encontró una diferencia
estadísticamente significativa (p=0.001) en CHT/PEGDE1 seco a 25°C con su homólogo
con 15% de HNa. Para la concentración intermedia (PEGDE2) no se detectaron diferencias
estadísticamente significativas entre ninguna de las muestras; es decir, los andamios secos
a 25°C y 150°C sin HNa, y con la adición de 15% y 30% de HNa presentan la misma
proliferación celular, independientemente de la temperatura de secado o la concentración
de hialuronato.
En cuanto a PEGDE3, los andamios con HNa presentaron una mayor viabilidad celular
sobre los andamios sin hialuronato, secos a 25°C y 150°C. En ambas muestras de (HNa
15% y 30%) se obtuvo un valor de p=0.000. Lo que nos indica que para los andamios con
la mayor concentración de PEGDE (3), la adición de HNa sí mejora la viabilidad celular.
Cabe mencionar que entre las muestras con HNa al 15% y HNa al 30% con PEGDE 3
también se registró una diferencia significativa, p=0.001, siendo mayor la proliferación de
osteoblastos en las muestras con HNa al 15%.
p=0.004
94
Con relación a los andamios con GA, solo se observa una mejora de la proliferación celular
en los andamios con la menor concentración de HNa (15%) (p=0.039), tanto para las
muestras con secado a 25°C como para las de secado a 150°C.
Analizando las muestras en cuanto al efecto de la concentración de HNa (figura 3.34), todos
los andamios presentaron valores semejantes de proliferación, siendo el andamio de
CHT/HNa con GA el único que presentó un valor menor al de las demás muestras, p=0.000
para la concentración del 15% y p=0.005 para la concentración del 30%.
Basándonos en estos resultados podemos inferir que si bien si existe una mejora en la
proliferación celular al emplear PEGDE como entrecruzante, esta diferencia no es
estadísticamente significativa al valor registrado para los andamios de CHT puro con HNa.
Kutlusoy et al. reportan que el uso de bajas concentraciones de glutaraldehído no afecta el
crecimiento y la proliferación celular, lo que coincide con lo encontrado en la presente
investigación. A pesar de que se observa proliferación de osteoblastos en las muestras con
GA, estas presentaron los valores más bajos para ambas concentraciones de HNa (15% y
30%) [11].
La mayor capacidad de absorción y retención de agua en las películas de quitosano cuando
se les incorpora grandes concentraciones de AH, hace que se retenga significativamente
más agua. Este efecto de podría minimizar la adhesión celular, lo que explicaría porque las
películas con HNa al 30% mostraron menor viabilidad celular [193].
Nath et al. [88] evaluaron la adhesión y proliferación celular en andamios de quitosano-
ácido hialurónico después de 1, 3, 5 y 7 días de cultivo. Reportan una diferencia significativa
en el comportamiento celular de los andamios a partir del tercer día, por lo que concluyen
que la superficie y la estructura extracelular del ácido hialurónico mejora la proliferación
sobre los andamios. Estos resultados coincidieron con estudios previos que sugieren que
los andamios basados en quitosano-ácido hialurónico (hidrogeles, fibras electrohiladas)
proporcionan una superficie favorable para la adhesión y proliferación celular.
Cuando se incorporó PEGDE a nuestros andamios el mayor porcentaje de viabilidad celular
se observó en los andamios con la concentración más baja (PEGDE1). Una concentración
relativamente alta de PEGDE y EGDE con un alto grado de entrecruzamiento podría
generar una disminución en la biocompatibilidad de los andamios con HNa [115].
95
Figura 3.34. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS de andamios de quitosano con HNa a) 15% b) 30%
(a)
(b)
96
Análisis de adhesión celular mediante Microscopía Electrónica de Barrido (MEB)
Se realizó el análisis por microscopia electrónica de barrido, para conocer la localización y
la posible adhesión de los osteoblastos en los andamios de este estudio. La distribución
celular, se evaluó al cabo de 2 días de incubación mediante ensayos en contacto directo e
indirecto. Las imágenes obtenidas se presentan en la figura 3.35. Como se puede apreciar
en las imágenes, se observa una mejor interacción y morfología celular en el ensayo en
contacto directo, ya que las prolongaciones citoplasmáticas y las células se van
organizando en forma de racimos.
En las películas de quitosano con HNa al 15%, la biocompatibilidad mejora cuando se
entrecruza con PEGDE, observándose una mejor morfología celular en las muestras con
menor concentración de PEGDE (PEGDE 1), este mismo efecto se observa en las películas
de AH al 30%. Lo anterior nos sugiere que el contenido del PEGDE ejerce una influencia
mayor en aumentar la biocompatibilidad que inclusive el HNa.
La viabilidad es nula o escasa en las muestras de CHT/AH entrecruzadas con
glutaraldehído, en ambas concentraciones de AH.
Balagangadharan et al. reportan una buena adhesión y viabilidad de condrocitos, en
andamios con ácido hialurónico. Observaron proliferación y distribución celular a manera
de nódulos conformados por grandes acúmulos de células redondeadas [28]. Nuestros
resultados no solo mostraron la adhesión y una buena viabilidad de osteoblastos a los
andamios de CHT/NHa/PEGDE, sino que también se observa dicha agregación celular en
forma de grandes nódulos compuestos por grupos de células esféricas, a lo que seguiría la
síntesis y secreción de componentes de la matriz autóloga y la consiguiente formación ósea
[181].
Mediante los resultados obtenidos por los ensayos de biocompatibilidad se puede concluir
que los andamios de quitosano con ácido hialurónico no son citotóxicos y presentan
suficiente viabilidad y proliferación celular. Al igual que en los andamios libres de HNa,
cuando se emplea PEGDE como entrecruzante la proliferación celular aumenta en los
andamios de quitosano con hialuronato de sodio.
97
Figura. 3.35. Imágenes por MEB de osteoblastos cultivados en andamios de CHT/AH en contacto directo e indirecto.
98
4. CONCLUSIONES
Con base en los resultados obtenidos se puede concluir que existe entrecruzamiento del
quitosano con los agentes entrecruzantes empleados (glutaraldehído y PEGDE) en las
películas elaboradas. Esto se corroboró mediante FTIR donde se detectaron cambios en la
relación amida I /amida II de las películas con entrecruzante en comparación con las
películas de quitosano sin entrecruzante.
Por medio de los análisis termogravimétricos se determinó que la degradación térmica de
las películas de quitosano se lleva a cabo en 2 etapas la primera corresponde a la pérdida
de agua terminando alrededor de 150 ℃ y la segunda corresponde a la degradación del
polímero a partir de 300 ºC.
En los difractogramas obtenidos mediante difracción de rayos X, se observó que las
películas entrecruzadas con PEGDE son menos cristalinas (es decir, tienden a ser más
amorfas) que las películas de quitosano sin agente entrecruzante, este efecto se incrementa
en las películas secadas en la estufa a 150ºC. Sin embargo, también fue evidente la
presencia de múltiples estructuras ordenadas (picos adicionales a 9.5° y 20° encontrados
a 5.5°, 12° y 15°) las cuales fueron dependientes no solo del agente de entrecruzamiento
empleado sino también del tratamiento térmico o de secado empleado. Estas estructuras
cristalinas u ordenadas también pueden perderse mediante la adición de un segundo
polímero de naturaleza amorfa como el ácido hialurónico.
En el análisis de EDX, el contenido de oxígeno aumento a medida que aumentaba la
concentración de PEGDE lo que confirma el entrecruzamiento con la incorporación de esta
molécula en el quitosano.
En el análisis por XPS el contenido de carbono aumentó en todas las películas, de igual
manera el oxígeno aumentó en las películas entrecruzadas con GA y PEGDE.
El entrecruzamiento también condujo a películas con mayor módulo elástico donde éste fue
mayor en el quitosano entrecruzadas con PEGDE3.
99
La viabilidad de osteoblastos no fue afectada por el entrecruzamiento de la quitosana con
PEGDE a bajas concentraciones. En este estudio fue evidente que la presencia de grupos
amino no es el único requerimiento para garantizar una buena adhesión en el quitosano ya
que muestras entrecruzadas con PEGDE, con menor concentración de grupos amino libres,
mostraron una alta proliferación celular. Mediante la expresión de vinculina e integrina 1β
también se demostró una buena adhesión celular.
La incorporación del AH al quitosano fue evidente mediante FTIR, Raman y DRX y se
observó que el PEGDE no solo es capaz de entrecruzar al quitosano sino también al ácido
hialurónico. En el análisis de XPS, el contenido de oxígeno aumentó a medida que
aumentaba la concentración de PEGDE y con la presencia de AH, lo que confirma su
incorporación al quitosano
La modificación de quitosano, quitosano/AH, con PEGDE permitió la obtención de
andamios con propiedades biocompatibles para el crecimiento de osteoblastos
En los ensayos de biocompatibilidad las películas de CHT-AH que mostraron una mejor
adhesión y viabilidad celular fueron las entrecruzadas con PEGDE. Sin embargo, un exceso
de AH (30%) no mejora su viabilidad celular. En contraste, muestras entrecruzadas con
glutaraldehído si son beneficiadas con la adición del ácido hialurónico.
Por lo tanto, el quitosano entrecruzado con PEGDE es una buena alternativa al
glutaraldehído no solo en términos de una mejor adhesión y alta viabilidad de osteoblastos.
Esto puede explotarse en la ingeniería del tejido óseo ya que no solo puede aplicarse en
forma de películas sino también para el relleno de grandes defectos óseos en forma de
esponjas obtenidas mediante liofilizado. La adición del ácido hialurónico no mejora mucho
más las propiedades conferidas por la incorporación del PEGDE, pero su naturaleza
antiadherente puede explotarse en el tratamiento de úlceras (aftas) donde no solo se
requieran propiedades antibacterianas sino también reparativas en la mucosa oral. En este
sentido, el entrecruzamiento con PEGDE es beneficioso ya que permite retener al ácido
hialurónico, compuesto altamente soluble en agua y que puede disolverse fácilmente si no
está unido químicamente al quitosano.
100
REFERENCIAS
[1] N. S. B. Amini AR, Laurencin CT, “Bone tissue engineering: recent advances and
challenges,” Crit Rev Biomed Eng, vol. 40, no. 5, pp. 363–408, 2012.
[2] “Periodontitis : facts , fallacies and the future,” vol. 75, pp. 7–23, 2017.
[3] and A. B. Susmita Bose, Mangal Roy, “Recent advances in bone tissue
engineering scaffolds,” Trends Biotechnol., vol. 30, no. 10, pp. 546–554, 2012.
[4] F. J. Rodríguez-Lozano et al., “Mesenchymal stem cells derived from dental
tissues.,” Int. Endod. J., vol. 44, no. 9, pp. 800–6, Sep. 2011.
[5] H. Shimauchi, E. Nemoto, H. Ishihata, and M. Shimomura, “Possible functional
scaffolds for periodontal regeneration,” Jpn. Dent. Sci. Rev., vol. 49, no. 4, pp. 118–
130, 2013.
[6] N.-H. Lin, S. Gronthos, and P. M. Bartold, “Stem cells and periodontal
regeneration.,” Aust Dent J, vol. 53, no. 2, pp. 108–21, 2008.
[7] M. Padial-Molina and H. F. Rios, “Stem Cells, Scaffolds and Gene Therapy for
Periodontal Engineering,” Curr. Oral Heal. Reports, vol. 1, no. 1, pp. 16–25, 2013.
[8] M. N. Collins and C. Birkinshaw, “Hyaluronic acid based scaffolds for tissue
engineering - A review,” Carbohydr. Polym., vol. 92, no. 2, pp. 1262–1279, 2013.
[9] M. Rodríguez-vázquez, B. Vega-ruiz, R. Ramos-zúñiga, D. A. Saldaña-koppel, and
L. F. Quiñones-olvera, “Chitosan and Its Potential Use as a Scaffold for Tissue
Engineering in Regenerative Medicine,” vol. 2015, 2015.
[10] P. D. Dalton and T. Woodfi, “Polymeric Scaffolds for Bone Tissue Engineering,”
Bone, vol. 32, no. 3, pp. 2004–2005, 2008.
[11] T. Kutlusoy, B. Oktay, N. K. Apohan, M. Süleymanoğlu, and S. E. Kuruca,
“Chitosan-co-Hyaluronic acid porous cryogels and their application in tissue
engineering,” Int. J. Biol. Macromol., vol. 103, pp. 366–378, 2017.
[12] P. R. Sivashankari and M. Prabaharan, “Prospects of chitosan-based scaffolds for
growth factor release in tissue engineering,” Int. J. Biol. Macromol., vol. 93, 2016.
[13] J. Venkatesan and S. K. Kim, “Chitosan composites for bone tissue engineering -
An overview,” Mar. Drugs, vol. 8, no. 8, pp. 2252–2266, 2010.
[14] T. Kamarul et al., “Biocompatibility and Toxicity of Poly(vinyl alcohol)/N,O-
Carboxymethyl Chitosan Scaffold,” vol. 2014, 2014.
[15] L. Ferroni et al., “A hyaluronan-based scaffold for the in vitro construction of dental
pulp-like tissue.,” Int. J. Mol. Sci., vol. 16, no. 3, pp. 4666–81, Jan. 2015.
101
[16] F. Croisier and C. Jérôme, “Chitosan-based biomaterials for tissue engineering,”
Eur. Polym. J., vol. 49, no. 4, pp. 780–792, 2013.
[17] X. Yang, X. Chen, and H. Wang, “Acceleration of osteogenic differentiation of
preosteoblastic cells by chitosan containing nanofibrous scaffolds,”
Biomacromolecules, vol. 10, no. 10, pp. 2772–2778, 2009.
[18] J. Li, J. Pan, L. Zhang, and Y. Yu, “Culture of hepatocytes on fructose-modified
chitosan scaffolds,” Biomaterials, vol. 24, no. 13, pp. 2317–2322, 2003.
[19] A. Barra, A. Romero, and J. Beltramino, “Obtencion De Quitosano,” Sitio Argentino
Prod. Anim., pp. 1–10, 2012.
[20] P. Kumar Dutta, J. Dutta, and V. S. Tripathi, “Chitin and chitosan: Chemistry,
properties and applications,” J. Sci. Ind. Res., vol. 63, no. January, pp. 20–31, 2004.
[21] T. Walimbe, A. Panitch, P. M. Sivasankar, and W. Lafayette, “A Review of
Hyaluronic Acid and Hyaluronic Acid-based Hydrogels for Vocal Fold Tissue
Engineering,” J. Voice, 2017.
[22] S. Mathews, S. A. Mathew, P. K. Gupta, R. Bhonde, and S. Totey,
“Glycosaminoglycans enhance osteoblast differentiation of bone marrow derived
human mesenchymal stem cells,” no. April 2012, pp. 143–152, 2014.
[23] C. CHIRCOV, “Hyaluronic acid-based scaffolds for tissue engineering,” vol. 59, no.
1, pp. 71–76, 2018.
[24] Z. Zhu, Y. Wang, J. Yang, and X. Luo, “Hyaluronic acid : a versatile biomaterial in
tissue engineering,” pp. 219–227, 2017.
[25] C. Muzzarelli and R. A. A. Muzzarelli, “Natural and artificial chitosan-inorganic
composites,” J. Inorg. Biochem., vol. 92, no. 2, pp. 89–94, 2002.
[26] M. Rodríguez-Vázquez, B. Vega-Ruiz, R. Ramos-Zúñiga, D. A. Saldaña-Koppel,
and L. F. Quiñones-Olvera, “Chitosan and Its Potential Use as a Scaffold for Tissue
Engineering in Regenerative Medicine,” Biomed Res. Int., vol. 2015, 2015.
[27] R. Raftery, F. J. O’Brien, and S. A. Cryan, “Chitosan for gene delivery and
orthopedic tissue engineering applications,” Molecules, vol. 18, no. 5, pp. 5611–
5647, 2013.
[28] K. Balagangadharan, S. Dhivya, and N. Selvamurugan, “Chitosan based nanofibers
in bone tissue engineering,” Int. J. Biol. Macromol., vol. 104, pp. 1372–1382, 2017.
[29] S. Deepthi, J. Venkatesan, S.-K. Kim, J. D. Bumgardner, and R. Jayakumar, “An
overview of chitin or chitosan/nano ceramic composite scaffolds for bone tissue
102
engineering,” Int. J. Biol. Macromol., vol. 93, pp. 1338–1353, 2016.
[30] S. Motamedian, P. Iranparvar, and G. Nahvi, “Bone Tissue Engineering: A Literature
Review,” Regeneration, vol. 1, no. 17, pp. 103–120, 2016.
[31] P. B. Malafaya, a. J. Pedro, a. Peterbauer, C. Gabriel, H. Redl, and R. L. Reis,
“Chitosan particles agglomerated scaffolds for cartilage and osteochondral tissue
engineering approaches with adipose tissue derived stem cells,” J. Mater. Sci.
Mater. Med., vol. 16, no. 12, pp. 1077–1085, 2005.
[32] S. Ge et al., “Bone repair by periodontal ligament stem cell-seeded
nanohydroxyapatite-chitosan scaffold,” Int. J. Nanomedicine, vol. 7, pp. 5405–5414,
2012.
[33] K. Tomihata and Y. Ikada, “In vitro and in vivo degradation of films of chitin and its
deacetylated derivatives,” Biomaterials, vol. 18, no. 7, pp. 567–575, 1997.
[34] Y. Xu, J. Han, Y. Chai, S. Yuan, H. Lin, and X. Zhang, “Development of porous
chitosan/tripolyphosphate scaffolds with tunable uncross-linking primary amine
content for bone tissue engineering,” Mater. Sci. Eng. C, vol. 85, pp. 182–190,
2018.
[35] S. B. Qasim, R. M. Delaine-Smith, T. Fey, A. Rawlinson, and I. U. Rehman, “Freeze
gelated porous membranes for periodontal tissue regeneration,” Acta Biomater., vol.
23, pp. 317–328, 2015.
[36] A. Arruda et al., “Performance of PRP Associated with Porous Chitosan as a
Composite Scaffold for Regenerative Medicine,” vol. 2015, 2015.
[37] H. Naderi-Meshkin et al., “Chitosan-based injectable hydrogel as a promising in situ
forming scaffold for cartilage tissue engineering,” Cell Biol. Int., vol. 38, no. 1, pp.
72–84, 2014.
[38] M. Naveed et al., “Chitosan oligosaccharide (COS): An overview,” Int. J. Biol.
Macromol., vol. 129, pp. 827–843, 2019.
[39] S. Kumari, P. Rath, A. Sri Hari Kumar, and T. N. Tiwari, “Extraction and
characterization of chitin and chitosan from fishery waste by chemical method,”
Environ. Technol. Innov., vol. 3, 2015.
[40] I. Corazzari et al., “Advanced physico-chemical characterization of chitosan by
means of TGA coupled on-line with FTIR and GCMS: Thermal degradation and
water adsorption capacity,” Polym. Degrad. Stab., vol. 112, pp. 1–9, 2015.
[41] C. K. S. Pillai, W. Paul, and C. P. Sharma, “Chitin and chitosan polymers:
103
Chemistry, solubility and fiber formation,” Prog. Polym. Sci., vol. 34, no. 7, pp. 641–
678, 2009.
[42] J. Z. Knaul, S. M. Hudson, K. A. M. Creber, and N. Carolina, “Crosslinking of
Chitosan Fibers with Dialdehydes : Proposal of a New Reaction Mechanism,” 1998.
[43] S. Demarger-andre and A. Domard, “Chitosan carboxylic acid salts in solution and
in the solid state,” vol. 23, pp. 211–219, 1994.
[44] P. K. Naito, Y. Ogawa, S. Kimura, T. Iwata, and M. Wada, “Crystal transition from
hydrated chitosan and chitosan/monocarboxylic acid complex to anhydrous chitosan
investigated by X-ray diffraction,” J. Polym. Sci. Part B Polym. Phys., vol. 53, no. 15,
pp. 1065–1069, 2015.
[45] W. Xie, P. Xu, and Q. Liu, “Antioxidant Activity of Water-Soluble Chitosan
Derivatives,” vol. 11, no. April, pp. 1699–1701, 2001.
[46] P. Zou et al., “Advances in characterisation and biological activities of chitosan and
chitosan oligosaccharides,” Food Chem., vol. 190, no. 12, pp. 1174–1181, 2016.
[47] R. A. A. Muzzarelli et al., “Chitosan taurocholate capacity to bind lipids and to
undergo enzymatic hydrolysis : An in vitro model,” vol. 66, pp. 363–371, 2006.
[48] J. Feng, L. Zhao, and Q. Yu, “Receptor-mediated stimulatory effect of oligochitosan
in macrophages,” vol. 317, pp. 414–420, 2004.
[49] R. Salah et al., “Anticancer activity of chemically prepared shrimp low molecular
weight chitin evaluation with the human monocyte leukaemia cell line, THP-1,” Int. J.
Biol. Macromol., vol. 52, no. 1, pp. 333–339, 2013.
[50] W. Xia, P. Liu, J. Zhang, and J. Chen, “Food Hydrocolloids Biological activities of
chitosan and chitooligosaccharides,” Food Hydrocoll., vol. 25, no. 2, pp. 170–179,
2011.
[51] M. Dash, F. Chiellini, R. M. Ottenbrite, and E. Chiellini, “Chitosan - A versatile semi-
synthetic polymer in biomedical applications,” Prog. Polym. Sci., vol. 36, no. 8, pp.
981–1014, 2011.
[52] R. Uppal, G. N. Ramaswamy, C. Arnold, R. Goodband, and Y. Wang, “Hyaluronic
acid nanofiber wound dressing-production, characterization, and in vivo behavior,”
J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater., vol. 97 B, no. 1, pp. 20–29, 2011.
[53] D. de Britto and S. P. Campana-Filho, “Kinetics of the thermal degradation of
chitosan,” Thermochim. Acta, vol. 465, no. 1–2, pp. 73–82, 2007.
[54] M. Rinaudo, “Chitin and chitosan: Properties and applications,” Prog. Polym. Sci.,
104
vol. 31, no. 7, pp. 603–632, 2006.
[55] M. Kumar, “A review of chitin and chitosan applications,” React. Funct. Polym., vol.
46, no. 1, pp. 1–27, 2000.
[56] C. A. Custódio, M. T. Cerqueira, A. P. Marques, R. L. Reis, and J. F. Mano, “Cell
selective chitosan microparticles as injectable cell carriers for tissue regeneration,”
Biomaterials, vol. 43, no. 1, pp. 23–31, 2015.
[57] K. J. Jeong et al., “In vivo study on the biocompatibility of chitosan-hydroxyapatite
film depending on degree of deacetylation,” J. Biomed. Mater. Res. - Part A, vol.
105, no. 6, pp. 1637–1645, 2017.
[58] S. Saravanan, R. S. Leena, and N. Selvamurugan, “Chitosan based biocomposite
scaffolds for bone tissue engineering,” Int. J. Biol. Macromol., vol. 93, pp. 1354–
1365, 2016.
[59] A. R. Costa-Pinto, R. L. Reis, and N. M. Neves, “Scaffolds Based Bone Tissue
Engineering: The Role of Chitosan,” Tissue Eng. Part B Rev., vol. 17, no. 5, pp.
331–347, 2011.
[60] A. Oryan and S. Sahvieh, “Effectiveness of chitosan scaffold in skin, bone and
cartilage healing,” Int. J. Biol. Macromol., vol. 104, pp. 1003–1011, 2017.
[61] K. Roy, H.-Q. Mao, S.-K. Huang, and K. W. Leong, “Oral gene delivery with
chitosan–DNA nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of
peanut allergy,” vol. 5, p. 387, Apr. 1999.
[62] R. Muzzarelli et al., “Biological activity of chitosan: ultrastructural study,”
Biomaterials, vol. 9, no. 3, pp. 247–252, 1988.
[63] A. Zubareva, B. Shagdarova, V. Varlamov, E. Kashirina, and E. Svirshchevskaya,
“Penetration and toxicity of chitosan and its derivatives,” Eur. Polym. J., vol. 93, no.
April, pp. 743–749, 2017.
[64] A. Muxika, A. Etxabide, J. Uranga, P. Guerrero, and K. de la Caba, “Chitosan as a
bioactive polymer: Processing, properties and applications,” International Journal of
Biological Macromolecules. 2017.
[65] M. Pourhaghgouy, A. Zamanian, M. Shahrezaee, and M. P. Masouleh,
“Physicochemical properties and bioactivity of freeze-cast chitosan nanocomposite
scaffolds reinforced with bioactive glass,” Mater. Sci. Eng. C, vol. 58, pp. 180–186,
2016.
[66] B. Kaczmarek, A. Sionkowska, and J. Skopinska-Wisniewska, “Influence of
105
glycosaminoglycans on the properties of thin films based on chitosan/collagen
blends,” J. Mech. Behav. Biomed. Mater., vol. 80, pp. 189–193, 2018.
[67] R. Landers, U. Hübner, R. Schmelzeisen, and R. Mülhaupt, “Rapid prototyping of
scaffolds derived from thermoreversible hydrogels and tailored for applications in
tissue engineering,” Biomaterials, vol. 23, no. 23, pp. 4437–4447, 2002.
[68] M. M. Gentleman and E. Gentleman, “The role of surface free energy in osteoblast–
biomaterial interactions,” Int. Mater. Rev., vol. 59, no. 8, pp. 417–429, 2014.
[69] S. Srichuwong, T. C. Sunarti, T. Mishima, N. Isono, and M. Hisamatsu, “Starches
from different botanical sources II: Contribution of starch structure to swelling and
pasting properties,” Carbohydr. Polym., vol. 62, no. 1, pp. 25–34, 2005.
[70] J. Ostrowska-czubenko and M. Gierszewska-dru, “Effect of ionic crosslinking on the
water state in hydrogel chitosan membranes,” vol. 77, pp. 590–598, 2009.
[71] C. Y. Liu and K. S. Zhao, “Dielectric relaxations in chitosan solution with varying
concentration and temperature: Analysis coupled with a scaling approach and
thermodynamical functions,” Soft Matter, vol. 6, no. 12, pp. 2742–2750, 2010.
[72] K. Ogawa, T. Yui, and M. Miya, “Dependence on the Preparation Procedure of the
Polymorphism and Crystallinity of Chitosan Membranes.,” Biosci. Biotechnol.
Biochem., vol. 56, no. September, pp. 858–862, 1992.
[73] S. Kumar-Krishnan et al., “Novel gigahertz frequency dielectric relaxations in
chitosan films.,” Soft Matter, vol. 10, no. 43, pp. 8673–8684, 2014.
[74] E. Prokhorov, J. G. Luna-Bárcenas, J. B. González-Campos, and I. C. Sanchez,
“Conductivity mechanisms in a composite of chitosan-silver nanoparticles,” Mol.
Cryst. Liq. Cryst., vol. 536, no. August 2013, pp. 24–32, 2011.
[75] M. Pizzoli, G. Ceccorulli, and M. Scandola, “Molecular motions of chitosan in the
solid state,” vol. 222, pp. 205–213, 1991.
[76] F. S. Kittur, K. V. H. Prashanth, K. U. Sankar, and R. N. Tharanathan,
“Characterization of chitin , chitosan and their carboxymethyl derivatives by
differential scanning calorimetry,” vol. 49, pp. 185–193, 2002.
[77] F. Mano, “Viscoelastic Properties of Chitosan with Different Hydration Degrees as
Studied by Dynamic Mechanical Analysis,” pp. 69–76, 2008.
[78] C. G. T. Neto, J. A. Giacometti, A. E. Job, F. C. Ferreira, J. L. C. Fonseca, and M.
R. Pereira, “Thermal Analysis of Chitosan Based Networks,” vol. 62, pp. 97–103,
2005.
106
[79] D. Meißner and A. Kwasniewski, “Molecular interpretation of the main relaxations
found in dielectric spectra of cellulose – experimental arguments,” pp. 137–150,
2004.
[80] J. Zawadzki and H. Kaczmarek, “Thermal treatment of chitosan in various
conditions,” Carbohydr. Polym., vol. 80, no. 2, pp. 395–401, 2010.
[81] K. Umemura and S. Kawai, “Modification of chitosan by the Maillard reaction using
cellulose model compounds,” vol. 68, pp. 242–248, 2007.
[82] I. Leceta, M. Peñalba, P. Arana, P. Guerrero, and K. De La Caba, “Ageing of
chitosan films: Effect of storage time on structure and optical, barrier and
mechanical properties,” Eur. Polym. J., vol. 66, pp. 170–179, 2015.
[83] I. Leceta, P. Guerrero, and K. De Caba, “Functional properties of chitosan-based
films,” Carbohydr. Polym., vol. 93, no. 1, pp. 339–346, 2013.
[84] S. Rivero, M. A. García, and A. Pinotti, “Heat treatment to modify the structural and
physical properties of chitosan-based films,” J. Agric. Food Chem., vol. 60, no. 1,
pp. 492–499, 2012.
[85] L. Fernández-de Castro et al., “Films of chitosan and chitosan-oligosaccharide
neutralized and thermally treated: Effects on its antibacterial and other activities,”
LWT - Food Sci. Technol., vol. 73, pp. 368–374, 2016.
[86] L. Wang, Y. Wang, J. Qu, Y. Hu, R. You, and M. Li, “The Cytocompatibility of
Genipin-Crosslinked Silk Fibroin Films,” J. Biomater. Nanobiotechnol., vol. 04, no.
03, pp. 213–221, 2013.
[87] M. Nieto-Suárez, M. A. López-Quintela, and M. Lazzari, “Preparation and
characterization of crosslinked chitosan/gelatin scaffolds by ice segregation induced
self-assembly,” Carbohydr. Polym., vol. 141, pp. 175–183, 2016.
[88] S. D. eb Nath, C. Abueva, B. Kim, and B. T. aek Lee, “Chitosan-hyaluronic acid
polyelectrolyte complex scaffold crosslinked with genipin for immobilization and
controlled release of BMP-2,” Carbohydr. Polym., vol. 115, pp. 160–169, 2015.
[89] N. Vasylieva et al., “Covalent enzyme immobilization by poly(ethylene glycol)
diglycidyl ether (PEGDE) for microelectrode biosensor preparation,” Biosens.
Bioelectron., vol. 26, no. 10, pp. 3993–4000, 2011.
[90] H. Kono, “Characterization and properties of carboxymethyl cellulose hydrogels
crosslinked by polyethylene glycol,” Carbohydr. Polym., vol. 106, no. 1, pp. 84–93,
2014.
107
[91] H. Kono, T. Nakamura, H. Hashimoto, and Y. Shimizu, “Characterization, molecular
dynamics, and encapsulation ability of β-cyclodextrin polymers crosslinked by
polyethylene glycol,” Carbohydr. Polym., vol. 128, pp. 11–23, 2015.
[92] Z. S. Akdemir, H. Akçakaya, M. V. Kahraman, T. Ceyhan, N. Kayaman-Apohan, and
A. Güngör, “Photopolymerized injectable RGD-modified fumarated poly(ethylene
glycol) diglycidyl ether hydrogels for cell growth,” Macromol. Biosci., vol. 8, no. 9,
pp. 852–862, 2008.
[93] P. Haque, A. I. Mustafa, and M. A. Khan, “Development and modification of
ethylene glycol grafted chitosan films by photocuring,” Nucl. Instruments Methods
Phys. Res. Sect. B Beam Interact. with Mater. Atoms, vol. 236, no. 1–4, pp. 314–
317, 2005.
[94] J. C. Adams and F. M. Watt, “Regulation of development and differentiation by the
extracellular matrix,” vol. 1198, pp. 1183–1198, 1993.
[95] F. Li, M. Nie, X. He, J. Fei, Y. Ding, and B. Feng, “Direct electrochemistry and
electrocatalysis of hemoglobin on a glassy carbon electrode modified with
poly(ethylene glycol diglycidyl ether) and gold nanoparticles on a quaternized
cellulose support. A sensor for hydrogen peroxide and nitric oxide,” Microchim.
Acta, vol. 181, no. 13–14, pp. 1541–1549, 2014.
[96] B. D. Mccloskey, H. Ju, and B. D. Freeman, “Composite Membranes Based on a
Selective Chitosan - Poly ( ethylene glycol ) Hybrid Layer : Synthesis ,
Characterization , and Performance in Oil - Water Purification,” pp. 366–373, 2010.
[97] G. Vargas, J. L. Acevedo, J. López, and J. Romero, “Study of cross-linking of
gelatin by ethylene glycol diglycidyl ether,” Mater. Lett., vol. 62, no. 21–22, pp.
3656–3658, 2008.
[98] G. Tripodo et al., “Hydrogels for biomedical applications from glycol chitosan and
PEG diglycidyl ether exhibit pro-angiogenic and antibacterial activity,” Carbohydr.
Polym., 2018.
[99] K. Meyer and J. W. Palmer, “On the nature of the ocular fluids,” Am. J. Ophthalmol.,
vol. 19, no. 10, pp. 859–865, 1936.
[100] J. A. Alkrad, Y. Mrestani, D. Stroehl, S. Wartewig, and R. Neubert, “Characterization
of enzymatically digested hyaluronic acid using NMR, Raman, IR, and UV-Vis
spectroscopies,” J. Pharm. Biomed. Anal., vol. 31, no. 3, pp. 545–550, 2003.
[101] L. Mayol, D. De Stefano, F. De Falco, R. Carnuccio, M. C. Maiuri, and G. De Rosa,
108
“Effect of hyaluronic acid on the thermogelation and biocompatibility of its blends
with methyl cellulose,” Carbohydr. Polym., vol. 112, 2014.
[102] C. Antich, R. Sabata, J. A. Marchal, C. U. Fuentenueva, and A. T. Area,
“ADVANCES OF HYALURONIC ACID IN STEM CELL THERAPY AND TISSUE
ENGINEERING , INCLUDING CURRENT CLINICAL TRIALS,” 2019.
[103] D. Evered, J. Whelm, B. Delpech, A. Delpech, G. Brucknert, and N. Girard, “H yal u
ro nan and h yal u ro n ect i n in the nervous system,” 1989.
[104] I. S. Yoon et al., “Proliferation and chondrogenic differentiation of human adipose-
derived mesenchymal stem cells in porous hyaluronic acid scaffold,” J. Biosci.
Bioeng., vol. 112, no. 4, pp. 402–408, 2011.
[105] J. A. Burdick and G. D. Prestwich, “Hyaluronic acid hydrogels for biomedical
applications,” Adv. Mater., vol. 23, no. 12, pp. 41–56, 2011.
[106] A. Ström, A. Larsson, and O. Okay, “Preparation and physical properties of
hyaluronic acid-based cryogels,” J. Appl. Polym. Sci., vol. 132, no. 29, pp. 1–11,
2015.
[107] C. E. Schanté, G. Zuber, C. Herlin, and T. F. Vandamme, “Chemical modifications
of hyaluronic acid for the synthesis of derivatives for a broad range of biomedical
applications,” Carbohydr. Polym., vol. 85, no. 3, pp. 469–489, 2011.
[108] M. Rinaudo, B. Lardy, L. Grange, and T. Conrozier, “Effect of mannitol on hyaluronic
acid stability in two In vitro models of oxidative stress,” Polymers (Basel)., vol. 6, no.
7, pp. 1948–1957, 2014.
[109] E. D. Prè, G. Conti, and A. Sbarbati, “Hyaluronic Acid ( HA ) Scaffolds and
Multipotent Stromal Cells ( MSCs ) in Regenerative Medicine,” Stem Cell Rev.
Reports, 2016.
[110] X. Xu, A. K. Jha, D. A. Harrington, M. C. Farach-Carson, and X. Jia, “Hyaluronic
acid-based hydrogels: from a natural polysaccharide to complex networks,” Soft
Matter, vol. 8, no. 12, p. 3280, 2012.
[111] X. Z. Shu et al., “Attachment and spreading of fibroblasts on an RGD peptide-
modified injectable hyaluronan hydrogel,” J. Biomed. Mater. Res., vol. 68A, no. 2,
pp. 365–375, 2004.
[112] T. Wang and M. Spector, “Development of hyaluronic acid-based scaffolds for brain
tissue engineering,” Acta Biomater., vol. 5, no. 7, pp. 2371–2384, 2009.
[113] S. Subramaniam, Y. Fang, S. Sivasubramanian, and C. Lin, “Hydroxyapatite-
109
calcium sulfate-hyaluronic acid composite encapsulated with collagenase as bone
substitute for alveolar bone regeneration,” Biomaterials, vol. 09.044, 2015.
[114] Y. Liu, X. Z. Shu, and G. D. Prestwich, “Osteochondral Defect Repair with
Autologous Bone,” Tissue Eng., vol. 12, no. 12, 2006.
[115] A. Ström, A. Larsson, and O. Okay, “Preparation and physical properties of
hyaluronic acid-based cryogels,” J. Appl. Polym. Sci., vol. 132, no. 29, pp. 1–11,
2015.
[116] B. Tavsanli and O. Okay, “Preparation and fracture process of high strength
hyaluronic acid hydrogels cross-linked by ethylene glycol diglycidyl ether,” React.
Funct. Polym., vol. 109, pp. 42–51, 2016.
[117] J. Kim et al., “Bone regeneration using hyaluronic acid-based hydrogel with bone
morphogenic protein-2 and human mesenchymal stem cells,” vol. 28, pp. 1830–
1837, 2007.
[118] P. S. J Patterson, d, R Siewa, SW Herringb, ASP Linc, R Guldbergc, “Hyaluronic
Acid Hydrogels with Controlled Degradation Properties for Oriented Bone
Regeneration,” Biomaterials, vol. 31, no. 26, pp. 6772–6781, 2010.
[119] and S.-W. C. Hyun-Ji Park, Yoonhee Jin, Jisoo Shin, Kisuk Yang, Changhyun Lee,
Hee Seok Yang, “Catechol-Functionalized Hyaluronic Acid Hydrogels Enhance
Angiogenesis and Osteogenesis of Human Adipose-Derived Stem Cells in Critical
Tissue Defects,” Biomacromolecules, pp. 1–31, 2016.
[120] T. Kuotlusy, B. Oktay, N. K. Apohan, M. Süleymanoğlu, and S. E. Kuruca,
“Chitosan-co-Hyaluronic acid porous cryogels and their application in tissue
engineering,” Int. J. Biol. Macromol., vol. 103, pp. 366–378, 2017.
[121] J. K. Park et al., “Solid Free-Form Fabrication of Tissue-Engineering Scaffolds with
a Poly ( lactic-co-glycolic acid ) Grafted Hyaluronic Acid Conjugate Encapsulating
an Intact Bone Morphogenetic Protein – 2 / Poly ( ethylene glycol ) Complex,” pp.
2906–2912, 2011.
[122] C. Arakawa, R. Ng, S. Tan, S. Kim, B. Wu, and M. Lee, “Photopolymerizable
chitosan – collagen hydrogels for bone tissue engineering,” J Tissue Eng Regen
Med, vol. 11, no. April 2014, pp. 164–174, 2017.
[123] D. G. Miranda, S. M. Malmonge, D. M. Campos, N. G. Attik, B. Grosgogeat, and K.
Gritsch, “A chitosan-hyaluronic acid hydrogel scaffold for periodontal tissue
engineering,” J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater., vol. 104, no. 8, pp.
110
1691–1702, 2016.
[124] K. Y. L. Do Yoon Kima, Honghyun Parka, Sang Woo Kima, Jae Won Leea,
“Injectable hydrogels prepared from partially oxidized hyaluronate and glycol
chitosan for chondrocyte encapsulation,” Carbohydr. Polym., 2016.
[125] M. Zhu, S. Lin, Y. Sun, Q. Feng, G. Li, and L. Bian, “Hydrogels functionalized with
N-cadherin mimetic peptide enhance osteogenesis of hMSCs by emulating the
osteogenic niche,” Biomaterials, vol. 77, pp. 44–52, 2016.
[126] G. M. Demirtaş TT, Irmak G, “A bioprintable form of chitosan hydrogel for bone
tissue engineering,” Biofabrication., vol. 2017;9(3):, 2017.
[127] I. Hamlet SM, Vaquette C, Shah A, Hutmacher DW, “3-Dimensional functionalized
polycaprolactone-hyaluronic acid hydrogel constructs for bone tissue engineering.,”
J Clin Periodontol., 2017.
[128] J. W. & Q. Z. Chun Liu, Deshuai Liu, Yingying Wang, Yun Li, Tao Li, Zhiyou Zhou,
Zhijian Yang, “Glycol chitosan / oxidized hyaluronic acid hydrogels functionalized
with cartilage extracellular matrix particles and incorporating BMSCs for cartilage
repair,” Artif. Cells, Nanomedicine, Biotechnol., vol. 46, no. S1, pp. S721–S732,
2018.
[129] Y. M. E. Aysel Koç Demir, Ayşe Eser Elçin, “Strontium-modi fi ed chitosan /
montmorillonite composites as bone tissue engineering sca ff old,” Mater. Sci. Eng.
C, vol. 89, no. January 2017, pp. 8–14, 2018.
[130] F. Sharifi, S. M. Atyabi, D. Norouzian, M. Zandi, S. Irani, and H. Bakhshi,
“Polycaprolactone/carboxymethyl chitosan nanofibrous scaffolds for bone tissue
engineering application,” Int. J. Biol. Macromol., vol. 115, pp. 243–248, 2018.
[131] S. Ranganathan, K. Balagangadharan, and N. Selvamurugan, “Chitosan and
gelatin-based electrospun fi bers for bone tissue engineering,” Int. J. Biol.
Macromol., vol. 133, pp. 354–364, 2019.
[132] Ö. Ö. Koca C, Kömerik N, “Comparison of Efficiency of Hyaluronic Acid and/or Bone
Grafts in Healing of Bone Defects,” Niger J Clin Pr., vol. 22, pp. 754–62, 2019.
[133] V. A. Reyna-urrutia et al., “Advanced fibroblast proliferation inhibition for
biocompatible coating by electrostatic layer-by-layer assemblies of heparin and
chitosan derivatives,” Int. J. Biol. Macromol., vol. 117, no. 3, pp. 121–130, Jan.
2017.
[134] K. Sweidan, A. Jaber, N. Al-jbour, R. Obaidat, and M. Al-, “Further investigation on
111
the degree of deacetylation of chitosan determined by potentiometric titration .,” J.
Excipients Food Chem., vol. 2, no. 1, pp. 16–25, 2011.
[135] B. Hoffmann et al., “A new biodegradable bone wax substitute with the potential to
be used as a bone filling material,” J. Mater. Chem., vol. 17, no. 38, pp. 4028–4033,
2007.
[136] Y. Zhang, C. Xue, Y. Xue, R. Gao, and X. Zhang, “Determination of the degree of
deacetylation of chitin and chitosan by X-ray powder diffraction,” Carbohydr. Res.,
vol. 340, no. 11, pp. 1914–1917, 2005.
[137] B. Focher, P. L. Beltrame, A. Naggi, and G. Torri, “Alkaline N-Deacetylation of Chitin
Enhanced by Flash Treatments. Reaction Kinetics and Structure Modifications,”
1990.
[138] V. A. Reyna-urrutia, V. Mata-haro, and J. V Cauich-rodriguez, “Effect of two
crosslinking methods on the physicochemical and biological properties of the
collagen-chitosan scaffolds,” Eur. Polym. J., vol. 117, no. April, pp. 424–433, 2019.
[139] R. F. Wallin, “A Practical Guide to ISO 10993- 12 : Sample Preparation and
Reference Materials A Practical Guide to ISO 10993- 12 : Sample Preparation and
Reference Materials,” pp. 10–13, 1998.
[140] D. M. Correia et al., “Effect of neutralization and cross-linking on the thermal
degradation of chitosan electrospun membranes,” J. Therm. Anal. Calorim., vol.
117, no. 1, pp. 123–130, 2014.
[141] G. C. Ritthidej, T. Phaechamud, and T. Koizumi, “Moist heat treatment on
physicochemical change of chitosan salt films,” vol. 232, pp. 11–22, 2002.
[142] Z. Osman and A. K. Arof, “FTIR studies of chitosan acetate based polymer
electrolytes,” Electrochimica Acta, vol. 48, no. 8. pp. 993–999, 2003.
[143] C. Guo, L. Zhou, and J. Lv, “Effects of expandable graphite and modified
ammonium polyphosphate on the flame-retardant and mechanical properties of
wood flour-polypropylene composites,” Polym. Polym. Compos., vol. 21, no. 7, pp.
449–456, 2013.
[144] L. Y. Lim and L. S. C. Wan, “HEAT TREATMENT OF CHITOSAN FILMS,” Drug
Dev. Ind. Pharm., vol. 1, no. 7, pp. 839–846, 1995.
[145] L. Balau, G. Lisa, M. I. Popa, V. Tura, and V. Melnig, “Physico – chemical properties
of Chitosan films,” vol. 2, no. 4, pp. 638–647, 2004.
[146] K. Ogawa, “Effect of Heating an Aqueous Suspension of Chitosan on the
112
Crystallinity and Polymorphs promising bioresource for industrial purposes
polymorph . 4 ) in Furthermore ,” vol. 55, no. 9, pp. 2375–2379, 1991.
[147] S. Sularsih, A. Yuliati, and C. P. D, “Degrees of chitosan deacetylation from white
shrimp shell waste as dental biomaterials,” Dent. J. (Majalah Kedokt. Gigi), vol. 45,
no. 1, p. 17, 2012.
[148] N. Balázs and P. Sipos, “Limitations of pH-potentiometric titration for the
determination of the degree of deacetylation of chitosan,” Carbohydr. Res., vol. 342,
no. 1, pp. 124–130, 2007.
[149] F. A. López, A. L. R. Mercê, F. J. Alguacil, and A. López-Delgado, “A kinetic study
on the thermal behaviour of chitosan,” J. Therm. Anal. Calorim., vol. 91, no. 2, pp.
633–639, 2008.
[150] F. a López, A. L. R. Ã. Merc, and F. J. Alguacil, “A Kinetic Study on the Thermal
Behaviour of Chitosan,” J. Therm. Anal. Calorim., vol. 91, pp. 633–639, 2008.
[151] A. Pawlak and M. Mucha, “Thermogravimetric and FTIR studies of chitosan blends,”
Thermochim. Acta, vol. 396, no. 1–2, pp. 153–166, 2003.
[152] R. J. Samuels, “Solid state characterization of the structure of chitosan films,” J.
Polym. Sci. Polym. Phys. Ed., vol. 19, no. 7, pp. 1081–1105, 1981.
[153] A. Baroudi, C. García-Payo, and M. Khayet, “Structural, mechanical, and transport
properties of electron beam-irradiated chitosan membranes at different doses,”
Polymers (Basel)., vol. 10, no. 2, 2018.
[154] S. G. N. & S. H. P. A. V. Raut, R. K. Satvekar, S. S. Rohiwal, A. P. Tiwari, A.
Gnanamani, S. Pushpavanam, S. G. Nanaware & S. H. PawaTo cite this article: A.
V. Raut, R. K. Satvekar, S. S. Rohiwal, A. P. Tiwari, A. Gnanamani, S.
Pushpavanam, “In vitro biocompatibility and antimicrobial activity of chitin monomer
obtain from hollow fiber membrane,” Des. Monomers Polym., no. April, 2016.
[155] T. Yui, K. Imada, K. Okuyama, Y. Obata, K. Suzuki, and K. Ogawa, “Molecular and
Crystal Structure of the Anhydrous Form of Chitosan,” Macromolecules, vol. 27, no.
26, pp. 7601–7605, 1994.
[156] K. Ogawa, S. Hirano, T. Miyanishi, T. Yui, and T. Watanabe, “A New Polymorph of
Chitosan,” Macromolecules, vol. 17, no. 4, pp. 973–975, 1984.
[157] P. Sikorski, R. Hori, and M. Wada, “Revisit of alpha-chitin crystal structure using
high resolution X-ray diffraction data.,” Biomacromolecules, vol. 10, no. 5, pp. 1100–
1105, 2009.
113
[158] K. Ogawa, T. Yui, and K. Okuyama, “Three D structures of chitosan,” Int. J. Biol.
Macromol., vol. 34, no. 1–2, pp. 1–8, 2004.
[159] K. Okuyama, K. Noguchi, Y. Hanafusa, K. Osawa, and K. Ogawa, “Structural study
of anhydrous tendon chitosan obtained via chitosan/acetic acid complex,” Int. J.
Biol. Macromol., vol. 26, no. 4, pp. 285–293, 1999.
[160] M. Kawahara et al., “Fourth 3D structure of the chitosan molecule: conformation of
chitosan in its salts with medical organic acids having a phenyl group.,” Biosci.
Biotechnol. Biochem., vol. 67, no. 7, pp. 1545–1550, 2003.
[161] C. Gartner, B. L. Löpez, L. Sierra, R. Graf, H. W. Spiess, and M. Gaborieau,
“Interplay between structure and dynamics in chitosan films investigated with solid-
state NMR, dynamic mechanical analysis, and X-ray diffraction,”
Biomacromolecules, vol. 12, no. 4, pp. 1380–1386, 2011.
[162] Q. He, Q. Ao, Y. Gong, and X. Zhang, “Preparation of chitosan films using different
neutralizing solutions to improve endothelial cell compatibility,” J. Mater. Sci. Mater.
Med., vol. 22, no. 12, pp. 2791–2802, 2011.
[163] L. J. Matienzo and S. K. Winnacker, “Dry processes for surface modification of a
biopolymer: Chitosan,” Macromol. Mater. Eng., vol. 287, no. 12, pp. 871–880, 2002.
[164] K. Lewandowska, A. Sionkowska, S. Grabska, and B. Kaczmarek, “Surface and
thermal properties of collagen/hyaluronic acid blends containing chitosan,” Int. J.
Biol. Macromol., vol. 92, pp. 371–376, 2016.
[165] Z. Yinghui, L. Jianchun, Z. Nanming, G. Haipeng, Z. Xiufang, and G. Yandao,
“Studies on nerve cell affinity of chitosan‐derived materials,” J. Biomed. Mater. Res.,
vol. 52, no. 2, pp. 285–295, 2002.
[166] F. Croisier and C. Jérôme, “Chitosan-based biomaterials for tissue engineering,”
Eur. Polym. J., vol. 49, no. 4, 2013.
[167] J. Drelich, E. Chibowski, D. Meng, and K. Terpilowski, “Hydrophilic and
superhydrophilic surfaces and materials Jaroslaw,” Soft Matte, vol. 7, pp. 9804–
9828, 2011.
[168] J. Drelich, E. Chibowski, D. D. Meng, and K. Terpilowski, “Hydrophilic and
superhydrophilic surfaces and materials,” Soft Matter, vol. 7, no. 21, pp. 9804–9828,
2011.
[169] D. M. Escobar, A. M. Castro Ramírez, and N. Castrillón Vergara, “Determining the
Relation between the Proportion of the Amino Group and the Degree of
114
Deacetylation of Chitosan,” Rev. Ciencias, vol. 18, no. 1, pp. 73–88, 2014.
[170] S. Romero-Vargas Castrill??n, X. Lu, D. L. Shaffer, and M. Elimelech, “Amine
enrichment and poly(ethylene glycol) (PEG) surface modification of thin-film
composite forward osmosis membranes for organic fouling control,” J. Memb. Sci.,
vol. 450, pp. 331–339, 2014.
[171] M. Zhang, X. H. Li, Y. D. Gong, N. M. Zhao, and X. F. Zhang, “Properties and
biocompatibility of chitosan films modified by blending with PEG,” Biomaterials, vol.
23, no. 13, pp. 2641–2648, 2002.
[172] R. Shen et al., “The use of chitosan/PLA nano-fibers by emulsion eletrospinning for
periodontal tissue engineering,” Artif. Cells, Nanomedicine, Biotechnol., vol. 0, no. 0,
pp. 1–12, 2018.
[173] D. Baskar and T. S. Sampath Kumar, “Effect of deacetylation time on the
preparation, properties and swelling behavior of chitosan films,” Carbohydr. Polym.,
vol. 78, no. 4, pp. 767–772, 2009.
[174] P. A. L. Lima, C. X. Resende, G. D. De Almeida Soares, K. Anselme, and L. E.
Almeida, “Preparation, characterization and biological test of 3D-scaffolds based on
chitosan, fibroin and hydroxyapatite for bone tissue engineering,” Mater. Sci. Eng.
C, vol. 33, no. 6, pp. 3389–3395, 2013.
[175] J. D. Bumgardner, R. Wiser, S. H. Elder, R. Jouett, Y. Yang, and J. L. Ong, “Contact
angle, protein adsorption and osteoblast precursor cell attachment to chitosan
coatings bonded to titanium,” J. Biomater. Sci. Polym. Ed., vol. 14, no. 12, pp.
1401–1409, 2003.
[176] R. Jayakumar, M. Prabaharan, P. T. Sudheesh Kumar, S. V. Nair, and H. Tamura,
“Biomaterials based on chitin and chitosan in wound dressing applications,”
Biotechnol. Adv., vol. 29, no. 3, pp. 322–337, 2011.
[177] S. Saladino, E. R. Di, M. Salamone, D. Mercuri, F. Segatti, and G. Ghersi,
“Formulation of Different Chitosan Hydrogels for Cartilage Tissue Repair,” vol. 38,
pp. 505–510, 2014.
[178] M. A. Woodruff, P. Jones, D. Farrar, D. M. Grant, and C. A. Scotchford, “Human
osteoblast cell spreading and vinculin expression upon biomaterial surfaces,” J. Mol.
Histol., vol. 38, no. 5, pp. 491–499, 2007.
[179] Y. Wang et al., “A study on the performance of hyaluronic acid immobilized chitosan
film,” Biomed. Mater., vol. 4, no. 3, 2009.
115
[180] S. J. Florczyk et al., “Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of
glioblastoma microenvironment ECM,” Biomaterials, vol. 34, no. 38, pp. 10143–
10150, 2013.
[181] H. D. Hwang et al., “Cross-linked hyaluronic acid-based flexible cell delivery system:
Application for chondrogenic differentiation,” Colloids Surfaces B Biointerfaces, vol.
91, no. 1, pp. 106–113, 2012.
[182] A. Synytsya, A. Synytsya, P. Alexa, R. Wagner, M. Davídková, and K. Volka,
“Raman spectroscopic study on sodium hyaluronate: An effect of proton and γ
irradiation,” J. Raman Spectrosc., vol. 42, no. 3, pp. 544–550, 2011.
[183] A. Aryaei, A. H. Jayatissa, and A. C. Jayasuriya, “Mechanical and biological
properties of chitosan/carbon nanotube nanocomposite films,” J. Biomed. Mater.
Res. - Part A, vol. 102, no. 8, pp. 2704–2712, 2014.
[184] J. Réeff, A. Gaignaux, J. Goole, C. De Vriese, and K. Amighi, “New sustained-
release intraarticular gel formulations based on monolein for local treatment of
arthritic diseases,” Drug Dev. Ind. Pharm., vol. 39, no. July 2012, pp. 1731–1741,
2013.
[185] R. Mille, E. W. Godbole, R. A. Robinson, R. H. Stokea, and S. Publications, “Notes
2069 1,” no. 1, pp. 2–4, 1969.
[186] J. K. Sheehan and E. D. T. Atkins, “X-ray fibre diffraction study of conformational
changes in hyaluronate induced in the presence of sodium, potassium and calcium
cations,” Int. J. Biol. Macromol., vol. 5, no. 4, pp. 215–221, 1983.
[187] C.-M. Lee, S.-W. Yang, S.-C. Jung, and B.-H. Kim, “Oxygen Plasma Treatment on
3D-Printed Chitosan/Gelatin/Hydroxyapatite Scaffolds for Bone Tissue
Engineering,” J. Nanosci. Nanotechnol., vol. 17, no. 4, pp. 2747–2750, 2017.
[188] F. A. BETTELHEIM, “Crystalline Sodium Hyaluronate,” Nature, vol. 182, p. 1301,
Nov. 1958.
[189] E. Martínez-Campos et al., “Cell Adhesion and Proliferation on Sulfonated and Non-
Modified Chitosan Films,” AAPS PharmSciTech, vol. 18, no. 4, pp. 974–982, 2017.
[190] T. Freier, H. S. Koh, K. Kazazian, and M. S. Shoichet, “Controlling cell adhesion and
degradation of chitosan films by N-acetylation,” Biomaterials, vol. 26, no. 29, pp.
5872–5878, 2005.
[191] K. Lewandowska, A. Sionkowska, S. Grabska, B. Kaczmarek, and M. Michalska,
“The miscibility of collagen/hyaluronic acid/chitosan blends investigated in dilute
116
solutions and solids,” J. Mol. Liq., vol. 220, pp. 726–730, 2016.
[192] B. Kaczmarek, A. Sionkowska, K. Łukowicz, and A. Maria Osyczka, “The cells
viability study on the composites of chitosan and collagen with glycosaminoglycans
isolated from fish skin,” Mater. Lett., vol. 206, pp. 166–168, 2017.
[193] C. H. Chen et al., “Injectable thermosensitive hydrogel containing hyaluronic acid
and chitosan as a barrier for prevention of postoperative peritoneal adhesion,”
Carbohydr. Polym., vol. 173, pp. 721–731, 2017.
117
ANEXOS
Anexo 1 Reacciones de entrecruzamiento esperadas entre a) el grupo NH2 del quitosano y el
PEGDE. b) entre el OH del quitosano y el PEGDE. c) entre el NH2 del quitosano y el GA.
d) entre el OH del quitosano y el GA.
118
Anexo 2 Deconvoluciones de carbono de las películas de quitosano secas a 25°C
Figura A3.
ANEXO 4
280282284286288290292294296298
Binding Energy (eV)
C1s Scan4 Scans, 38.2 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
C1s C-C
C1s C-OC1s N-C=O
280282284286288290292294296298
Binding Energy (eV)
C1s Scan4 Scans, 38.2 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
C1s C-C
C1s C-O
C1s N-C=O
280282284286288290292294296298
Binding Energy (eV)
C1s Scan4 Scans, 38.2 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
C1s C-C
C1s C-O
C1s N-C=O
280282284286288290292294296298
Binding Energy (eV)
C1s Scan4 Scans, 38.2 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
C1s C-C
C1s C-O
C1s N-C=OC1s Scan D
280282284286288290292294296298
Binding Energy (eV)
C1s Scan4 Scans, 38.2 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
C1s C-O
C1s C-C
C1s N-C=O
CH
T-P
EG
DE
1
CH
T
CH
T-P
EG
DE
2
CH
T-P
EG
DE
3
CH
T-G
A
119
Anexo 3
Imágenes de MEB de las esponjas obtenidas por liofilización de quitosano, quitosano entrecruzado con GA (CHT/GA) y quitosano entrecruzado con PEGDE, (CHT/PEGDE 1,
2, 3).
120
Anexo 4
Espectro XPS de carbono, oxígeno y nitrógeno de las películas de quitosano/AH al 15%
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
280282284286288290292294296
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
C1s Scan2 Scans, 19.1 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
C1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
7.00E+04
526528530532534536538540542544
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
O1s Scan2 Scans, 20.1 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
O1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
526528530532534536538540542544
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
O1s Scan2 Scans, 20.1 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
O1s
5.00E+03
6.00E+03
7.00E+03
8.00E+03
9.00E+03
1.00E+04
1.10E+04
1.20E+04
392394396398400402404406408
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
N1s Scan8 Scans, 1 m 12.4 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
N1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
7.00E+04
280282284286288290292294296
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
C1s Scan2 Scans, 19.1 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
C1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
7.00E+04
526528530532534536538540542544
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
O1s Scan2 Scans, 20.1 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
O1s
5.00E+03
6.00E+03
7.00E+03
8.00E+03
9.00E+03
1.00E+04
1.10E+04
1.20E+04
392394396398400402404406408
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
N1s Scan8 Scans, 1 m 12.4 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
N1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
280282284286288290292294296
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
C1s Scan2 Scans, 19.1 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
C1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
7.00E+04
8.00E+04
526528530532534536538540542544
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
O1s Scan2 Scans, 20.1 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
O1s
5.00E+03
6.00E+03
7.00E+03
8.00E+03
9.00E+03
1.00E+04
1.10E+04
1.20E+04
1.30E+04
1.40E+04
392394396398400402404406408
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
N1s Scan8 Scans, 1 m 12.4 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
N1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
280282284286288290292294296
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
C1s Scan2 Scans, 19.1 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
C1s
6000
7000
8000
9000
10000
394396398400402404406408410
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
N1s Scan8 Scans, 1 m 12.4 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
N1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
526528530532534536538540542544
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
O1s Scan2 Scans, 20.1 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
O1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
280282284286288290292294296
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
C1s Scan2 Scans, 19.1 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
C1s
CH
T-P
EG
DE
1
CH
T
CH
T-P
EG
DE
2
CH
T-P
EG
DE
3
CH
T-G
A
121
Anexo 5
Espectro XPS de carbono, oxígeno y nitrógeno de las películas de quitosano/AH al 30%
CH
T-P
EG
DE
1
5.00E+03
6.00E+03
7.00E+03
8.00E+03
9.00E+03
1.00E+04
1.10E+04
1.20E+04
392394396398400402404406408
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
N1s Scan8 Scans, 1 m 12.4 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV
N1s
CH
T-G
A
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
7.00E+04
8.00E+04
526528530532534536538540542544
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
O1s Scan
O1s
8.00E+03
9.00E+03
1.00E+04
1.10E+04
1.20E+04
1.30E+04
1.40E+04
1.50E+04
1.60E+04
392394396398400402404406408
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
N1s Scan
N1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
7.00E+04
8.00E+04
9.00E+04
1.00E+05
280282284286288290292294296
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
C1s Scan
C1s
CH
T
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
7.00E+04
8.00E+04
526528530532534536538540542544
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
O1s Scan
O1s
6.00E+03
8.00E+03
1.00E+04
1.20E+04
1.40E+04
1.60E+04
1.80E+04
2.00E+04
392394396398400402404406408
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
N1s Scan
N1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
7.00E+04
8.00E+04
9.00E+04
280282284286288290292294296
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
C1s Scan
C1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
7.00E+04
8.00E+04
526528530532534536538540542544
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
O1s Scan
O1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
7.00E+04
8.00E+04
9.00E+04
280282284286288290292294296
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
C1s Scan
C1s
CH
T-P
EG
DE
2
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
7.00E+04
8.00E+04
526528530532534536538540542544
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
O1s Scan
O1s
6000
7000
8000
9000
10000
392394396398400402404406408
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
N1s Scan
N1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
280282284286288290292294296
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
C1s Scan
C1s
CH
T-P
EG
DE
3
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
7.00E+04
526528530532534536538540542544
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
O1s Scan
O1s
7.00E+03
8.00E+03
9.00E+03
1.00E+04
1.10E+04
1.20E+04
1.30E+04
1.40E+04
1.50E+04
1.60E+04
392394396398400402404406408
Co
unts
/ s
Binding Energy (eV)
N1s Scan
N1s
0.00E+00
1.00E+04
2.00E+04
3.00E+04
4.00E+04
5.00E+04
6.00E+04
7.00E+04
8.00E+04
280282284286288290292294296
Cou
nts
/ s
Binding Energy (eV)
C1s Scan
C1s
122
Anexo 6
Productos Académicos Derivados de esta Investigación
Presentación de Trabajos en Congresos Internacionales
Presentación de Cartel Científico “POLYETHYLENE GLYCOL DIGLYCIDYL ETHER CROSSLINKED CHITOSAN AS BIOMATERIAL”. XV Simposio Latinoamericano de Polímeros. Cancún – Riviera Maya, México. Octubre 23 – 27 2016.
Ponencia “BIOCOMPATIBILIDAD DE ANDAMIOS DE QUITOSANO ENTRECRUZADO CON POLIETILENGLICOL DIGLICEDIL ÉTER COMO BIOMATERIAL”. XXV Encuentro Nacional y XVI Iberoamericano de Investigación en Odontología. Zacatecas, México. 10 de noviembre de 2017
Presentación de Cartel Científico “THE EFFECT OF DRYING TEMPERATURE ON PROPERTIES OF CROSSLINKED CHITOSAN”. 4th US-Mexico Symposium on Advances in Polymer Science MACROMEX 2017, XXX Congreso Nacional de la S.P.M.” Los Cabos, Mexico. Diciembre 3 al 7 de 2017.
Presentación de Cartel Científico “BIOCOMPATIBILIDAD DE ANDAMIOS DE QUITOSANO SOMETIDOS A DIFERENTES TEMPERATURAS DE SECADO”. 5º. Congreso Internacional de REDBIOT. Centro de Investigaciones Científicas de Yucatán. 24 al 26 de octubre de 2018
Presentación de Cartel Científico “BIOCOMPATIBILIDAD DE ANDAMIOS DE QUITOSANO SOMETIDOS A DIFERENTES TEMPERATURAS DE SECADO”. XXVI Encuentro Nacional y XVII Iberoamericano de Investigación en Odontología. León Guanajuato 7 al 9 de noviembre de 2018”
Artículos Originales en Revistas Arbitradas y Enlistadas en JCR
Chuc-Gamboa, M.G.; Vargas-Coronado, R.F.; Cervantes-Uc, J.M.; Cauich-Rodríguez, J.V.; Escobar-García, D.M.; Pozos-Guillén, A.; San Román del Barrio, J. The Effect of PEGDE Concentration and Temperature on Physicochemical and Biological Properties of Chitosan. Polymers 2019, 11, 1830.
Recommended