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Ministério da Ciência, Tecnologia, InovaçCa e Comunicações Instituto Nacional de Pesquisas da Amaz6nia
Coordena@o de Capacitação Divisão Apoio Técnico
PROGRAMA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DO INPA RELAT~RIO FINAL
GENOTIPAGEM POR MULTI LOCUS SEQUENCE TYPING (MLST) DE
ISOLADOS DE Cryptococcus gattii OBTIDOS DE FONTES AMBIENTAIS NA
ÁREA URBANA E PERI-URBANA DE MANAUS
BOLSISTA: Nicolle Tayná Brandão dos Santos
ORIENTADOR(A): João Vicente Braga de Souza
Relat6rio Final apresentado ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazhnia, como requisito para a conclusão como participante do Programa de Iniciação Científica do INPA.
Manaus - Arnazònas 2017
Apoio Financeiro:
4 3 ~ ~ ~ 9 --I-
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Minisiéno da Ciência, Tecnologia, Inovações e Comunicações Instituto Nacional de Pesquisas da AmaAnia
Coorde- de Capita@o Divisão Anoio Técnico
Titulo Trabalho do Bolsista: Genotipagem por Multi Locus Sequence Typing
(MLST) de isolados de Cryptococcus gattii obtidos de fontes ambientais na área
urbana e peri-urbana de Manaus.
Resumo
Cryptococcus gattii é um agente saprófita que participa da biodegradação dos substratos orgânicos presentes em ocos e troncos de árvores onde podem estabelecer colonização, transformando esses microambientes em fontes de infecção inalatória para indivíduos imunodeprimidos e hígidos nos quais é mais prevalente. Atualmente o método padrão-ouro para genotipagem de Cryptococcus é o Multi Locus Sequence Typing (MLST), por apresentar maior acurácia na determinação dos genótipos do que as técnicas anteriores baseadas apenas em PCR e por ser baseado no sequenciamento e identificação de polimorfismos presentes em sequências de múltiplos genes conservados, além de apresentar uma maior capacidade de discriminação entre cepas de um mesmo genótipo. Desta forma, o objetivo do trabalho foi realizar a genotipagem por MLST de isolados de Cryptococcus gattii obtidos de fontes ambientais na área urbana e peri-urbana de Manaus. Foram incluídos na análise molecular deste estudo, 6 isolados ambientais de Cryptococcus gatti obtidos de fontes ambientais da área urbana e peri- urbana de Manaus. Todos os isolados eram do tipo molecular VGII e conforme o sequenciamento dos múltiplos lócus, os mesmos apresentaram perfil alélico compatível em 100% de similaridade com o ST20, sendo ambos do subtipo molecular VGIIa. Conclui-se que as cepas de C. gattii VGII oriundas da água do Rio Negro pertencem a um subtipo molecular denominado de VGIIa identificado por MLST como ST20. Indivíduos que mantenham contato com a água do Rio Negro expõem-se ao risco de infecção por tal agente que apresenta potencial de causar surtos de Criptococose como relatado na América no Norte. E o ST20 compartilha semelhança genotípica com STs de origem exclusiva do continente americano, incluindo STs identificados apenas no Amazonas.
Palavras Chaves: 1. Cryptococcus gattii 2. Multi Locus Sequence Typing 3. Tipo molecular VGII
Subárea: Saúde
Financiamento
(PIBICICNPq)
Data: -- o$ 1 i b 12u~F
Bolsista
Apoio Financeiro:
O<..", rC
PROGRAMA DE INICIAÇAO CIENTÍFICA DO INPA RELAT~RIO FINAL
O Cryptococcus gattii é um agente saprófita que participa da biodegradação
dos substratos orgânicos presentes em ocos e troncos de árvores onde podem estabelecer
colonização, transformando esses microambientes em fontes de infecção inalatória para
indivíduos imunodeprimidos e hígidos nos quais é mais prevalente. Esta levedura é
responsável pela Criptococose que é uma micose com potencial invasivo para múltiplos
órgãos, causando lesões de aspecto nodular e tumoral nos pulmões e quadros graves de
meningoencefalite que podem ser de dificil resolução e associados ao desenvolvimento
de sequelas neurológicas (Change et al. 2004; Velagapudi et al. 2009; Ellabib et al.
2016).
Anteriormente considerado raro e restrito a regiões de clima tropical e
subtropical, C. gattii expandiu a sua distribuição geográfica e desde 1999 tem emergido
como um importante patógeno responsável por surtos em indivíduos hígidos e animais
relatados em Vancouver no Canadá e em cidades do Noroeste Pacífico dos EUA,
demonstrando uma mudança nas suas características eco - epidemiológicas (Kidd et al.
2004; Byrnes et al. 2009; Byrnes et al. 201 0).
As ferramentas de caracterização molecular baseadas na PCR foram
desenvolvidas e utilizadas nos últimos anos com o intuito de investigar a diversidade
genética deste patógeno, de mapear sua distribuição geográfica e de investigar as causas
deste surto e permitiram a distinção desta espécie em quatro genótipos: VGI, VGII,
VGIII e VGIV, sendo mais frequente o tipo molecular VGII, principalmente no Brasil
onde é endêmico (Meyer et al. 2003; Trilles et al. 2008; Freire et al. 2012; Da Silva et
al. 2012).
Atualmente o método padrão-ouro para genotipagem de Cryptoco~cus é o I
Multi Locus Sequence Typing (MLST), por apresentar maior acurácia na determinação
dos genótipos do que as técnicas anteriores baseadas apenas em PCR e por ser baseado
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no sequenciamento e identificação de polimorfismos presentes em sequências de
múltiplos genes conservados, além de apresentar uma maior capacidade de
discriminaçiio entre cepas de um mesmo genótipo. O MLST tem sido aplicado para a
vigilância epidemiológica da Criptococose em nível mundial, permitindo a identificação
de novos genótipos, na realização de estudos filogenéticos que tem ajudado a estimar a
origem evolutiva desses patógenos, na avaliação de relações de parentesco genético
entre isolados obtidos de diferentes regiões e na detecção de recombinações que podem
ser refletidas em mudanças fenotípicas e de patogênese (Fraser et al. 2005; Meyer et al.
2009; Hagen et al. 20 13; Khayhan et al. 2013; Souto et al. 2016; Ferreira et al. 201 7).
Tais estudos tem demonstrado que isolados de origem amazônica apresentam
uma intima relação genética com os que foram associados ao surto no norte do
continente americano e cepas com os mesmos genótipos já foram identificadas em
amostras de origem clínica e ambienta1 no Amazonas, no entanto os estudos regionais
ainda são escassos, a diversidade genética dos isolados ambientais foi pouco explorada,
principalmente com amostras de Manaus onde se concentram os casos de Criptococose
e mais evidências são necessárias para confirmar essas hipóteses filogenéticas (Hagen et
al. 2013; Brito et al. 2015; Souto et a1. 2016). Desta forma, o objetivo do trabalho foi
realizar a genotipagem por MLST de isolados de Cryptococm gattii obtidos de fontes
ambientais na área urbana e peri-urbana de Manaus.
Local de estudo
Este estudo @i definido como observacional e descritivo. Foi realizado no
Laboratório de Mitologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA, no
período de Fevereiro de 20 17 a Julho de 20 17.
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Amostras
Foram utilizados 6 isolados ambientais de Cryptococcus gattii que foram
obtidos de amostras de água do Rio Negro coletada em três pontos da orla de Manaus,
assim como de amostras de madeira em decomposição e de inseto obtidas na Reserva
Florestal Adolpho Ducke. As cepas encontram-se atualmente depositadas na Coleção de
Micro-organismos de Interesse Médico do INPA (CMIM) e foram caracterizadas apenas
por PCR como sendo do genótipo principal VGII em um estudo anterior realizado por
Bentes (2014).
Quadro 1. Origem e identificação dos isolados analisados.
Identificação da amostra I I
Tipo de amostra
AM 1 -RN2
AM2-PSR20
Local de isolamento
Agua do rio negro I Porto do São Raimundo
I I
I I Ducke I
Agua do rio negro
AM3-PSR22
AM4-RF50
I I
AM5-RF63 I Madeira em decomposição I Reserva Florestal Adolpho
Porto do São Raimundo
Agua do rio negro I Porto do São Raimundo
1 I Ducke I
Madeira em decomposição Reserva Florestal Adolpho
I Ducke I AM6-FORM63
I I I Legenda: AM - Amostra; RN - Rio Negro; PSR - Porto do São Raimundo; RF - Reserva
Florestal; FORM - formiga.
Inseto
Extra* de DNA
Reserva Florestal Adolpho
I
As cepas criopreservadas foram inicialmente reativadas em Ágar Sabouraud e
em seguida repicadas em uma nova placa contendo o meio de cultura Ágar Níger para
obtenção de biomassa fúngica jovem que foi utilizada para a extração de DNA por
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fenol:clorof6rmio:álcool-isoamílico conforme o protocolo de Ferrer et al. (2001). A
concentração de DNA Genômico extraído foi verificada por leitura em
espectrofotômetro (GeneQuant-pro RNADNA Calculator, GE Healthcare) no
comprimento de onda de 260 nrn (unidade de absorbância correspondeu a 50 pg/rnL) e a
razão de pureza determinada pela razão entre as absorbâncias a 260 e 280 nrn.
Amplificação dos Iócus do MLST e purificação dos produtos de PCR
Foi realizada inicialmente a amplificação individual dos genes conservados:
CAP59, LACI, GPDI, SODl, PLBI, UM5 e da região IGSl, que foram padronizados
pela ISHAM para C. gattii. As concentrações dos reagentes utilizados na PCR foram
determinados após modificações no protocolo proposto por Litvintseva et al. (2006). As
temperaturas de amplificação da PCR seguiram a padronização da ISHAM. E os
produtos de PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose a 1,5 % por 40
min a 100 V. Para a precipitação e remoção de primers e nucleotídeos não incorporados
na reação de PCR, os amplicons foram purificados com Polietilenoglicol(20%, 2.5M de
NaCl conforme protocolo descrito por Dunn & Blattner (1987) com modificações.
Reaç6es de Sequenciamento do DNA
Na reação de sequenciamento foi utilizado o Kit BigDyeB Terminator v3.1
Cycle Sequencing (Applied Biosystems). Os amplicons foram ressuspendidos em água
ultrapura e quantificados em espectrofotômetro para adequação do volume de DNA
conforme as recomendações do fabricante do kit (5-20 ng para fragmentos de DNA com
500 a 1000 pb). Em seguida o DNA foi adicionado na microplaca de 96 poços (Applied
Biosystems) com o primer e água MilliQB, totalizando um volume de 7,5 pL. O
volume final de 10 pL da reação de sequenciamento para cada poço foi comple(do com
a adição de 1 pL de BigDyeB e 1,5 pL de tampão 5X. As microplacas foram colocadas
em termociclador e as temperaturas de amplificação foram programadas conforme
instruções do fabricante (22).
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Após a amplificação e incorporação dos dideoxinucleotídeos (ddNTP's) aos
fragmentos de DNA, esses produtos da reação de sequenciamento foram submetidos a
precipitação com isopropanol75% e álcool 75% para remoção de ddNTP's livres. Após
esta etapa, foi adicionada Formamida Hi-di nos poços para desnaturação do DNA e em
seguida as microplacas foram submetidas a eletroforese capilar no aparelho AI31 3730
DNA Analyser.
Determinação dos sequences types (ST's)
As sequências nucleotidicas foram editadas utilizando o s o h a r e Sequencher
5.3 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, EUA). As sequências corrigidas foram
submetidas ao site do banco de dados Fungal UCST Database
(http://mlst.mycologylab.org/) para identificação dos alelos presentes em cada um dos
seis genes conservados e da região IGS1 por comparação com alelos de referência já
depositados. A combinação dos números alélicos gerou um código de sete dígitos (perfil
alélico) e o ST (13).
Análise de associação genética entre STs
Foi utilizado o algoritrno goeBURST por meio do software online
PHYLOVIZ (http://www.~yloviz.net/) com o propósito de avaliar o grau de
proximidade genética e a relação geográfica dos STs identificados neste estudo com os
já descritos na literatura e depositados no banco de dados do MLST. Inicialmente foi
realizado consulta e download do perfil alélico de 167 STs de C. gattii VGII disponíveis
no banco de dados Fungal MLST Database e em seguida a busca da origem geográfica
dos mesmos citadas em artigos científicos (Souto et al. 2016; Brito-Santos et al. 2015).
Durante a análise foram utilizados os dados de 124 STs que tinham origem geográfica
conhecida. O algoritmo realizou a comparação do perfil alélico dos diferentes STs e os
agrupou de forma a interligar os STs geneticamente semelhantes, exibindo diferentes
cores para os mesmos conforme a sua origem geográfica. Na análise final foram
mantidos apenas os STs com perfil alélico mais semelhante ao ST caracterizado no
presente estudo (23,24).
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram incluídos na análise molecular deste estudo, 6 isolados ambientais de
Crypococcus gatti obtidos de fontes ambientais da área urbana e peri-urbana de
Manaus. Destes, foi realizada a PCR dos sete locos de todos os isolados, porém s6 foi
possível obter dados de sequenciamento de DNA de isolados provenientes de amostras
de água do Rio Negro coletada na orla do Porto do São Raimundo (Tabela I), pois as
sequências não apresentaram qualidade suficiente para gerar resultado. Todos os
isolados eram do tipo molecular VGII e conforme o sequenciamento dos múltiplos
lócus, os mesmos apresentaram perfil alélico compatível em 100% de similaridade com
o ST20 (Tabelal), sendo ambos do subtipo molecular VGIIa, o mesmo identificado em
associação ao surto de Criptococose que teve início em Vancouver no Canadá a partir de
1999, expandindo-se pelo Noroeste Pacífico dos Estados Unidos nos anos seguintes
(Kidd et al. 2004; Byrnes et al. 2009; Byrnes et al. 2010).
Tabela 1. Resultado da genotipagem por MLST de duas cepas isoladas da água do
RioNegro.
Isolados Local de origem
Genótipo CAP59 GPDI IGSI LACI PLBI SOD1 URAS ST
PSR20 Portosão VGIIa 1 1 4 4 1 14 7 20
PSR22 Raimundo VGIIa
Pela análise realizada pelo algoritmo goeBURST, foi observado que o ST20
apresentou associação genética com os nove sequence types seguintes: ST48, ST122,
ST246, ST250, ST251, ST252, ST253, ST266 e ST267, caracterizando um complexo
clonal devido a extrema semelhança no perfil alélico, já que a maioria dos STs (ST122,
ST246, ST25, ST251, ST252, ST253, ST266 e ST267) apresentaram entre si diferenças
de apenas 1 lócus. Em relação a origem geográfica destes STs, foi observado que este
complexo clonal apresenta indícios de predominância no continente Americano, apesar
do ST20 já ter sido identificado na Europa e do ST48 (o que apresentou menor grau de
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semelhança no perfil alélico com o ST20) ter sido identificado exclusivamente na
Oceania (Brito-Santos et al. 20 15; Souto et al. 20 16).
Figura 1. Diagrama radial construído com algoritmo goeBURST apresentando as associações genéticas e geográficas do ST20 identificado neste estudo com outros já descritos na literatura. Os números no interior dos círculos correspondem a identificação dos STs e os números externos indicam a quantidade de lócus distintos entre os mesmos. Cores diferentes foram utilizadas para categorizar os STs de acordo com sua origem geográfica: verde claro (STs identificados no Amazonas), verde escuro (Brasil), azul (América do Norte), vermelho (Europa), roxo (Oceania). As origens geográficas foram obtidas dos estudos de: BRITO-SANTOS et al. (2015) e SOUTO et al. (2016) e colaboradores.
No Amazonas, o uso do MLST para avaliar a diversidade genotipica de
isolados ambientais dos agentes da Criptococose foi aplicado em apenas dois estudos
que analisaram isolados obtidos de poeira domiciliar em municípios do interior do
estado. Na pesquisa de Brito-Santos et al. (2015) conduzida no munícipio de Santa
Isabel do Rio Negro, foi observado que mais de dois STs podem coabitar um mesmo
ambiente, sendo identificado em tais amostras o ST20. No mesmo estudo foram
caracterizados pela primeira vez os ST266 e ST267 e curiosamente os mesmos foram
identificados pela análise de goeBURST no nosso estudo como componentes do
complexo clonal do ST20, demonstrando que isolados de C. gattii presentes no ambiente #
amazônico estão geneticamente associados ao subtipo molecular VGIIa que é de atual
emergência por ter sido gerado através de recombinações genéticas entre STs de cepas
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VGII de origem na América do Sul, surgindo com o risco em potencial de causar surtos
de Criptococose (Fraser et al. 2005).
Resultados distintos foram obtidos por Alves (2016), que obteve isolados de C.
gattii e de C. neoformans a partir de poeira domiciliar coletadas em uma comunidade
rural no munícipio de Iranduba, na zona metropolitana de Manaus e ao analisarem os
isolados de C. gattii por MLST não identificaram o ST20. Tal sequence type também já
foi identificado como agente de Criptococose em casos diagnosticados pela Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) (Souto et al. 2016). Nossos
resultados apresentaram indícios adicionais que confirmam o estabelecimento do ST20
no ambiente amazônico, no entanto descrevemos pela primeira vez que o ST20 é o
subtipo molecular de cepas VGII carreadas pela água do Rio Negro na orla de Manaus,
já que este foi um achado intdito descrito por Bentes (2014).
Conclui-se que as cepas de C. gattii VGII oriundas da água do Rio Negro
pertencem a um subtipo molecular denominado de VGIIa identificado por MLST como
ST20. Indivíduos que mantenham contato com a água do Rio Negro expõem-se ao risco
de infecção por tal agente que apresenta potencial de causar surtos de Criptococose
como relatado na América no Norte. E o ST20 compartilha semelhança genotípica com
STs de origem exclusiva do continente americano, incluindo STs identificados apenas
no Amazonas.
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PROGRAMA DE MICIAÇAO CIENT~FICA DO INPA
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