View
216
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Zalety:
możliwość uzyskania dużej
biomasy
modyfikacje postranslacyjne
eksprymowanych białek
transport eksprymowanych
białek do pożywki
Drożdżowe systemy ekspresyjne
Duża biomasa
W przypadku hodowli bakterii E. coli stosując
omawiane uprzednio systemy ekspresji genów (np.
system pET) jesteśmy w stanie uzyskać około 5 g
„mokrej” biomasy z litra hodowli
W przypadku hodowli drożdży Saccharomyces
cerevisiae stosując zaprojektowane dla nich systemy
ekspresji genów istnieje możliwość uzyskania od 100
do 200 g biomasy z litra hodowli
Modyfikacje postranslacyjne białek u
drożdży
Fosforylacja – kowalencyjne ufosforylowanie grup -OH, zazwyczaj do reszt seryny, tyrozyny, treoniny lub histydyny
Acetylacja – dołączenie grupy acylowej, zazwyczaj na N-końcu sekwencji aminokwasowej białka
Alkilacja - dołączenie grupy alkilowej (np. metylowej lub etylowej)
Izopropenylacja - dołączenie grupy izoprenoidowej (np. farnesol i geranylgeraniol)
Glikozylacja - dołączenie „reszty cukrowej” do reszt kw. asparaginowego, hydroksylizyny, seryny lub treoniny wynikiem czego jest powstanie glikoproteiny
Ubikwitynacja – kowalencyjne dołączenie ubikwityny do docelowego białka
Saccharomyces cerevisiae
GRAS (Generally Regarded As Safe)
Możliwość modyfikacji posttranslacyjnych
Organizm dobrze poznany
Saccharomyces cerevisiae - wady
Brak stabilności szczepów transformowanych
Hiperglikozylacja – może zablokować interakcje z
przeciwciałami
rozwiązanie – użycie mutantów (mnn1, mnn9) lub
wyeliminowanie potencjalnych miejsc glikozylacji
Plazmidowe wektory wahadłowe
Zawierają dwa ori replikacji: prokariotyczne i eukariotyczne
Zawierają „niezależne” lub „uniwersalne” markery
selekcyjne przeznaczone do selekcji i utrzymania
plazmidów w komórkach bakterii jak i/ lub drożdży
Promotor GAL1
Represja promotora w obecności glukozy
Indukcja promotora w obecności galaktozy (podniesienie
poziomu transkrypcji ponad 5000 razy)
Możliwość wstępnej hodowli na rafinozie
YES™ Vector Collection
YES™ Vector Collection - zestaw wektorów plazmidowych przeznaczonych do ekspresji białek heterogenicznych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, należą do nich wektory serii: pYes i pYC
Wszystkie wektory plazmidowe z YES™ Vector Collection są wektorami wahadłowymi E. coli/ Saccharomyces cerevisiae (konstrukcja plazmidów rekombinantowych opartych o wektory plazmidowe z YES™ Vector Collection odbywa się w E. coli, natomiast ekspresja klonowanych genów w Saccharomyces cerevisiae)
Wektory plazmidowe serii pYES
ori pUC1
ori pUC1 zapewnia wysokokopijność plazmidów rekombinowanych pYES2 w komórkach E. coli (~400 kopii na komórkę)
Prokariotyczne ori replikacji
Wektory plazmidowe serii pYES
gen bla
gen bla zapewnia
komórkom E. coli
niosącym plazmidy
pYES2 oporność na
ampicylinę
Prokariotyczny marker
selekcyjny
Wektory plazmidowe serii pYES
2m origin
2m origin umożliwia replikację plazmidów rekombinowanych pYES2 w komórkach drożdży (od 10 do 40 kopii na komórkę)
Eukariotyczne ori replikacji
Wektory plazmidowe serii pYES
gen ura3
eukariotyczny marker selekcyjny
gen ura3 zapewnia komórkom auksotroficznych drożdży S. cerevisiae niosącym plazmidy pYES2, nie produkującym endogennie uracylu wzrost na pożywkach bez tego nukleotydu
Wektory plazmidowe serii pYES
Promotor GAL1
promotor GAL1 pozwala na wydajną ekspresję genów wklonowanych do wektora pYES2
Wektory plazmidowe serii pYES
Ekspresja genów spod
promotora GAL1 może być
regulowana na dwa sposoby
Ekspresja spod promotora
GAL1 – wariant 1
Represor – glukoza obecna w
pożywce
Induktor – galaktoza obecna w
pożywce pod warunkiem
nieobecności w niej glukozy
Wektory plazmidowe serii pYES
Ekspresja spod promotora
GAL1 – wariant 2
Represor – brak, w miejsce
glukozy obecna jest w pożywce
rafinoza
Induktor – galaktoza obecna w
pożywce niezależnie od
obecności w niej rafinozy
Wektory plazmidowe serii pYES
Promotor GAL1
Wariant 1 – konieczność usunięcia glukozy z pożywki przed dodaniem galaktozy, najczęściej odbywa się przez odwirowanie drożdży z pożywki z glukozą i przeniesienie ich na pożywkę z galaktozą
Wariant 2 - (rafinoza-galaktoza) ekspresja białka spod promotora GAL1 odbywa się znacznie szybciej niż w wariancie 1 (glukoza-galaktoza)
Wektory plazmidowe serii pYES
Terminator CYC1
Terminator CYC1 pozwala na efektywną terminację transkrypcji zachodzącej spod promotora GAL1
Terminator CYC1 zapewnia powstawanie stabilnego transkryptu mRNA w komórkach drożdży S. cerevisiae
Wektory plazmidowe serii pYES
Promotor T7
Obecny w wektorach
plazmiadowych serii pYES i
pYC promotor T7 nie jest
wykorzystywany do
ekspresjii genów
wklonowanych w MCS ,
promotor ten pozwala
na transkrypcję in vitro w
obrębie MCS
Wektory plazmidowe serii pYES
f1 origin
f1 origin pozwala na
uzyskanie
jednoniciowego DNA
plazmidu pYES2
Wektory serii pYES
Wektory tej serii analogicznie jak wektory serii pET mogą
sekwencje kodujące domeny fuzyjne np. His-tag, mające na
celu np. ułatwienie oczyszczania powstałych białek
fuzyjnych i/lub możliwość detekcji ich produkcji z
wykorzystaniem przeciwciał
Szczep gospodarza dla wektorów serii pYES
(pYC)
Szczepem wykorzystywanym do ekspresji białek spod promotora GAL1 jest auksotroficzny szczep drożdży Saccharomyces cerevisiae INVSc1
Genotyp: his3 ∆1/his3 ∆1 leu2/leu2 trp1-289/trp1-289 ura3-52/ura3-52
Fenotyp: His-, Leu-, Trp-, Ura-
Wektor plazmidowy pYES3/CT zawiera sekwencję kodującą marker selekcyjny gen TRP1
Inne drożdżowe szczepy gospodarzy
dla wektorów serii pYES (pYC)
Zastosowanie wektorów
plazmidowych takich jak:
pYES6/CT i pYC6/CT niosących
„uniwersalny” marker selekcyjny:
gen oporności na antybiotyk
blastycydynę daje możliwość
użycia nieauksotroficznych
szczepów drożdży S. cerevisiae -
Blastycydyna jest toksyczna
zarówno dla komórek drożdży S.
cerevisiae jak i bakterii E. coli
Wektory serii pYC
Wektory plazmidowe serii
pYC różnią się od wektorów
plazmidowych serii pYES
odmiennym eukariotycznym
drożdżowym ori replikacji
W miejsce ori 2m (pYES)
występuje hybrydowe ori
replikacji CEN6/ARSH4
Wektory serii pYC
ori replikacji CEN6/ARSH4 ori replikacji CEN6/ARSH4
zapewnia plazmidom pYC „niskokopijność” (1-2 kopii plazmidu na komórkę drożdży)
Plazmidy te wykorzystywne są do ekspresji genówkodujących białka „toksyczne” dla komórek drożdży S. cerevisiae
Podsumowanie
Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Saccharomyces cerevisiae opiera się o wahadłowe wektory plazmidowe
Szczepy Saccharomyces cerevisiae wykorzystywane w znanych drożdżowych systemach drożdżowych są mutantami auksotrofowymi
Najczęściej wykorzystywanym promotorem drożdżowym jest promotor GAL1 podlegający ścisłej regulacji ekspresji: induktor/represor
Kluyvyromyces lactis - Novagen
Wysoki poziom ekspresji
Możliwość zakupu gotowych kompetentnych
komórek K. lactis
Proste protokoły (dla osób bez doświadczenia w
pracy z drożdżami)
Możliwość wykorzystania systemów dla celów
komercyjnych (system sublicencjonowania)
Możliwość produkcji białek na zewnątrz lub wewnątrz
komórek
Kluvyromyces lactis - NovagenEkspresja w drożdżach zachodzi spod silnego
promotora LAC4, który NIE umożliwia ekspresji w E. coli (geny kodujące białka toksyczne dla E. coli mogą być klonowane do plazmidu pKLAC1 w bakteriach przed ich ekspresją w systemach drożdżowych)
Białka produkowane w K. lactis ulegają modyfikacjom (glikozylacja)
Selekcja odbywa się bez użycia antybiotyków –acetamidaza (amdS) z pKLAC1 pozwala transformowanym komórkom na użycie acetamidu, jako źródła azotu
Kluyvyromyces lactis – wektor
pKLAC1
5´ i 3´ koniec promotora LAC4 (PLAC4-PBI) rozdzielony DNA kodującym β-lakatmazę (ApR)
pMB1 origin (ori) zapewniające replikację w E. coli
K. lactis α-MF (kodujący peptyd sygnalny)
Multiple cloning site (MCS) – miejsce wielokrotnego klonowania
LAC4 terminator transkrypcji (TT) położony bezpośrednio za 3´ PLAC4-PBI
Drożdżowy promotor ADH2 (PADH2) zapewniający ekspresję genu acetamidazy (amdS)
5´ i 3´ koniec promotora LAC4 (PLAC4-PBI) rozdzielony DNA kodującym β-lakatmazę (ApR)
Linearyzacja wektora enzymem SacII lub BstXI umożliwia insercję klonowanego DNA pod natywny promotor LAC4 w genomie K. lactis
Kluyvyromyces lactis – New England Biolabs
Ekspresja z wektora
zawierającego gen kodujący białko
fuzyjne (białko klonowane – kolor
czarny i α-MF domenę –
niebieski). Peptyd sygnalny α-MF
kieruje białko do retikulum
endoplazmatycznego, a następnie
jest usuwany przez peptydazę
sygnalną (SP). Białko jest
transportowane do aparatu Golgi
gdzie proteaza Kex usuwa
domenę α-MF. Białko ulega
sekrecji.
Kluyvyromyces lactis - Novagen
SDS-polyacrylamide gel electrophoresis separation of secreted recombinant maltose binding protein (MBP) and detection by Coomassie staining. Lane 1: Protein Molecular Weight Markers. Lane 2: spent culture medium (15 µl) from wild-type K. lactis cells. Lane 3: spent culture medium (15 µl) from K. lactis cells harboring an integrated expression cassette containing the E. coli malE gene.
Recommended