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Curso 4: Toxicogenômica e Genotoxicidade

GENOTOXICIDADE: Aplicação do Teste de Ames, Micronúcleos, Aberrações Cromossômicas e Cometa

em avaliações ocupacionais e ambientais

Dr. Juliana da Silva (ULBRA)

Dr. Miriana Machado (GENOTOX – Centro de Biotecnologia, UFRGS)

Porto Alegre, 27 de abril de 2014

2

Capacidade que algumas substâncias têm em

causar distúrbios da estrutura do genoma

(DNA) ou de sua função (expressão).

GENOTOXICIDADE

3

DNA

adaptado de Baylin & Schuebel, 2007

octâmero de histonas

H2A, H2B, H3, H4

células humanas

citosina, guanina, adenina, timina

4

AGENTES QUÍMICOS/

FÍSICOS

REPARAÇÃO

fiel

incorreta

MORTE CELULAR

± Metabolismo endógeno

MUTAÇÕES

5

Ghosal & Chen 2013

6

Importância do estudo das Mutações:

Mutações: se não ocorre morte celular, as células podem

proliferar e passar o gene mutado para as células filhas...

Mutações em células somáticas ou germinativas:

50 % abortos

30 % problemas de aprendizado

20 % defeitos congênitos

2 % infertilidade masculina

Câncer…

7

MUTAÇÃO

Mutação gênica

Alteração em um gene, tornando-se um alelo diferente. Podem

envolver substituição, adição ou perda de uma única base

Mutação cromossômica

mutações estruturais

Modificações maiores, alteração nos cromossomos. Mutações

estruturais ou numéricas

Leucemia mielóide crônica

Fibrose cística

8

CÂNCER

GENOTOXICIDADE / MUTAÇÃO

9Adaptado de H. Ellinger-Ziegelbauer et al., 2009

EXPRESSÃO GÊNICA

ALTERADA

Reparação de DNA

Checkpoint

Ciclo celular Oncogenes

MUTAÇÃO

CÂNCER

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Antimetabólitos:5-FluorouracilAnálogos de folato

Alquilantes monofuncionais:TemozolomidaNitrosuréiasTrabectedina

Alquilantes bifuncionais:Mostarda nitrogenadaMitomicina CCisplatina

Inibidores da TopoisomeraseCampotencinaEtoposídeoDoxorrubicina

Inibidores da ReplicaçãoHidróxiuréiaAfidicolina

Radiomiméticos e agentes oxidativos:BleomicinaDoxorrubicina

Por outro lado…

GENOTOXICIDADE

Hurley, 2002, Chabner & Roberts Jr., 2005Reichert & Wenger, 2008, Helleday et al., 2008

CÂNCER

11

ENSAIOS DE

GENOTOXICIDADE

12

- Predição do potencial carcinogênico de produtos para usohumano e/ou veterinário

BATERIA DE ENSAIOS DE GENOTOXICIDADE:Segurança Toxicológica - Registro de Produtos

13

- Avaliação dos efeitos da exposição ocupacional e ambiental

BATERIA DE ENSAIOS DE GENOTOXICIDADE:Risco Ocupacional / Ambiental

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In vitro In vivo Assays for Gene Mutations Salmonella typhimurium reverse mutation assay (Ames test, bactéria)

X

Escherichia coli reverse mutation assay (bacteria) X Gene mutation in mammalian cells in culture X Drosophila sex-linked recessive lethal assay (fruit fly) X Gene mutation in Saccharomyces cerevisiae (yeast) X Mouse Spot test X Assays for Chromosomal and Genomic Mutations In vitro cytogenetic assay (CHO/SHE/Human lymphocyte)

X

In vivo cytogenetic assay X Micronucleus test X Dominant lethal assay X Herutable translocation assay X Mammalian germ cell cytogenetic assay X Assays for DNA Effects DNA damage and repair: unscheduled DNA synthesis in vitro

X

Mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae (yeast)

X

In vitro sister chromatid exchange(SCE) assay X

PRINCIPAIS ENSAIOS DE GENOTOXICIDADE

15

Limitações de cada modelo...

(Jena et al., 2002)

16

Ensaios de Genotoxicidade utilizados no Desenvolvimentode Produtos, Análises Ambientais e Ocupacionais

Ensaio Tipo de dano Medicamentos Cosméticos Agroquímicos Ambiente Ocupacional

Ames Mutação Gênica X X X X

Mouse Lymphoma

Mutação Gênica X* X

Aberrações Cromossômicas in vitro

Mutação Cromossômica X* X X

Micronúcleos in vitro

Mutação Cromossômica X* X X X

Micronúcleosin vivo

Mutação Cromossômica X X X

Cometa in vitro Quebras no DNA X X

Cometa in vivo Quebras no DNA X* X X

17

Teste de Ames

- Mutagenicidade gênica – ensaio de mutação reversa

- Salmonella typhimurium: mutação no operon da histidina(his-)

2º mutação prototrófica para histidina (his+)

18

Teste de Ames

- Produtos químicos

- Medicamentos

- Cosméticos

- Águas

- Sedimentos

- Lodos

- Efluentes

- Amostras atmosféricas

19

Ativação Metabólica (S9 mix): utilizado em todos os experimentos in vitro

Aroclor 1254

Fração microssomal

S9S9-mix

20

Erro no quadro de leitura

Substituição de pares de bases

S. Typhimurium TA97a

S. Typhimurium TA98

S. Typhimurium TA100

S. Typhimurium TA102

S. Typhimurium TA1535

21

Resultado negativo: o nº de revertes/placa similar ao nº de revertentes espontâneos

Resultado positivo: Índice mutagênico (MI) 2

MI= nº rev./placa amostra

nº rev./ placa C-

22

Sorcerer – Contador Automático de Colônias

23

Ensaio Mouse Lymphoma

- Mutagenicidade gênica em células de mamífero em cultura

- Linhagem L5178Y tk+/-: heterozigota no locus TK1 (timidina cinase)

24

Ensaio Mouse Lymphoma

- A timidina cinase é uma enzima não essencial que recicla a timidina

que pode ser incorporada no DNA.

- Trifluorotimidina (TFT) é um análogo tóxico da timidina que quanto

incorporado no DNA no lugar da timidina, interfere no metabolismo do

DNA, sendo tóxico para a célula.

- Se a cópia funcional do gene TK é perdida por decorrência de

mutações, o TFT não é incorporado e as células conseguem sobreviver

25

3 h treatmentwith or without S9-mix

L5178Y cells, 37 °C, 5% CO2

24 h, 37 °C

Ensaio Mouse Lymphoma

-TFT +TFT

Agar + medium

wash-out

2 days, 37 °C

26

- Avaliação de quebras cromossômicas (mutações cromossômicas).

Ensaio de Aberrações Cromossômicas in vitro

27

Ensaio de Aberrações Cromossômicas in vitro

Manual or automatedanalysis

KCl (75 mM) 20’, RT

3 or 4 h treatmentwith or without S9-mix

Colchicine, 1,5 h

V79 cells or lymphocytes, 1.5 x 105 cells/well

37 °C, 5% CO2

24 or 48 h, 37 °C

Fixation(2x, 5’)

Staining(2 % Giemsa, 5-8’) 24 h

Slide preparation

24 h

4 °C

24 h

4 °C

1,5-2 x cell cycle

37 °C

28

-Avaliação de divisão celular (viabilidade):

Índice Mitótico – quantificação de metáfases em 2000 células

Ensaio de Aberrações Cromossômicas in vitro

Céluas de sangue periférico humano

29

Avaliação de mutagenicidade:

Ensaio de Aberrações Cromossômicas in vitro

- Contagem de cromossomos (46 ± 2 humanos)

- Quantificação de metáfases contendo cromossomos

aberrantes

(200 metáfases/grupo /doador)

30

Metáfase normal de sangue periférico humano

Metáfase aberrante de sangue periférico humano

31

Chinese hamster lung fibroblast (V79 cells)

Ensaio de Micronúcleos in vitro

- Avaliação de quebras cromossômicas (clastogênese) e aneugênese.

32Fenech, 2007

Ensaio de Micronúcleos in vitro

33

Ensaio de Micronúcleos in vitro

Manual or automatedanalysis

KCl (75 mM) 3’, 4 °C

3 h treatmentwith or without S9-mix

Cytochalasin B (3 µg/mL), 21 h

V79 cells, 1.5 x 105 cells/well

37 °C, 5% CO2

24 h, 37 °C

21 h treatmentwithout S9-mix and with Cytochalasin B, 37 °C

Fixation(2x, 5’)

Staining(2 % Giemsa, 5-8’) 24 h

Slide preparation

24 h

4 °C

24 h

4 °C

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Análise Manual:

• Viabilidade celular: contagem de células mononucleadas, binucleadas

(BN) e multinucleadas em 1000 células por cultura – Índice de

Replicação.

Índice de Replicação (IR %) = [(nº cél. BN) + (nº cél. multinucleadas x2)]/nº total de cél. analisadas (grupo tratamento) x 100[(nº cél. BN) + (nº cél. multinucleadas x2)]/nº total de cél. analisadas (controle negativo)

• Mutagenicidade: avaliação da presença de células

BN com micronúcleos (BNm) em no mínimo 1000

células BN por cultura.

Ensaio de Micronúcleos in vitro

35

Análise Automatizada

Pathfinder ScreenTox Cytometry System (IMSTAR, França).

Ensaio de Micronúcleos in vitro

36

Análise Automatizada

• Captura de imagens em uma área pré-selecionada de cada lâmina;

• Identificação automatizada de células

mononucleadas, binucleadas e multinucleadas;

• Identificação automatizada de

micronúcleos em todas as

células;

• Validação das células BNm por

um técnico treinado;

Ensaio de Micronúcleos in vitro

37

Análise Automatizada

• Viabilidade celular: contagem de células mononucleadas, binucleadas

(BN) e multinucleadas em no mínimo 1000 células por cultura – Índice

de Replicação.

• Mutagenicidade: avaliação da presença de células BN com

micronúcleos (BNm) em no mínimo 1000 células BN por cultura.

Ensaio de Micronúcleos in vitro

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- Avaliação de quebras simples, duplas e sítios álcali-lábeis.

- Danos recentes.

- Sensibilidade.

- Vários tipos celulares in vitro

- Vários tecidos in vivo

(sangue, fígado, pulmão etc).

Linfócito de sangue periférico

Sutherland e Costa, 2001

Células V79 (fibroblastos de pulmão de hasmter chinês)

Ensaio Cometa Alcalino in vitro

Hemócitos de Mexilhão Dourado (Villela et al., 2006)

(Azqueta & Collins, 2013)

39

Neutralização

Eletroforese

(300 mA, 25V, 20 min)

Coloração (SYBR Gold)

Lise pH 10

Células+

Agarose LMP

Cultivo e tratamento das células

(3 h)

Preparo das

lâminas

PathFinderScreen Tox

Ensaio Cometa Alcalino in vitro

40

Análise no PathFinder (SYBR Green)

Classificação pelo conteúdo de DNA na cauda (% Tail DNA) e tipo de cauda (Olive Tail Moment)

41

Métodos Alternativos ao Uso de Animais de Experimentação – 3 R

(Replacement Reduction and Refinement)

Teste de Ames

Teste Mouse Lymphoma

Micronúcleos in vitro

Aberrações cromossômicas in vitro

Cometa

- Únicos considerados para registro de cosméticos

- Avaliação de vários endpoints no mesmo ensaio

(Toxicidade)

42(Goodsaid et al., 2010)

Futuro…

BATERIA DE ENSAIOS DE

GENOTOXICIDADE

TOXICOGENÔMICA

&

43

Normas de Referência:

OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS - Bacterial Reverse Mutation Test – 471/97

OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS - In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test – 473/97

OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS – Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test – 474/97

OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS - In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test – 476/97

OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS - In Vitro Micronucleus Test – 487/10

ICH Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1)

(2011)

DRAFT OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS – Rodent Alkaline single cell gel electrophoresis (Comet)

assay.

RESOLUÇÃO CONSEMA 129/2006

44

Obrigada!

mirianagenotox@gmail.com