De la génomique aux outils de diagnostic rapides : Applications industrielles Etat des travaux du...

De la génomique aux outils de diagnostic rapides :

Applications industrielles

Etat des travaux du projet BOARDBacilles thermorésistants: des Outils

d’Analyses au Recensement des Dangers

Gen2Bio, le 27 mars 2008 daniele.sohier@adria.tm.fr

ADRIA, centre de transfert

technologique

Modélisation– Formulation, durée de vie, process– Microbiologie prévisionnelle

Qualité & sécurité de l’aliment au long de sa durée de vie

Hygiène de production, maîtrise des flores d’intérêt

Outils de diagnostic– Détection, identification, traçabilité– Microbiologie, moléculaire

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ADRIA, centre de transfert

technologqiue

Modélisation– Formulation, durée de vie, process– Microbiologie prévisionnelle

Réponse à des attentes : développement de produit,

i.e. expertises, outils, transfert

Outils de diagnostic– Détection, identification, traçabilité– Microbiologie, moléculaire

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(Re) émergence de bactéries

…Bactéries sporulées

…Un bref état des lieux!Travaux en coursPerspectives & discussion

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Productions primaires

C. perfringens dans les élevages

1 Craven SE et al. 2001, Avian dis 45:887-896 2 Tansuphasiri et al. 2005, Southeast Asia J Trop Med Public Health 36:954-961

3 Van Immerseel F et al. 2004, Avian pathol 33:537-549

- colonisation du tractus intestinal de volaille, porc

- contamination des environnements primaires

- augmentation de l’antibiorésistance des isolats2

- augmentation de l’incidence d’entérite nécrotique chez les volailles suite à l’arrêt des antibiotiques comme facteurs de croissance3

les phénomènes de colonisation du tractus intestinal et de synthèse de toxines restent encore mal connus

Contamination des viandes…plats cuisinés et Contamination des viandes…plats cuisinés et restauration collectiverestauration collective33!!

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Productions secondaires

Bacillus Hautement Thermorésistant dans le lait UHT (HRS)

- Brevibacillus, Geobacillus stearothermophilus, B. sporothermodurans 1,2

Lait UHT

Homologie des empreintes génétiques

Lait cruHétérogénéité des empreintes génétiques

1 Scheldeman P et al. 2006, J Appl Microbiol 101:542-555 2 Olivier Guillaume-Gentil et al. 2004, Appl. Env. Microbiol 68:4216-4224

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Productions secondaires

Bactéries HRS dans les produits appertisés

- Moorella …-…Brevibacillus, Geobacillus stearothermophilus, B. sporothermodurans, Paenibacillus

Bactéries HRS et acidophiles dans les pectines de fruit

- Alicyclobacillus

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Productions secondaires

Bacillus psychrotrophes dans les produits pasteurisés, conservés au froid

- groupe groupe B. cereusB. cereus émétique émétique : B. weihenstephanensis 1

+ 45 % entre 1999 et 2005 des

produits réfrigérés prêts à l’emploi

1Thorsen L et al. 2006, Appl Environ Microbiol 72:5118-51212 Hoffmaster AR et al, 2004, Proc Natl Acad Sci U S A. 101:8449-54.

- à noter : transfert du plasmide de B. anthracis vers B. cereus 2

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Altérations!

Adaptation ou sélection par le process ?Etude de prévalence et analyse des dangers

Bactéries sporulées, sélectionnées par les process ou adaptées aux process…

– ovoproduits– poudre de lait– produits pasteurisés conservés au froid– produits UHT– produits appertisés– …etc

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Prévalence et analyse des dangers

Quand la microbiologie fait défaut…

– dénombrements des spores après traitement thermique– dénombrement de B. cereus– dénombrement de C. perfringens Alicyclobacillus, Anoxybacillus, Bacillus,

Brevibacillus, Clostridium, Geobacillus, Morella, Paenibacillus…

Biodiversité de genres, d’espèces et de caractéristiques physiologiques, et donc de génomes!

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(Re) émergence de bactéries

…Bactéries sporulées

…Un bref état des lieux!BOARDPerspectives & Discussion

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Bacilles thermorésistants: des Outils d’Analyses au Recensement des Dangers

Filières impliquées

DRAFDIRECTION REGIONALEDE L’AGRICULTURE ET DE LA FORET

MINISTERE DE L’AGRICULTURE

ET DE LA PECHE

DRAFDIRECTION REGIONALEDE L’AGRICULTURE ET DE LA FORET

DRAFDIRECTION REGIONALEDE L’AGRICULTURE ET DE LA FORET

MINISTERE DE L’AGRICULTURE

ET DE LA PECHE

MINISTERE DE L’AGRICULTURE

ET DE LA PECHE

BOARD

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BBA (Bretagne Biotechnologies Alimentaires) animé par le Pôle Agronomique OuestADRO Ouest animé par le Pôle Agronomique Ouest

Sociétés des produits de la mer et produits appertisés

Partenaires

Partenaires industriels

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Partenaires industriels

PME

Centres R&D

Partenaires

Sylvie HallierPatrice ChablainStéphane Bonilla

Danièle SohierFlorence Postollec

Ivan Leguérinel

Florence Baron

Michel GauthierSophie Jan

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Développement d’un outil de diagnostic moléculaireDéveloppement d’un outil de diagnostic moléculaire

détection &détection &

identificationidentification

alimentaliment

BOARD : Objectifs

- la détermination de leur prévalence en IAA pour une meilleure analyse des risques et évaluation des meilleure analyse des risques et évaluation des

dangersdangers

permettant, à partir de matrice alimentaire ou ingrédient, - la détection & identification de

bactéries sporulées

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Programme R&D

Cahier des charges Sélection des genres, espèces cibles

Alicyclobacillus, Anoxybacillus, Bacillus, Geobacillus, Moorella, Paenibacillus B. cereus, B. mycoides, B. pumilus, B. subtilis, B. licheniformis, B. thuringiensis, B. sporothermodurans, B. weihenstephanensis, B. laterosporus

Seuil de détection > 10/g et résultats à J1

Enrichissement over-night

Outil multi-cibles, avec des contraintes de coûts

PCR multi-multicilbes plutôt qu’une biopuce….GeneDisc!

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Objectif Objectif

détecter une contamination

< 10 spores/g

Échantillon (10mL)

2-Kit d’extraction

1-GeneExtract

Extrait d’ADN(300µL)

Échantillon (10mL)

2-Kit d’extraction

1-GeneExtract

Échantillon (10mL)

2-Kit d’extraction

1-GeneExtract

Extrait d’ADN(300µL)

Protocole d’extraction

ExtraitMix réactionnel

GeneDisc Cycler

détection du gène cible

ExtraitMix réactionnel

GeneDisc Cycler

ExtraitMix réactionnel

GeneDisc Cycler

détection du gène cible

Protocole d’amplificationExtraction

PCR temps réel

25g aliment + diluant

Enrichissement 20h, 37°C

Extraction

Protocole

Programme R&D

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Programme R&D

GeneDisc multi-cibles : Analyse des génomes

– Exploiter et séquencer !

Recherche de séquences cibles dans les bases de données & séquençage complémentaire

Valider l’identification de la collection pour les tests de spécificité Valider les conditions d’enrichissement / Phylogénie Séquences cibles…

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Arbre phylogénétique

C. perfringens

Brevibacillus laterosporus

Paenibacillus

B. cereus

Alicyclobacillus acidoterrestris

Moorella thermoacetica

Anoxybacillus flavithermus

Geobacillus stearothermophilus

B. subtilis

B. pumilus B. licheniformis

B. circulans

B. weihenstephanensis

30°Caérobie

37°C+/- aérobie

37°CANaérobie

55°CANaérobie

55°Caérobie

Programme R&D

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25g matrice

+ 100ml RCM

Inoculation aux concentrations désirées

20h à 37°Cananaeaerobiose

20h à 55°Cananaerobiose

20h à 55°Caerobiose

20h à 30°Caerobiose

Extraction

Détection & identification par PCR en temps réel

Programme R&D

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Programme R&D

GeneDisc multi-cibles : Analyse des génomes

– Analyses et alignement des séquences Sélection de sondes oligonucléotidiques Optimisation des mélanges réactionnels

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Deux GeneDisc

Bacillus Paenibacillus, Anoxybacillus Geobacillus

GeneDisc1: Genres

Clostridium Moorella contrôles

Programme R&D

B. cereus B. mycoides B. pumilus B. subtilis contrôles

B. laterosporus Bacillus

GeneDisc2: Bacillus spp.

B. licheniformis B. thuringiensis B. sporothermodurans B. weihenstephanensis

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Programme R&D

Validation de la méthode

– Inclusivité et exclusivité

– Niveau de détection

– Exactitude Matrices artificiellement contaminées

Matrices naturellement contaminées : dénombrement des spores et identification par séquençage

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(Re) émergence de bactéries

…Bactéries sporulées

…Un bref état des lieux!Travaux en coursPerspectives & discussion

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Perspectives & discussion

Prévalence des flores sporulées et analyse des dangers Evolution des GeneDisc en fonction de l’état des connaissances : description des espèces et acquisition de séquences BOARD : exemple concret de la génomique aux applications industrielles !…ANR MEMOSPORE

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Horror vacui…

Bactéries sporulées : vers une adaptation aux process de production et de conservation ?– « La nature a horreur du vide.

Mais d’autant qu’il ne saurait y avoir d’espace vide en aucun endroit de l’univers, et que les parties de la matière, étant rondes, ne sauraient se rejoindre si étroitement ensemble, qu’elles ne laissent plusieurs petits intervalles au recoin entre elles : il faut que ces recoins soient remplis de quelques autres parties de cette matière. »

Descartes, Principa philosophiae, 1644

Merci pour votre attention!

florence.postollec@adria.tm.frsbonilla@genesystems.fr