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Universidade Estadual do Ceará
Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS DO NORDESTE BRASILEIRO
FRENTE A DIFERENTES CEPAS DE MICROSPORUM CANIS,
CANDIDA SPP E MALASSEZIA PACHYDERMATIS
Fortaleza-Ceará 2005
ii
Universidade Estadual do Ceará
Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS DO NORDESTE BRASILEIRO
FRENTE A DIFERENTES CEPAS DE MICROSPORUM CANIS,
CANDIDA SPP E MALASSEZIA PACHYDERMATIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de
Veterinária da Universidade Estadual do Ceará como
requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre
em Ciências Veterinárias.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade
Animal
Orientador: Dra. Selene Maia de Morais
Co-orientador: Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
Fortaleza - Ceará
2005
iii
Universidade Estadual do Ceará Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS DO NORDESTE BRASILEIRO FRENTE A DIFERENTES
CEPAS DE Microsporum canis, Candida spp E Malassezia
pachidermatis
Autora: Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle
Defesa em _____/____/________ Conceito:
Nota:
Banca Examinadora
___________________________________________
Selene Maia de Morais, Profa. Dra.
Orientadora (UECE)
Nilberto R. F. do Nascimento, Prof. Dr.
Examinador (UECE)
Marcos Fábio Gadelha Rocha, Prof. Dr.
Co-Orientador/Examinador (UECE)
______________________________________ ______________________________________
Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante, Dra.
Examinadora (UFC)
iv
F677a Fontenelle, Raquel Oliveira dos Santos
Avaliação do potencial antifúngico de óleos essenciais
de plantas do nordeste brasileiro frente a diferentes cepas de
dermatófitos e leveduras / Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle –
Fortaleza, 2005.
102 p.; il.
Orientadora: Profa. Dra. Selene Maia de Morais.
Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) –
Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
1. Óleos essenciais 2. Atividade antifúngica 3.
Toxicidade 4. Croton 5. Lippia I. Universidade Estadual do Ceará,
Faculdade de Veterinária. II. Título.
CDD: 815.53
v
DEDICO,
A Deus, razão do meu existir e ao meu marido Joffre Fontenelle Filho, por estar ao meu lado em todos os momentos.
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e a todos aqueles que tanto me ajudaram, durante todo o
curso.
À professora Dra. Selene Maia de Morais, por sua orientação e dedicação na
realização deste trabalho.
Ao professor Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha, pela dedicação, compreensão e
amizade oferecida neste trabalho, e pela co-orientação.
Ao Professor Dr. Nilberto Robson Falcão do Nascimento, pela paciência,
orientação e principalmente pela sua simplicidade como ser humano.
A minha banca examinadora composta pela Dra. Selene Maia de Morais, pelos
Dr(s) Marcos Fábio Gadelha Rocha, Nilberto Robson Falcão do Nascimento e pela Dra.
Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante.
Aos professores do PPGCV, pela paciência e dedicação.
As Dra. Marta Regina Kerntopf e Adriana Rocha Tomé, pela contribuição à
realização deste trabalho.
A todos os alunos dos laboratórios de Química em Produtos Naturais, em
especial à aluna Cristiane Maria Souza de Castro que muito me ajudou nos
experimentos.
vii
A todos os amigos do Centro Especializado em Micologia Médica, que me
ajudaram na realização desse projeto e estiveram ao meu lado durante este período
(Carolina Sidrim de Paula Cavalcante, Rossana Aguiar Cordeiro e Francisco Atualpa
Soares Júnior) em especial, a Érika Helena Salles de Brito por todos os ensinamentos e
amizade.
A todos os colegas do mestrado em Ciência Veterinárias do PPGCV, que
fizeram parte da minha vida durante estes dois anos. E aqueles que fazem parte do
PPGCV.
A Alzenira e Adriana Albuquerque, secretárias do PPGCV, que em muito me
ajudaram durante todo o tempo de mestrado.
A CAPES, pelo financiamento da bolsa durante o período de dois anos.
A meu marido, Joffre Fontenelle Filho, pelo grande incentivo e força.
Aos meus pais, Luís Gonzaga Rodrigues dos Santos e Edvirgens Moreira
Oliveira dos Santos, pelo apoio, carinho e incentivo.
A meus irmãos, Rute Oliveira dos Santos e Moisês Oliveira dos Santos por todo
o apoio.
viii
RESUMO
Produtos naturais à base de plantas medicinais vêm sendo estudados ao longo dos anos e a
constatação de sua eficácia tem sido demonstrada por pesquisadores de todo mundo. As micoses
constituem um sério problema, especialmente em lugares de clima tropical e subtropical, os
dermatófitos e as Candida spp são os patógenos mais freqüentes destas enfermidades. O
objetivo deste trabalho foi investigar a atividade antifúngica de óleos essenciais de plantas do
nordeste brasileiro frente a diferentes cepas de dermatófitos (Microsporum canis) e leveduras
(Candida albicans, Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis) que acometem animais;
determinar o grupo de fungos mais sensíveis às plantas utilizadas; averiguar os componentes
químicos que se encontram em maior quantidade nas diversas plantas que apresentaram
atividade antifúngica e avaliar a toxicidade através da dose letal média (DL50) por via
intraperitoneal e oral em camundongos. Para tanto as plantas foram coletadas e identificadas,
posteriormente os óleos essenciais foram obtidos e seus constituintes analisados por
cromatografia de gás e espectrometria de massa. Os fungos foram recuperados da micoteca do
Centro Especializado em Micologia Médica e a viabilidade dos mesmos foi avaliada através de
testes laboratoriais. A atividade antifúngica foi averiguada através do método de difusão em
ágar. Os óleos essenciais obtidos do Croton nepetaefolius e do Croton argyrophylloides
demonstraram atividade apenas contra o M. canis enquanto que os óleos essenciais do Croton
zehntneri e da Lippia sidoides foram efetivos contra todos os fungos testados apresentando dose-
dependência. O óleo essencial da Lippia sidoides foi mais potente que os óleos essenciais das
espécies de Croton. Nas maiores concentrações o óleo essencial da L. sidoides inibiu
completamente o crescimento dos fungos. Este óleo essencial apresentou o timol (59,65%) e o
cariofileno (10,60%) como maiores constituintes. A toxicidade aguda de todos os óleos
essenciais até 3 g/Kg por via oral foi desprovida de qualquer toxicidade. A administração oral de
100 mg/Kg durante 30 dias não induziu nenhuma alteração histopatológica, hematológica ou
bioquímica significativa. Desta forma, devido à alta eficácia e a baixa toxicidade, os óleos
essenciais do Croton zehntneri e da Lippia sidoides constituem fontes importantes de compostos
antifúngicos que podem ser úteis no tratamento de micoses em animais.
ix
ABSTRACT
Mycoses are serious public health concern specially in subtropical and tropical regions with
dermatophytes and yeast infections being the most common pathogens. This work was
undertaken in order to test whether essential oils extracted from the leaves of Croton species
(Croton nepetaefolius, Croton argyrophylloides and Croton zehntneri) or from Lippia sidoides
would represent a potential therapeutic alternative for this infectious threats. Thase plants are
used in the folk medicine to treat dermatological problems and in the present study were tested
them in vitro against several strains of Microsporum canis, Candida albicans, Candida tropicalis
e Malassezia pachydermatis and also evaluated for its acute and sub-chronic toxicological
effects. The chemical constituents of the essential oils were determined by GL-Chromatography
coupled to mass espectroscopy. The essential oils obtained from Croton nepetaefolius and Croton
argyrophylloides were effective only against M. canis while the essential oils of Croton zehntneri
and Lippia sidoides were effective against all tested strains in a dose-related way. Lippia sidoides
was the most efficient being at the higher doses used (i.e. 75 and 100 mg/mL) as effective as the
positive controls used griseofulvin for M. canis, itraconazol for M. pachydermatis and
amphotericin B. Lippia sidoides essential oil at these doses sometimes completely inhibited fungi
growth. This essential oil has thymol (59.6%) and caryophyllene (10.6%) as major constituents.
The acute administration of all essential oils up to 3 g/Kg by the oral route to mice was devoided
of overt toxicity. The oral administration of 100 mg/Kg to rats during 30 days did not induce
histopathological, haemathological or serum biochemical alterations. Therefore, due to its high
efficacy and low toxicity the essential oils of Croton zehntneri and Lippia sidoides are promising
drugs in the search of new antifungal drugs.
x
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Colônia de Microsporum canis................................................................................. 11
Figura 2: Colônias de Candida spp. ..........................................................................................12
Figura 3: Blastoconídios de levedura. .......................................................................................12
Figura 4: Colônia típica de Malassezia spp. ..............................................................................14
Figura 5: Esquema de uma extração do óleo essencial............................................................. 33
Figura 6: Halo de inibição produzido pela maior concentração (100 mg/mL) de OECa testada,
perante cepa de Microsporum canis........................................................................................... 47
Figura 7: Halo de inibição produzido pela menor concentração (25 mg/mL) do OELs perante
cepa de Microsporum canis....................................................................................................... 47
Figura 8: Halo de inibição produzido pela maior concentração do OECn (100mg/mL) perante
cepa de Microsporum canis....................................................................................................... 47
Figura 9: Halo de inibição produzido pela maior concentração (100mg/mL) do OECn perante
cepa de Microsporum canis....................................................................................................... 48
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Classes de toxicidade aguda de substâncias administradas a ratos por diferentes vias e
extrapolação para toxicidade humana ........................................................................................... 17
Tabela 2: Análise química das três espécies de Croton e da Lippia sidoides.............................. 43
Tabela 3: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides
contra M. canis ............................................................................................................................. 45
Tabela 4: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides
contra Candida spp ...................................................................................................................... 46
Tabela 5: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides
contra M. pachydermatis .............................................................................................................. 46
Tabela 6: Peso dos ratos após tratamento com 117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia
sidoides durante 30 dias................................................................................................................. 49
Tabela 7: Parâmetros Bioquímicos de ratos Wistar antes do tratamento, após 15 dias e 30 dias do
tratamento com 117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia sidoides ou veículo durante 30
dias................................................................................................................................................ 49
Tabela 8: Parâmetros hematológicos de ratos Wistar antes e depois de tratamento oral com
117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia sidoides ou veículo durante 30 dias.......................... 50
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
CHCM Concentração de hemoglobina corpuscular média
DL50 Dose letal média
DMSO Dimetil-sulfóxido
HCM Hemoglobina corpuscular média
K.I. Índice de retenção na coluna do cromatógrafo
IT Inibição total
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
OELs Óleo Essencial da Lippia sidoides
OECn Óleo Essencial do Croton nepetaefolius
OECa Óleo Essencial do Croton argyrophylloides
OECz Óleo Essencial do Croton zehntneri
OE Óleo Essencial
TGO Transaminase glutâmica oxalacética
TGP Transaminase glutâmica pirúvica
TW Tween
UFC/mL Unidades Formadoras de Colônia por mililitro
VCM Volume corpuscular médio
xiv
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 2
2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................................ 4
2.1 Plantas medicinais......................................................................................................... 4
2.1.1 Importância das plantas medicinais.............................................................................. 4
2.1.2 Óleo essencial............................................................................................................... 6
2.2 Plantas medicinais estudadas nesta dissertação......................................................... 7
2.2.1 Croton spp. .................................................................................................................. 7
2.2.2 Lippia sidoides.............................................................................................................. 8
2.3 Fungos: aspectos gerais ................................................................................................. 9
2.3.1 Dermatófitos................................................................................................................ 10
2.3.2 Leveduras..................................................................................................................... 11
2.4 Estudos de toxicidade................................................................................................... 15
2.4.1 Toxicidade aguda......................................................................................................... 16
2.4.2 Toxicidade sub-crônica ............................................................................................... 18
2.4.2.1 Avaliação Bioquímica.............................................................................................. 18
xv
2.4.2.2 Avaliação Hematológica.......................................................................................... 21
3 JUSTIFICATIVA .......................................................................................................... 25
4 HIPÓTESE ...................................................................................................................... 27
5 OBJETIVOS.................................................................................................................... 29
5.1 Objetivo Geral.............................................................................................................. 29
5.2 Objetivos Específicos................................................................................................... 29
6 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................... 32
6.1 Coleta das plantas........................................................................................................ 32
6.2 Obtenção dos óleos essenciais..................................................................................... 32
6.3 Análise da composição química dos compostos vegetais......................................... 33
6.4 Determinação da dose letal média (DL50) ................................................................ 34
6.5 Toxicidade sub-crônica............................................................................................... 34
6.6 Microrganismos.......................................................................................................... 35
6.6.1 Recuperação das cepas.............................................................................................. 35
xvi
6.6.2 Identificação laboratorial........................................................................................... 36
6.6.2.1 Candida spp............................................................................................................ 36
6.6.2.2 Malassezia pachydermatis...................................................................................... 37
6.6.2.3 Dermatófitos........................................................................................................... 38
6.7 Atividade antifúngica................................................................................................. 40
6.7.1 Método de difusão em ágar....................................................................................... 40
7 RESULTADOS.............................................................................................................. 42
7.1 Análise dos óleos essenciais........................................................................................ 42
7.2 Atividade antimicrobiana .......................................................................................... 44
7.3 Toxicidade.................................................................................................................... 48
8 DISCUSSÃO................................................................................................................... 52
9 CONCLUSÕES.............................................................................................................. 56
10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA......................................................................... 57
xvii
ANEXO.............................................................................................................................. 67
Artigo: Antifungal and Toxicologial evaluation of essential oils from Northeast Brazil.. 68
Introdução
19
1 INTRODUÇÃO
As plantas medicinais, seus óleos essenciais e demais compostos, constituem
fonte viável de medicamentos para enfermidades das mais variadas possíveis. Essas plantas
surgem como alternativa em locais onde a falta de medicamentos é uma constante e o seu
custo é elevado. Aliados a esses fatores, a resistência a antibióticos e a toxicidade durante
tratamentos prolongados com várias drogas antifúngicas têm sido a razão para uma
extensiva procura de novas drogas para a terapêutica de infecções causadas por fungos.
Poucos desses produtos, no entanto, foram estudados de acordo com protocolos científicos
modernos e adequados. Portanto, a validação científica é essencial ao seu uso na espécie
humana e animal como medicamentos alternativos. Muitas dessas plantas são
popularmente usadas no tratamento de micoses.
Doenças infecciosas causadas por fungos representam um problema crítico
para a saúde pública. Nos últimos anos, ocorreu uma incidência crescente de infecções
fúngicas em virtude do aumento de indivíduos com o sistema imunológico comprometido
tais como: pacientes transplantados, acometidos por câncer ou infetados com o HIV.
Com o aumento na freqüência das micoses e do reduzido número de drogas
para o tratamento destas enfermidades, a realização de testes de sensibilidade se faz mais
necessária, o que torna a escolha da terapêutica, baseada na droga, mais eficaz, cada vez
mais adequada e eficiente.
Várias drogas já foram e continuam sendo testadas contra diferentes espécies
fúngicas pertencentes aos gêneros Candida e Malassezia, assim como para fungos
filamentosos, dentre elas, terbinafina, itraconazol, fluconazol e cetoconazol. Ademais, bons
resultados são obtidos a partir de estudos desenvolvidos com novas drogas antifúngicas,
como: voriconazol, albaconazol, ravuconazol, posaconazol e caspofungina.
Nos últimos anos, o interesse pela fitoterapia tem crescido acentuadamente em
todo o mundo. Além dos sucessos quase que “miraculosos” e dos aspectos históricos
20
fascinantes da medicina tradicional, notícias sobre descobertas de produtos naturais que
beneficiam a sociedade, de uma forma ou de outra, se tornaram cada vez mais freqüentes.
Os inúmeros problemas associados à terapia convencional foram os responsáveis pelo
crescimento nas pesquisas sobre plantas medicinais e seu conseqüente aumento na
produção e venda desses remédios.
Dessa forma, para uma eficiente investigação da atividade de compostos de
plantas usadas na medicina popular do Nordeste, contra espécies de dermatófitos e
leveduras, faz-se necessário a realização de testes de sensibilidade in vitro, correlacionando
com resultados in vivo. Nesta dissertação, foram avaliados a atividade antifúngica dos
óleos essenciais do Croton zenhtneri, Croton nepetaefolius, Croton argyrophylloides e da
Lippia sidoides contra o dermatófito (Microsporum canis) e as leveduras (Candida
albicans, Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis) que acometem animais.
21
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Plantas medicinais
2.1.1 Importância das plantas medicinais
A fitoterapia pode ser historicamente definida como a ciência que trata dos
problemas de saúde, utilizando os vegetais (fitocomplexos), sendo contemporânea ao início
da civilização. As plantas são tradicionalmente usadas por populações de todos os
continentes no controle de doenças e pragas. Os egípcios já faziam uso medicinal dos
vegetais. Algumas das espécies que eles utilizavam continuam empregadas até os dias de
hoje, tais como: Papaver somniferum (papoula), Scilla maritima (scila), Aloe Vera
(babosa) e Ricinus communis (óleo de rícino) (Lavabre, 1993).
No Brasil, o comércio de ervas medicinais começou com os índios e,
atualmente, em qualquer cidade, é possível comprar plantas, pós e ungüentos em mercados
e também nas ruas. Essa alternativa é utilizada tanto dentro de um contexto cultural, na
medicina popular, quanto na forma de fitoterápicos, pelo fato de essas plantas serem fontes
importantes de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais constituem
modelos para a síntese de um grande número de fármacos, revelando nestes produtos alta
diversidade em termos de estrutura e de propriedades físico-química e biológica (Wall &
Wani, 1996).
Para enfatizar o benefício de certas plantas com propriedades medicinais, basta
recordar que o princípio ativo do comprimido símbolo da alopatia, a aspirina, ácido acetil-
salicílico (AAS) foi sintetizada, por Gilm, em 1859, baseado na salicina, substância ativa
de Salix alba L. (Calixto et al., 2000).
22
Apesar do aumento dos estudos sobre plantas medicinais, somente de 15 a 17%
destas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal (Soejarto, 1996). Considerando a
grande biodiversidade do Nordeste brasileiro, esse número poderia ser bem maior (Rabelo,
2003).
A automedicação “milagrosa” com plantas medicinais, chegando ao extremo
de substituir terapias tradicionais em doenças graves, é prática bastante utilizada tanto em
populações de baixa renda, como único lenitivo para seus males, bem como nas camadas
mais privilegiadas que gozam de facilidade sanitária e pronto atendimento médico,
somente por puro modismo ou sob influência de grande exploração comercial. Assim, é
necessária extrema atenção ao uso não controlado das plantas medicinais e seus devidos
estudos de toxicidade para garantir o perfeito uso na espécie humana (Rabelo, 2003).
O Brasil possui sérios problemas de saúde pública, principalmente na região
Nordeste em razão do baixo poder aquisitivo de grande parte da população local, o alto
custo dos remédios torna-os inacessíveis até mesmo nos mais simples casos, como dores
agudas e/ou crônicas, febres e gripes (Rabelo, 2003). Portanto, o uso popular das plantas
medicinais foi o primeiro passo para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos de
baixo custo para uma região tão carente de recursos financeiros e, por outro lado, tão rica
em flora, reunindo milhares de espécies vegetais distintas (Rabelo, 2003). É válido
ressaltar, contudo, que a planta dita medicinal, muitas vezes, chega às mãos do usuário
despojada de qualquer informação fidedigna: há desconhecimento total da época da coleta,
do especialista (se foi um especialista) que a colheu, dos cuidados tomados durante os
processos de armazenamento, secagem e moagem, da ausência de contaminação por
fungos e outros microrganismos, se é tóxica ou não. Tudo isso torna impossível à previsão
de eventuais efeitos colaterais que a planta possa provocar, porém, nada haveria a objetar
ao receituário de plantas integrais ou de seus extratos brutos, desde que se tratasse de
produtos obtidos sob rigoroso controle (Ribeiro, 1993).
23
2.1.2 Óleo Essencial
Os óleos essenciais (OE) são produtos de composição complexa extraídos de
plantas por vários processos, sendo o mais utilizado a destilação por arraste em vapor
d’água (Craveiro et al., 1976; Bruneton, 1995). Essas plantas têm um conteúdo de óleo
essencial em torno de 0,1 a 0,5% e, raramente, de 1 a 5% do peso verde (Bruneton, 1995).
Embora sua maior utilização ocorra nas áreas de alimentos (condimentos
aromatizantes de alimentos e bebidas), cosméticos (perfumes e produtos de higiene) e
também em farmácias, drogas vegetais ricas em óleos essenciais são empregadas in natura
para a preparação de infusões e/ou sob a forma de outras preparações simples (Lavabre,
1993).
De forma geral, os óleos essenciais são misturas complexas de substâncias
voláteis, lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas. Também podem ser chamados de
óleos voláteis, óleos etéreos ou essências. Essas denominações derivam de algumas de suas
características físico-químicas, como, por exemplo, a de serem geralmente líquidos de
aparência oleosa a temperatura ambiente, advindo daí a designação de óleo. Sua principal
característica, entretanto, é a volatilidade, diferindo dos óleos fixos, misturas de
substâncias lipídicas, obtidos geralmente de sementes. Outra característica importante é o
aroma agradável e intenso, sendo por isso chamados de essências (Bruneton, 1995; Simões
et al., 1999).
Os constituintes químicos desses óleos aromáticos variam desde
hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples, fenóis, aldeídos, éteres, ácidos orgânicos,
ésteres, cetonas, lactonas, cumarinas, até compostos contendo nitrogênio e enxofre. Podem
ser utilizados para a síntese de vitaminas, hormônios, antibióticos e antissépticos (1978;
Lavabre, 1993; Bruneton, 1995).
24
2.2 Plantas medicinais estudadas nesta dissertação
2.2.1 Croton spp
Uma das famílias mais estudadas no Brasil é a das Euforbiaceas (Brito &
Brito, 1993). Essa família é composta de aproximadamente 290 gêneros, entre eles o
Croton, e cerca de 7.500 espécies, distribuídas em todas as regiões tropicais e subtropicais
do mundo (Barroso, 1991).
Amplamente distribuído na flora do Nordeste brasileiro, principalmente nas
caatingas, o gênero Croton é muito importante pela sua utilidade ao indivíduo que vive
afastado dos grandes centros populacionais (Lorenzi & Matos, 2002). As espécies de
Croton podem ser agrupadas, de acordo com as denominações populares, em canelas
silvestres, marmeleiros, velames, dentre outras (Fernandes et al., 1971). Várias espécies de
Croton têm sido estudadas nesses últimos anos, dentre as quais se destacam o C. zenhtneri,
C. nepetaefolius e C. argyrophylloides.
O Croton nepetaefolius Baill., marmeleiro vermelho ou marmeleiro sabiá é
usado para aliviar distúrbios gastrintestinais, na forma de chás e infusões. Seu óleo
essencial tem o efeito antiespasmódico comprovado sobre a musculatura lisa intestinal
(Coelho de Souza et al., 1997), assim como efeito anti-hipertensivo, que é mais potente em
animais com hipertensão genética ou experimental, o qual se deve a um componente
direto, um relaxamento miogênico do músculo liso vascular, e a um efeito indireto, via
atuação no sistema nervoso autônomo. Ademais, o óleo essencial tem atividade
antiinflamatória, também relatada, sugerindo que o mesmo tenha também atuação sobre as
funções imunológicas do organismo. Essa hipótese é reforçada por dados da literatura,
mostrando que o metil eugenol, um importante constituinte deste óleo, tem propriedade
imunomoduladora e antiinflamatória (Franchomme & Penoel, 1995).
25
O Croton argyrophylloides Muell. Arg. conhecido como marmeleiro prateado,
é um arbusto de ramos delgados, cilíndricos, cinerescentes e escabros. O fracionamento
dos extratos hexânicos e alcoólicos do lenho do caule e do estrato hexânico da casca do
caule levaram ao isolamento de um ácido carboxílico diterpênico e seu éter metílico
(Monte, 1980). O estudo químico do seu óleo essencial mostrou a presença de .-pineno e
�-guaieno (Craveiro, 1976).
O Croton zehntneri Pax et Hoffm., conhecido popularmente como canela de
cunhã, é uma planta subarbustiva e caducifólia do Nordeste brasileiro, pertencente à
família Euphorbiaceae. A medicina popular emprega esta planta para diversos fins, sendo
alguns desses já validados farmacologicamente. Por exemplo: o tipo químico anetol é
antidispéptico e estomáquico; o tipo metil-eugenol é usado popularmente, em forma de
chás e infusões, contra a insônia e como sedativo, embora seu uso ainda não esteja
validado cientificamente, mesmo estando comprovado que estas propriedades podem ser
atribuídas ao metil-eugenol; o tipo eugenol é utilizado como anti-séptico (Craveiro et al.,
1976).
2.2.2 Lippia sidoides
Lippia sidoides, conhecida popularmente como alecrim-pimenta, é um
arbusto de folhas caducas, bastante aromático e próprio da vegetação nordestina,
pertencente à família Verbenaceae. Seu óleo essencial rico em timol é responsável pelo
alto poder antiséptico de suas folhas. Possui inúmeras aplicações na medicina popular,
sendo muitas delas comprovadas cientificamente. É usada para combater infecções da
garganta e da boca, para o tratamento de ferimentos na pele e no couro cabeludo, para o
tratamento de acne, sarna infectada, panos-brancos, impigens, caspa do mau cheiro nos
pés, nas axilas e virilha (Matos, 2000). Botelho & Soares (1994) testaram extratos de
26
Lippia sidoides contra bactérias causadoras de cárie, encontrando eficácia por parte
desses extratos.
2.3 Fungos: aspectos gerais
O estudo dos fungos tem aproximadamente 150 anos, porém as manifestações
clínicas ocasionadas por esses microrganismos são conhecidas desde a antigüidade
(Mendes-Giannini & Melhem, 1996). O desenvolvimento do conhecimento das espécies de
fungos brasileiros é relatado por Fidalgo (1968).
Nos últimos anos, a Micologia Médica evoluiu muito como ciência básica.
Diversos fungos foram reclassificados e as infecções fúngicas foram alvo de sensíveis
alterações. Essas mudanças taxonômicas não tiveram bases e/ou razões apenas teóricas e
especulativas, já que encerram conotações práticas nos setores clínico, laboratorial e
terapêutico (Paula, 1998).
Além da capacidade de produzir doença em seres humanos, os fungos também
causam doenças em animais e vegetais, destroem a madeira e materiais sintéticos e
compartilham com as bactérias um importante papel na decomposição de restos orgânicos
do solo (Mendes-Giannini & Melhem, 1996).
Doenças fúngicas ocorrem com relativa freqüência em clínicas de pequenos
animais, sendo que, nos casos crônicos, o tratamento se torna mais difícil e, às vezes,
frustrante. A problemática do tratamento pode ser justificada pelo limitado arsenal de
drogas antifúngicas comparadas com as drogas antibacterianas, pelo aparecimento de
vários efeitos colaterais à terapia com medicamentos convencionais e pela seleção de cepas
resistentes aos fármacos utilizados (Sidrim & Rocha, 2004).
27
2.3.1 Dermatófitos
O estudo das dermatofitoses teve início juntamente com a história da
Micologia Médica. Em 1839, Robert Remak elucidou a etiologia do favus. Quase um
século depois, os dermatófitos foram classificados por um brilhante dermatologista francês
de nome Raymond Jacques Andrien Sabouraud. Hoje existem muitos fungos pertencentes
aos gêneros Trichophyton, Epidermophyton e Microsporum; entretanto, a denominação
dermatófito é utilizada somente para os fungos pertencentes a esses gêneros e que são
queratinofílicos e capazes de causar doenças em humanos e animais (Sidrim & Rocha,
2004).
Dentre as infecções fúngicas, as micoses superficiais são consideradas
preocupantes para os veterinários. Nos animais domésticos, as dermatofitoses,
consideradas como micoses superficiais, possuem grande interesse pelo seu potencial
zoonótico (Garcia et al., 2000; Crespo et al., 2000).
Os dermatófitos são um grupo de fungos taxonomicamente relacionados que
têm capacidade de invadir tecido queratinizado (pele, pêlos e unhas, do homem e dos
animais), produzindo dermatofitose, que também é conhecida como tínea. A infecção pode
ocorrer em qualquer idade, embora os jovens sejam mais comumente afetados do que os
idosos, assim como pacientes com imunossupressão ou debilitados (Muller et al., 1985;).
O Microsporum canis (Figura 1) é o responsável pela maioria de casos de
micoses em animais de estimação e o mais freqüente dermatófito zoofílico de humanos, em
28
diversas áreas urbanas (Cabañes, 2000; Brilhante et al., 2002). As enfermidades micóticas
têm importância distinta dentro das enfermidades veterinárias em virtude do seu potencial
zoonótico (Hay, 1995; Nakamura et al., 1999). Vários pesquisadores demonstraram a
importância epidemiológica dos animais nas dermatofitoses. Dentre os animais
domésticos, o gato é o principal disseminador do Microsporum canis (Nakamura et al.,
1999). As dermatofitoses em felinos são clinicamente caracterizadas por áreas de alopecia
e quebra de pêlos e em raros casos o M. canis é associado com o desenvolvimento de
grânulos e nódulos teciduais. O M. canis é cosmopolita, endêmico em criações de felinos, e
todos os animais jovens podem estar clinicamente afetados e, em contraste, os adultos
portadores podem não apresentar lesões (Nakamura et al., 1999).
2.3.2 Leveduras
A história natural das doenças causadas por leveduras é mais bem
compreendida à luz da susceptibilidade do hospedeiro. O indivíduo normal apresenta
mecanismos de defesa inespecíficos e específicos, tais como barreiras anatômicas e
fisiológicas, resposta inflamatória e resposta imunológica, que, juntos, representam
obstáculo ao estabelecimento da infecção fúngica (Sidrim & Rocha, 2004).
Figura 1: Colônia de Microsporum canis. (Fonte: CEMM, 2005)
29
O gênero Candida é composto por fungos leveduriformes hialinos, que
apresentam duas formas de reprodução: assexuada ou anamorfa e sexuada ou teleomorfa.
Taxonomicamente, são enquadradas no grupo dos ascomicetos, visto que a reprodução
sexuada é caracterizada pela produção de ascos (Sidrim & Rocha, 2004).
Todas Candida spp apresentam colônias de coloração branca, superfície lisa e
textura glabrosa úmida (Raposo et al., 1996; Moretti et al., 2004) (Figura 2), que crescem
bem dentro de 48 horas, entre temperaturas de 25 e 37°C (Sidrim & Rocha, 2004). Com
relação à microscopia, se lâminas forem preparadas diretamente a partir de um fragmento
da colônia ou de uma amostra clínica positiva, apenas estruturas unicelulares, denominadas
blastoconídeos, que podem estar isoladas ou apresentando brotamento, vão ser visualizadas
(Figura 3). Desta forma, torna-se necessário a realização de microcultivo em placa de Petri,
para melhor visualização da disposição das estruturas fúngicas típicas de cada espécie,
sendo este, na maioria das vezes, suficiente para identificar o microrganismo (Moretti et
al., 2004).
A Candida albicans, apesar de fazer parte da microbiota normal do trato
intestinal, pode ser patógeno oportunista das regiões mucocutâneas, trato digestivo e
(Fonte: CEMM, 2005)
Figura 3: Blastoconídios de levedura. (Fonte: CEMM, 2005)
Figura 2: Colônias de Candida spp.
30
genital de mamíferos e aves, além de envolver pele, unhas e trato respiratório com riscos
de desencadear fungemias. A candidíase como doença primária é extremamente rara, e, via
de regra, está associada a neoplasias, doenças imunomediadas e ao uso prolongado de
corticosteróides, antimicrobianos ou drogas citostáticas (Rippon, 1988; Kwon-Chung &
Bennet, 1992).
As leveduras do gênero Malassezia são associadas ao homem e aos animais,
causando diferentes enfermidades, ou como parte da microbiota de pele e mucosas (Bond
et al., 2000; Midgley, 2000).
Em animais, a primeira descrição de malasseziose, no caso, produzido por M.
pachydermatis data de 1925, quando Weidman isolou leveduras em forma de garrafa, não
lipodependentes, de lesões de pele de rinoceronte indiano, as quais denominou de
Pityrosporum pachydermatis. Desde então, é isolada de grande variedade de animais
homeotermos, particularmente mamíferos domésticos e selvagens (Guillot et al., 1994;
Guillot & Bond, 1999).
As leveduras do gênero Malassezia têm habilidade de utilizar lipídios como
fonte de carbono, sendo lipofílicas, e exigem a presença de ácidos graxos de cadeias longas
para seu desenvolvimento, sendo, portanto, lipodependentes, sendo a M. pachydermatis a
única exceção, pois, embora lipofílica, não é lipodependente, tendo a capacidade de se
desenvolver mesmo em meios sem adição de lipídeos (Midgley, 2000; Sidrim & Rocha,
2004).
As espécies de Malassezia, em geral, apresentam colônias com textura
cremosa, coloração de creme a marron-clara (Figura 4) e propriedades micromorfológicas
semelhantes, caracterizadas pela presença de blastoconídios globosos, ovais e com
presença de uma constrição denominada colarete, que podem ser visualizados em lâminas
confeccionadas a partir de um fragmento da própria colônia ou desde o exame direto de
amostra clínica positiva. Na microscopia, podem também ser visualizados filamentos
31
curtos de parede grossa, com um ou dois septos (Sidrim & Rocha, 2004; Chen & Hill,
2005).
Embora M. pachydermatis seja microrganismo comensal, algumas condições
podem propiciar seu desenvolvimento exacerbado, levando à subseqüente doença clínica.
O estado de doença, presumivelmente, reflete alterações nos mecanismos físicos, químicos
e/ou imunológicos do animal, que normalmente restringem a colonização da levedura.
Assim, fatores como terapia antibacteriana, emprego de corticóides, alergias, dermatites
seborréicas, distúrbios nutricionais ou hormonais e doenças intercorrentes, como
neoplasias, são considerados fatores predisponentes a malasseziose (Guillot & Bond,
1999).
Figura 4: Colônia típica de Malassezia spp.
(Fonte: CEMM, 2005)
32
2.4 Estudos de toxicidade
A Farmacologia, como ciência experimental que trata das propriedades das
drogas e seus efeitos em sistemas vivos, envolve o estudo das fontes das drogas
(farmacognosia), a ação das drogas no organismo (farmacodinâmica), o uso de drogas no
tratamento das doenças (terapêutica), e os efeitos tóxicos das drogas ou xenobióticos
(toxicologia) (Brown e Davis, 2001).
A toxicologia é o ramo científico que estuda as propriedades de químicos e
seus efeitos em organismos vivos, com objetivo de assegurar seus potenciais efeitos
adversos, a fim de ajudar a assegurar e proteger a saúde humana ou animal (Roberfroid,
1995).
Um efeito adverso é definido como uma alteração anormal, indesejável ou
nociva após exposição a substâncias potencialmente tóxicas. A morte é o efeito adverso
mais drástico que pode ocorrer, porém, efeitos adversos de menor gravidade incluem
alteração de consumo de alimentos ou água, variação no peso corpóreo ou de órgãos,
alterações anatomopatológicas ou simplesmente de níveis enzimáticos (Barros e Davino,
1996).
Os testes toxicológicos, aplicados em animais de laboratório e sob condições
previamente estabelecidas, permitem determinar os possíveis efeitos das substâncias em
humanos ou animais expostos a estas (Barros e Davino, 1996).
33
No Brasil, a resolução 1/78 (D.O. 17/10/78) do Conselho Nacional de Saúde,
estabelece como tipos de ensaios de toxicidade: aguda, subaguda (subcrônica), crônica,
teratogenia e embriotoxicidade e estudos especiais (Vasconcelos, 2002).
2.4.1 Toxicidade aguda
A toxicidade aguda de um composto químico é definida como os efeitos
adversos que ocorrem dentro de um período curto após administração de dose única ou
doses múltiplas administradas dentro de 24 horas (Barros e Davino, 1996). A toxicidade
aguda é expressa pela quantidade necessária, em mg/kg de peso corpóreo, para provocar a
morte em 50% de um lote de animais submetidos a experiência, sendo representada pela
dose letal 50 (Eaton e Klaasson, 1995; Barros e Davino, 1996; Repetto, 1997; Larini,
1997). Os valores de dose letal 50 (DL50) são obtidos a partir de índices de mortalidade
observados, empregando-se diversos métodos estatísticos. Entre estes métodos, destaca-se
o método de PROBITOS (termo derivado de PROBITS = probability units) que, além de
determinar o valor de toxicidade aguda e seus limites fiduciais, possibilita a obtenção de
uma reta “dose-resposta” (Larine, 1997).
Os resultados obtidos a partir dos estudos de toxicidade aguda servem também
para conhecimento do mecanismo de ação da substância, identificar possíveis órgãos ou
sistemas sensíveis e determinar se os efeitos são reversíveis ou não. Ainda mais, os
resultados obtidos dos estudos de toxicidade aguda são empregados para o delineamento
dos estudos de toxicidade subcrônica e crônica, particularmente no que se refere à escolha
de doses (Barros e Davino, 1996).
Hadge e Sterner (1949) apresentam uma tabela de toxicidade oral, inalatória e
por contato (pele) para ratos e fazem uma extrapolação para humanos (tab. 2).
34
Tabela 1: Classes de toxicidade aguda de substâncias administradas a ratos por diferentes
vias e extrapolação para toxicidade humana.
Classe Termo usual DL50 Oral
[ 1 ]
Inalação
[ 2 ]
DL50 Pele
[ 3 ]
DL50
Huma
na
[ 4 ]
1 Toxicidade Elevada ����PJ <10 ����PJ 15 mg
2 Toxicidade Alta 1–50 mg 10 – 102 5 – 43 mg 5 ml
3 Toxicidade Média 50–500 mg 102 – 103 44 – 340 mg 30 g
4 Toxicidade Baixa 0.5–5 g 103 – 104 0,35 – 2,81 mg 250 g
5 Praticamente atóxico 5–15 g 104 – 106 2,82 – 22,59 mg 1000 g
6 Relativ. Inofensivo > 15 g >106 > 22,6 g > 1 Kg
Segundo Repetto (1997), o estudo de toxicidade aguda permite determinar o
grau de toxicidade aproximada de uma substância em quatro categorias conforme a DL50
aproximada por via oral. Estas categorias são:
I. Muito tóxica: DL50 inferior ou igual a 25 mg/kg.
II. Tóxica: DL50 inferior ou igual a 250 mg/kg.
III. Nociva: DL50 inferior ou igual a 2000 mg/kg.
IV Sem toxicidade aguda: DL50 superior a 5000 mg/kg.
35
2.4.2 Toxicidade subcrônica
Os estudos de toxicidade subcrônica são realizados para obter informações sobre a toxicidade de substâncias químicas, em humanos ou animais, após exposições repetidas a estas (Barros e Davino, 1996).
Os estudos de toxicidade subcrônica e crônica, que objetivam determinar o
efeito tóxico após exposição prolongada a doses cumulativas da substância em teste, não
se diferenciam na sua essência, mas, sim, em sua extensão (Repetto, 1997). Parâmetros
hematológicos e bioquímicos devem ser avaliados no início e final do estudo. Exames
histopatológicos, também, devem ser realizados no final do experimento (Barros e Davino,
1996).
Os estudos de toxicidade subcrônica e crônica são feitos após a administração cumulativa de uma substância e envolvem análise hematológica, análise bioquímica e histopatológica dos animais. Além destes parâmetros, devem ser feitas observações diárias para verificar o comportamento dos animais tratados (Vasconcelos, 2002).
2.4.2.1 Avaliação Bioquímica
A avaliação de alguns parâmetros bioquímicos fornece indicações de alterações fisiológicas que podem estar envolvidas com a ocorrência de efeitos provocados por uma substância e ajudam no diagnóstico de algumas patologias, entre elas podendo-se citar as intoxicações (Vasconcelos, 2002).
O fígado tem papel essencial no metabolismo dos nutrientes, incluindo o
controle e a manutenção do nível de glicose sangüínea, na desintoxicação e excreção de
metabólitos, na síntese de muitas proteínas plasmáticas e na digestão mediante a síntese,
secreção biliar e conservação de ácidos biliares, que são essenciais para uma ótima
hidrólise da gordura da dieta e para absorção intestinal de ácidos gordurosos e outros
lipídios, incluindo vitaminas lipossolúveis (Tennant, 1997).
36
Muitas toxinas induzem danos hepáticos. A suscetibilidade do fígado ao
insulto tóxico é em parte uma conseqüência de sua localização entre o trato digestivo e o
resto do organismo e o papel central que ele desempenha na biotransformação e disposição
de xenobióticos (Turk e Casteel, 1997).
As manifestações clínicas da disfunção hepática são diretamente atribuíveis a
alterações nas funções metabólicas, de excreção, de síntese e digestivas do fígado. O
fígado tem a maior reserva funcional, e sinais de falência hepática freqüentemente não se
desenvolvem até que 70% ou mais da capacidade funcional do fígado esteja perdida. É
importante salientar que, até quando uma fração maior da massa hepatocelular for perdida
em uma injúria aguda, por exemplo, hepatite aguda ou necrótica, a recuperação é possível
em virtude da capacidade única de recuperação do fígado (Tennant, 1997). As enzimas
hepáticas, por ocasião de uma injúria hepática, são liberadas para o plasma e o aumento da
quantidade destas enzimas plasmáticas torna-se de utilidade diagnóstica.
Em todas as espécies domésticas, a atividade da aspartato aminotransferase ou
transaminase glutâmica oxalacética (AST/TGO) é alta no fígado e, na injúria aguda ou
crônica do fígado, a atividade da TGO do plasma é aumentada. Atividade da alanina
aminotransferase ou transaminase glutâmica pirúvica (ALT/TGP) sérica é considerada
específica para injúrias hepáticas em cães e gatos, e em pequenos animais com injúrias
hepatocelulares, um aumento fracional na atividade da TGP é de 4 a 8 vezes maior do que
o aumento correspondente em TGO (Center, 1996).
A albumina é sinterizada pelo fígado como todas as proteínas plasmáticas,
exceto as imunoglobulinas. É a proteína plasmática mais osmoticamente ativa em razão da
sua abundância e tamanho, contribuindo com cerca de 75% da atividade osmótica do
plasma (Kaneko, 1997).
37
Hipoalbuminemias podem ter origem hepática, no caso da hepatite crônica
difusa especialmente em cirroses, ou podem ter origem não hepática, como no caso das
dietas inadequadas, má absorção, gastroenteropatias com perda de proteínas, diarréias
crônicas etc. (Hagiware, 1983).
Outro parâmetro de avaliação bioquímica é a dosagem das bilirrubinas séricas.
A bilirrubina resulta da degradação da hemoglobina no sistema retículo endotelial, e é
excretada pelo sistema hepatobiliar para a luz intestinal. A determinação do nível sérico
das bilirrubinas tem importância fundamental no diagnóstico das três formas de icterícia:
hemolítica, hepática e pós-hepática ou obstrutiva (Hagiware, 1983). A bilirrubina é
derivada da destruição de eritrócitos danificados ou senescentes por macrófagos do baço,
fígado e medula óssea. Colestase resulta em hiperbilirubinemia conjugada. A bilirrubinúria
pode ocorrer em virtude de regurgitação da bilirrubina conjugada. Hemólise pode resultar
em hiperbilirrubinemia não conjugada (Turk e Casteel, 1997).
Em mamíferos, os rins funcionam como o maior órgão de excreção para
eliminação de resíduos metabólicos do corpo. Perda parcial da função renal resulta em
desvios variáveis do normal, dependendo da quantidade de tecido funcional remanescente.
O termo azotemia refere-se ao acúmulo de resíduos de nitrogênio no sangue. Concentração
sangüínea de uréia e creatinina são medidas como índices de azotemia, embora nenhum
dos dois provoque toxicidade significante em razão do seu acúmulo (Finco, 1997).
A creatinina é formada no metabolismo da creatina e fosfocreatina muscular. O seu nível sangüíneo não é afetado pela dieta, idade ou sexo do animal. É excretada totalmente pelos glomérulos, não ocorrendo reabsorção tubular. Serve, portanto, como índice de filtração glomerular e, por ser facilmente eliminada, o seu aumento na circulação sangüínea ocorre mais tardiamente nos estados de insuficiência renal, quando comparada à uréia sangüínea (Hagiware, 1983). Em muitas espécies domésticas, as concentrações séricas de uréia e creatinina são estimativas grosseiras da taxa de filtração glomerular. Com base no mecanismo de excreção renal destes dois compostos, a creatinina é o melhor indicador (Finco, 1997).
2.4.2.2 Avaliação hematológica
38
A Hematologia é a ciência que estuda o sangue sob aspecto morfológico,
fisiológico e patológico, e, conseqüentemente, Hematologia clínica veterinária representa o
emprego dos conhecimentos da citada especialidade na interpretação e resolução de
problemas clínicos de âmbito veterinário (Birgel, 1983).
A presença de alterações hematológicas em animais de laboratório expostos a
novos agentes farmacêuticos é um importante elemento na avaliação total de riscos e
perigos de potencial exposição pelo animal (Vasconcelos, 2002).
O sangue e a medula óssea apresentam uma mistura complexa de células que
respondem de maneiras diferentes aos vários insultos tóxicos. Os efeitos de substâncias
nas células sangüíneas não são restritos à destruição celular ou inibição de hematopoiese.
Alguns agentes estimulam a hematopoiese, enquanto outros afetam a função das células do
sangue, resultando em diminuição ou aumento da função (Lund, 2000).
O sangue é constituído por elementos sólidos, ou seja, os corpúsculos celulares
(hemácias, leucócitos e plaquetas), pelo plasma que é composto de 90% de água e dilui as
proteínas e minerais, e, finalmente, pelos elementos gasosos (O2 e CO2 ) (Birgel, 1983).
O hemograma expressa as condições do sangue periférico num certo momento
da vida de um animal, nele aparecendo registrados os valores quantitativos e qualitativos
das células do sangue. Está dividido em eritrograma e leucograma (Souza, 1998).
O eritrograma é o estudo dos glóbulos vermelhos e compreende os seguintes
parâmetros:
⇒ contagem de hemácias/mm3;
39
⇒ hemoglobina (g/dL);
⇒ hematócrito (%);
⇒ índice hematimétrico - VCM (volume corpuscular médio), HCM
(hemoglobina corpuscular média) e CHCM (concentração de hemoglobina corpuscular
média).
O leucograma é o estudo dos glóbulos brancos e compreende a contagem
global e diferencial dos leucócitos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos e
monócitos). A contagem diferencial é expressa em valores relativos, que representam a
percentagem de cada leucócito em relação à contagem total, ou em valores absolutos que
significam a quantidade de cada leucócitos por mm3 de sangue. O leucograma, também, faz
referências à morfologia dos leucócitos, como, por exemplo, a presença de granulações
tóxicas nos neutrófilos, linfócitos atípicos ou alguma anomalia leucocitária (Souza, 1998).
Também faz parte do hemograma a avaliação das plaquetas, que consiste da
contagem do número de plaquetas por mm3 de sangue e a análise da morfologia das
plaquetas, verificando se existe alguma anomalia quanto a coloração, tamanho ou
agregação (Vasconcelos, 2002).
Pequenas diferenças nos valores médios nos grupos dos animais tratados
comparados com os valores do grupo-controle são, com freqüência estatisticamente
significantes, e nem todas as pequenas diferenças detectáveis nesta situação estão
diretamente relacionadas aos efeitos tóxicos do composto que está sendo estudado (Lund,
2000).
40
Justificativa
41
3 JUSTIFICATIVA
Com o aumento na freqüência das micoses e do reduzido número de drogas
para o tratamento destas enfermidades, os óleos essenciais de plantas constituem fontes
importantes de compostos antifúngicos. No Nordeste do Brasil, várias plantas são
utilizadas pelo povo, principalmente em locais onde a falta de medicamentos é uma
constante e o custo é elevado. Para o seu uso em larga escala, no entanto, estudos que
comprovem estas atividades, associados à determinação da toxicidade, fazem-se
necessários. Um estudo detalhado, abordando os aspectos químicos, micológicos e
farmacológicos dos óleos essenciais do Croton zenhtneri, Croton nepetaefolius, Croton
argyrophylloides e da Lippia sidoiedes é importante para a sua validação como prováveis
substâncias com atividade antifúngica contra dermatófitos (Microsporum canis) e
leveduras (Candida albicans, Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis).
42
Hipótese
43
4 HIPÓTESE
Os óleos essenciais do Croton zenhtneri, Croton nepetaefolius, Croton
argyrophylloides e da Lippia sidoides constituem fontes de compostos antifúngicos para
combater micoses em humanos e animais.
44
Objetivos
45
5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo Geral
O objetivo deste estudo foi investigar a atividade antifúngica ‘in vitro’ dos
óleos essenciais de Croton spp. e Lippia sidoides contra dermatófitos (Microsporum canis)
e leveduras (Candida albicans, Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis).
5.2 Objetivos Específicos
1 Estabelecer a sensibilidade dos microrganismos testados frente aos óleos essenciais
utilizados;
2 averiguar os componentes químicos que se encontram em maior quantidade nas diversas
plantas que apresentam atividade antifúngica;
3 avaliar a toxicidade aguda e subcrônica dos óleos essenciais das plantas.
.
46
47
Material e
Métodos
48
6 MATERIAL E MÉTODOS
6.1 Coleta das plantas
As plantas foram coletadas no Município de Viçosa do Ceará. As exsicatas
foram depositadas no Herbário Prisco Bezerra, no Departamento de Biologia da UFC, onde
foram identificadas taxonomicamente.
6.2 Obtenção dos óleos essenciais
Os óleos essenciais do C. zenhtneri, C. nepetaefolius, C. argyrophylloides e da
Lippia sidoides foram extraídos no Laboratório de Produtos Naturais da Universidade
Estadual do Ceará.
A obtenção dos óleos essenciais foi realizada por destilação a vapor d’água ou
hidrodestilação, de acordo com o método descrito por Craveiro et al. (1976). Esse processo
consistiu na propriedade que as essências possuem de serem miscíveis com água no estado
de vapor. As folhas da planta foram picadas e colocadas em um recipiente, conectado em
uma extremidade a um vaso contendo água em ebulição, e a outra extremidade a um
condensador. O vapor de água arrastou as substâncias voláteis contidas no material,
formando uma mistura de vapores. Após a passagem pelo condensador, ocorreu a
separação das fases hidrofílica e hidrofóbica por decantação que foram coletadas em
erlenmeyer. A fase hidrofóbica constitui o óleo essencial (Figura 5).
49
Figura 5:. Esquema de uma extração do óleo essencial.
6.3 Análise da composição química dos compostos vegetais
Os óleos essenciais foram analisados por cromatografia de gás acoplada a
espectrometria de massa.
A cromatografia gasosa separa componentes a partir de misturas complexas de
compostos voláteis. Nas aplicações analíticas, é possível o acoplamento com um sistema
de espectrometria de massa que é extremamente útil na separação e identificação de
estruturas, como, por exemplo, de componentes de óleos essenciais (óleos voláteis)
(Craveiro, 1976; Simões, et al., 1999).
50
6.4 Determinação da dose letal média (DL50)
A dose letal média foi estimada segundo o método de Miller e Tainter, (1944).
Para tanto, foram utilizados camundongos albinos (Mus musculus) pesando entre 20-30 g
que foram divididos (n = 10/grupo). Os camundongos foram tratados por via
intraperitoneal e oral através de cânula de gavagem, com salina (0,01 mL/kg) ou com os
compostos vegetais (100; 300; 500; 750; 1000; 2000 e 3000 mg/kg). Os animais foram
observados por 1 hora para verificação de efeitos hipocráticos, sendo anotados em tabelas
modificadas de Malone. Após 24 horas, o número de mortos foi registrado.
6.5 Toxicidade subcrônica
Para averiguar a toxicidade subcrônica, ratos Wistar de ambos os sexos
divididos em dois grupos (n=10/grupo) tratados pela via oral durante 30 dias com OELs na
concentração determinada pela dose letal média obtidas em estudos prévios em
camundongos com administração intraperitoneal e 1 mL/kg/dia de veículo (salina). Estes
animais foram pesados no início, durante e após os trinta dias para avaliação de ganho de
peso. Amostras de sangue foram coletadas antes, 15 e 30 dias após o tratamento, e a
concentração sérica de uréia, creatinina, transaminase glutâmica oxalacética (TGO) e
transaminase glutâmica pirúvica (TGP) foram comparadas entre e dentro dos grupos. As
amostras de sangue foram coletadas do plexo infraorbital em tubos com gel separador para
soro (Vacuette, São Paulo, Brasil) e centrifugadas a 3000 g e as análises bioquímicas foram
realizadas com o uso de kits disponíveis comercialmente (Labtest, Lagoa Santa, Minas
Gerais, Brasil). No final do período experimental, coração, pulmão, fígado, rins e baço
foram coletados de todos os grupos, fixados em formol, processados e corados para análise
51
histopatológica. Os valores de contagem total e diferencial de células sangüíneas obtidos
antes e após o tratamento foram comparados.
6.6 Microrganismos
Foram utilizadas 07 cepas de Candida albicans, 05 de Candida tropicalis, 10
de Microsporum canis, provenientes do estoque em ágar batata à -20ºC com DMSO 10%;
e 10 cepas de Malassezia pachydermatis, estocadas em ágar Dixon modificado, também a
temperatura de -20ºC. As cepas utilizadas foram provenientes do CEMM (Centro
Especializado em Micologia Médica), do Departamento de Patologia e Medicina Legal da
Universidade Federal do Ceará.
6.6.1 Recuperação das cepas
As cepas de Candida albicans, Candida tropicalis e Microsporum canis
estocadas em ágar batata acrescido de DMSO (10%) à –20 ºC foram descongeladas e
repicadas para um tubo contendo ágar batata. Estas foram incubadas a 28 ºC e observadas
diariamente por 04 dias, no caso das Candidas e 10 dias para os dermatófitos, com o
objetivo de verificar a presença de crescimento das colônias e, assim, confirmar a
viabilidade das cepas.
Da mesma forma, as cepas de Malassezia pachydermatis foram descongeladas
e um fragmento da colônia repicado para dois tubos de ensaio, um contendo, ágar Dixon
modificado e outro ágar batata. Os tubos contendo os inóculos foram incubados a 37 ºC e
52
observados diariamente por um período de até 10 dias, a fim de verificar o crescimento e a
manutenção da viabilidade das cepas.
6.6.2 Identificação laboratorial
6.6.2.1. Candida spp
A identificação laboratorial das espécies de Candida foi feito com o objetivo
de avaliar a viabilidade das cepas após a estocagem, mediante a união de uma série de
testes:
A. Prova do Tubo Germinativo - é um método simples que permite a distinção
entre a C. albicans ou C. dubliniensis, que são positivas para este teste, de outras espécies
de leveduras, consideradas tubo germinativo negativo.
B. Microscopia - o estudo micromorfológico das espécies de Candida é
possível através da prova do microcultivo. Esta é realizada em meio corn-meal-tween 80,
onde, sob baixa tensão de oxigênio, ocorre produção de conídeos e filamentação, sendo
possível sugerir a espécie, isso pela presença e disposição de blastoconídeos, hifas
verdadeiras e pseudo-hifas, que se distinguem de acordo com a espécie.
C. Assimilação de carboidratos - esta representa a habilidade que uma levedura
tem de crescer aerobicamente na presença de determinado carboidrato, fornecido como
única fonte de energia. A positividade é avaliada por meio da observação de halo de
crescimento da levedura em presença do carboidrato fornecido. Os açúcares utilizados são:
53
dextrose, maltose, sacarose, galactose, lactose, trealose, melobiose, L-arabinose, celobiose,
xilose, rafinose, dulcitol, ramnose, inulina, manitol, inositol, entre outros.
D. Assimilação de nitrogênio - determina a capacidade que uma levedura tem
de crescer aerobiamente na presença de um composto nitrogenado fornecido como fonte de
energia. Em meio ágar sólido, desprovido de qualquer fonte de nitrogênio e adicionado da
suspensão de levedura, são colocadas alíquotas de compostos nitrogenados. A positividade
será avaliada mediante o crescimento da levedura em presença do composto nitrogenado
fornecido. Geralmente, as fontes utilizadas são: a peptona, que será utilizada como controle
positivo, e o nitrato de potássio.
E. Fermentação de carboidratos - por esta prova, será avaliada a capacidade
que cada espécie de Candida tem de crescer, anaerobiamente, na presença de determinado
açúcar fornecido como única fonte de energia. A positividade será avaliada por intermédio
da produção de gás carbônico e alteração do pH. Os carboidratos geralmente utilizados
são: dextrose, maltose, sacarose, galactose, lactose e trealose.
6.6.2.2. Malassezia pachydermatis
Para a avaliação da viabilidade das cepas de Malassezia foram levados em
consideração os seguintes aspectos:
A. Características macroscópicas - as colônias de Malassezia spp., de uma
forma geral, apresentam textura glabrosa seca com coloração no tom de amarelo-creme.
54
B. Características microscópicas - a microscopia foi analisada por intermédio
da coloração de Gram. O que se observa são blastoconídeos com morfologia oval e
apresentando brotamento em colarete, podendo estar ou não associados a hifas curtas e
tortuosas.
C. Prova da urease - nesta prova, foi analisada a capacidade de o fungo
produzir a enzima urease, apresentado por algumas espécies deste gênero.
D. Assimilação do tween (20, 40, 60 e 80) - frente a este teste, a espécie poderá
ou não assimilar os diversos tween testados.
E. Repique para meios não ricos em lipídio - com o intuito de observar o
crescimento que definirá a espécie.
A capacidade do microrganismo produzir a enzima urease, assimilar o tween
40 e 80, e de crescer em meio pobre em lipídio, dentre todas as espécies do gênero, só é
observada na espécie que será estudada, a Malassezia pachydermatis.
6.6.2.3. Dermatófitos
Para avaliar a viabilidade das cepas fúngicas dermatofíticas, após terem sido
retiradas da micoteca, foram realizados alguns testes, dentre eles:
55
A. Macromorfologia - na análise das características macromorfológicas, foram
levados em consideração o relevo e a textura, bem como a presença ou ausência de
pigmento (Sidrim & Rocha, 2004).
B. Micromorfologia - o estudo micromorfológico foi feito a partir do
isolamento primário, sendo uma pequena alíquota da colônia retirada do ágar e montada
entre lâmina e lamínula com corante lactofenol azul-algodão. A montagem foi observada
em microscopia óptica em objetiva de 40X. Nestas preparações, podem ser visualizadas
estruturas de reprodução (macroconídios e microconídios), bem como estruturas de
ornamentação (hifas nodulares, pectinadas, entre outras).
C. Perfuração de pêlo - esta prova tem como objetivo visualizar se o fungo
perfura ou não o pêlo, in vitro. Este teste baseia-se em manter cabelos de crianças pré-
púberes esterilizados em ágar - gel, sendo alíquotas de fungos repicadas sobre o pêlo. O
teste foi considerado positivo quando foram observadas perfurações perpendiculares ao
longo do pêlo. Alguns fungos possuem enzimas capazes de degradar a queratina, in vitro,
como fonte de energia (Sidrim & Rocha, 2004).
D. Prova da urease - esta prova bioquímica é processada em meio de
Christensen e detecta a presença ou ausência de enzima urease produzida pelo fungo. O
resultado é considerado positivo quando houver a mudança do meio de amarelo para róseo
e será negativo quando o meio se mantiver amarelo (Sidrim & Rocha, 2004).
E. Prova de requerimento vitamínico - utilizada para diferenciação de cepas
baseadas em exigências nutricionais. Os meios de cultura utilizados foram enriquecidos
com ácido nicotínico, tiamina, histidina e inositol, sendo a base do ágar T1 ao T5 a caseína
e do ágar T6 e T7 o nitrato de amônia (Sidrim & Rocha, 2004).
56
6.7 Atividade antifúngica
6.7.1 Método de difusão em ágar
A atividade contra dermatófitos e leveduras dos extratos das plantas foi
qualitativamente medida pelo método de difusão em ágar (Camm et al., 1975; Cole, 1994),
onde, o inóculo dos dermatófitos e das leveduras foram adicionados às placas de Petri com
ágar batata com o auxílio de um swab. Um pequeno poço foi feito no centro da placa
usando uma pipeta Pasteur e 100 µL do óleo essencial das plantas juntamente com seu
diluente (óleo mineral) e os controles negativos com água destilada foram adicionados aos
poços nas concentrações de 5%, 10% e 20%; os controles positivos para as leveduras
foram a anfotericina B e o itraconazol enquanto que para as cepas de M. canis, foi utilizada
a griseofulvina. As placas foram guardadas a temperatura ambiente e a leitura foi feita após
07 dias. O diâmetro da zona de inibição ao redor do poço foi medido e registrado nas
quatro direções diferentes.
57
Resultados
58
7 RESULTADOS
7.1 Análise dos óleos essenciais
A análise química do óleo essencial das três espécies de Croton e da Lippia
sidoides está mostrada na tabela 1. No óleo essencial do Croton nepetaefolius, observou-se
em maior quantidade a presença de metil-eugenol (15,73%) e biciclogermacreno (14,08%).
O Croton argyrophylloides apresentou o spathulenol (20,33%) e biciclogermacreno
(11,72%) em maiores proporções, enquanto que o Croton zehntneri mostrou o estragol
(72,85%) e o anetol (14,32%) em maiores quantidades. A Lippia sidoides apresentou o
timol (59,65%) e o cariofileno (10,60%) em maiores proporções.
59
Tabela 2: Análise química das três espécies de Croton e da Lippia sidoides
Composição (%) K.I. Componentes C. a. C. n. C. z. L. s.
931 .-Thujene - - - 1.48 939 .-Pinene 5.55 - - 0.51 976 Sabineno 4.68 - - - 991 Myrceno - - 0.43 5.43 1018 .-Terpinene - - - 1.43 1026 Para Cymene - - - 9.08 1031 Limonene - - - 1.01 1033 1,8-Cineole 11.22 8.00 0.59 - 1050 E-�-Ocimene - - 0.38 0.27 1062 G-Terpinene - - - 3.83 1098 Linalool - - - 0.28 1171 Umbellulone - - - 0.46 1189 .-Terpineol - 3.54 - - 1196 Methyl chavicol - - 72.85 - 1235 Methyl Thymylether - - - 1.79 1285 Anethole - - 14.32 - 1290 Thymol - - - 59.65 1298 Ortho-Vanillin - 5.04 - - 1339 /-Elemene - - 0.16 - 1376 .-Copaene - - - 0.66 1391 �-Elemene 6.24 3.72 0.32 - 1404 Methyl-Eugenol - 15.73 - - 1413 E- .-Bergamotene - 4.56 - - 1419 E-Caryophyllene 5.67 11.38 1.63 10.60 1435 E- .-Bergamotene - 9.09 0.22 - 1439 Aromadendrene - 3.35 - 0.53 1455 .-Humulene - 5.90 0.16 0.56 1459 Dehidroaromadendrane - - - 0.91 1461 Alloaromadendreno - - 0.27 - 1480 Germacrene-D - - 0.93 - 1485 �-Selinene 3.16 - - - 1500 Bicyclogermacrene 11.72 14.08 5.12 - 1505 Cupareno - - 0.17 - 1506 �-Bisabolene - 2.95 0.24 - 1524 / -Cadinene - - 0.20 0.35 1578 Spathulenol 20.33 4.28 0.64 - 1581 Caryophyllene Oxide - 4.37 - 0.72 1593 Veridiflorol - - 0.32 - KI – índice de retenção na coluna do cromatógrafo. Ca = Croton argyrophylloides, Cn = Croton nepetafolius, Cz = Croton zenhtneri, Ls =
Lippia sidoides.
60
7.2 Atividade antimicrobiana
Os óleos essenciais do Croton nepetaefolius e do Croton argyrophylloides
demonstraram atividade apenas contra o M. canis (figuras 6 e 8). No entanto, os óleos
essenciais do Croton zehntneri e da Lippia sidoides apresentaram atividade contra todos os
fungos testados (tabelas 3, 4 e 5). O óleo essencial do Croton nepetaefolius foi o menos
efetivo, apresentando atividade antifúngica apartir da concentração de 50 mg/ml, enquanto
que o Croton argyrophylloides e o Croton zehntneri (figura 9) inibiram o crescimento do
fungo em todas as doses testadas. As zonas de inibição de crescimento foram relativamente
grandes e com o aumento das concentrações mostraram dose-dependência. Por outro lado,
o óleo essencial da L. sidoides (figura 7) foi claramente mais potente que os óleos
essenciais das espécies de Croton, apresentando grande zona de inibição de crescimento na
menor concentração quando comparado com a máxima resposta obtida com os óleos dos
Croton. Na concentração �����PJ�PO�R�yOHR�HVVHQFLDO�GD�L. sidoides inibiu totalmente o
crescimento do Microsporum canis (tabela 3). Quando comparado com a griseofulvina (1
mg/ml), droga usada como controle positivo, todas as espécies de Croton mostraram baixo
crescimento da zona de inibição. Os valores das médias do crescimento das zonas de
inibição nas maiores concentrações do C. nepetaefolius, C. argyrophylloides e C. zehntneri
e da griseofulvina foram 19,8 ± 7,2; 31,2 ± 9,9; 22 ± 7,3 e 51,6 ± 6,7, respectivamente
(tabela 3).
O óleo essencial do C. nepetaefolius e do C. argyrophylloides foram
inofensivos contra Candida spp mesmo nas mais altas concentrações. A adição destes
óleos nas concentrações de 100 mg/mL não induziu nenhuma inibição no crescimento do
fungo (tabela 4). Por outro lado o C. zehntneri e L. sidoides foram efetivos contra a
Candida spp, sendo a L. sidoides mais potente, e em concentrações superiores a 25 mg/ml
ela apresentou maiores zonas que o controle positivo, anfotericina B (tabela 4). A máxima
inibição da zona de crescimento medido em milímetros para C. zehntneri, L. sidoides e
anfotericina B foi 12,6 ± 1.1; 23,2 ± 1,8 (p<0,05 C. zehntneri e anfotericina B) e 10,8 ±
1,5, respectivamente.
61
Similarmente, os óleos essenciais do C. nepetaefolius e do C. argyrophylloides
foram inofensivos contra Malassezia pachydermatis. A incubação destes óleos na
concentração de 100 mg/ml novamente foi inofensivo e não demonstrou nenhum efeito no
crescimento do fungo. Contudo, a incubação do C. zehntneri e mais eficientemente da L.
sidoides induziram zonas de inibição de crescimento do fungo de forma dose-dependente.
Na concentração de 100 mg/ml a L. sidoides induziu uma inibição total do crescimento do
fungo com maiores zonas de inibição que do itraconazol (controle positivo) em
concentração acima de 25 mg/ml (tabela 5). As zonas máximas de inibição do C. zehntneri
e do itraconazol foram 22,6 ± 6,7 e 29,7 ± 9,0, enquanto a L. sidoides tem similar zona na
concentração de 25mg/ml e 41,2 ± 9,5 (p<0,05 vs. C. zehntneri e itraconazol) a 50 mg/ml
(tabela 5).
Tabela 3: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides contra M. canis
Zona de inibição de crescimento (mm)
Espécie de fungo dermatofítico - Microsporum canis
Drogas
25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml (1 mg/ml)
Croton nepetaefolius 10.2±1.7 18.6±4.6a 18.7±4.2a 19.8±7.2a - Croton argyrophylloides 14.8±4.0 21.1±4.2a 26.2±5.5a 31.2±9.9b -
Croton zehntneri 11.8 ±3.0 16.8±5.8 18.7±4.4 22±7.3a - Lippia sidoides 33.4±12.4c IT IT IT -
Griseofulvina - - - - 51.6 ± 6.7d
IT= Inibição total do crescimento do fungo a p<0.05 vs. 25mg/ml b p<0.05 vs. 50 mg/ml c p<0.05 vs. Croton species tested at 25 mg/ml d p<0.05 vs. Todas as concentrações das espécies de Croton testadas e L. sidoides em 25 mg/ml
62
Tabela 4: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides contra Candida spp.
Zona de inibição de crescimento (mm)
Espécie de fungo leveduriforme – Candida spp.
Drogas 25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml (5 �g/ml)
Croton nepetaefolius NI NI NI NI - Croton argyrophylloides NI NI NI NI -
Croton zehntneri 7.4±1.1 9.0±1.4 10.0±1.5 12.6±1.1 - Lippia sidoides 9.8±0.9 16.4±2.1a 21.5±4.2a,b 23.2±1.8a,b -
Anfotericina B - - - - 10.75 ± 1.5 NI= Não ocorreu inibição do crescimento do fungo a p<0.05 vs. 25mg/mL b p<0.05 vs. Anfotericina B
Tabela 5: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides contra M. pachydermatis
Zona de inibição de crescimento (mm)
Espécie de fungo leveduriforme – Malassezia pachydermatis
Plants
25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml (8 �g/ml)
Croton nepetaefolius NI NI NI NI - Croton argyrophylloides NI NI NI NI -
Croton zehntneri 11.6 ± 2.9 13.2 ± 2.7 17.2 ± 3.9a 22.6 ± 6.7a - Lippia sidoides 30.0 ± 10.0 41.2 ± 9.5b 50.0 ± 8.3a,b IT -
Itraconazol - - - - 29.7 ± 9.0 IT= Inibição total do crescimento do fungo NI= Não ocorreu inibição no crescimento do fungo a p< 0.05 vs. 25 mg/mL b p< 0.05 vs. Itraconazol
63
Figura 6: Halo de inibição produzido pela maior concentração (100 mg/mL) de OECa testada, perante cepa de Microsporum canis.
(Fonte: Fontenelle, 2005)
(Fonte: Fontenelle, 2005)
Figura 7: Halo de inibição produzido pela menor concentração (25 mg/mL) do OELs perante cepa de Microsporum canis.
(Fonte: Fontenelle, 2005)
Figura 8: Halo de inibição produzido pela maior concentração do OECn (100mg/mL) perante cepa de Microsporum canis.
64
7.3 Toxicidade
A administração dos óleos essenciais nas doses de 100 a 3000 mg/kg não
induziu uma notável alteração no comportamento padrão dos ratos. Todos os óleos
essenciais induziram miotonia, taquipnéia e dispnéia. A DL50 calculada foi de 168,6
(160,5-176,7) mg/kg para o Croton argyrophylloides de 163.8 (155.3-172.3) mg/kg para o
Croton nepetaefolius e de 117,95 (110,61-125,29) mg/kg para a Lippia sidoides. O Croton
zehntneri não apresentou toxicidade nas concentrações testadas for i.p. administração e
depois da administração oral nenhum óleo essencial demostrou toxicidade até 3 g/kg.
Além disso a avaliação toxicológica do óleo essencial, mais eficiente, com
atividade antifúngica, que também foi o mais abundante, foi administrado durante 30 dias
por gavagem, oralmente, nas doses correspondente a DL50 estimado pela rota
intraperitoneal. A administração subcrônica do óleo essencial da L. sidoides foi destituído
de toxicidade. O peso corporal não foi afetado pelo tratamento, estando com 322,9 ± 18,96
g no primeiro dia e 328,3 ± 22,67 g no 30o. dia quando comparado com o veículo de
tratamento dos animais 331,1 ± 24.0 g vs. 357,2 ± 21,2 (p>0,05) (tabela 6).
(Fonte: Fontenelle, 2005)
Figura 9: Halo de inibição produzido pela maior concentração (100mg/mL) do OECn perante cepa de Microsporum canis.
65
Tabela 6: Peso dos ratos após tratamento com 117,95 mg/kg de óleo essencial da Lippia
sidoides durante 30 dias.
Grupo Peso inicial Peso final Tratado com Lippia sidoides 322,9 ± 18,96 g 328,3 ± 22,67 g
Controle 333,1 ± 24,.02 g 357,2 ± 21,19 g
Os parâmetros bioquímicos analisados, creatinina, uréia e TGO e TGP, não
foram significativamente afetados (tabela 7). Os perfis séricos dos vários marcadores não
foram alterados quando comparados com o controle interno, i.e., os valores obtidos antes
dos tratamentos ou com os grupos tratados com salina (tabela 8). Adicionalmente a
avaliação histopatológica do fígado, rins, pulmões, coração e baço não revelou alterações
na estrutura padrão dos tecidos estudados. Por isso, a administração da DL50 do óleo
essencial da Lippia sidoides a ratos durante 30 dias não induziu manifestações significantes
sistêmicas de toxicidade. Similarmente, os perfis hematológicos de ratos Wistar não foram
significativamente afetados.
Tabela 7: Parâmetros Bioquímicos de ratos Wistar antes do tratamento, após 15 dias e 30 dias do tratamento com 117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia sidoides ou veículo.
Parâmetros Bioquímicos/Toxicidade Sub Crônica
Grupo Uréia Creatinina TGO TGP
Antes de OELs
88,71 ± 19,85 (n=10)
0,87 ± 0,09 (n=10)
100,2 ± 15,89 (n=10)
52,1 ± 9,98 (n=10)
OELs (15 dias)
55,96 ± 4,87 (n=09)
0,87 ± 0,16 (n=08)
125,7 ± 10,33 (n=09)
55,54 ± 9,15 (n=09)
OELs (30 dias)
46,56 ± 8,65 (n=09)
0,84 ± 0,06 (n=09)
135,3 ± 12,94 (n=09)
41,86 ± 10,52 (n=09)
Antes do veículo
51,8 ± 18,65 (n=10)
1,04 ± 0,05 (n=10)
138,3 ± 15,89 (n=10)
37,02 ± 13,68 (n=10)
Veículo (15 dias)
64,4 ± 9,53 (n=10)
0,89 ± 0,13 (n=10)
120,3 ± 10,33 (n=10)
66,36 ± 13,77 (n=10)
Veículo (30 dias)
48,4 ± 7,68 (n=10)
0,97 ± 0,15 (n=10)
122,2 ± 12,94 (n=10)
50,25 ± 14,25 (n=10)
66
Tabela 8: Parâmetros hematológicos de ratos Wistar antes e depois de tratamento oral com 117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia sidoides ou veículo durante 30 dias.
Dia zero 30 dias após tratamento com OELs
Parâmetros Média ± EP IC (95%) Média ± EP IC (95%)
Hemáceas MM3 3,6 ± 1,75 3,5 – 3,7 3,5 ± 178000 3,3 - 3.,6
Hemoglobina g/dL 8, 9 ± 1,3 8,08 – 9,69 8,4 ± 1,28 7,47 – 9,32
Hematócrito % 28,7 ± 1,2 27,84 – 29,62 28,45 ± 1,17 27,61 – 29,29
Leucócitos totais 6820 ± 877 6121 - 7519 6590 ± 967,8 5898 - 7282
67
Discussão
68
8 DISCUSSÃO
Os óleos essenciais são fontes potenciais de componentes antimicrobianos
(Lemos et al., 1990; Souza et al., 2003; Gurgel et al., 2005; Phongpaichit et al., 2005;
Yayli et al., 2005). Os resultados de pesquisas anteriores, contudo, dificilmente podem ser
correlacionados com estudos atuais, visto que os métodos empregados para testar a
atividade destes compostos não são padronizados. A composição dos óleos essenciais varia
grandemente na dependência da região geográfica, devido a variedade e idade da planta,
bem como pelo método de secagem e de extração empregados (Jerkovic et al., 2001).
Nosso estudo mostrou que o óleo essencial do Croton zehntneri e da Lippia
sidoides foram efetivos contra Microsporum canis, uma das mais comuns espécies de
dermatófito causador de infecções fúngicas superficiais em humanos, gatos e cachorros
(Brilhante et al., 2005; Sidrim & Rocha, 2004; Brilhante et al., 2005a,b).. Eles também
foram ativos contra foram ativos contra Candida spp. e Malassezia pachydermatis, que são
leveduras importantes, envolvidas em micoses de humanos e animais (Sidrim & Rocha,
2004). Os óleos essenciais do C. argyrophylloides e C. nepetafolius foram pouco efetivos
e não mostraram um perfil de concentração-relação.
Os maiores componentes dos óleos essenciais que foram mais eficientes com
relação à atividade antifúngica foram identificadas como o estragol e o anetol para o C.
zehntneri e o timol para a L. sidoides.
A ausência de atividade contra leveduras pelos óleos essenciais do C.
argyrophylloides e C. nepetafolius contrastando com a eficácia do C. zehntneri e da L.
sidoides pode ser explicada pela presença do estragol e do anetol em altas quantidades no
C. zehntneri e do timol na L. sidoides. Estes componentes não estão presentes no óleo
essencial do C. argyrophylloides e do C. nepetafolius e tais compostos foram previamente
registrados por serem efetivos como antifúngico incluindo leveduras (?).
69
Lopes Júnior et al. (2005) determinaram que o óleo essencial do Croton
zehntneri tinha ação antibacteriana contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli e
Klebisiella pneumoniae, bem como ação antifúngica contra Cryptococcus neoformas e
Candida albicans. No presente estudo, o estudo fitoquímico feito com o óleo essencial do
Croton zehntneri usado, demonstrou a presença de estragol e anetol, sendo este último uma
substância que previamente mostrou atividade antifúngica (Lopes Júnior et al., 2005).
Lacoste et al., 1996 registraram o potencial antimicrobiano da L. sidoides contra
microrganismo da microflora da pele, bem como seus principais componentes, timol e
carvacrol (Lacoste et al., 1996)
O presente estudo revelou que a administração por até 30 dias de uma dose
correspondente a DL50 não afetou qualquer parâmetro bioquímico, hematológico ou
histopatológico estudado. Uma vez que o OELs está sendo testado quanto a sua eficácia
antifúngica e quanto a sua segurança com relação ao tratamento, o período de
administração é suficiente para comprovar que este óleo essencial é seguro para
administração oral em protocolos com dosagens simples ou repetidas como proposta
terapêutica até o limite da DL50.
A contagem de células vermelhas do sangue também foi normal após
tratamento durante 30 dias com OELs e nenhuma alteração foi observada no hematócrito
ou valores de hemoglobina. As plaquetas também permaneceram inalteradas em número e
forma. Por isso, é improvável que a administração por longo prazo de OELs cause danos
diretos nas células sangüíneas, na medula óssea ou anormalidades na absorção ou
incorporação de nutrientes necessários para a eritropoiese, pelo menos em grau suficiente
para causar anemia. Similarmente, a administração durante 30 dias de OELs não causou
efeitos significantes na contagem total ou diferencial das células sangüíneas da linhagem
branca. Assim, estes efeitos dão suporte à falta de efeitos tóxicos induzidos por OELs
diretamente nas células sangüíneas e nenhum dano direto à medula óssea. Além do mais,
uma atividade imunodepressora deste extrato é também improvável.
70
Os resultados sugerem a importância e a necessidade de pesquisas do potencial
no uso dos os óleos essenciais no tratamento de infecções fúngicas. O pequeno número de
antifúngicos disponíveis para o tratamento de micoses, a maioria fungistáticos, juntamente
com a resistência emergente induz a pesquisa de terapêuticos alternativos combinado com
o baixo custo e baixa toxicidade, como os óleos essenciais.
Os resultados deste estudo explicam e justificam, em parte, o uso popular
destas plantas para o tratamento de micoses e destacam o potencial antifúngico que podem
ser explorados para propósitos terapêuticos como uma alternativa para o tratamento de
micoses superficiais.
Os óleos essenciais do C. zehntneri e da L. sidoides podem ter uma eficiente
aplicação como medicamento tópico para a pele no o tratamento de infecções fúngicas e
bacterianas superficiais, particularmente em micoses cutâneas.
71
Conclusões
72
9 CONCLUSÕES
1 Os óleos essenciais do Croton zehntneri e da Lippia sidoides apresentaram
atividade contra cepas de M. canis, Candida spp e Malassezia pachydermatis;
2 os óleos essenciais do Croton nepetaefolius e do Croton argyrophylloides
demonstraram atividade apenas contra o M. canis;
3 a administração, por longo prazo, de OELs é relativamente segura e,
provavelmente, desprovida de toxicidade significativa;
4 os óleos essenciais das plantas estudadas constituem fontes importantes de
compostos antifúngicos que podem ser úteis no tratamento de micoses em
animais.
73
10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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82
Anexo
Artigo científico
83
JOURNAL OF ETHNOPHARMACOLOGY
ANTIFUNGAL AND TOXICOLOGIAL EVALUATION OF ESSENTIAL
OILS FROM NORTHEAST BRAZIL
R. O. S. Fontenelle1; S. M. Morais1.4. * ; E. H. S. Brito1; M. R. Kerntopf1; R. S. N.
Brilhante2; A. J. Monteiro5; A. R. Tomé1; M. G. R. Queiroz6; N. R. F. Nascimento1;
J.J.C. Sidrim 2; M. F. G. Rocha1.2.
1Faculty of Veterinary; Post-Graduation Program in Veterinary Sciences; State
University of Ceará. Fortaleza – CE. Brazil.
2Departament of Pathology and Legal Medicine. Faculty of Medicine. Medical
Mycology Specialized Center. Federal University of Ceará. Fortaleza – CE. Brazil.
3Departament of Biology. State University of Ceará. Fortaleza – CE. Brazil.
4Departament of Chemistry. State University of Ceará. Fortaleza – CE. Brazil.
5Departament of Statistics. Federal University of Ceará. Fortaleza – CE. Brazil.
6Departament of Clinical Biochemistry. College of Pharmacy, Federal University of
Ceará. Fortaleza – CE. Brazil.
84
Author for correspondence: Selene Maia de Morais. Rua Ana Bilhar. No. 601. Apto
400: Meireles. CEP: 60 160-110. Fortaleza. CE. Brazil. Phone: 55 (85) 3232-3834.
Fax: 55 (85) 3495-8692. E. mail: selene@uece.br
85
Abstract
Mycoses are serious public health concern specially in subtropical and tropical regions
with dermatophytes and yeast infections being the most common pathogens. This work
was undertaken in order to test whether essential oils extracted from the leaves of Croton
species (Croton nepetaefolius, Croton argyrophylloides and Croton zehntneri) or from
Lippia sidoides would represent a potential therapeutic alternative for this infectious
threats. This plants are used in the folk medicine to treat dermatological problems and we
tested them in vitro against several strains of Microsporum canis, Candida albicans,
Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis and also evaluated its acute and sub-
chronic toxicological effects. The chemical constituents of the essential oils were
determined by GL-Chromatography coupled to mass espectroscopy. The essential oils
obtained from Croton nepetaefolius and Croton argyrophylloides were effective only
against M. canis while the essential oils of Croton zehntneri and Lippia sidoides were
effective against all tested strains in a dose-related way. Lippia sidoides was the most
efficient being at the higher doses used (i.e. 75 and 100 mg/mL) as effective as the
positive controls used griseofulvin for M. canis, itraconazol for M. pachydermatis and
amphotericin B. Lippia sidoides essential oil at these doses sometimes completely inhibited
fungi growth. This essential oil has thymol (59.6%) and caryophyllene (10.6%) as major
constituents. The acute administration of all essential oils up to 3 g/Kg by the oral route to
mice was devoided of overt toxicity. The oral administration of 100 mg/Kg to rats during
30 days did not induce histopathological, haemathological or serum biochemical
alterations. Therefore, due to its high efficacy and low toxicity the essential oils of Croton
zehntneri and Lippia sidoides are promising drugs in the search of new antifungal drugs.
Key-words:Croton spp, Lippia sidoides, dermatophytes, yeasts, antifungal activity.
86
Introduction
Mycoses constitute a common health problem, especially in tropical and
subtropical developing countries; dermatophytes and Candida spp. being the most
frequent pathogens. In recent years, there has been a quest for new antifungal
compounds due to lack of efficacy, side effects, and resistance associated with the
existing drugs. Much attention has been drawn to plant-derived fungicides, based on
the knowledge that plants have their own defense against fungal pathogens. Plants are
capable of sensing the presence of potential phytopathogens including fungi and can
produce antifungal compounds to protect themselves from biotic attack, that could be
essential against fungal infection (Wojtaszek, 1997).
Essential oils obtained from many plants have recently gained popularity and scientific
interest. Many plants have been used for different purposes, such as food, drugs and
perfumery (Fostel and Lartey, 2000; Giordani et al, 2001).
Researchers have been interested in biologically active compounds isolated from
plants species for the elimination of pathogenic microorganisms, because of the
resistance that microorganisms have built against many synthetic antibiotics (Essawi &
Srour, 2000; Gurgel et al., 2005). In traditional medicine, many essential oils were
claimed to be effective against fungal pathogens and therefore, research on this field
may lead to the development of effective drugs against pathogenic fungi (Ezoubeiri et
al., 2003; Rasooli et al., 2005; Gurgel et al., 2005; Yayli et al., 2005; Baldovini et al.,
2005).
Widely spread in Brazilian Northeast flora, mainly in the caatinga region, Croton
species are used for several indication in the folk medicine (Lorenzi and Matos, 2002).
Some pharmacological activities of Croton essentil oils were validated such as intestinal
87
antispasmodic for C. nepetaefolius and C. zehntneri, (Magalhães et al., 1998 and 2003),
antimicrobial for C. argyrophylloides (De Albuquerque et al., 1974) and
antihypertensive for C. nepetaefolius (Lahlou et al., 1999).
On the other hand, Lippia sidoides Cham. is a Verbenaceae known as “alecrim-
pimenta” used in folk medicine (the aerial parts) as antiseptic. The essential oil
extracted from the leaves, which has thymol and carvacrol as major constituents, was
shown in preliminary studies, to have bactericidal and antifungal activity (Lemos et al.,
1990) as well as larvicidal activity against Aedes aegypti Linn (Carvalho et al., 2003).
The specific aim of the present study was to examine, in vitro, the antifungal activity of
essential oils from C. nepetaefolius, C. zehntneri, C. argyrophylloides and Lippia
sidoides against Microsporum canis, Malassezia pachydermatis, Candida albicans and
Candida tropicalis, as well as study its chemical composition and evaluate acute and
subchronic toxicity in mice and rats.
2. Materials e Methods
2.1. Botanic identification
Croton species (Croton nepetaefolius, Croton argyrophylloides and Croton zehntneri)
and Lippia sidoides were haversted in Viçosa-Ceará, Brazil located at 3Û��¶��¶¶�6�(latitude) and e 41Û��¶��¶¶�:��ORQJLWXGH���LGHQWLILHG�E\�ERWDQLVWV�DW�WKH�3ULVFR�%H]HUUD�Herbarium in the Departament of Biology of the Federal University of Ceará where a
voucher sample is deported at the references number #32448, #32444, #32446 and
#25149, respectively.
88
2.2. Essential oil extraction
The essential oil from the three Croton species studied (Croton nepetaefolius, Croton
argyrophylloides and Croton zehntneri) was extracted by steam distillation in a
clevenger apparatus (Craveiro et al., 1979).
2.3. Chemical analysis of the essential oil
The chemical composition of the essential oil was determined by GL-Chromatography
coupled to mass espectroscopy performed on a Hewlett – Packard 5971 CG/MS
instrument employing the following conditions: polydimethylsiloxano-DB-5 (30 mm x
0.25 �m film thickness) fused silica capillary column; the carrier gas was helium
(1mL/min). The column temperature ranged from 35 to 180�&�PLQ��DW���&�PLQ��WKem
from 180 to 280�&��DW����&�PLQ��PDVV�HVSHFWUR�ZDV�REWDLQHG�E\�HOHWURQLF�LPSDFW����eV. The identification of constituents was done by using computer-based library search,
with retention indices and visual interpretation of the mass spectro (Adams, 2001).
2.4. Antifungal Activity
The fungi employed in this study (Candida albicans {n=05}, Candida tropicalis
{n=03}, Malassezia pachydermatis {n=10} and Microsporum canis {n=10}) were
obtained from the culture collection of the Specialized Center of Medical Mycology,
Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil.
The antifungal activity of essential oils from Croton spp. and from Lippia
sidoides were evaluated against dermatophytes and yeast by the agar-well diffusion
89
method (Camm et al., 1975; Cole, 1994). Briefly, Petri dishes (diameter, 15 cm) were
prepared with Potato Dextrose Agar (Biolab); all oils were weighed and dissolved in
mineral oil to obtain test concentrations of 25, 50, 75 and 100 mg/ml. Griseofulvine,
itraconazole and Anfotericine B were used as positive controls. These drugs were
dissolved in saline at concentration of 0.005mg/ml, 0.008mg/ml and 1mg/ml,
respectivelly. Each fungal strain was suspended in sterile saline and diluted at 1x106 -
5x106 colony forming unit (cfu) per ml. They were “flood-inoculated” onto the surface
of agar of the dish. The wells (6 mm in diameter) were cut from the agar and 0.100 ml
of essential oil were delivered into them. After incubation during 3-5 days for yeasts
and 5-8 days for M. canis, at 28Û&��DOO�dishes were examined for any zones of growth
inhibition and diameters of these zones were measured in milimeters.
2.5. Acute and subchronic toxicity
The essential oil was administered to albino Swiss (Mus musculus) mice
weighing 20-30g by oral route or intraperitoneally at doses ranging from 100 to 3000
mg/kg (n=10 per group). The results obtained were compared to those for animals
treated with Tween 80 (3% in saline v/v; 0.1 ml/100g). The Lethal Dose 50 (LD50) was
calculed by the probit method (Miller and Tainter, 1944) by using SPSS 7.0 for
windows. The animals were observed for an additional period of 1 h and the general
effects were noted in a table modified from Malone (Malone and Robichaud, 1962).
Since, in preliminary studies, the essential oil of Lippia sidoides was shown
to be more potent and efficacious against all tested fungi strains and it was the most
available we decided to study its toxicological (hematological, histopathological and
serum biochemistry in rats by 30 days oral administration. For this, Wistar rats from
90
both sexes were separated in two groups (n=10/group) and treated with 117.95
mg/Kg/dia Lippia sidoides essential oil or Tween 3% in saline (v/v) by oral gavage.
Blood samples were collectd by punction in the infraorbital plexus at day 0 (one day
before starting oil or vehicle administration) and then in day 15 and 30. The serum
concentration of urea, creatinine, glutamic oxalacetic (GOT) and piruvic transaminases
(GPT) were determined by using commercially kits (Labtest, Lagoa Santa, MG, Brazil)
and compared inside and between groups.
At the end of the experimental period (30 days), histopathological analysis of
heart, lungs, liver, kidneys and spleen were performed by optical microscopia.
Additionaly, the blood samples collected at day 0 and 30 were used for hematological
examination for red blood cell count, hemoglobin, hematocrit, mean corpuscular
hemoglobin and white blood cell count. The values obtained were compared inside and
between groups.
.2.5. Statistical analysis
The antifungal activity was expressed as mean ± SD of the diameter of zones of
growth inhibition (mm). The antifungal activity of essential oils were analysed by linear
correlation for individual analysis and bicaudal paired Student's t Test to evaluate
differences among essential oils and against positive control.
The LD50 and 95% confidence intervals were calculated using SPSS 1.0 for
Windows. The data obtained from subchronic toxicological studies were expressed as
mean ± 95% confidence intervals and data range. The differences inside and between
groups were evaluated by the analyses of variance ANOVA followed by the correction of
Tukey-Kramer with significance level set at 5%.
91
3. Results
3.1. Chemical composition of the essential oils
The chemical analysis of the three species of Croton studied and Lippia sidoides
are shown in table 1. Croton nepetaefolius has methyl-eugenol (15.73%) e
bicyclogermacrene (14.08%) as major constituents, while Croton argyrophylloides
presented spathulenol (20.33%) and biciclogermacrene (11.72%) as main components.
Croton Zehntneri analysis revealed estragol (72.85%) and anethol (14.32%) as major
constituents.
The essential oil of Lippia sidoides has thymol (59.65%) and caryophyllene
(10.60%) as major compounds.
92
Table 1. Chemical analysis of three Croton species and Lippia sidoides
essential oil
Composition (%) K.I. Components C. argyrophylloides C. nepetaefolius C. zehntneri Lippia
sidoides
931 ù-Thujene - - - 1.48 939 ù-Pinene 5.55 - - 0.51 976 Sabineno 4.68 - - - 991 Myrceno - - 0.43 5.43 1018 ù-Terpinene - - - 1.43 1026 Para Cymene - - - 9.08 1031 Limonene - - - 1.01 1033 1,8-Cineole 11.22 8.00 0.59 - 1050 E-�-Ocimene - - 0.38 0.27 1062 G-Terpinene - - - 3.83 1098 Linalool - - - 0.28 1171 Umbellulone - - - 0.46 1189 ù-Terpineol - 3.54 - - 1196 Methyl chavicol - - 72.85 - 1235 Methyl Thymylether - - - 1.79 1285 Anethole - - 14.32 - 1290 Thymol - - - 59.65 1298 Ortho-Vanillin - 5.04 - - 1339 û-Elemene - - 0.16 - 1376 ù-Copaene - - - 0.66 1391 ú-Elemene 6.24 3.72 0.32 - 1404 Methyl-Eugenol - 15.73 - - 1413 E- .-Bergamotene - 4.56 - - 1419 E-Caryophyllene 5.67 11.38 1.63 10.60 1435 E- .-Bergamotene - 9.09 0.22 - 1439 Aromadendrene - 3.35 - 0.53 1455 ù-Humulene - 5.90 0.16 0.56 1459 Dehidroaromadendrane - - - 0.91 1461 Alloaromadendreno - - 0.27 - 1480 Germacrene-D - - 0.93 - 1485 ú-Selinene 3.16 - - - 1500 Bicyclogermacrene 11.72 14.08 5.12 - 1505 Cupareno - - 0.17 - 1506 ú-Bisabolene - 2.95 0.24 - 1524 û -Cadinene - - 0.20 0.35 1578 Spathulenol 20.33 4.28 0.64 - 1581 Caryophyllene Oxide - 4.37 - 0.72 1593 Veridiflorol - - 0.32 -
93
3.2. Antimicrobial activity
The essential oils from C. nepetaefolius and C. argyrophylloides were only
effective against M. canis. Nevertheless, the essential oils from Croton zehntneri and
Lippia sidoides were effective against all tested fungi strains (table 2, 3 and 4). In this
regard, C. nepetaefolius essential oil was the least effective with saturation of maximal
antifungal activity achieved in the concentration of 50 mg/mL while C. argyraphylloides
and C. zenhtneri inhibited fungal growth in a dose-related fashion. The zones of growth
inhibition were larger with increasing doses showing dose-dependency. On the other hand,
L. sidoides essential oil was clearly more potent than Croton essential oil with higher
growth inhibition zones in the lower concentration when compared with maximal response
obtained with Croton oils. In concentrations ≥ 50 mg/mL L. sidoides essential oil totally
inhibited M. canis growth in culture (table 2). When compared to the positive control drug
used, i.e., griseofulvin (1 mg/mL) all Croton species showed lower maximal growth
inhibition zones. The mean values of growth inhibition zones for the higher concentration
of C. nepetafolius, C. argyraphylloides and C. zehntneri and for griseofulvin were 19.8 ±
7.2, 31.2 ± 9.9, 22 ± 7.3 and 51.6 ± 6.7, respectively (table 2).
Surprisingly, the essential oil obtained from C. nepetafolius or C. argyraphylloydes
were innefective against Candida spp. even in higher concentrations. The addition of these
oils up to 100 mg/mL did not induced any inhibition of fungal growth (table 3). On the
other hand, C. zenthtneri and Lippia sidoides were effective against this strain with L.
sidoides being more potent and in concentrations above 25 mg/mL with higher zones than
the positive control amphotericin B (table 3). The maximal inhibition of fungal growth
measured as zones of inhibition in milimeters for C. zenthneri, L. sidoides and
94
amphotericin B were 12.6±1.1, 23.2±1.8 (p<0.05 vs. C. zenthneri and amphotericin B) and
10.8±1.5, respectively.
Similarly, C. nepetafolius and C. argyraphylloides essential oils were ineffective
against Malassezia pachydermatis. The incubation of these oils up to 100 mg/mL agains
was devoided of any effect in fungal growth. Although, the incubation of C. zenthneri and
most efficiently L. sidoides essential oil induced a dose-related inhibition of fungal growth.
At 100 mg/mL concentration L. sidoides induced a total inhibition of fungal growth in
culture with higher zones than itraconazole (positive control) in concentrations above 25
mg/mL (table 4). The maximal zones of inhibition for C. zenthneri and itraconazole were
22.6±6.7 and 29.7±9.0 while L. sidoides had similar zones at 30 mg/mL concentration and
41.2±9.5 (p<0.05 vs. C. zenthneri and itraconazole) at 50 mg/mL (table 4).
95
Table 2 Antifungal activity of the essential oil from Croton species and of the Lippia sidoides against M. canis in agar-well diffusion assay
Growth inhibition zones (mm)
Dermatophytic fungal specie - Microsporum canis
Drugs
25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml (1 mg/ml)
Croton nepetaefolius 10.2±1.7 18.6±4.6a 18.7±4.2a 19.8±7.2a - Croton argyrophylloides 14.8±4.0 21.1±4.2a 26.2±5.5a 31.2±9.9b -
Croton zehntneri 11.8 ±3.0 16.8±5.8 18.7±4.4 22±7.3a - Lippia sidoides 33.4±12.4c TI TI TI -
Griseofulvin - - - - 51.6 ± 6.7d
TI= Total inhibition of fungal growth a p<0.05 vs. 25mg/mL b p<0.05 vs. 50 mg/mL c p<0.05 vs. Croton species tested at 25 mg/mL d p<0.05 vs. All concentrations of Croton species tested and L. sidoides at 25 mg/mL
Table 3 Antifungal activity of the essential oil from Croton species and of the Lippia sidoides against Candida spp. in agar-well diffusion assay
Growth inhibition zones (mm)
Yeast fungal species – Candida spp.
Plants
25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml ����J�PO�
Croton nepetaefolius NI NI NI NI - Croton argyrophylloides NI NI NI NI -
Croton zehntneri 7.4±1.1 9.0±1.4 10.0±1.5 12.6±1.1 - Lippia sidoides 9.8±0.9 16.4±2.1a 21.5±4.2a,b 23.2±1.8a,b -
Amphotericin B - - - - 10.75 ± 1.5 NI= None inhibition of fungal growth a p<0.05 vs. 25mg/mL b p<0.05 vs. Amphotericin B
96
Table 4 Antifungal activity of the essential oil from Croton species and of the Lippia sidoides against M. pachydermatis in agar-well diffusion assay
Growth inhibition zones (mm)
Yeast fungal specie – Malassezia pachydermatis
Plants
25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml ����J�PO�
Croton nepetaefolius NI NI NI NI - Croton argyrophylloides NI NI NI NI -
Croton zehntneri 11.6 ± 2.9 13.2 ± 2.7 17.2 ± 3.9a 22.6 ± 6.7a - Lippia sidoides 30.0 ± 10.0 41.2 ± 9.5b 50.0 ± 8.3a,b TI -
Itraconazole - - - - 29.7 ± 9.0 TI= total inhibition of fungal growth NI= None inhibition of fungal growth a p< 0.05 vs. 25 mg/mL b p< 0.05 vs. Itraconazole
3.3. Toxicity
The administration of essential oils at doses ranging from 100 to 3000 mg/Kg
induced no remarkable alterations in the behavior pattern of mice. All essentials oils
induced myotonia, tachypnea, and dyspnea. The calculated LD50 and 95% confidence
interval for Croton argyrophylloides were 168.6 (160.5-176.7) mg/Kg, for Croton
nepetaefolius were 163.8 (155.3-172.3) mg/Kg and for Lippia sidoides were 117.95
(110.61-125.29) mg/Kg. Croton zehntneri was devoided of any overt toxicity after
intraperitoneal administration. None of the essential oil tested presented remarkable signs
of toxicity after ora administration up to 3 g/Kg.
In further toxicological evaluation the most efficient antifungal essential oil, which
was the most abundant too, was administered during 30 days by oral gavage in a dose
correpondent to the LD50 estimated for the intraperitoneal route. The sub-chronic
administration L. sidoides essential oil was devoided of overt toxicity. The body weight
was not affected by the treatment being 322.9 ± 18.96 g in the first day and 328.3 ± 22.67
97
g at the 30th day as compared to 331.1± 24.0g vs. 357.2 ± 21.2 in vehicle treated animals
(P>0.05).
Moreover, the serum biochemical parameters observed, i.e., creatinine, urea and
oxalacetic-piruvic and glutamic-piruvic transaminases were not significantly affected
(table 5). Additionally, the histopathological evaluation of liver, kidney, lungs, heart,
spleen revealed no structural alterations in these organs obtained from L. sidoides essential
oil reated animals as well as in vehicle treated animal. Similarly, the evaluation of red and
white blood cell reveal no remarkable sign of hematological toxicity induced by L. sidoides
essential oil.
98
Table 6
Serum Biochemical parameters of Wistar rats during sub-chronic oral administration of Lippia sidoides essential oil
Groups Urea Creatinine GOT GPT
L. sidoides
Day 0 88.71 ± 19.85
(n=10) 0.87 ± 0.09
(n=10) 100.2 ± 15.89
(n=10) 52.1 ± 9.98
(n=10)
L. sidoides
15th day 55.96 ± 4.87
(n=09) 0.87 ± 0.16
(n=08) 125.7 ± 10.33
(n=09) 55.54 ± 9.15
(n=09) L. sidoides
30th day 46.56 ± 8.65
(n=09) 0.84 ± 0.06
(n=09) 135.3 ± 12.94
(n=09) 41.86 ± 10.52
(n=09) Vehicle Day 0
51.8 ± 18.65 (n=10)
1.04 ± 0.05 (n=10)
138.3 ± 15.89 (n=10)
37.02 ± 13.68 (n=10)
Vehicle 15th day
64.4 ± 9.53 (n=10)
0.89 ± 0.13 (n=10)
120.3 ± 10.33 (n=10)
66.36 ± 13.77 (n=10)
Vehicle 30th day
48.4 ± 7.68 (n=10)
0.97 ± 0.15 (n=10)
122.2 ± 12.94 (n=10)
50.25 ± 14.25 (n=10)
Table 7
Hematological Parameters of Wistar rats during sub-chronic oral administration of Lippia sidoides essential oil
Day 0 30th day
Parameters Média ± EP IC (95%) Média ± EP IC (95%)
Red Cells x 10 6/mm3 3.6 ± 1.75 3.5 x 106 - 3.7 x 106 3.5 x 106 ± 178000 3.3 x 106 - 3.6 x 106
Hemoglobin g/dL 8.9 ± 1.3 8.08 - 9.69 8.4 ± 1.28 7.47 - 9.32 Hematocrit % 28.7 ± 1.2 27.84 - 29.62 28.45 ± 1.17 27.61 - 29.29
Leucocytes x 103 / mm3 6820 ± 877 6121 - 7519 6590 ± 967.8 5898 - 7282
99
4. Discussion
This study shows that the essential oil of C. zenthneri of Lippia sidoides are quite
effective against Microsporum canis, one of the most common species of dermatophytes
that cause superficial fungal infection in humans, cats and dogs. They were also active
against Candida spp. and Malassezia pachydermatis, which one important yeasts envolved
in diseases (Brilhante et al., 2004). The essential oils of C. argyraphylloides and C.
nepetafolius were mildly effective and did not show a good concentration-relation profile.
The major components of the more efficient antifungal essential oils were
identified as estragol and anethol for C. zenhtneri and thymol for L. sidoides.
The absence of activity against yeast by the essential oils from C. nepetafolius and
C. argyraphylloides contrasting to the efficacy of C. zenthneri and L. sidoides may be
explained by the presence of estragol and anethol in high amounts in C. zenthneri and of
thymol in L. sidoides. These compounds are not present in the essential oil of C.
argyraphylloides or C. nepetafolius and were previously reported to be effective as
antifungals including against yeasts (Shin and Pyun, 2004; Giordani et al., 2004; Shin and
Kim, 2004; Mimica-Dukic et al., 2003; Lachowicz et al., 1998; Wan et al., 1998).
Plant essential oils are a potentially useful source of antimicrobial compounds.
Results reported from different studies are difficult to compare, presumably, because of
different test methods, bacterial strains and sources of antimicrobial samples used. The
compositions of the essential oil of herbs and spices can vary greatly depending upon the
geographical region, the variety, the age of the plant, the method of drying and the method
of extraction of the oil (Jerkovic et al., 2001).
100
For instance, Lopes Júnior et al., 2005 found that the essential oil from Croton
zehntneri reveal antibacterial action against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and
Klebisiella pneumoniae and antifungal action against Cryptococcus neoformas and
Candida albicans. In addition phytochemical studies carried out on essential oil used in
this study demonstrated the presence of estragole and anethole, which were previously
shown to exert antifungal activity (Lopes Júnior et al., 2005). Lacoste et al., 1996 reported
the antimicrobial potential of L. sidoides against microorganisms from skin microflora as
well as its main components, thymol and carvacrol (Lacoste et al., 2006).
On the other hand, this study shows that the oral administration of L. sidoides
essential oil during 30 days at a 117 mg/Kg dose regime (equivalente to the calculated
LD50 after intraperitoneal injection in mices) did not induce any significant alteration in the
biochemical or hematological parameters analyzed, nor altered weight gain or structural
pattern of main organs as revealed by the histopathologic analysis. Despite additional tests,
as reproductive toxicity analysis, cytotoxic and mutagenesis evaluation must be
performed, the present results show that L. sidoides essential oil is probably safe for acute
use to treat superficial mycoses.
The results underline the importance and the need for research into the potential
use of essential oils in the management of fungal infections. The relatively small number
of antifungals available for the treatment of mycoses, most of them fungistatic, together
with emerging resistance, led us to search for therapeutic alternatives combining low cost
and low toxicity, such as essential oils.
The result of this study explain and justify, at least in part, the popular use of this
plants for the treatment of mycoses and points out the potential antifungal effect of them
101
that can be explored for therapeutic purposes as an alternative treatment for superficial
mycoses.
The essential oils of C. zenthneri and L. sidoides may find efficient application as
a topical skin ointment for the treatment of superficial fungal and bacterial infection,
particularly in cutaneous mycoses.
102
References
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Cultivadas. São Paulo: Instituto Plantarum, 2002. OLIVEIRA, A. C.; LEAL-CARDOSO, J. H.; SANTOS, C. F. et al. Antinociceptive effects
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