Desarrollo y Optimización de un procedimiento para la

Desarrollo y Optimización de un procedimiento para la cuantificación de

tetrahidrocannabinol (THC) en muestras de orina por cromatografía de gases acoplada a

espectrometría de masas (CG-EM).

Almaraz Sibaja Ana Patricia

Comisión Nacional de Cultura Física y Deporte Laboratorio Nacional de Prevención y Control del

Dopaje

Delta-9- Tetrahidrocannabinol

• El ∆9-Tetrahidrocannabinol, (∆-9-THC, THC), es un narcótico del grupo de los cannabinoides.

• El THC se metaboliza principalmente en el hígado por reacciones de hidroxilación y oxidación microsomal , siendo sus principales metabolitos, el 11-OH-THC, que a su vez puede metabolizarse a 11-nor-9-carboxy-THC (THC-COOH) que puede presentarse en forma libre o como glucurónido.

Dopaje por THC:

• La Agencia Mundial Antidopaje (AMA) incluyó el THC en el subgrupo“S8. Cannabinoides”.

• El THC y en general los cannabinoides actúan como ansiolíticos en dosis pequeñas, pueden mejorar la oxigenación y la recuperación por lo que su consumo ha sido prohibido en todos los deportes.

• La AMA a través de una lista de sustancias y métodos prohibidos en el deporte, ha establecido que si una muestra de orina contiene THC o su metabolito THC-COOH en concentración superior a 15 ng/mL, se declara que el deportista presente un resultado adverso a este compuesto.

• Optimizar una metodología por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas para la determinación del THC y sus metabolitos en las muestras de orina.

• Comparar la eficiencia de hidrólisis del THC y sus metabolitos excretados en forma conjugada utilizando hidrólisis enzimática e hidrólisis alcalina.

• Optimizar el procedimiento de extracción de THC en orina humana, evaluando diferentes valores de pH.

• Optimizar el procedimiento de extracción de THC en orina humana, evaluando diferentes disolventes orgánicos en la extracción líquido-líquido, así como el efecto de la concentración de un electrolito fuerte en la muestra para lograr un efecto de “salting-out”.

• Evaluar la limpieza de la muestra a partir de extracción en fase sólida, utilizando cartuchos con fase C-8 y C-18.

• Realizar un manejo estadístico adecuado de los resultados para garantizar la confiabilidad de los mismos.

Optimización del procedimiento de preparación de muestra para la

determinación y cuantificación de THC en orina humana.

3 mL de orina humana

Adicionar Estándar Interno (EI)

Hidrólisis

“Salting out” Extracción

líquido-líquido

Separar la fase orgánica

Evaporar el disolvente bajo corriente de N2

T<50°C

Derivatizar los tubos con 50 µL de

MSTFA:NH4I:Ditioeritritol

análisis cromatográfico

Evaporar el disolvente

Derivatizar

Análisis instrumental (CG-EM)

Extracción con terc-butilmetiléter

*Las pruebas se realizaron en 2 muestras de orina diferentes, por triplicado

Evaporar el disolvente

Análisis instrumental (CG-EM)

pH 5:

S.A de acetatos

S.A de fosfatos

pH 7:

S.A de fosfatos

pH 9:

S.A de fosfatos

S.A de amonio/amoniáco

S.A.: Disolución amortiguadora

Se emplearon los siguientes volúmenes de una disolución de NaCl al 30% :

0 mL

0.250 mL

0.500 mL

1 mL

2 mL

La EFS se evaluó empleando dos columnas no polares:

C8

C18

Ocupando como eluyente metanol

Para evaluar éste parámetro se emplearon 3 diferentes disolventes orgánicos:

Terc-butil metil éter

Acetato de etilo

Cloroformo

NOTA: El parámetro evaluado para todos los experimentos fue el Área Relativa del ión más abundante (ión de cuantificación) del THC y sus metabolitos con respecto al ión más abundante del estándar interno, éstas se obtuvieron mediante la siguiente ecuación:

Arelativa= Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜

Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑛𝑜

HIDRÓLISIS

EVALUACIÓN DE pH

SALTING OUT

EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (EFS)

EXTRACCIÓN CON DIFERENTES DISOLVENTES ORGÁNICOS

*TBME: terc-butilmetiléter **Acetato: acetato de etilo

MEJORES CONDICIONES

PARÁMETRO MEJORES CONDICIONES

Hidrólisis KOH 10 M

pH 5

Cantidad de NaCl al 30% 500 µL

Disolvente Acetato de etilo

Ión 371 THC-COOH Ión 374 THC-COOHd3

• Se procesaron las 2 muestras por triplicado con las mejores condiciones obtenidas y se cuantificó la concentración de THC-COOH mediante la curva de calibración con la siguiente fórmula:

𝐴𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 = 𝐹𝑟𝑟 ∗ 𝐶𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎

De la pendiente de la curva obtenemos el Frr:

Frr= 0.7056

Para cuantificar la concentración de THC-COOH:

𝑇𝐻𝐶 =𝐴𝑟𝑒𝑙

𝐹𝑟𝑟∗ [EI]

número de muestra

[THC-COOH](ng/mL)

Desviación estándar

%CV

1 15.970 0.259 1.62

2 30.540 2.650 8.68

• Los resultados obtenidos mediante las pruebas de hidrólisis con la enzima β-glucuronidasa, y la hidrólisis alcalina con KOH 10M, mostraron que la hidrolisis básica con KOH 10M presentó mayor eficiencia comparando las áreas relativas de cada muestra y cada tipo de hidrólisis.

• En cuanto a las pruebas de extracción a diferentes pH observamos que para el THC y sus metabolitos THC-COOH y 11-OH-THC, la disolución amortiguadora de acetatos (pH=5) presentó un mejor rendimiento de extracción para el analito.

• El fenómeno fisicoquímico de salting-out ayudó a mejorar la transferencia de los analítos de interés de la fase acuosa a la fase orgánica, obteniendo como resultado una extracción más cuantitativa, según los resultados obtenidos, con la adición de 500 µL de la disolución de NaCl se obtuvo el mejor rendimiento de extracción para el THC-COOH.

• En las pruebas de extracción en fase sólida, se observa que la columna con fase C8 tiene una mejor eficiencia que la columna C18, esto debido a las características del THC y sus metabolitos, al tener grupos funcionales polares, éstos son más afines por el cartucho con cadena hidrocarbonada más corta.

• El último parámetro a evaluar para la optimización del método fue la extracción con diferentes disolventes orgánicos, para el analito de interés (THC-COOH), se observó una mayor área relativa utilizando acetato de etilo como extractante.

• En este trabajo se logró la optimización del procedimiento de preparación de muestra para la cuantificación de THC-COOH en muestras de orina de atletas, como parte del control antidopaje exigido por la AMA. El método fue probado en dos muestras reales con diferentes niveles de concentración de THC-COOH obteniéndose resultados confiables, con coeficientes de variación porcentuales menores a 10 %. Se encuentra en proceso la validación completa del método desarrollado.

• Fundación Instituto Catalán de Farmacología. Uso terapeútico del cannabis: Farmacología básica. España 2007

• Por un deporte limpio. Fundación Miguel Indurain. Enero de 2012.

• WADA. The 2012 Prohibited List. International Standard. http://www.wadaama.org

• Instituto Peruano del Deporte. www.ipd.gob.pe/conad/image/folleto.pdfte

• Tsadik T. Abraham, et al.Simultaneous GC–EI-MS Determination of Δ9-Tetrahydrocannabinol, 11-Hydroxy-Δ9-Tetrahydrocannabinol, and 11-nor-9-Carboxy-Δ9-Tetrahydrocannabinol in Human Urine Following Tandem Enzyme-Alkaline Hydrolysis. J Anal Toxicol. 2007 October ; 31(8): 477–485.