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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA – CONCYT –
SECRETARÍA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA – SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA – FONACYT –
UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA
INFORME FINAL
EVALUACIÓN DE LA DEGRADACIÓN DE FUNGICIDAS
EN CAMAS BIOLÓGICAS
PROYECTO FODECYT No. 022-2006
ADRIAN GIL, Ph.D.
Investigador Principal
Guatemala Julio de 2011
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
1
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo
Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de
Ciencia y Tecnología –SENACYT- y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –
CONCYT-.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
2
Equipo de investigación:
Licda. Ana Luisa Mendizábal de Montenegro
Licda. Fabiola Prado de Micheo
Br. Rossina Espósito
Dra. María del Pilar Castillo
Dr. Adrián Francisco Gil Méndez
La parte experimental se desarrolló en el Laboratorio de Instrumentación Química
Avanzada del Instituto de Investigaciones de la Universidad del Valle de Guatemala, y el
Laboratorio del Departamento de Toxicología de la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala.
Los Plaguicidas fueron proporcionados por Agrequima.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
3
CONTENIDO
página
Resumen 4
Abstract 5
Parte I
I.1. Introducción 7
I.2. Planteamiento del problema 9
I.2.1 Antecedentes en Guatemala 9
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación 10
I.3. Objetivos e Hipótesis 11
I.3.1 Objetivos 11
I.3.1.1 General
I.3.1.2 Específicos
I.3.2 Hipótesis 11
I.4 Metodología 12
I.4.1 Localización 12
I.4.2 Preparación de las camas biológicas escala laboratorio 12
Parte II
Marco Teórico 17
Parte III
III.1 Resultados 33
III.2 Discusión de resultados 53
Parte IV
IV.1 Conclusiones
55
IV.2 Recomendaciones 56
IV.3 Referencias Bibliográficas 57
IV.4 Anexos 61
Parte V
V.1 Informe Financiero
65
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
4
Resumen
La aplicación de plaguicidas contribuyó significativamente a la mejora en la productividad
agrícola, sin embargo al mismo tiempo ha representado un alto riesgo de contaminación del
suelo y agua. Por esta razón es importante seguir las recomendaciones de buenas
prácticas en el manejo de plaguicidas cuando se trasvasan o diluyen. Sin embargo aún
siguiendo las recomendaciones, es posible que haya pequeños derrames de las soluciones
de plaguicidas en los lugares donde se realizan las diluciones o se trasvasan las mismas.
Una alternativa que se ha planteado es la degradación biológica de los plaguicidas
aprovechando la capacidad que los microorganismos tienen de degradar sustancias
complejas como la celulosa. Para ello se prepara sistema que tiene tierra y broza entre
otros materiales, para promover el crecimiento de microorganismos que contribuyan a la
descomposición de estas sustancias. A estos sistemas se les ha denominado “cama
biológica”. Este efecto se ha comprobado y estudiado especialmente en Suecia. Puesto
que en Guatemala, por las condiciones de temperatura y humedad se utilizan diversos
fungicidas, se presenta la evaluación de la efectividad de “camas biológicas” para la
degradación de bajas concentraciones de fungicidas, utilizando material provenientes del
campo agrícola guatemalteco.
Se estableció el proceso para preparar y caracterizar camas biológicas experimentales a
escala laboratorio. Se determinó la capacidad de retención de agua para posteriormente
tener control sobre la humedad del sistema, también la reproducibilidad en la toma de
muestra y la manera de determinar la actividad biológica mediante la absorción y
cuantificación del dióxido de carbono producido.
Así mismo, se estableció la estrategia analítica para la determinación de Clorotalonil,
Tebuconazol, Captán y Benomyl incluyendo pruebas para extraer los fungicidas
remanentes utilizando diversos solventes, y cuantificando por HPLC. Se determinó que el
Clorotalonil se degradó en un 100% en 6 días y el Tebuconazol se degradó en un 70% en
40 días. Los resultados obtenidos muestran la pronta degradación de los plaguicidas
estudiados hasta la casi desaparición del mismo en pocos días lo que confirma su
efectividad para su uso en la prevención de la contaminación del suelo, durante el proceso
de lavado y trasvase de estos plaguicidas.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
5
Abstract
The application of pesticides contributed significantly to improve agricultural productivity.
However, at the same time it has represented a high risk of contamination of soil and water.
Therefore it is important to follow the best practices in pesticide management when
transferred or during the preparation of diluted solutions. Yet even when used as
recommended, there may be small spills of pesticide solutions in places where the dilutions
are made or when the aspersion tanks are filled.
An alternative that has emerged is the biological degradation of pesticides taking advantage
of the capacity that microorganisms have to degrade complex substances such as cellulose.
This systems are prepared with soil, straw and compost to allow the growth of
microorganisms that contribute to the breakdown of these pesticides. These systems have
been called "biological bed." The effect of these systems has been tested and surveyed
especially in Sweden. In Guatemala, because of the temperature and humidity conditions,
various fungicides are used. In this work, we present the evaluation of the effectiveness of
"biological beds" for the degradation of low concentrations of fungicides, using material
from the Guatemalan agricultural field.
The process to prepare and characterize experimental laboratory-scale biological beds was
established; including water holding capacity determination and the reproducibility of
sampling and the determination of the biological activity and quantification by absorbing
carbon dioxide produced.
Likewise, the analytical strategy was established for the determination of chlorothalonil,
tebuconazole, Captan and Benomyl including tests to extract the remaining fungicides
using different solvents and quantified by HPLC. It was found that chlorothalonil was
degraded by 100% in 6 days and tebuconazole was degraded by 70% in 40 days. The
results show the rapid degradation of pesticides studied to the near disappearance in a few
days confirming its effectiveness for use in the prevention of soil contamination during the
washing process and transfer of these pesticides.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
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PARTE I
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
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I.1 INTRODUCCIÓN
Los plaguicidas son sustancias o mezcla de sustancias utilizadas con la finalidad de
prevenir, destruir, repeler o controlar cualquier plaga. Estas plagas pueden ser tan diversas
como insectos, animales, hierbas, hongos y virus (EPA 2011). Estas sustancias pueden ser
naturales o sintéticas. Su uso permitió el aumento sustancial en los productos cosechados, a
mediados del siglo pasado. Sin embargo su uso descontrolado propició la generación de
varios problemas, como la resistencia de las plagas a los mismos. Una de las
preocupaciones que surgieron en ese entonces fue el riesgo de la contaminación de agua y
suelo por las sustancias químicas utilizadas; especialmente porque debido a sus estructuras
normalmente complejas, es difícil su degradación.
Para disminuir los riesgos de contaminación se ha trabajado extensamente en la
capacitación para asegurar la correcta aplicación de los plaguicidas, desde el hecho de
aplicar las dosis correctas, el equipo adecuado, y también la correcta manipulación de los
recipientes cuando se cuando se trasvasa o se limpia el equipo.
Existe amplia información acerca de los procedimientos para el buen manejo de los
mismos. Sin embargo, aún cuando se siguen las recomendaciones para el buen manejo de
los plaguicidas, es inevitable que existan pequeños derrames especialmente cuando se
trasvasa el plaguicida a los instrumentos de aplicación, hay que considerar que usualmente
el trasvase se realiza siempre en el mismo lugar por lo que se puede generar una zona de
alta concentración.
Los procesos de degradación de plaguicidas incluyen la acción de la radiación ultravioleta,
el procesamiento en plantas y animales. Pero también desde hace años se conoce la
capacidad de los microorganismos del suelo para degradar los plaguicidas pero hasta
recientemente se han realizado estudios para poder establecer sistemas que contribuyan a
esa degradación.
Es interesante anotar que actualmente al mismo tiempo del interés por propiciar los proceso
de degradación de los plaguicidas en el suelo, existe preocupación por el hecho de que en
los lugares donde se han aplicado plaguicidas, se podría favorecer el crecimiento de
microorganismos que metabolicen muy rápidamente estos compuestos con el riesgo de
disminuir su efectividad en el control de plagas.
Para favorecer la degradación de los plaguicidas, en Suecia se diseñaron sistemas que
contienen una especie de filtro biológico con diversos materiales, incluyendo especialmente
tierra y elementos nutrientes que contribuyan al desarrollo de los microorganismos. Estos
sistemas en general se les ha denominado “biobeds” o camas biológicas. A la fecha ya
existen documentos guía para construir estos sistemas (Fogg 1997).
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
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Las camas biológicas son sistemas en los que se favorece el crecimiento de hongos capaces
de degradar los plaguicidas para que si ocurre un derrame, el plaguicida pueda ser
descompuesto y no alcance el manto freático ni se acumule en el suelo. En general las
camas biológicas son construidas utilizando un agujero en el suelo, el cual se rellena con
capas de arcilla, cal y una mezcla de paja-tierra-broza. En la parte superior se siembra
grama para favorecer la distribución de los plaguicidas derramados y regular la humedad.
Existen diversos diseños para las mismas pues se procura reutilizar materiales disponibles
en el área para que su construcción sea de bajo costo.
Estos sistemas se han implementado de manera más o menos empírica en diferentes países,
en Suecia se han desarrollado estudios específicos. En Guatemala, la Asociación del
Gremio Químico Agrícola (Agrequima) ha impulsado su uso y su estudio, dentro de toda
la parte de difusión de buenas prácticas en el uso de plaguicidas.
Actualmente se han realizado numerosas investigaciones sobre el destino de varios
plaguicidas cuando se utilizan camas biológicas. En Guatemala no existen estudios en ese
sentido, por esa razón es que se consideró realizar este estudio, además considerando que
en nuestro campo agrícola se utilizan fungicidas puesto que los hongos son una plaga
importante por las condiciones climáticas propias.
Por esto el trabajo presentado busca evaluar la degradación de fungicidas en nuestro medio,
puesto que estos, están diseñados específicamente para eliminar los hongos presentes, cabe
cuestionar si sus características podrían impedir la degradación de estos compuestos.
Dentro de este estudio se inició con la preparación de camas biológicas a escala laboratorio,
para tener control de la temperatura y humedad. En estos sistemas se utilizó una mezcla de
tierra y broza de caña, para tener composición similar a la que se podría preparar en un
sistema a mayor escala. Puesto que la capacidad de retener agua, depende de la
composición del suelo, se determinó esta capacidad en el suelo y luego en todos los
sistemas se mantuvo la humedad constante.
Puesto que el interés es establecer la acción de los fungicidas en un sistema comparable al
que se utiliza en campo, las concentraciones de fungicidas fueron las utilizadas en la
aplicación de estos químicos.
Se evaluó la actividad biológica, mediante la determinación de la producción de dióxido de
carbono, como indicador de la degradación de materia orgánica por procesos biológicos.
Para ello se capturó el dióxido de carbono en trampas de hidróxido de sodio. Con ello se
pudo observar que la actividad fue mayo en presencia de plaguicidas.
El seguimiento de la degradación se realizó midiendo la cantidad de plaguicida presente en
la “cama biológica” en el tiempo mediante cromatografía, no se realizó el estudio o
caracterización de los metabolitos producidos. Se realizaron pruebas de extracción para
seleccionar los solventes adecuados, y las mejores condiciones para cuantificar la presencia
de los plaguicidas. Los resultados confirman la efectividad de estos sistemas para degradar
plaguicidas.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
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1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
1.2.1 ANTECEDENTES EN GUATEMALA
Para evitar la contaminación del medio ambiente cuando se utilizan plaguicidas, es
indispensable que los mismos se utilicen a las concentraciones y dosis recomendadas;
además que se sigan cuidadosamente los procedimientos de dosificación y manejo seguro.
Sin embargo, se ha encontrado que en el trabajo normal de la aplicación de plaguicidas,
existe otra fuente de contaminación originada por los pequeños derrames accidentales.
Estos, son los pocos mililitros que se derraman durante el trasvasado de la solución de
plaguicidas o en el lavado de los instrumentos de trabajo. Cuando La alta concentración
facilita que residuos de los plaguicidas alcancen niveles freáticos o se acumulen en el suelo.
En Guatemala, la Asociación del Gremio Químico Agrícola (Agrequima) se ha ocupado de
la implementación de estos sistemas en el campo, desarrollándolos bajo el nombre de
“biodep”; sin embargo no existen todavía datos concretos de su funcionamiento en
nuestras condiciones. Por ejemplo es de importancia conocer el impacto que tiene el uso de
fungicidas, que es distinto que en los países ubicados a mayor latitud.
En Guatemala, Agrequima ha impulsado la construcción de camas biológicas en dos
diseños: uno es llamado propiamente “cama biológica” con su parte superior a ras del
suelo, y otra denominada “mesa biológica con su parte superior elevada, diseñada para
retener los derrames en aspersores, esquemas de ambos diseños se muestran en la figura 1.
Figura 1.
Esquemas de dos diseños de cama biológica
Fuente: Agrequima, 2004
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
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I.2.2 JUSTIFICACION DEL TRABAJO DE INVESTIGACION.
En el trabajo de campo es inevitable que existan pequeños derrames cuando se trasvasan los
plaguicidas tanto concentrados para diluir como diluidos para trasvasar a los recipientes que
van a servir para su aspersión. Usualmente el trasvase se realiza en el mismo lugar por lo
que se genera una zona de alta concentración.
En Guatemala, Agrequima se ha ocupado de la implementación de los sistemas de camas
biologicas en el campo, pero no existen todavía datos concretos de su funcionamiento en
nuestras condiciones de suelo y clima, ni tampoco datos del impacto que genera el uso de
fungicidas sobre los hongos que forman las camas biológicas y que actúan en la
degradación de los plaguicidas.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
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I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS.
I.3.1 OBJETIVOS
I.3.1.1 General
Evaluar el funcionamiento de las camas biológicas cuando se utilizan fungicidas.
I.3.1.2 Específicos
Construir camas biológicas experimentales, que sirvan para estudios permanentes.
Establecer la metodología cromatográfica adecuada para el análisis de fungicidas
Revisar el diseño actual de las camas biológicas usadas en Guatemala.
Determinar el porcentaje de recuperación de cinco plaguicidas en camas biológicas.
Elaborar un documento detallado para la construcción y uso de las camas biológicas.
I.3.2 HIPÓTESIS.
Los microorganismos presentes en una cama biológica son capaces de degradar el nivel
normal de utilizado de fungicidas.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
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I.4 Metodología.
I.4.1 Localización
La elaboración de las camas biológicas experimentales así como el monitoreo de la
producción de dióxido de carbono, se llevo a cabo en las instalaciones de la Universidad del
Valle en el edificio C de laboratorios (Latitud 14º 36' 14.54" N; 90º 29' 22.57" O,
elevación 1517msnm. temperatura minima 20 C y máxima 23C y humedad relativa
promedio de 54%)
La parte de análisis químico de los fungicidas se llevo a cabo en las instalaciones del
Laboratorio de Instrumentación Química Avanzada Edificio II1 de la Universidad del Valle
de Guatemala (Latitud 14º 36' 14.54" N; 90º 29' 22.57" O, elevación 1517msnm.)
temperatura minima 20 C y máxima 23C y humedad relativa promedio de 54%) y en el
Laboratorio de Toxicología de la Universidad de San Carlos de Guatemala (Latitud 14º 38'
45.20" N; 90º 30' 44.73" O, elevación 1497.8msnm temperatura minima 20 C y máxima de
27 C con humedad relativa de aprox. 64%).
I.4.2 LAS VARIABLES
I.4.2.1 Variables Dependientes
Temperatura ambiental.
Concentración de hongo en la cama experimental.
I.4.2.2 Variables Independientes
Humedad en las cajas donde se encuentra la cama biológica experimental.
Concentración del fungicida.
I.4.3 Preparación de las camas biológicas escala laboratorio
Se prepararon camas biológicas en recipientes impermeables, colocando cantidad constante
de la mezcla. Se determinó el índice de retención de agua y luego se añadió suficiente agua
para que la tierra tuviera el 60% del valor humedad.
Para a evaluación de la degradación de los plaguicidas, se tomaron porciones de tierra
equivalentes con un muestreador cilíndrico. Se preparó un sistema de referencia al que no
se le agregó plaguicida alguno y se utilizó para establecer la línea base de la producción de
dióxido de carbono y también durante el proceso de extracción y cuantificación de los
plaguicidas.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
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I.4.3.1 Contenido de humedad
(método proporcionado por la Dra. María del Pilar Castillo)
Pesar una cápsula.
Pesar aproximadamente 5 gramos de muestra en la cápsula.
Secar durante la noche a 105 °C
Sacar del horno y colocar en un desecador para dejar enfriar.
Pesar.
(pc+ms). - (pc).
% Materia seca = ______________
(pc+mh).- (pc).
donde:
(pc).= peso de la cápsula
(pc+mh).= peso de la cápsula más el material
húmedo
(pc+ms). = peso de la cápsula más el material
seco
% humedad = 100 - % materia seca
I.4.3.2. Determinación de Water Holding Capacity (WHC)
(método proporcionado por la Dra. María del Pilar Castillo)
Para la determinación del WHC se hace uso de tubos de plástico (3.5 a 4 cm de
diámetro y 6.5 cm de alto) con una net de nylon atada al fondo con una liga.
Se llenan los tubos casi hasta el borde con el suelo.
Para compactar la muestra se golpea el tubo suavemente sobre la mesa unas 5 a 6
veces.
Los tubos con la muestra se colocan en un recipiente con agua por 2 días (altura del
agua 1 – 1.5 cm).
Al cabo de los dos días se trasladan los tubos sobre una pariila y se deja que el agua
escurra por unas 5 horas.
Vaciar el contenido del tubo en una cápsula (pre-pesada) y pesar.
Secar la cápsula mas la muestra a 105°C durante la noche.
Determinar el peso seco.
El peso seco y la humedad de la muestra determinadas a éstas condiciones representan
el 100% de la capacidad de la muestra.
I.4.3 Ensayos químicos:
a. Identificación: Para la identificación de la longitud de onda máxima a utilizar para
el análisis por Cromatografía Líquida (HPLC) de los fungicidas incluidos en el presente
estudio, se determinó el espectro de cada uno en la región Ultravioleta-Visible (UV/VIS).
b. Cuantificación del principio activo: Se buscó estandarizar un procedimiento con el
equipo de HPLC acoplado a un detector UV/VIS según el trabajo a continuación descrito:
se disolvieron los estándares en metanol, luego se tomó una alícuota la cual fue filtrada
a través de un filtro para soluciones orgánicas de 0.2um a un vial previo a su inyección en
el HPLC.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
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I.4.4.1 Determinación de longitud de onda de máxima absorbancia.
De acuerdo a su solubilidad, se prepararon soluciones concentradas de 1 mg/mL de
clorotalonil y tebuconazol en acetona, el captan en diclorometano y el benomyl en
cloroformo. A partir estas, se hicieron diluciones en metanol (0.01mg/mL), usadas para el
análisis UV/VIS, estableciendo los picos de máxima absorbancia en un intervalo de
longitud de onda de 190 a 400 nm.
I.4.4.2 Determinación de las condiciones analíticas para cuantificación.
Para el desarrollo del método analítico empleando HPLC y basado en los datos anteriores,
obtenidos por espectroscopia UV-VIS, así como en la literatura revisada, se prepararon
estándares con cada uno de los fungicidas a estudiar y con esto se probaron diferentes fases
móviles, diferentes columnas y longitudes de onda, tratando de obtener la máxima
respuesta posible para cada uno de ellos y se optimizaron así las condiciones de separación
de los mismos (Tabla 15).
De las soluciones concentradas (1mg/mL), se hicieron diluciones de 0.01 mg/mL de cada
uno de los fungicidas con la fase móvil correspondiente.
De las columnas usadas y fases ensayadas, los mejores resultados obtenidos fueron
empleando la columna C18, hypersil ODS; y de las fases, para la determinación de
clorotalonil acetonitrilo: agua (70:30) a 231 nm, y para tebuconazol acetonitrilo: agua
(50:50) a 223 nm. Para el Benomyl y Captan por razones de tiempo se excluyeron del
estudio.
Al tener ya establecidas las condiciones analíticas, se realizaron estudios de recuperación
fortificando muestras de biomezcla, con 60% de humedad, por separado con cada uno de
los dos fungicidas. También se prepararon curvas de calibración de cada uno de ellos para
obtener los datos de linealidad y cuantificación de las muestras.
Con los fungicidas a usarse en las camas biológicas (clorotalonil y tebuconazol) para
evaluar su degradación; se iniciaron los ensayos de las camas biológicas aplicando cada
uno de ellos por separado; y de acuerdo al plan de muestreo, se hicieron los análisis
correspondientes cada quince días determinando el porcentaje de degradación de los
mismos, tomando como base el resultado obtenido en el primer muestreo al momento de
asperjarlas (tiempo 0). Al mismo tiempo se tomó una muestra control sin los hongos y sin
los fungicidas.
I.4.4.3 Análisis de la biomezcla
Las muestras de biomezcla se pesaron en frascos de vidrio con tapón hermético, se les
agregó el volumen del solvente indicado en las tablas (2 a 14); los frascos se agitaron por
una hora en un agitador rotatorio. Los extractos metanólicos se filtraron a través de sulfato
de sodio anhidro y de filtros de 0.2 um, recibiendo el filtrado en viales sellados y
almacenados en refrigeración hasta el momento de su análisis.
En el caso de los extractos con diclorometano, se llevó a sequedad 1 mL de cada muestra
bajo corriente de nitrógeno a una temperatura inferior a 40˚C y posteriormente se
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
15
reconstituyo con 1 mL de la fase móvil correspondiente y se filtro a través de membrana de
0.2 um a viales, sellados y almacenados en refrigeración.
Las muestras fueron posteriormente inyectadas en triplicado en el HPLC alternándolas con
los estándares correspondientes.
I.4.5 Análisis estadístico
La prueba estadística que se utilizó en este trabajo fue la de mínimos cuadrados en base a la
cual se calculó la concentración de las muestras y luego promedios y desviación estándar de
las diferentes replicas que se trabajaron.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
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PARTE II
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
17
MARCO TEÓRICO
Se ha encontrado que en el trabajo normal de la aplicación de plaguicidas, existe otra fuente
de contaminación originada por los pequeños derrames accidentales. Estos, son los pocos
mililitros que se derraman durante el trasvasado de la solución de plaguicidas o en el lavado
de los instrumentos de trabajo. Cuando La alta concentración facilita que residuos de los
plaguicidas alcancen niveles freáticos o se acumulen en el suelo. En la figura siguiente
tomada de una presentación explicativa de las camas biológicas, da una idea de la
contaminación producida por diferentes aspectos del proceso en el trasvase de sustancias y
lado de equipo.
Figura 2 Posibles fuentes de contaminación en el área de trabajo
Fuente: Bayer CropScience Cherwell Study
II.1 Construcción de camas biológicas
Las camas biológicas en su diseño original consisten en un agujero en el suelo de 60 cm. de
profundidad el cual es rellenado por una capa de arcilla al fondo, una biomezcla de paja,
suelo y turba y una capa de grama en la superficie. Se puede incluir una rampa para el
estacionamiento del equipo de aspersión (Fig. 2).
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
18
Figura 3. Diagrama de una cama biológica
Fuente: (Uppsala BioCenter)
La típica biomezcla sueca consiste de paja, suelo y turba en una proporción de 50-25-25 %
en volumen. El suelo provee de capacidad de retención y de microorganismos degradadores
de pesticidas. La turba provee también con una alta capacidad de retención y mantiene la
humedad del sistema. La capa de grama en la superficie contribuye con el equilibrio de la
humedad por evapo-transpiración y sirve además como un indicador de derrames de
pesticidas ya que mata el césped de la superficie generando zonas decoloradas. (Uppsala
BioCenter)
Existen varios diseños utilizados para la construcción de camas biológicas. Uno de las
diferencias importantes son las camas biológicas selladas y las que son abiertas. En las
abiertas, que es el diseño original desarrollado en Suecia, las sustancias pasan a través del
sistema y el lixiviado se integra directamente en el suelo. En cambio en los sistemas
cerrados la solución que queda en el fondo del sistema debe ser bombeado para extraerlo.
En la figura 3 se muestra la comparación esquemática de estos diseños.
Se ha discutido la conveniencia de que la parte inferior de la cama biológica esté cerrada,
con el objeto de evitar que plaguicidas con alta movilidad puedan atravesar la capa de
arcilla. Sin embargo esto presenta varios problemas ya que se anega fácilmente con la
lluvia, por otro lado si se le protege de la lluvia, la parte superior se vuelve impermeable al
tener poca movilidad de los plaguicidas derramados, evitando su degradación (Fogg P.
2004b). Por esta razón lo recomendable es el diseño de camas biológicas abiertas, pero se
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
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hace necesario el monitoreo apropiado para asegurarse que efectivamente los plaguicidas
sean degradados. Otra solución es cubrir parcialmente el sistema y que se encuentre a una
altura un poco superior del nivel del suelo.
Figura 4. Modelo de cama biológica abierta y cerrada
Fuente http://biobed.org
En las camas o mesas biológicas recién construidas, los materiales se hunden como 10 cm
al año; se recomienda entonces, remover la capa de grama, llenar nuevamente con la
mezcla, y luego volver a sembrar la grama. Es necesario reparar cualquier daño que tenga
la cobertura de grama, se sugiere reemplazarla antes de que inicie la temporada de siembra
o de invierno. (Agrequima)
El contenido de humedad es importante. Debe ser lo más alto posible para permitir la
actividad de los microorganismos que degradan los productos químicos, pero no tan alto
que la filtración de productos para la protección de cultivos se vuelva un riesgo. Se ha
encontrado que un contendio de 60% de la capacidad de retención de agua permite el nivel
más alto de disipación de la mayoría de pesticidas. Mientras en pruebas realizadas a 30 y
90 % de la capacidad de retención de agua, dieron como resultado una limitada actividad
microbiana (Castillo M, 2008).
De acuerdo a las experiencias de Suecia, las camas tienen una vida útil entre 5 a 8 años,
luego de este tiempo la mezcla paja-tierra-broza, debe cambiarse. La mejor época para
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
20
cambiar la mezcla, es inmediatamente antes de que inicie la nueva temporada de
aspersiones. (Agrequima)
El material que se saca de las camas biológicas debe colocarse encima de un plástico
grande, con el propósito de evitar que los posibles residuos de productos para la protección
de cultivos que existan no lleguen al suelo, y para cubrir el material en caso de lluvia.
En este estudio se desarrolló la metodología para el estudio de la degradación de
plaguicidas en camas biológicas a escala laboratorio. Se probó el seguimiento de la
actividad biológica midiendo la generación de dióxido de carbono. Se estableció también
la metodología para la determinación por cromatografía, trazando curvas de calibración,
determinando porcentajes de recuperación con diferentes solventes. El desarrollo de la
metodología para la cuantificación cromatográfica fue la parte más complicada y debido a
ello al final únicamente se pudo establecer completamente la degradación de dos
plaguicidas. Para los otros plaguicidas no fue posible implementar la metodología
apropiada.
Los niveles de degradación encontrados son muy buenos ya que si en otros estudios se hace
el seguimiento de la degradación durante meses, en este caso en pocas semanas ya no era
posible detectar la presencia de los plaguicidas.
II.2 Funcionamiento de las camas biológicas
Figura 5. esquema de la acción de las enzimas en la degradación
Fuente: Adaptado de Hofrichter, M y Papinutti, 2003
Aprovechando la capacidad de degradación de plaguicidas por microorganismos, Desde
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
21
hace algunos años se ha investigado la disminución en el impacto ambiental de estos
derrames de plaguicidas al utilizar los sistemas llamados “camas biológicas”. Se ha
documentado la degradación de distintos plaguicidas en estos sistemas incluyendo diversos
herbicidas, insecticidas y fungicidas. Algunos estudios han logrado monitorear el
comportamiento de estos sistemas durante varios años (Tortensson, L. 2000)
La degradación de los plaguicidas en el suelo implica diferentes procesos, además de los
procesos de degradación biológica también se desarrollan fenómenos de degradación
abióticos, como procesos de hidrólisis, oxidación, reducción e isomerización, que en
conjunto ayudan a la degradación de los plaguicidas (McBride 1994).
La degradación de plaguicidas por microorganismos es conocida hace algunos años, se ha
tratado de establecer el mecanismo de la degradación, con la identificación de plásmidos de
algunos microorganismos (Don, R. 1981). A pesar de la eficiencia de los
microorganismos por degradar casi cualquier estructura, existen algunas que son
especialmente difíciles de descomponer y permanecen en el ambiente por mucho tiempo,
tal es el caso de los bifenilos policlorinados (PCBs). Esta dificultad para degradar este tipo
de compuestos se atribuye al efecto combinado de su poca solubilidad en agua y que tiene
pocos sitios posibles para el ataque enzimático, aunque la degradación microbiológica de
los mismos ha sido mostrada (Farley, K. 1994), por ejemplo se ha estudiado que la
degradación del tres hidrocarburos cíclicos, fenantreno, pireno y benzopireno siguiendo
conjuntamente los niveles de actividad de la lignina peroxidasa y manganeso peroxidasa
(Wang C. 2009)
Las camas biológicas funcionan por los mecanismos anteriores. Aunque se ha observado
un aumento sustancial en la degradación cuando se ha inoculado el hongo Phanerochaete
chrysosporium (von Wirén-Lehr 2001). Estos hongos producen unas enzimas llamadas
lignina peroxidasas y manganeso peroxidadas; estas enzimas son capaces de degradar la
lignina. El P. chrysosporium, es llamado hongo de descomposición blanca pues al degradar
la lignina de la madera, deja prácticamente intacta la celulosa por lo que queda luego de la
descomposición es blanca. La Lignina tiene una estructura química compleja, tal como se
muestra en la figura. Algunas de las estructuras de los plaguicidas son similares al de la
lignina, quizá por ello el Phanerochaete chrysosporium ha mostrado capacidad para la
descomposición de plaguicidas. Parte de la función de la paja y broza agregada en la
mezcla de la cama biológica tiene la función de proporcionar alimento accesible a los
microorganismos. Por esa razón se ha recomendado dejar reposar la mezcla al ambiente
por varias semanas previo a la preparación de la mezcla (Fogg, P 2004a).
La producción de las enzimas arriba mencionadas no es completamente estable, pero dentro
de las recomendaciones para la buena producción se encuentra que la temperatura debe
estar entre 25 a 39°C, que existan trazas de elementos como hierro, manganeso, calcio,
cinc, cobre; así como asegurar una fuente de nitrógeno y carbono. Se ha utilizado tartrato
de amonio, glucosa o glicerol. El pH que se considera óptimo está entre 4.2 a 6.2.
También se ha mostrado que la producción es mejor cuando el hongo está inmovilizado
(Sing D., 2008)
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
22
Figura 6. Comparación entre la estructura de la Lignina (a) y dos plaguicidas (b)
carbendazim (c) propineb
a
b
c
Fuente:(Lignin institute 2001)
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
23
Tabla 1. Plaguicidas degradados en camas biológicas
plaguicida tipo Referencia
dimethoato acaricida b, d
chlorpyrifos acaricida, insecticida, nematicida d
clorotalonil fungicida b, d
epoxiconazol fungicida d
fenpropimorph fungicida a, c
propiconazol fungicida a, c
tolyfluanid fungicida a
diflufenican herbicida c
MCPA herbicida a
mecoprop herbicida a, b, d
metazachlor herbicida a, c
metabenzthiazuron herbicida a. c
terbutilazine herbicida a, c
terbutryn herbicida a
benzatone herbicida a
clopyralid herbicida a
cianazine herbicida a
diclorprop herbicida a
ethofumesate herbicida a
fluroxypyr herbicida a, c
isoproturon herbicida e, d
linuron herbicida a
metsulfuron-methyl herbicida b, d
pendimethalin herbicida d
deltamethrin Insecticida a
esfenvalarate Insecticida c
lambda-cyhalothrin Insecticida a
pirimicarb Insecticida a, c
cifluthrin Insecticida a
a. Torstensson L. 1997
b. Fogg, P. 2004
c. Torstensson L. 2000
d. Fogg. P. 2004b
e. von Wirén-Lehr, S. 2001
La estructura química de los plaguicidas en muchos casos favorece su adsorción en el
sustrato sobre todo en el caso de los plaguicidas que no son completamente solubles en
agua. El hecho de que sean más o menos hidrofóbicos, afecta los coeficientes de partición
y consecuentemente, su distribución en el sustrato, efectos y posterior destino. En el caso
de sustancias sin carga, se ha establecido el parámetro llamado “coeficiente de partición de
carbono orgánico” puesto que la adsorción en la suspensión de suelo es debida al carbono
(Elzerman A. 1987). Por ello es importante establecer un método para asegurarse de la
desorción de cualquier remanente de los plaguicidas.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
24
La degradación de tebuconazol y propiconazol ha sido también estudiada en madera de
desecho que originalmente fue tratada con estos plaguicidas, en este caso la degradación es
sumamente lenta, esperado por la alta concentración original (Woo, 2010)
Por otro lado las camas biológicas tienen suelo, normalmente del mismo lugar, que
contribuye con la carga microbiológica, además de sitios adecuados para la retención de
plaguicidas. Es importante para el funcionamiento de las camas biológicas que estas
cuenten con una fuente suplementaria de carbono; se ha probado con diferentes materiales,
sin embargo lo que mejor ha funcionado es la paja del trigo en donde se han realizado los
estudios (Morgan, P. 1993) sin embargo en las pruebas realizadas en latinoamérica, se han
utilizado otros materiales, como caña (Castillo M. 2008).
Las camas biológicas tienen una vida útil de aproximadamente 5 años. Luego de lo que se
debe renovar el material de la misma. El material excavado se coloca sobre plástico
impermeable al aire libre para favorecer la descomposición de los residuos que quedaran
adsorbidos.
Los estudios para la determinación de plaguicidas degradados en camas biológicas son
diversos, y en la tabla 1 se presentan ejemplos de ellos así como el tipo de plaguicida.
II.3 Propiedades de los fungicidas que se estudiarán
II.2.1 Propiedades del Clorotalonil
El clorotalonil es un fungicida de amplio espectro, se utiliza principalmente en agricultura y
también en plantas ornamentales. Los productos en los que se utiliza incluye cítricos,
grosellas, arándanos, fresas, plátano, vid, lúpulo, tomate, verduras, tabaco, café, té, soja,
maní, patatas, cebollas, cereales y remolacha azucarera.
Status: ISO 1750
IUPAC: tetracloroisoftalonitrilo
CAS: 2,4,5,6-tetracloro-1,3-bencenodicarbonitrilo
Reg. No.: 1897-45-6
Formula: C8Cl4N2
Actividad: fungicida (fungicida aromático)
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
25
Figura 4. Estructura química del Clorotalonil
InChI: InChI=1/C8Cl4N2/c9-5-3(1-13)6(10)8(12)7(11)4(5)2-14
Propiedades Físicas
Peso Molecular : 265.9
Propiedades : Cristales Blancos
Punto de fusión : 250-251 °C
Punto de ebullición : 350 °C
Presión de vapor : < 9.2mmHg/170.4c
Solubilidad (en solución 1 l) :
o Agua : 0.6ppm / 25c
o Acetona : 20g
o Ciclohexano : 30g
o Dimetil formaldehído : 30g
o Dimetil sulfoxido : 20g
o kerosina : menos de 10g
o xileno : 20g(Kg.)
II.2.2 Propiedades del Tebuconazol o Folicur
Status: ISO 1750
IUPAC: (RS)-1-p-clorofenil-4,4-dimetil-3-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmetil)pentan-3-ol
CAS: α-[2-(4-clorofenil)etil]-α-(1,1-dimetiletil)-1H-1,2,4-triazol-1-etanol
Reg. No.: 107534-96-3
Formula: C16H22ClN3O
Actividad: fungicida (fungicida conazol )
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
26
Figura 5, Estructura química del Tebuconazol
InChI: InChI=1/C16H22ClN3O/c1-15(2,3)16(21,10-20-12-18-11-19-20)9-8-13-4-
6-14(17)7-5-13/h4-7,11-12,21H,8-10H2,1-3H3/t16-/s3
Propiedades
Físicas
Peso molecular: 307.8
Propiedades: Cristales incoloros
punto de fusión es de 102.4 °C
densidad relativa es de 1.25 a 26 °C
Presión de vapor: presión de vapor de 1.7 X 10 -3
mPa a 20 °C
Punto de fusión: 102.4°C
Punto de ebullición: No aplicable
Solubilidad:
o agua a 20ºC 32mg/l a 20 °C.
o diclorometano,
o isopropanol,
o tolueno
o hexano.
Esta sustancia es estable a altas temperaturas.
II.2.3 Propiedades del Captan
Aplicado contra un amplio intervalo de hongos, posiblemente es de los fungicidas más
utilizados. No tiene actividad insecticida ni acaricida.
Status: ISO 1750
IUPAC: N-(triclorometiltio)ciclohex-4-ene-1,2-dicarboximida
CAS:
3a,4,7,7a-tetrahydro-2-[(triclorometil)tio]-1H-isoindol-1,3(2H)-diona
(No. 133-06-2)
Reg. No.: 133-06-2
Formula: C9H8Cl3NO2S
Actividad: fungicida (fungicida ftalamida)
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
27
Figura 6. Estructura química del Captan
InChI: InChI=1/C9H8Cl3NO2S/c10-9(11,12)16-13-7(14)5-3-1-2-4-
6(5)8(13)15/h1-2,5-6H,3-4H2
Propiedades
Físicas
Peso Molecular: 300.6
Propiedades: sólido cristalino blanco (cuando esta puro) Polvo
amarillo amorfo (material técnico)
Punto de fusión: 178°C cuando tiene una pureza de 93-95% y
técnico 160-170°C.
Presión de Vapor: (volatilidad) De el compuesto puro es de 1 x 10-5
torr a 25°C y del técnico es mucho más alta.
Solubilidad
o Agua es prácticamente insoluble <O.5 mg/l así como en
aceites de petróleo
o Solventes orgánicos comunes 10 y 100 mg/l
Es estable a temperatura normal a excepción cuando está bajo
condiciones alcalinas
Se descompone a aproximadamente 100°C, lentamente en
ambiente seco pero rápidamente en ambiente húmedo.
Es un compuesto no corrosivo pero forma productos de
descomposición que si son corrosivos.
II.2.4 Propiedades del Benomyl
Controla un amplio espectro de hongos en frutas, nueces, vegetales, campos agrícolas y
ornamentales. También es efectivo contra las polillas.
Modo de acción: el benomil y su metabolito principal, carbendazim, se unen a los
microtúbulos, estructuras esenciales de las células, interfiriendo en sus funciones, como la
división celular, transporte intracelular etc.
Status: ISO 1750
IUPAC: metil 1-(butilcarbamoil)benzimidazol-2-ylcarbamato
CAS:
metil [1-[(butilamino)carbonil]-1H-benzimidazol-2-yl]carbamato
(No.17804-35-2)
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
28
Reg. No.: 17804-35-2
Formula: C14H18N4O3
Actividad:
acaricida (acaricida carbamato)
fungicida (fungicida benzimidazol y benzimidazolilcarbamato)
nematicida (nematicida carbamato)
:
Figura 7. Estructura química del Benomyl
InChI:
InChI=1/C14H18N4O3/c1-3-4-9-15-13(19)18-11-8-6-5-7-10(11)16-
12(18)17-14(20)21-2/h5-8H,3-4,9H2,1-
2H3,(H,15,19)(H,16,17,20)/f/h15,17H
Propiedades
Físicas
Peso Molecular: 290.4
Propiedades: Cristales de ligero color café
Punto de Fusión: 140 °C
Punto de Ebullición:
Presión de Vapor: menor de 5 x 10-6
Pa
Solubilidad:
o Agua a 25 °C y pH 5 3.6 mg/L
o Heptano 40 g/100g solvente a 25 °C
o Cloroformo 9.4 g/100g solvente a 25 °C
Se hidroliza rápidamente en soluciones acuosas diluidas y en el suelo
a isocianato de butilo y a carbendazim.
Se descompone por ácidos y bases fuertes.
Es estable a la luz
II.2.5 Propiedades del Isoproturon
En este estudio, el isoproturon fue utilizado como estándar interno.
Status:
ISO 1750 (published)
IUPAC: 3-(4-isopropilfenil)-1,1-dimetilurea o
3-p-cumenil-1,1-dimetilurea
CAS: N,N-dimetil-N′-[4-(1-methiletil)fenil]urea
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
29
Reg. No.: 34123-59-6
Formula: C12H18N2O
Activity: algicida
herbicida (herbicida de fenilurea)
estructura:
InChI: InChI=1S/C12H18N2O/c1-9(2)10-5-7-11(8-6-10)13-12(15)14(3)4/h5-9H,1-
4H3,(H,13,15)
(Wood, A. 2010)
En la tabla 3, se muestran algunos otros de los fungicidas de uso frecuente en Guatemala,
junto con su estructura. Se puede apreciar que en general todos contienen nitrógeno en su
estructura, lo que es posible sirva como fuente de este elemento para la síntesis de las
enzimas que conllevan a su degradación por microorganismos.
Tabla 3. Fungicidas de uso común en Guatemala
Fungicidas Grupo funcional estructura
mancoceb Ditiocarbamato polimérico
a
propineb Ditiocarbamato polimérico
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
30
ziram ditiocarbamato
cimoxanil Nitrógeno alifático
matalaxyl Ácido acilamino
fenamidona imidazol
II.4 Métodos analíticos
II.4.1 Clorotalonil
Las muestras son extraídas con algún solvente orgánico como acetona. En la mayoría de
casos el análisis se realiza utilizando cromatografía gas-liquida utilizando un detector de
captura de electrones. Esto proporciona suficiente sensibilidad para el análisis de trazas de
residuos de clorotalonil a límites hasta 0.01 mg/kg . En algunos casos se determina
utilizando un método multi-resíduo y el porcentaje de recuperación entre 89-104 %.
II.4.2 Tebuconazol
La muestra se extrae utilizando una solución acetona/agua y el compuesto particionado en
diclorometano. Despues de limpiarlo en un acolumna Florisil, el residuo se determina por
GLC utilizando un detector de ionización de llama alcalina. El límite de detección
obtenido es de 0.05 mg/kg con una recuperación de 87.4%.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
31
II.4.3 Captan
Se utiliza el cromatografía gas-líquido para la determinación de varios fungicidas,
incluyendo captan, folpet, captafol, vinclozolin e iprodion.
Las muestras han sido estraídas con acetate de etilo en pesencia de ácido fosfórico y
acetato de etilo evaporado y disuelto en diclorometano para limpiarlo por cromatotrafía de
permeación en gel. Luego se continua limpiado con una columna pequeña de Nuchar/silica
gel. El eluato se pasa en una columan de Florisil para tener una solución lista para la
determinación de captan. CEl captan se determino con GLC con un detector fotométrico
en l modo de sulfuro. El límite de detección es cercano a 0.01mg/kg (FAO 1999).
II.4.4 Benomyl
La mayoría de métodos para determinar benomyl y los residuos de sus productos de
degradación en plantas y suelo, involucra la extracción con un solvente orgánico,
purificación del extracto y conversión del residuo a carbendazim. Los residuos pueden
determinarse con el uso de procedimientos cromatografía líquida, HPLC de fase reversa
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
32
PARTE III
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
33
III.1 Resultados
III.1.1 Camas Biológicas
Se prepararon camas biológicas a escala laboratorio utilizando recipientes de material
plástico y tierra mezclada con fragmentos de hoja de caña, aunque en los estudios previos,
el material que se utiliza es paja del trigo, en Guatemala el cultivo de trigo es poco, en
cambio el de caña es muy extendido. La tierra fue proporcionada por Agrequima. En este
caso la tierra no fue esterilizada puesto que el hongo no fue inoculado externamente. La
tierra fue homogeneizada mezclándola antes de colocarla en las camas biológicas.
El muestreo se realizó tomando secciones de tierra de la cama biológica, para proceder a la
extracción y posterior cuantificación.
En la foto No. 1 se muestra uno de los sistemas utilizados como cama biológica
experimental.
Foto No. 1 Sistema utilizado para la cama experimental
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
34
III.1.2 Capacidad de retención de agua (water holding capacity)
Se determinó la capacidad de retención de agua en la mezcla utilizada para preparar las
camas biológicas, para posteriormente mantener un porcentaje constante de humedad en
ellas. Los valores utilizados se muestran a continuación.
Tabla 2. Capacidad de retención de agua
Capacidad de retención de agua 69.19%
% de Humedad antes de la aspersión 10.244 %
% de Humedad después de la aspersión 63.03%
Cantidad de agua utilizada para la aspersión 5.3 L
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
III.1.3 Evaluación de la actividad biológica en la mezcla
Una manera de revisar si existe actividad biológica de degradación de materia orgánica en
las muestras es la determinación de la producción de CO2. A continuación se muestra la
gráfica y los datos que resultaron al determinar el CO2 producido en el sistema control, sin
plaguicida comparado con un sistema con Folicur.
Gráfica 1. CO2 generado (acumulado) en sistema sin plaguicida y con plaguicida
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
35
Con estos resultados se muestra que existe mayor actividad de degradación de materia
orgánica en el sistema al que se agregó Folicur.
Tabla 3. Sistema de cama biológica control
Concentración inicial No se agregó fungicida
Temperatura de mediciones 30 +/- 1 °C
Gramos de muestra utilizados 1.0 +/- 0.0001 g
Fecha mL de HCl
referencia
mL HCl
gastados
Normalidad
NaOH
Mg de
CO2
Mg CO2
acumulados
07 Mayo 5.9 4.90 0.0988 4.3472 4.3472
09 Mayo 5.9 4.60 0.0988 5.65136 9.99856
11 Mayo 5.9 4.00 0.0988 8.25968 13.91104
21 Mayo 5.9 3.90 0.0988 8.6944 16.95408
23 Mayo 5.9 3.90 0.0988 8.6944 17.3888
25 Mayo 5.9 3.80 0.0988 9.12912 17.82352
04 Junio 5.8 3.50 0.0988 9.99856 19.12768
06 Junio 5.8 3.50 0.0982 9.99856 19.9364
08 Junio 5.8 3.30 0.0982 10.868 20.73984
18 Junio 5.8 3.20 0.0982 11.30272 22.03608
20 Junio 5.8 3.20 0.0982 11.30272 22.46816
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Tabla 4. Sistema de cama biológica con Folicur
Concentración inicial 50mg /Kg
Temperatura de mediciones 30 +/- 1 °C
Gramos de muestra utilizados 1.0 +/- 0.0001 g
Cantidad de biomezcla en la cama 3 Kg
Cantidad de Folicur asperjado 0.6 mL
Fecha
mL de
NaOH
referencia
mL HCl
gastados
Normalidad
NaOH
Mg de
CO2
Mg CO2
acumulados
07 Mayo 5.9 3.70 0.0988 9.56384 9.56394
09 Mayo 5.9 3.30 0.0988 11.30272 20.8665
11 Mayo 5.9 2.90 0.0988 13.0416 24.34432
21 Mayo 5.9 2.70 0.0988 13.91104 26.95264
23 Mayo 5.9 2.30 0.0988 15.64992 29.56096
25 Mayo 5.9 1.70 0.0988 18.25824 33.90816
04 Junio 5.8 1.30 0.0988 19.5624 37.82064
06 Junio 5.8 0.80 0.0982 21.604 41.1664
08 Junio 5.8 0.50 0.0982 22.9002 44.5042
18 Junio 5.8 0.30 0.0982 23.7644 46.66464
20 Junio 5.8 0.00 0.0982 25.06064 48.82504
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
36
III.1.2 Desarrollo del método analítico
De los análisis efectuados por espectroscopia UV/VIS se obtuvieron los siguientes datos
para la determinación de la longitud de onda máxima para cada fungicida.
Tabla 5. Determinación longitud de onda de máxima absorbancia
Estándar Longitud de Onda (nm) Absorbancia (AU)
Clorotalonil 217 4.000
221 4.000
224 3.981
231 3.969
215 3.954
Tebuconazol 270 1.648
221 0.703
202 0.647
194 0.571
Captan 210 2.098
249 0.067
Benomyl 217 3.957
240 2.077
275 1.333
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Para el desarrollo del método analítico empleando HPLC y basado en los datos anteriores
así como en la literatura revisada, se probaron diferentes fases móviles, longitudes de onda
y columnas, tratando de obtener la máxima respuesta posible en una determinación
simultanea de los compuestos y optimizar las condiciones de separación de los mismos.
Se prepararon los fungicidas en concentraciones de 1 mg/mL, disolviendo estándares puros
en los solventes indicados anteriormente y diluciones finales de 0.01 mg/mL de acuerdo a
la fase móvil empleada.
Las columnas utilizadas se listan a continuación:
Columna C18, hypersil ODS, 200 x 2.2mm, 5um; C18;
Supelcosyl, 150 x 4.6 mm., 5um;
Columnas conectadas en línea: RP 18, Supelcosyl 150x4.6mm, 5um y Chromolit
100 x 4.6 mm, 5um;
Chromolit RP18, 100x4.6mm, 5um (Merck),
De las columnas indicadas anteriormente la que dio los mejores resultados fue la ODS
Hypersil 5µm 200 x 2.1mm; C18 RP, con la que se realizó todo el estudio.
Con respecto a la fase móvil y la longitud de onda, se inicio probando con la fase de
acetonitrilo: Metanol: Acido Acético 0.05M (35:30:35) para todos los fungicidas y a las
longitudes de onda de 210 y 230nm.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
37
Posteriormente, según especificaciones de los certificados de análisis de los estándares se
probaron las fases: acetonitrilo: agua (70:30) para clorotalonil a 231nm y acetonitrilo: agua
con 0.04% de acido fosfórico (60:40) para Captan a 210. Y de acuerdo a la literatura se
escogió acetonitrilo: agua (50:50) para tebuconazol a 223 nm; y para benomyl, metanol:
agua (80:20) a 254 nm. Se obtuvieron mejores resultados empleando las fases para los
compuestos individuales.
III.1.3 ENSAYOS DE RECUPERACIÓN
Se realizaron pruebas de recuperación en muestras de biomezcla con un porcentaje de
humedad de 60% fortificándolas individualmente con cada uno de los compuestos, como se
describe a continuación.
III.1.3.1 Ensayos de recuperación para CLOROTALONIL
Condiciones de trabajo.
Detector UV. Longitud de onda:231 nm
Columnas conectadas en línea: RP 18, Supercosyl 150x4.6mm, 5um y Chromolit 100x4.6
mm, 5um.
Fase Móvil: Acetonitrilo/agua (70:30)
Flujo: 06 mL/min
Atenuación: 6
Volumen de inyección: 20 l
CURVA DE CALIBRACIÒN:
Preparación de los estándares a partir de la solución madre de clorotalonil 1mg/mL en
acetona, en concentraciones de 1, 2, 5, 10, 20, y 30 ug/mL en fase móvil.
Resultados del análisis de los datos obtenidos.
Tabla No. 6. Resultados de curva de calibración para clorotalonil
Concentración
g/mL Altura
a: 0.743184
b: 5.864055
r: 0.9998
1 7.22
2 11.86
5 29.25
10 60.54
20 117.68
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
(Nota, se incluyo un valor de 30 g/mL pero se observó que este ya no cumple con la
linealidad por lo que se eliminó)
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
38
Gráfica No. 2 Curva de calibración de clorotalonil
Curva de calibración Clorotalonil
y = 5.8641x + 0.7432
R2 = 0.9997
0
20
40
60
80
100
120
140
0 5 10 15 20
Concentración (ug/ml)
Alt
ura
de p
ico
Datos
Lineal (Datos)
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
7.2.1.a PRIMER ENSAYO.
Se pesaron 10 g de biomezcla con 60 % de humedad en 2 erlenmeyers de 250 mL tratando
cada uno de la siguiente forma:
1- Fortificada con 50 ppm (0.5 mg/10g) de clorotalonil.
2- Fortificada con 5 ppm (0.05mg/10g) de clorotalonil
Se Extrajeron con 25 mL de diclorometano y agitación por 1 hora.
Se Filtraron a través de sulfato de sodio anhidro.
Se transfirieron 3 mL de cada uno a beakers de 10 mL, evaporándolos a sequedad
utilizando para ello un ventilador y una lámpara de calor moderado.
Se reconstituyeron con 3 mL de fase móvil, se filtraron a través de membranas de nylon de
0.45um y se inyectaron en el cromatógrafo líquido (HPLC), bajo las condiciones
establecidas.
Resultados:
Fortificación: 5 ppm
Concentración obtenida: 2.3 ppm.
Recuperación: 46.55 %
Fortificación: 50 ppm
Concentración obtenida: 24.3 ppm.
Recuperación: 48.60 %
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
39
III.1.3.1.b SEGUNDO ENSAYO.
Se realizó bajo las mismas condiciones descritas en el primer ensayo pero con una
concentración de 30 ppm (0.3mg/10g) y metanol como solvente de extracción.
Resultado:
Fortificación: 50 ppm
Concentración obtenida: 12.55 ppm.
Recuperación: 41.83 %
III.1.3.1.c TERCER ENSAYO
Se pesaron 10 g de biomezcla con 60 % de humedad en 1 erlenmeyers de 250 mL y 4 g de
biomezcla seca (equivalentes a 10 g de biomezcla húmeda) en otro erlenmeyer de 250 mL.
Cada una se fortificó con 50 ppm (0.50 mg/10g) de Clorotalonil.
Se extrajeron con 50 mL de diclorometano y agitación por 1 hora.
Se filtraron a través de sulfato de sodio anhidro
Se transfirieron 4ml de la solución en duplicado de cada muestra: dos evaporados con
nitrógeno a temperatura menor de 50o C y los otros dos con ventilador y lámpara con calor
moderado.
Se reconstituyeron con 3 mL de fase móvil, se filtraron a través de membranas de nylon de
0.45um y se inyectaron en el cromatógrafo líquido (HPLC), bajo las condiciones
establecidas.
Resultados:
Muestra con 60% de humedad evaporada con calor y ventilación
Fortificación: 50 ppm
Concentración obtenida: 28.24 ppm
Recuperación: 56.48%
Muestra Seca evaporada con nitrógeno
Fortificación: 50 ppm
Concentración obtenida: 47.9 ppm.
Recuperación: 95.8 %
Muestra seca evaporada con calor y ventilación
Fortificación: 50 ppm
Concentración obtenida: 48.0 ppm.
Recuperación: 96 %
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
40
III.1.3.1.d CUARTO ENSAYO.
Del ensayo anterior (muestra húmeda y seca), se evaporaron 4 mL de los extractos con
calor moderado y ventilación, sin sobresecar.
Se reconstituyeron en 2 mL de fase móvil.
Resultados:
Muestra húmeda
Fortificación: 50 ppm
Concentración obtenida: 30.78 ppm.
Recuperación: 61.56 %
Muestra seca
Fortificación: 50 ppm
Concentración obtenida: 41.92 ppm.
Recuperación: 81.34%
III.1.3.2 Ensayos de recuperación para TEBUCONAZOL
Condiciones de trabajo:
Detector UV Longitud de onda: 223 nm
Columna: Chromolit RP18, 100x4.6mm, 5um (Merck).
Fase móvil: acetonitrilo/agua, 50:50
Flujo: 0.6mL/min
Atenuación: 6
Tiempo de retención aproximado: 9.2
Volumen de inyección: 20 L
CURVA DE CALIBRACION
Preparación de los estándares a partir de las solución madre (1mg/mL) de tebuconazol en
metanol, en concentraciones: 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 y 20 ug/mL en fase móvil.
Resultados del análisis de los datos obtenidos.
Tabla No. 7. Curva de calibración para tebuconazol
Concentración
ug/mL Altura
a= 0.01457274
b= 19.635607
r= 0.99995
0.2 3.9
0.5 10.1
1 19.7
2 41.3
5 97
10 194
20 394
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
41
Gráfica No. 3 Curva de calibración para tebuconazol
Curva de calibración Tebuconazol
y = 19.636x + 0.0146
R2 = 0.9999
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 5 10 15 20
Concentración (ug/ml)
Alt
ura
del
pic
o
Datos
Lineal (Datos)
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
III.1.3.2.a PRIMER ENSAYO:
Se pesaron 10 g de biomezcla con 60 % de humedad en 2 erlenmeyers de 250 mL
Se fortificaron con 50 ppm de tebuconazol (0.5mg/10g)
Se secaron a 50o C en horno convencional.
Se extrajeron en frascos de vidrio de 100 mL con 50mL de diclorometano cerrados
herméticamente y agitando por una hora.
Se les agregaron 5 g de sulfato de sodio anhidro y se filtraron con vacío usando filtros de
porosidad fina.
Se transfirieron 5 mL a beakers de 10 mL y se evaporaron a 50o C bajo corriente de
nitrógeno.
Se reconstituyeron con 4 mL de fase móvil, se filtraron a través de membranas de nylon de
0.45um y se inyectaron en el cromatógrafo líquido (HPLC), bajo las condiciones
establecidas.
RESULTADOS:
Fortificación: 50 ppm
Concentración obtenida: 34.04 ppm.
Recuperación: 68.08%
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
42
III.1.3.2.b SEGUNDO ENSAYO
Se pesaron 3 g de biomezcla con 60 % de humedad en 2 frascos de 100 mL
Se fortificaron con 50 ppm de tebuconazol (0.15mg/3g)
a. Se extrajeron con 20mL de diclorometano, 5g de sulfato de sodio
anhidro y agitando por una hora.
b. Se extrajeron con 20mL de metanol, 5g de sulfato de sodio anhidro y
agitando por una hora
Se filtraron con vacío usando filtros de porosidad fina.
Se transfirieron 2 mL a beakers de 10 mL y se evaporaron a temperatura menor de 40o C
bajo corriente de nitrógeno.
Se reconstituyeron con 2 mL de la fase móvil correspondiente, se filtraron a través de
membranas de nylon de 0.45um y se inyectaron en el cromatógrafo líquido (HPLC), bajo
las condiciones establecidas.
RESULTADOS
Extracción con diclorometano:
Fortificación: 50 ppm
Concentración obtenida: 34 ppm.
Recuperación: 68 %
Extracción con metanol:
Fortificación: 50 ppm
Concentración obtenida: 32 ppm.
Recuperación: 64 %
Inyección del extracto en metanol sin evaporar:
Fortificación: 50 ppm
Concentración obtenida: 50.66 ppm
Recuperación: 101.3 %
III.1.3.3. Ensayo de recuperación para CAPTÁN
Condiciones de trabajo:
Detector UV Longitud de onda: 210nm
Columnas conectadas en línea: Supercosil RP18, 150x4.6 mm, 5 m y Lichrospher RP18,
125x4 mm, 5um.
Fase móvil: Acetonitrilo/agua con 0.04 % de ácido fosfórico (60:40)
Flujo: 0.5 mL/min
Atenuación: 6
Tiempo de retención aproximado: 9.4
Volumen de inyección: 20 ul
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
43
CURVAS DE CALIBRACION
Preparación de los estándares a partir de la solucion madre (1mg/mL) de captan en
diclorometano en concentraciones: 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 y 20 ug/mL en metanol.
Resultados del análisis de los datos obtenidos.
Tabla No. 8. Curva de calibración de captan
Concentración
ug/mL Altura
a= 0.968974051
b= 31.75315715
r= 0.99977
0.2 6.13
0.5 15.43
1 29.94
2 60.95
5 170.42
10 319.22
20 633.54
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Gráfica No. 4 Curva de calibración para Captan
Curva de calibración Captán
y = 31.753x + 0.969
R2 = 0.9995
0
100
200
300
400
500
600
700
0 5 10 15 20
Concentración (ug/ml)
Alt
ura
del
pic
o
Datos
Lineal (Datos)
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
44
III.1.3.3..a PRIMER ENSAYO:
1- Peso de biomezcla en duplicado: 3g con 60% de humedad
Fortificadas con 50 ppm (0.15mg/3g), en frascos de vidrio de 125 mL, con tapadera
hermética, sin llevar las muestras a sequedad.
a- Extracción con 20 mL de diclorometano, 5 g de sulfato de sodio anhidro y agitación por
1 hora.
b- Extracción con 20 mL de metanol, 5 g de sulfato de sodio anhidro y agitación por 1 hora.
Filtración con vacío.
2 mL de cada uno, llevados a sequedad con nitrógeno a 40o C y reconstituidos con 2 mL de
la fase móvil. Se inyectaron las muestras de acuerdo a las condiciones establecidas.
En ninguno de los extractos se detectó la presencia del captán.
Inyección directa de los extractos sin llevarlos a sequedad:
Metanol: captán no detectado
Diclorometano: interfiere con el tiempo de retención del captán.
III.1.3.4. Ensayo de recuperación para BENOMYL
Condiciones de trabajo:
Cromatógrafo HPLC, HP 1050
Detector: UV
Longitud de onda: 217 nm
Columnas conectadas en línea: Supercosil RP18, 150x4.6mm, 5 um y Lichrospher RP18,
125x4mm, 5um.
Fase móvil: Acetonitrilo/agua (70:30).
Flujo: 0.3 mL/min
Atenuación: 7
Tiempo de retención aproximado: 10.7
Volumen de inyección: 20 ul
CURVA DE CALIBRACIÓN:
Preparación de los estándares a partir de las solución madre (1mg/mL), de benomyl en
cloroformo; y a las siguientes concentraciones: 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 y 20 ug/mL en
metanol.
Resultados del análisis de los datos obtenidos.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
45
Tabla No. 9. Curva de calibración para benomyl
Concentración
ug/mL Altura a= 4.609452736
b= 10.74875622
r= 0.99972
1 13.3
2 25.6
5 59.9
10 114.6
20 218.1
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Gráfica No. 5 Curva de calibración para benomyl
Curva de calibracón Benomyl
y = 10.749x + 4.6095
R2 = 0.9994
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20
Concentración (ug/ml)
Alt
ura
de p
ico
Datos
Lineal (Datos)
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
III.1.3.4.a PRIMER ENSAYO:
1- Peso de la biomezcla con 60 % de humedad, en duplicado: 3 g
Fortificadas con 50 ppm (.15mg/3g), en frascos de vidrio de 125 mL con tapadera
hermética.
a- Extracción con 25 mL de diclorometano y agitación por 1 hora.
b- Extracción con 25 mL de metanol y agitación por 1 hora.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
46
Adición de sulfato de sodio anhidro, 2 mL del extracto en diclorometano, evaporados a
temperatura ambiente y nitrógeno, reconstituidos con la fase móvil acetonitrilo/agua
(70:30). Inyectado en el cromatógrafo líquido de acuerdo a las condiciones establecidas.
Inyección directa del extracto en metanol.
RESULTADO:
a- Extracción con diclorometano:
Fortificación: 50 ppm
Concentración obtenida: 4.83 ppm
Recuperación: 9.7 %
b- Extracción con metanol:
Fortificación: 50 ppm
Concentración obtenida: 31.67 ppm
Recuperación. 63.33 %
III.1.4. ANÁLISIS DE LA BIOMEZCLA
Para el análisis de la muestra se realizó un acucioso trabajo de laboratorio implicando el
cuidadoso proceso de extracción, de la biomezcla y preparación de las muestras para
inyectar. Se tuvo el cuidado te tener repeticiones de cada lectura obtenida.
A continuación en la tabla 10 se puede observar un ejemplo de la secuencia de toma de
datos en cada experimento.
Muestras 2-06-07 ( se agrega 40ul (40ug) de clotoralonil a muestras 1 a 4 y 40ul (40ug)
de isoproturon a todas) y 15 ml de solvente
inyeccion muestra identificacion peso
tiempo
ret area
tiempo
ret area
470 1-1 control MeOH 5.3217 1.665 47.64310 2.137 107.32387
471 1-2 1.670 53.88868 2.142 112.62553
472 1-3 1.670 52.77863 2.145 112.67017
473 2-1 control MeOH 5.0668 1.670 56.15741 2.145 120.25230
474 2-2 1.670 61.65915 2.145 125.64621
475 2-3 1.670 63.03048 2.142 136.22520
476 3-1 control FM 5.0648 1.665 103.82418 2.140 372.59366
477 3-2 1.665 103.83111 2.142 363.39212
478 3-3 1.665 88.93159 2.143 331.94196
479 4-1 control FM 5.3048 1.666 121.12303 2.142 410.60864
480 4-2 1.663 98.67403 2.136 359.56436
481 4-3 1.663 99.90018 2.139 358.65704
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
47
482 5-1*
clorotalonil
MeOH 5.1131 1.670 51.03104 2.140 2.35484
483 5-2* 1.665 46.33340 2.150 7.27434
484 5-3* 1.674 48.87279 2.150 2.12823
485 6-1*
clorotalonil
MeOH 5.1632 1.670 47.17229 2.160 8.64984
486 6-2* 1.670 51.02285 2.165 8.88115
487 6-3* 1.670 54.96916 2.169 10.75564
488 7-1 clorotalonil FM 5.222 1.665 73.97864 2.140 4.46492
489 7-2 1.665 94.30045 2.145 5.75883
490 7-3 1.665 78.05051 2.140 5.32309
491 8-1 clorotalonil FM 5.2948 1.665 98.77853 2.131 19.66606
492 8-2 1.670 92.23166 2.135 11.59338
493 8-3 1.670 93.85056 2.140 23.47212
inyección muestra rel de areas
Peso de
muestra/ml
solvente
agregado
Conc. en
mg/ml
(mg/ml
clorotalonil
* ml
solv)/peso
muestra
promedio
de PPM SD
470 1-1 2.25266345 0.35478 0.001888 0.005320 0.00510 0.000194
471 1-2 2.08996639 0.001754 0.004945
472 1-3 2.13476875 0.001791 0.005049
473 2-1 2.141343413 0.337786667 0.001796 0.005318 0.00525 0.000160767
474 2-2 2.037754494 0.001712 0.005067
475 2-3 2.161259124 0.001813 0.005367
476 3-1 3.588698317 0.337653333 0.002982 0.008830 0.00888 0.00028484
477 3-2 3.499838536 0.002909 0.008615
478 3-3 3.732553978 0.003099 0.009180
479 4-1 3.390012948 0.353653333 0.002819 0.007971 0.00832 0.000309888
480 4-2 3.643961435 0.003027 0.008560
481 4-3 3.590154092 0.002983 0.008435
482 5-1* 0.046145248 0.340873333 8.052E-05 0.0002362 0.00032 0.000155604
483 5-2* 0.156999918 0.0001713 0.0005026
484 5-3* 0.043546317 7.839E-05 0.0002299
485 6-1* 0.183366965 0.344213333 0.0001929 0.0005605 0.00056 2.57838E-05
486 6-2* 0.174062209 0.0001853 0.0005383
487 6-3* 0.195666807 0.0002030 0.0005897
488 7-1 0.060354178 0.348133333 9.216E-05 0.0002647 0.00027 1.02063E-05
489 7-2 0.061068956 9.275E-05 0.0002664
490 7-3 0.068200579 9.859E-05 0.0002831
491 8-1 0.199092455 0.352986667 0.0002058 0.0005830 0.00057 0.000145092
492 8-2 0.125698486 0.0001457 0.0004127
493 8-3 0.250101012 0.0002476 0.0007013
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
48
Promedio total por
solvente SD
Control en Metanol
0.00518 0.000103272
Control en Fase Movil
0.00860 0.000391441
Muestras en Metanol
0.00044 0.000169616
Muestras en Fase
Movil
0.00042 0.000208049
estandar
Concentración
mg/ml rel area
regresión
lineal
1 0.001 1.14577062
Intercepto -0.0521785
2 0.002 2.4245197
pendiente 1221.034823
3 0.004 4.82041794
Correlación 0.999865979
Inicialmente se realizó el estudio considerando la curva de calibración sin utilizar un
estándar interno. Los resultados de este estudio ser resumen en el gráfico que se muestra a
continuación:
III.1.4.1 RESULTADOS OBTENIDOS SIN UTLIZAR ESTÁNDAR INTERNO
Tabla No. 10. Resultados obtenidos para cuantificacion de Tebuconazol
Control en Metanol
Control en Fase Movil
Muestra en Metanol
Muestra en Fase Movil
09-May
Prom 27.8946 15.4141 0.9083 1.7867
SD 25.4833 16.8989 3.0341 0.9299
19-May
Prom 188.22086 197.205 178.42008 35.52052
SD 8.03010693 2.67351858 67.9401636 4.68627988
04-Jun
Prom 91.21828 78.30639 88.12615 44.35185
SD 2.87729882 27.1273598 24.5749853 0.55491338
18-Jun
Prom 154.4765 76.65469 68.07502 80.39664
SD 41.7700845 2.19802935 10.9340876 29.6956733
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
49
Grafica No. 6. Resultados de cuantificación de tebuconazol sin estándar interno
Tebuconazol sin estándar interno
0
5
10
15
20
25
30
09/05/2007 19/05/2007 04/06/2007 18/06/2007
fecha de muestreo
co
nce
ntr
ac
ión
pp
m
en diclorometano en metanol
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
En estos resultados se observa una anomalía ya que para las pruebas en las que se utilizó
diclorometano, el primer resultado aparece con menor concentración que el obtenido en la
segunda fecha de muestreo, y en el caso de los resultados con metanol, para el penúltimo
punto se obtuvo una concentración menor que para el último. Por esto, se consideró
trabajar utilizando estándar interno en las determinaciones. Los resultados se muestran a
continuación:
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
50
III.1.4.2. RESULTADOS OBTENIDOS UTILIZANDO ESTANDAR INTERNO DE
ISOPROTURON
Grafica No. 7. Resultados obtenidos para isoproturon utilizando estándar interno
Tebuconazol con estándar interno
0
5
10
15
20
25
30
09/05/2007 19/05/2007 04/06/2007 18/06/2007
fecha de muestreo
co
nc
en
tra
ció
n d
e
pp
m
en diclorometano en metanol
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Figura 9. Porcentaje de degradación de Tebuconazole extracto metanólico
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
51
Grafica No. 8. Resultados obtenidos para clorotalonil utilizando estándar interno
Degradación de clorotalonil
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
19/05/2007 22/05/2007 25/05/2007 28/05/2007 31/05/2007 02/06/2007
co
ncen
tració
n p
pm
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Gráfica 8 porcentaje de clorotalonil degradado
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
52
Tabla No. 11. Resultados obtenidos para clorotalonil
Control en Metanol
Control en Fase Móvil
Muestra en Metanol
Muestra en Fase Móvil
19-May
Prom 82.41 63.52 5.85 2.31
SD 0.32 7.59 1.78 0.56
Concentración (ppm) 7.10 3.64
22-May
Prom 95.91 76.68 3.14 1.80
SD 7.41 4.64 0.75 0.49
Concentración (ppm) 3.27 2.35
25-May
Prom 84.05 58.29 0.45 0.37
SD 9.69 0.44 0.11 0.18
Concentración (ppm) 0.53 0.63
28-May
Prom 153.65 116.24 0.08 0.07
SD 12.60 19.99 0.04 0.01
Concentración (ppm) 0.06 0.06
31-May
Prom 127.38 97.21 0.14 0.15
SD 4.10 5.49 0.01 0.05
Concentración (ppm) 0.11 0.16
02-Jun
Prom 67.21 111.37 0.44 0.42
SD 0.99 1.43 0.17 0.21
Concentración (ppm) 0.66 0.38
Fuente: Fodecyt No. 022-2006
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
53
III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
III.2.1 Sistema de cama biológica experimental
El diseño inicial para los sistemas experimentales de las camas biológicas consistía en
columnas rellenas de la mezcla considerando que de esa manera se podría colectar el
lixiviado para determinar la cantidad de plaguicida retenido. Sin embargo ese sistema tiene
algunos inconvenientes; especialmente el hecho de la posibilidad de que los plaguicidas
queden adsorbidos en la matriz de suelo y broza por lo que el dato obtenido en el lixiviado
podría conducir a resultados erróneos. Por esta razón, se determinó que para establecer el
nivel de degradación en el suelo la mejor manera es tomando muestras del suelo para
extraer el plaguicida presente y determinarlo. De esa manera también es posible establecer
el porcentaje de degradación en el suelo en función del tiempo.
El diseño de las camas biológicas escala laboratorio permitió fácilmente tomar muestras
para evaluar la degradación de los plaguicidas, de manera reproducible. También fue
posible mantener un buen control de la temperatura y humedad.
El sistema para cuantificar el dióxido de carbono generado, es una buena herramienta para
tener una idea de la actividad biológica que se está desarrollando, puesto que podría
suceder el caso de que el plaguicida aplicado inhibiera la misma. Es interesante observar
que con la presencia de plaguicida, la actividad biológica se incrementó. Para poder tener
un mejor estudio del proceso de degradación, será necesario utilizar otras técnicas de
manera que sea posible introducir marcadores de carbono por ejemplo, para poder
establecer el origen del dióxido de carbono generado.
La parte que resultó más complicada fue el desarrollo del método analítico para la
determinación del contenido de plaguicidas, se realizaron numerosas pruebas tanto de
extracción y de recuperación del suelo con el objeto de tener resultados confiables.
A los pocos días de la aspersión de Clorotalonil en la cama biológica, se encontró una
degradación casi total de este fungicida. Esta prueba se repitió con muestras de una nueva
aspersión con este compuesto, analizando muestras cada tres días e implementando además
el uso de estándar interno (Isoproturón) desde la etapa de extracción.
En el caso de Tebuconazol los análisis utilizando Clorotalonil como estándar interno se
implementaron hasta el tercer muestreo. Utilizando estándar interno, la curva es mejor
definida, sin embargo en ambos casos es posible observar que al cabo de un mes la
concentración del Tebuconazole ha disminuido drásticamente. Sin embargo no se logró
llegar hasta la degradación total. Siempre quedó un remanente de aproximadamente 20%
de lo que originalmente se asperjó en la cama biológica.
Se realizaron diversas pruebas con otros fungicidas, como el Propiconazole, Triadimefon y
Benomyl pero no se consiguió llegar a afinar la metodología de la extracción a partir de
muestras provenientes de las camas biológicas.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
54
PARTE IV
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
55
VI.1. Conclusiones
V.1.1 Se estableció el procedimiento para evaluar el funcionamiento de camas biológicas
escala laboratorio, incluyendo la recuperación de plaguicidas para comprobar su
degradación, la capacidad de retención de agua y la actividad biológica como
dióxido de carbono producido.
V.1.2 En este trabajo se construyeron camas biológicas experimentales a escala de
laboratorio que pueden ser utilizadas para el estudio de la degradación de
plaguicidas por los microorganismos presentes en la tierra con contenido en materia
vegetal.
V.1.3 Se estableció el proceso analítico con porcentaje de recuperación y obtención de
curva de calibración para el Clorotalonil, Tebuconazol, Captan y Benomyl
V.1.4 Se evaluó la capacidad de la biomezcla obtenida localmente para la degradación de
plaguicidas, pero no se realizaron experimentos en camas biológicas a escala
completa.
V.1.5 Solamente se tuvo resultados concretos para dos de los plaguicidas. Para el
Clorotalonil, el 100% de degradación en 6 días y para el Tebuconazol el 70% en 40
días.
V.1.6 Este objetivo no se cumplió al no haber sido posible la construcción de camas
biológicas a escala completa y evaluación.
Confirmación de la hipótesis
“Los microorganismos presentes en una cama biológica son capaces de degradar el nivel
normal de utilizado de fungicidas”
Los resultados obtenidos muestran que los microorganismos presentes naturalmente en la
mezcla utilizada en las camas biológicas preparadas, fueron capaces de degradar los
fungicidas cuando se encuentran en concentraciones iguales a las utilizadas normalmente
en las aplicaciones en el campo, por lo que la hipótesis se acepta
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
56
VI.2 Recomendaciones
VI.2.1 Aislar hongos están activos en la mezcla. En la literatura se muestra que son
hongos chrysosporium, sin embargo con la diversidad natural de Guatemala es
posible analizar los diferentes hongos presentes.
VI.2.1 Estudiar la capacidad máxima de degradación en las camas biológicas, esto es el
límite de concentración.
VI.2.3 Evaluar el mecanismo de degradación con plaguicidas marcados con carbono-14 lo
que permite un seguimiento de la degradación.
VI.2.4 Construir camas biológicas a escala completa para el estudio de la degradación de
plaguicidas.
VI.2.5 Revisar la metodología analítica en mezcla de plaguicidas.
VI.2.5 Es necesario evaluar los aspectos como diferentes capas de la biomezcla y otros
materiales, el pasto que crece sobre la cama biológica.
VI.2.6 Continuar con la evaluación de la degradación de los distintos plaguicidas utilizados
en Guatemala.
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
57
IV. 3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
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28. Trajkovska, V., S. Petrovska-Jovanovié. Optimization of HPLC conditions for
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31. Weismahr, K. Houghton, C. Sedklak, D. Analysis of the Dithiocarbamate
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http://www.alanwood.net/pesticides/index.html
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
60
IV. ANEXOS
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
61
Anexo 1
Otros resultados
Como parte del proyecto se tuvo la visita de la Dra María del Pilar Castillo quien tuvo
diferentes reuniones tanto con el equipo de trabajo, como con personal de Agrequima.
Adicionalmente dictó una conferencia abierta al público interesado, relacionado con el tema
de la investigación.
Calendario de actividades cumplido por la Dra. María del Pilar Castillo
Lunes 18 de septiembre
9:30 visita al campus de la Universidad del Valle de Guatemala
10:30 a 14:00 Reunión preliminar con el equipo de trabajo de la UVG
Licda. Fabiola de Micheo
Br. Rossina Espósito
Dr. Adrián Gil
16:00 a 18:00 revisión de documentos relacionados al proyecto
Martes 19 de septiembre
9:30 a 12:00 reunión de trabajo con Br. Rossina Espósito para revisar los detalles
experimentales del proyecto
1 2:30 a 16:00 Reunión con el equipo UVG y Agrequima
Licda. Fabiola de Micheo
Br. Rossina Espósito
Lic Julio Ruano - Agrequima
Br. Rossina Espósito
Miércoles 20 de septiembre
7:00 a 18:00 horas. Visita de campo a los lugares posibles de instalación de camas
biológicas en Laguna de Retana
Jueves 21 de septiembre
10:00 horas Reunión de trabajo con equipo UVG
Br. Rossina Espósito
Br. Rossina Espósito
11:30 horas Visita a los laboratorios de Microbiología de la UVG
13:00 horas almuerzo
14:00 a 17:00 horas reunión de trabajo para revisión detalles experimentales
17:30 a 19:00 horas conferencia “Camas biológicas” uso de la biotecnología en
protección de suelos
Viernes 22 de septiembre
10:00 a Reunión de trabajo y elaboración de documento detallando adecuaciones
experimentales y elaboración de conclusiones.
13:00 horas reunión con el Dr. Rolando Cifuentes, Director de Centreo de Estudios
Agrícolas y Forestales
15:00 a 17:00 horas Reunión con personal de Agrequima
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62
Anexo 2
i. Siglas
1. DER Desviación Estándar Relativa
2. HP Hewlett Packard
3. rpm Revoluciones por minuto
4. UVG Universidad del Valle de Guatemala
ii. Abreviaturas de unidades
1. MB Megabyte 1 x 106 byte
2. GB Gigabyte 1 x 109 byte
3. g gramo
4. mg miligramo 1 x 10-3
gramos
5. µg microgramo 1 x 10-6
gramos
6. ng nanogramo 1 x 10-6
gramos
7. ρg picogramo 1 x 10-12
gramos
8. MHz MegaHertz 1 x 106 Hertz
9. l litro
10. mL mililitro 1 x 10-3
litros
11. cm centimetro 1 x 10-2
metro
12. mm milimetro 1 x 10-3
metro
13. µm micrometro 1 x 10-6
metro
14. nm nanometro 1 x 10-9
metro
15. N Newton
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
63
Anxo 3, muestra de los cromatogramas obtenidos
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
64
PARTE V
Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas
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V.1 Informe Financiero
AD-R-0013
Nombre del Proyecto:
Numero del Proyecto: 22-2006
Investigador Principal: Dr. Adrián Francisco Gil Méndez
Monto Autorizado: Q150,122.50
Fecha de Inicio y Finalización: 01/06/2006 al 31/05/2007
Menos (-) Mas (+)
1 Servicios no personales
181
Estudios, investigaciones y proyectos de
factibilidad 56,500.00Q 42,374.97Q 14,125.03Q
122 Impresión, encuadernación y reproducción 2,000.00Q 2,000.00Q
133 Viáticos en el interior 1,000.00Q 1,000.00Q
141 Transporte de personas 13,000.00Q 11,618.40Q 1,381.60Q
163
Mantenimiento y reparación de equipo médico,
sanitario y de laboratorio 3,000.00Q 2,699.76Q 300.24Q
196 Servicios de atención y protocolo 7,000.00Q 1,309.20Q 4,141.35Q 1,549.45Q
2 MATERIALES Y SUMINISTROS
223 Piedra, arcilla y arena 100.00Q 100.00Q
224 Pómez, cal y yeso 100.00Q 100.00Q
241 Papel de escritorio 149.50Q 149.50Q -Q
261 Elementos y compuestos químicos 16,600.00Q 3,172.15Q 19,772.15Q -Q
264 Insecticidas, fumigantes y similares 1,000.00Q 1,000.00Q
267 Tintes, pinturas y colorantes 1,114.70Q 1,114.70Q -Q
268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc 7,000.00Q 1,854.67Q 6,795.16Q 2,059.51Q
269 Otros productos químicos y conexos 10,000.00Q 5,026.82Q 4,973.18Q
272 Productos de Vidrio 3,000.00Q 2,433.54Q 566.46Q
274 Cemento 200.00Q 200.00Q
291 Útiles de oficina 45.00Q 45.00Q -Q
295
Útiles menores, médico-quirúrgicos y de
laboratorio 10,000.00Q 7,147.23Q 2,852.77Q
3
PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E
INTANGIBLES
329 Otras maquinarias y equipos 2,000.00Q 2,000.00Q
914 Gastos no previstos 3,975.00Q 3,975.00Q
GASTOS DE ADMÓN. (10%) 13,647.50Q 13,647.50Q
150,122.50Q 6,336.02Q 6,336.02Q 111,939.26Q 38,183.24Q
MONTO AUTORIZADO 150,122.50Q Disponibilidad 38,183.24Q
(-) EJECUTADO 111,939.26Q
SUBTOTAL 38,183.24Q
(-) CAJA CHICA -Q
TOTAL POR EJECUTAR 38,183.24Q
Ejecutado Renglon Pendiente de
Ejecutar
PRÓRROGA AL 30/09/2007
NOVENA CONVOCATORIA
LINEA FODECYT
En Ejecuciòn
Grupo
TRANSFERENCIA
Nombre del Gasto
Evaluación de la Degradación de Fungicidas en Camas Biológicas
Asignacion
Presupuestaria
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