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DETECCIÓN DE RESISTENCIA BACTERIANA POR MÉTODOS MOLECULARES EN BACTERIAS GRAM
POSITIVAS Y NEGATIVAS.POSITIVAS Y NEGATIVAS.
Dra. Norma Velázquez GuadarramaLaboratorio de Investigación en Bacteriología
Antibiótico
Toda sustancia de origen natural osintética con la capacidad de destruir osintética con la capacidad de destruir oimpedir el desarrollo de un organismovivo.
3) Alcanzar el sitio blanco 3) Alcanzar el sitio blanco para ejercer su efecto para ejercer su efecto
1) Concentrarse en el órgano, 1) Concentrarse en el órgano, tejido o células donde se tejido o células donde se encuentren las bacteriasencuentren las bacterias
2) Penetrar en el interior de la2) Penetrar en el interior de labacteria, concentrarse ybacteria, concentrarse ypermanecer activopermanecer activo
• antibióticos naturales: producidos pormicroorganismos (por ejemplo la penicilina)
• antibióticos semi-sintéticos: disponen de unesqueleto producido por microorganismos yesqueleto producido por microorganismos ymodificado químicamente (por ejemplo, laampicilina)
• quimioterápicos: son fármacos totalmente desíntesis creados en el laboratorio (por ejemplo,las sulfamidas)
Clasificación de los antibióticos
• Naturaleza Química
• Mecanismo de Acción
Naturaleza Química
• Beta-lactámicos– Penicilina– Cefalosporinas– Monobactámicos– Monobactámicos– Carbapenems– Inhibidores de Betalactamasas
• Polipéptidos• Aminoglucosidos• Anfenicoles• Tetraciclinas• Macrolidos• Glucopeptidos• Glucopeptidos• Lincosamidas• Sulfonamidas• Inhibidores de la folato redutasa• Quinolonas
En base a su mecanismo de acción
Acción de la Teicoplanina en la Síntesis de Pared Bacteriana
Resistencia Bacteriana
• Pérdida de la sensibilidad de unmicroorganismo a un antimicrobiano alque originalmente era susceptible.que originalmente era susceptible.
• Capacidad de las bacterias dedesarrollar mecanismos para evadirel efecto de los antibióticos a loscuales eran previamente susceptible
• Natural: Cuando todos losintegrantes de una determinadaespecie son resistentes.
• Adquirida: Cuando afecta a algunosintegrantes de una especie pero no ala totalidad.
Resistencia antimicrobiana
Bacteria Susceptible
Bacteria Resistente
Nueva Bacteria Resistente
Transferencia de Genesde Resistance
Centers for Disease Control and Prevention Campaign to Prevent Antimicrobial Resistance in Healthcare Settings
Resistencia adquirida• Cromosómica: se origina por mutaciones
• Extracromosómica
– Plasmidos– Plasmidos
– Trasposones
– Integrones
Mecanismos de transferencia genética
conjugación
Transformación
Transducción
Transformación
The Science Creative Quarterely Jan- March 2007
Disminución de la permeabilidad celular
BOMBAS DE EXPULSIÓN ACTIVA
RESISTENCIA A LA VANCOMICINA EN S. aureus
Identificación y Susceptibilidad
(CLSI) Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI/2007
Determinación del perfil de susceptibilidad antimicrobiana por la prueba de difusión
con disco
(CLSI) Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI/2007
Antibióticos activos in vitro sin eficacia clínica
(CLSI) Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI/2007
Prueba del Doble Disco para determinar Fenotipo “D”
SENSIBLEFENOTIPO cMLS
FENOTIPO iMLSFENOTIPO M
Detección de BLEEs por prueba de doble disco
Disco de la izquierda con 30 µg de CTX y disco central con 20mas 10µg de amoxicilina con ác. clavulánico y a la derechadisco con 30 µg de CAZ, muestran un fenotipo de resistenciaa ambas cefalosporinas
CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Oct. 1995, p. 557–584
Determinación de la inducción de β-lactamasas AmpC
Cefotaxima
Cefoxitina
E-test para determinación de MBL
Walsh. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Apr. 2005, p. 306–325
E-test por un extremo imipenem (IP) y en el otro extremo imipenem más EDTA (IPI), reducción de 3 diluciones en la CIM en presencia de EDTA prueba positiva para metalo-ββββ-lactamasa (MBL), recomienda como S. malthophilia
ATCC13636 como control +
Concentración Inhibitoria Mínima
stock
MH
Antibióticos
Solidificar
Inhibición del crecimiento
Lectura e interpretación de Lectura e interpretación de
placasplacas
Oxa 0.25Oxa 0.25µµg/ml Oxa 0.5 g/ml Oxa 0.5 µµg/ml Oxa 1g/ml Oxa 1µµg/mlg/ml
Oxa 2Oxa 2µµg/ml Oxa 4g/ml Oxa 4µµg/mlg/ml
MÉTODOS
Verificaciónde cepas
Susceptibilidad
Método de difusión en disco
• Aislamiento en Gelosa Sangre
• Aislamiento en Gelosa Sal-Manitol
• Catalasa
• Prueba de la Coagulasa
Susceptibilidad Antimicrobiana
Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)
Prueba del doble disco para determinar Fenotipo “D”
Extracción de DNAIdentificación del gen mecA y
tipificación del SCCmec por PCR-Multiplex
SAMR
Kit de extracción deDNA Genómico Wizard®
Identificación del gen mecA y tipificación del SCCmec por PCR-Múltiplex
Tamaño Amplicón
(pb)Especificidad
613 SCCmec I
398 SCCmec II
280 SCCmec III
776 SCC IVa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tipo II Tipo V776 SCCmec IVa
493 SCCmec IVb
200 SCCmec IVc
881 SCCmec IVd
325 SCCmec V
147 mec A
Tipo IVaGel de agarosa 2%
Tipo II
Claritromicina
Claritromicina
� Mecanismo de acción:� Interfiere en la síntesis de
proteínas, se fija a lasubunidad 50S ribosomal.
� Mutación puntual en elgen 23S rRNA,gen 23S rRNA,principalmente en lasposiciones:
� 2142 (A2142 a G/C/T).� 2143 (A2143 a G/C).
Condiciones de Amplificación gen 23S
PCR
Desnaturalización 94ºC ----- 30s
Alineamiento 50ºC ----- 30s
Extensión 72ºC ----- 60s
30 ciclos
Condiciones de digestión Bsa I
Enzima Bsa I 5U
DNA Amplicon 5µg55ºC / 1 hora
Micromarker DNA
298
434
458
pb15001000
900800700600500
400
300
100 pb promega1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
80
102
174
298200
100
Tetraciclina
� Mecanismo de acción:� Inhibe la síntesis de
proteínas por la unión ala subunidad 30Sribosomal y bloqueandoel sitio de unión deltRNA-aminoacil.
Tetraciclina
tRNA-aminoacil.
� Mutaciones porsustitución y delecionesen el rRNA 16S,involucra lasposiciones:
� AGA 926-928 TTC
Identificación de mutaciones en el gen 16S del rRNA
GEN OLIGONUCLEÓTIDOS AMPLIFICADO
16S 16S-880fw 5-ATAGACGGGGACCCGCACAAG-3
16S-999rv5-TGGCAAGCCAGACACTCCA-3
120 pb.
Condiciones de PCR:
94ºC/ 15 min. preincubación
95ºC/ 10 seg. desnaturalización
56ºC/ 10 seg. alineamiento 30 ciclos
72ºC/ 10 min. extensión
Amplificados se mandaran asecuenciar para determinarlas mutaciones de losnucleótidos 926 a 928 delgen 16S del rRNA.
(Glocker E. et al, 2005)
frxA
Metronidazol
� Mecanismo de acción:� Produce pérdida de la
estructura helicoidal del DNA,inhibición de la síntesis deácidos nucleicos y muertecelular.
� Mutaciones sin sentido(deleciones o inserciones) en(deleciones o inserciones) enel gen rdxA y frxA quecodifican paranitrorreductasas.
� Dos tipos de cepasresistentes aquellas querequieren solo la inactivaciónde rdxA y aquellas querequieren de la inactivaciónde rdxA y frxA
Identificación de los genes rdxA y frxA
GEN OLIGONUCLEÓTIDOS AMPLIFICADO
rdxA
frxA
rdxA-F5-GCAGGAGCATCAGATAGTTCT-3
rdxA-R5-GGGATTTTATTGTATGCTACAA-3
frxA-F5-GGATATGGCAGCCGTTTATCATT -3
frxA-R
886 pb.
780 pb.frxA-R
5-GAATAGGCATCATTTAAGAGATTA-3
Condiciones de PCR:
94ºC/ 2 min. preincubación
95ºC/ 4 seg. desnaturalización
58ºC/ 40 seg. alineamiento 30 ciclos
72ºC/ 1 min. extensión
72ºC/ 10 min. extensión final
Jeong J.Y et al, 2000, Jeong J.Y et al, 2001
Mutación no habrá amplificación de los genes.
Sin mutación amplificación de los genes.
CONTROL DE CALIDAD DE LOS MÉTODOS A EMPLEAR
• E. faecalis ATCC 29212• GENTAMICINA 4-16 µg/mL• VANCOMICINA 1-4 µg/mL• OXACILINA 8-32 µg/mL• OXACILINA 8-32 µg/mL• HLRA sensible (gentamicina 500 µg/mL, HLRA estreptomicina 200 µg/mL)
• E. faecalis ATCC 59212• HLRA resistente • VancomicinaR 6 µg/mL en BHI
Oligonucleótidos para la amplificaciónpor PCR de Enterococcus resistentes aelevados niveles de Gentamicina yEstreptomicina
GEN SECUENCIAProducto
amplificado (pb)Referencia
GEN SECUENCIA amplificado (pb)Referencia
aac(6’)-Ie
aph(2’’)-Ia
(Gm)
5´-TGA TGA TTT TCC TTT GAT GT-3´
5´-CAA TCT TTA TAA GTC CTT TT-3´1,395
Suk-Kyung Lim,Koichi Tanimoto,
ant(6’) (Sm)5´-ACT GGC TTA ATC AAT TTG GG-3´
5´-GCC TTT CCG CCA CCT CAC CG-3´597
Udo, E. E., N. Al-Sweih,
Ciclo Temperatura Tiempo No. Ciclos
Desnaturalización 94° C 5 min. 1
Condiciones de la PCR para los genes
ant (6’)(Sm) y aac (6’)- aph (2’’) (Gm)
Desnaturalización inicial
94° C 5 min. 1
Desnaturalización 94° C 1min.
30Alineamiento 47° C 1min.
Extensión 72° C 1min.
Extensión final 72° C 5min. 1
**El almacenamiento es a 4°C
Electroferograma de los productos de la PCR para los genes ant (6’) y aac (6’)- aph
(2’’) de cepas HLRA
M C(-) C(+) C(-) C(+) 1 2 3 4 5 6(Sm) (Sm) (Gm) (Gm)
2000
3000
1395 pb1000
500
100
Fig 11. Ensayo de PCR para cepas HLRA. Línea M; MPM; línea C(-) ATCC 59212; línea C(+), ATCC 29212; lineas nones son cepas HRLA aac (6’)- aph (2’’) (+) ; líneas pares son cepas HLRA ant (6’) (+).
597 pb(Sm)
1395 pb(Gm)
• Obtención cepas (gram, catalasa, 6.5%NaCl)
• “over.night”
• Extracción de DNA total (kit Wizard® de Promega)
• Amplificación por PCR
Oligonucleótidos para la amplificación por PCR de los genesvanA y vanB de cepas de enterococos VancomicinaResistentes
GEN SECUENCIAProducto
amplificado (pb)Referencia
Van A5'- CAT GAA TAG AAT AAA AGT TGC AAT A - 3'5'- CCC CTT TAA CGC TAA TAC GAT CAA - 3'
1,030 Clark, N. C.,
Van B5’GTG ACA AAC CGG AGG CGA GGA 3’5’CCG CCA TCC TCC TGC AAA AAA 3’
433 Clark, N. C.,
Resistentes
PROGRAMACIÓN PARA GENES Van A.
Ciclo Temperatura Tiempo No. Ciclos
Desnaturalización inicial
94° C 5 min. 1
Condiciones de la PCR para el gen vanA y vanB
inicial
Desnaturalización 94° C 1min.
30Alineamiento 55° C 1min.
Extensión 72° C 1min.
Extensión final 72° C 5min. 1
**El almacenamiento es a 4°C
Electroferograma de los productos de la Electroferograma de los productos de la amplificación por PCR para los genes amplificación por PCR para los genes vanAvanA y y
vanBvanB
1000
500
200
100
3000
433 pb.
vanB
1 2 3 4 C(+) C(+) 7 8 M
Pie de figura
1,030 pb.
vanA
500
200
100
3000
400
Fig10. Ensayo de PCR para cepas EVR . Línea M; MPM; línea C(+), ATCC 29212; línea 3, capa EVR con vanB (+); lineas 4,7,8 cepas EVR con vanA (+); líneas restantes vanA y vanB (-)
Macrorestricción con enzima NotI empleando PFGE
Cepa microbiana
37°C/ 3 días
Cepa 1. Lavado con sol. salina EDTA,
(1min. 5000 rpm) y decantar
2. Agregar 1ml. de sol. PIV (TRIS-HCl 2M (pH 7.6) + NaCl 5M+ agua destilada estéril)
37°C/ 3 días
Bloques al 2%
Agarosa de bajo punto de
fusión
adicionar a los bloques
Agregar 1ml de sol. de lisis EC
Incubar/ 1 hr.
(Hosaka Y. et al, 2005)
Decantar la solución
agregar 1ml de sol. ES
Sol. ES: EDTA (pH 9-9.5)0.5M + Proteinasa K + sarcosil 20%
Incubar a 50°C/ 48hrs
Decantar la sol. ES
Agregar regulador TEconteniendo sol.fluorada defenilmetilsulfonil.
Incubar a temp. ambiente/ 4 hrs.
Hacer 3 lavados con TE por 10 min. c/u
Incubar a tem. ambiente/20 Decantar la sol.
Corte de los bloques de
agarosa
Sol. Tris-EDTA
ambiente/20 min.
PFGE
fragmentos de 40 a 20 kb a 9 V/cm a 14ºC /30 hrs/ 11 min.
fragmentos de 20 a 10 kb a 9 V/cm a 14ºC /26 hrs/ 3 min.
Buffer TBE 0.5 X
Decantar la sol.
Incubar con regulador de la enzima NotI/ 30 min.
Incubar a 37ºC/ 16 hrs. con 50U de NotI
Pseudomonas aeruginosa
multirresistentes
28H 116D 356H 379U 382D 452H 437H 438H 483H 498H 668H 672H 845H 925H
291
339.5388436.5
48.5
97
145.5
194
242.5
291
Foto gel de agarosa 1.2% de P.ae digeridas con enzima Spe I
Marcador
397U Liof
397U 4ºC
397U ºT amb
4U ºT amb
197UºT amb
4U 4ºC
4U Liof
197U 4ºC
197U Liof
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