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Coltivazione dei batteri
Fattori influenzanti la crescita
Identificazione dei microrganismi
Giovanni Di Bonaventura
B.Sc., Ph.D.
Terreni di coltura
Terreno di coltura: mezzo nel quale o sulquale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo
Caratteristiche:
concentrazione adatta di sostanze nutritive per la crescita batterica
adeguato grado di umidità
reazione (pH) adatta
sterili e protetti da qualsiasi inquinamento
Terreni di coltura
Contenuto qualitativo (1 di 2)
Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine (caseina, soja, ecc.)
NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le necessità osmotiche richieste, in vivo, da alcuni microrganismi parassiti
Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, sono aggiunti per scopi specifici in terreni particolari
Estratti di lievito, carne, d’organo: forniscono fattori di crescita e sali inorganici
Terreni di coltura
Contenuto qualitativo (2 di 2)
Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina vitamine. Necessari per la crescita di batteri più “esigenti” dal punto di vista nutrizionale
Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a spettro meno definito (sali biliari, cristalvioletto, sodio-azide)
Indicatori: le sostanze coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.) permettono di seguire il metabolismo fermentativo del batterio in esame, determinando il viraggio di colore del terreno a valori critici di pH
Terreni di coltura
Classificazione (1 di 3)
In base allo stato fisico:
Terreni LIQUIDI: componenti sciolti in acqua e sterilizzati.
Terreni SOLIDI: possono essere naturalmente tali (terreno alla patata) o vengono solidificati per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina, silica-gel)
Terreni di coltura
Classificazione (2 di 3)
In base alla costituzione chimica:
Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri autotrofi. Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono presenti come sali inorganici in composizione e quantità note.
Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui il batterio necessita sono presenti in quantità note.
Terreni COMPLESSI: ignota l’esatta composizione chimica delle sostanze nutritive (estratto di carne di bue, cuore, cervello, ecc.). Comprendono la maggior parte dei terreni usati in laboratorio.
Terreni di coltura
Classificazione (3 di 3)
In base alla funzione:Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie
microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche.
Terreni SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide, cristalvioletto) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di altre. Utilizzati per l’isolamento di specifici microrganismi da campioni altamente contaminati.
Terreni DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Usati per la ID di specifici microrganismi.
Terreni di coltura
Tecniche di semina per isolamento
Semina per isolamento
Principali terreni di coltura usati
in microbiologia diagnostica (1 di 3)
Cetrimide Agar:Terreno selettivo per l’isolamento e l’identificazione presuntiva di
Pseudomonas aeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato per stimolare la produzione di pigmento. Cetrimide, verso cui P. aeruginosa è resistente, inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi.
Columbia Blood Agar Base:Terreno di uso generale e base per terreni addizionati di sangue (S.
aureus, streptococchi emolitici) e selettivi (cocchi Gram+, H. pylori, Gardnerella).
Hektoen Enteric Agar:Terreno differenziale e selettivo per l’isolamento di Salmonella e
Shigella dalle altre Enterobacteriaceae in campioni enterici. I sali biliari inibiscono la crescita della normale flora Gram+. Presenza di tiosolfato (fonte di S) e sali di ferro (citrato ammonio ferrico) per evidenziare la produzione di H2S (colonie nerastre, Salmonella)
Cetrimide Agar
Columbia Blood Agar Base
Salmonella: colonie lac- Klebsiella: colonie lac+
Hektoen Enteric Agar
Principali terreni di coltura usati
in microbiologia diagnostica (2 di 3)
MacConkey agar: evidenziazione, isolamento e conta dei coliformi e degli
Enterobatteri (E. coli, Klebsiella, Salmonella, Shigella). La presenza di cristalvioletto e dei sali biliari inibisce la crescita di Gram+. La presenza di lattosio evidenzia la capacità fermentante: le colonie fermentanti il lattosio (Klebsiella, E. coli, Enterobacter aerogenes) appariranno rosa acceso, incolori quelle non fermentanti (Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, P. aeruginosa).
Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar: non selettivo, per la crescita e tests di sensibilità degli anaerobi.
Urea broth base (terreno di Christensen): evidenziazione attività ureasica delle Enterobacteriaceae
mediante viraggio di un indicatore di pH (rosso fenolo).
MacConkey agar
A: colonie lac- di P. aeruginosa; B: colonie lac+ di E. coli
A B
Urea broth base
Principali terreni di coltura usati
in microbiologia diagnostica (3 di 3)
Mannitol Salt Agar:Terreno selettivo per l’isolamento di stafilococchi presunti
patogeni. Azione selettiva dell’elevata [NaCl]. S. aureusproduce colonie con alone giallo-brillante; gli stafilococchi coagulasi-negativi formano colonie di colore rosso porpora.
Mueller-Hinton agar: per la determinazione dei saggi di antibiotico-sensibilità.
Saboraud Dextrose Agar: terreno acido indicato per l’isolamento di diversi funghi e
lieviti. Candida albicans (colonie incolori/rosa); Candida non-albicans (colonie rosa scuro/rosse).
Salmonella-Shigella Agar (Agar SS): terreno selettivo e differenziale per l’isolamento di
Salmonella e Shigella dalle feci e da campioni di altra natura.
Mannitol Salt Agar
Sabouraud Agar
Salmonella Shigella Agar (SS-agar)
Salmonella typhimurium
Salmonella dublin
Fattori influenzanti la crescita
(1 di 6)
Crescita vs Tolleranza “Crescita” generalmente indica l’acquisizione di
biomassa per la divisione cellulare (o riproduzione).
Alcuni microrganismi possono sopravvivere a condizioni non permissive per la loro crescita.
Il suffisso “-fili” viene spesso usato per descrivere le condizioni permissive per la crescita, mentre il termine “tollerante” descrive le condizioni in cui il microrganismo sopravvive, ma non necessariamente cresce. Ad esempio, un “batterio termofilo” cresce in presenza di elevate temperature, mentre un “batterio termotollerante” sopravvive ad elevate temperature, ma cresce a temperature inferiori.
Fattori influenzanti la crescita
(2 di 6)
Obbligato (stretto) vs facoltativo “Obbligato” (o “stretto”) indica che una data condizione
è necessaria per la crescita batterica.
“Facoltativo” indica che il microrganismo può crescere in quella condizione, sebbene non necessaria.
Il termine “facoltativo” viene spesso usato in presenza di condizioni sub-ottimali. Ad esempio, un “termofilo obbligato” necessita di elevate temperature per la sua crescita, mentre un “termofilo facoltativo” può crescere ad alte temperature ma anche a temperature più basse.
Fattori influenzanti la crescita
(3 di 6)
Temperatura La maggior parte dei batteri cresce in un
intervallo termico di circa 20°C, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo “optimum termico”
Psicrofili: ~0 – 20ºC
Mesofili: ~10 – 50ºC
Termofili: ~40 – 75 ºC
Ipertermofili: ~70 – 110 ºC
Fattori influenzanti la crescita
Temperatura
Fattori influenzanti la crescita
(4 di 6)
pH
Acidofili:
crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 – 6, generalmente)
funghi e lieviti (pH 5 - 6)
Neutrofili:
crescono tra pH 6 – 8
maggior parte dei batteri
Alcalofili:
crescono a pH > 8 (pH 8 – 9.5, generalmente)
Fattori influenzanti la crescita
(5 di 6)
Concentrazione salina (pressione osmotica)
Alofili:
Crescono ad elevate concentrazioni saline (generalmente 1 M), sopportando elevate pressioni osmotiche;
Stafilococchi
Ossigeno (O2)
Aerobiobbligati
Aerobi facoltativi
Anaerobi obbligati
Anaerobi facoltativi
Microaerofili
Fattori influenzanti la crescita
(6 di 6)
Batteri AEROBI OBBLIGATI vivono solo in presenza di O2
Batteri AEROBI-ANAEROBI FACOLTATIVI vivono in presenza/assenza di O2
Batteri ANAEROBI OBBLIGATI vivono in assenza di O2
Batteri MICROAEROFILI vivono in presenza di (O2 5%, CO2 10%, N2 85%)
Terreni particolari per l’isolamento
di agenti eziologici poco frequenti
Origine prelievo
Diagnosi presuntiva
Batteri patogeni Terreni per l'isolamento
Feci Colera Vibrio cholerae Vibrio
parahaemolyticus
Acqua peptonata alcalina TCBS
Faringe Infiammazione ostruttiva
epiglottide e faringe
Faringite membranosa
Haemophilus influenzae
Corynebacterium diphteriae
Agar sangue cioccolato o agar Casman
Agar Loeffler Agar Tinsdale
Terreno al tellurito di
sodio
Terreni particolari per l’isolamento
di agenti eziologici poco frequenti
Origine prelievo Diagnosi presuntiva
Batteri patogeni Terreni per l'isolamento
Tampone rinofaringeo
Pertosse Bordetella pertussis
Bordet-Gengou alla patata
Escreato Tubercolosi
Micosi polmonare
Mycobacterium tuberculosis
Blastomyces dermatitidis
Lowenstein-Jensen
Middlebrook 7H-11
Brain-heart Infusion agar
Urina Leptospirosi Leptospira spp. Semisolido di Fletcher
Sangue, midollo osseo o biopsia
Brucellosi Brucella spp. Agar brucella
Terreni per l’isolamento degli
anaerobi da campioni patologici (1 di 2)
Terreno Scopo
Agar sangue (AS) Terreno in piastra non selettivo di usogenerale
Agar cioccolato (AC) Utilizzato principalmente perl'isolamento di Haemophilus eNeisseria; usato anche per l'isolamentodi anaerobi esigenti
Agar MacConkey (MAC) Isolamento di bacilli Gram- aerobi edanaerobi facoltativi
Agar sangue feniletilalcool (PEA)
Isolamento cocchi Gram+ anerobifacoltativi ed anaerobi obbligati Gram+e Gram-
Terreni per l’isolamento degli
anaerobi da campioni patologici (2 di 2)
Terreno Scopo
Agar sangue kanamicina-vancomicina (KV)
Isolamento selettivo di bacilli anaerobi Gram-
Terreno al tioglicolato (BBL-0135C) + emina + vitamina K1 (THIO)
Brodo di arricchimento utilizzato per arricchire i terreni in piastra particolarmente se il campione è scarso
Terreno di Thayer-Martin modificato (MT)
Impiegato per arricchire i terreni per anaerobi quando si sopetta nel campione la presenza di Neisseria gonorrhoeae o N. meningitidis
Giara per anaerobiosi
Anaerobiosi
Figure 6.5
Cappa (camera) per anaerobiosi
Giara con “candela”
Sistemi per generazione di carbossifilia (CO2-packet)
Carbossifilia
(5% O2, 10% CO
2, 85% N
2)
Figure 6.7
Identificazione dei
microrganismi
1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen
2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) tipo (aspetto) coloniale emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc. crescita su terreni selettivi
3. Caratteristiche biochimiche4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)5. Tipizzazione fagica6. Identificazione genotipica
ID dei microrganismi
Aspetto macroscopico delle colonie
(1 di 2)
Forma Rilievo
piatto
sopraelevato
convesso
umbonato
sottile, allungatoeffusopuntiforme
circolare
filamentosa
rizoide
irregolare
d < 1 mm
irregolare, a filo intrecciato
irregolare, ramificata
ID dei microrganismi
Aspetto macroscopico delle colonie
(2 di 2)
Superficie Margine
intero
ondulato
eroso
filamentoso
arricciato
liscia
radiata
rugosa
concentrica
rilevata ondulata
anelli concentrici
raggrinzita
ID dei microrganismi
Aspetti macroscopici (emolisi)
Streptococcus spp
Staphylococcus spp
ID dei microrganismi
Aspetti macroscopici (fermentazione)
Staphylococcus spp
ID dei microrganismi
Aspetti macroscopici (sciamaggio)
Proteus mirabilis
ID dei microrganismi
Caratteristiche biochimiche
Enterobacteriaceae, in particolare: capacità di utilizzare determinati substrati come
unica fonte di carbonio acidi organici o loro sali (acetato, citrato, malonato) +
indicatore pH (blu di bromotimolo: vira al blu a pH basico)
presenza di particolari enzimi ureasi, lisina- ornitina-decarbossilasi, arginina-diidrolasi,
beta-galattosidasi, ureasi
produzione di specifici prodotti metabolici terminali H2S, indolo, acetoino (reazione di Voges-Proskauer)
capacità di fermentare particolari zuccheri (O-F test) 1% carboidrato + indicatore pH + campanella di Durhan
(produzione di gas)
ID dei microrganismi
Caratteristiche biochimiche
API (bioMérieux) Identification System
ID dei microrganismi
Caratteristiche antigeniche
Produzione di antisieri (Ab specifici) mediante inoculazione di microrganismi nella cavia
Utilizzo di antisieri per reazione di agglutinazione colonia stemperata in NaCl + antisiero specifico
reazione positiva: agglutinazione dei microrganismi
Possibile tipizzazione specifica ed intra-specifica (tipi sierologici o sierotipi)
Agglutinazione
AgAg
Ag
AgAg
Ab
ID dei microrganismi
Tipizzazione fagica
Una singola specie può comprendere ceppi diversi (sottospecie o tipi)
Impiego di batteriofagi a fini identificativi esempio: tipizzazione di S. aureus
estremamente sensibile a numerosi (20) batteriofagi virulenti (litici)
sensibilità non uniforme (stipite-specifica)
individuazione di “tipi fagici”
Utile ai fini epidemiologici (studio delle modalità di diffusione dell’infezione)
Tipizzazione fagica
ID dei microrganismi
Identificazione molecolare
Polymerase Chain Reaction
amplificazione di sequenze “bersaglio”, specifiche per il genere, la specie od il tipo batterico
elevata sensibilità (necessità di poche copie del target di partenza) e specificità.
sequenziamento genico (genotipizzazione)
RNA ribosomale
grandi quantità di rRNA altamente conservate in specie differenti;
presenza di sequenze di rRNA “specifiche” per specie e tipo. L’amplitudo della differenza nell’rRNA di due batteri rivela quanto filogeneticamente “vicini” essi siano: piccole differenze in rRNA sono suggestive per una vicinanaza tra le specie, mentre grandi differenze indicano che le specie sono più distanti tra loro.
L’individuazione di un pattern in rRNA che non trova riscontro in nessun altra sequenza nota, indica la scoperta di una nuova specie.
ID dei microrganismi
Identificazione molecolare
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