清酒酵母の遺伝子組換え 技術の進展と展望 -...

赤田倫治

山口大学工学部

清酒酵母の遺伝子組換え

技術の進展と展望

｢よい清酒はよい酵母から｣

｢よい清酒はよい酵母から｣

酵母ゲノム

｢よい清酒はよい酵母から｣

酵母遺伝子

FAS2ATF1---

遺伝子組換え酵母のお

酒を飲みたいですか？

GREEN CO-OP

どうすれば組換えのお酒

を飲んでもらえるか

遺伝子組換え微生物食品の不安

抗生物質耐性遺伝子

食品用組換え微生物

大腸菌DNA病原性微生物

？

プラスミド

有用遺伝子

導入用マーカー

自然形質転換をおこなう病原性細菌類

Species from clinical Transformation frequencyisolates (transformants/viable cell)Campylobacter jejuni 2.0 x 10-4

Campylobacter coli 1.2 x 10-3

Haemophilus influenzae 7.0 x 10-3

Haemophius parainfluenzae 8.6 x 10-3

Helicobacter pylori 5.0 x 10-4

Neisseria gonorrhoeae 1.0 x 10-4

Neisseria meningitidis 1.1 x 10-2

Staphylococcus aureus 5.5 x 10-6

Streptococcus pneumoniae 2.9 x 10-2

Streptococcus sanguis 2.0 x 10-2

Streptococcus mutans 7.0 x 10-4

Lorenz and Wackernagel, 1994を改変

解決

不要DNA配列の除去

遺伝子組換え微生物の不安を除くことから着手

有用遺伝子

不要大腸菌プラスミドDNA

不要抗生物質耐性遺伝子

マーカー遺伝子

有用遺伝子

遺伝子除去技術の開発

グルコース培地：正常OFF

不安な遺伝子を抜く方法

ガラクトース誘導増殖阻害遺伝子

GAL10promoter

ON

増殖増殖できない ガラクトース培地

GIN11

Y'X

cen

Subtelomeric region

C1-3A repeat

GIN11配列テロメア

染色体末端近くの配列の過剰発現は酵母の増殖を止める

GIN11はtelomeric X-element の配列

1 GATCAATAAC AGTGTTTGTG GAGCATTTTC TGAATACAAT AAACCCAAAA CAGAAACTTC CCTTTTGTAT CACTGTTCTG

81 GAAAAGGGGT GGGCGGTAAT AAAGCTAATA GGGTGTGTCC ATAAGTAATA CTGAACTTGG AAATGTGCGG CTTTGCAGCA

161 TTTTGTCTTT CTATAAAAAT GTGTCGTTCC TTTTTTTCAT TTTTTGGCGC GTCGCCTCGG GGTCGTATAG AATATGCGTC

241 ACTTTTAAAA ATAAGATTGC AGATCAGGGC AAAACAAGTA GCAAATCATA GCAAGAGACC CTGATTTTTG TGACATAAAT

321 ATTTTTACTT CTGTGTTAGG TTAACTTTTT ATGTAACTGT AAATGGAATA GAGTTGAGGG GATAGTGCCC ACAAGTCAAT

401 ATGTTTATTT TGTAAAGTTG AAAGATAATT ATTTTTATGT TTAGGTGATT TTGGTGTTGA ATTTTCTGTA ATATTAACAT

481 AAGAGTAATA CATTGAGTGG TTAGTATATG GTGTAAAAGT GGTATAACGC ATGTATTAAG AGCAGTTATA CAATATTTGG

561 GGCCGCTGAA TGAGATATAG ATATTAAAAT GTGGATAATC ATGGGCTTTA TGGGTAAATG GAACAGGGTA TAGACCACTG

641 AGGCAAGTGC CGTGCATAAT GATATGAGTG CATCTAGT

(C1-3A)n

TelomereY'Xcen

Subtelomeric region

GIN11

cen

20100

0

20

40

60

80

pGL108

p315GAL

Time (hr)

5 15 25

Pla

sm

idlo

ss r

ate

(%) コントロール

プラスミド

GIN11を発現させたプラスミド

ガラクトース液体培地でGIN11プラスミドは抜け落ちる

協会７号増殖阻害遺伝子導入

組換え協会７号

生えている酵母では不要遺伝子が抜けている！

ガラクトース培地

FAS2変異遺伝子は香気成分を増加させる

1250Gly⇨Ser

GGT⇨AGT

香気成分カプロン酸エチルの増加

脂肪酸合成酵素(Fatty acid synthase)

1 1887

F A S 2

FAS2-1250S

吟醸香

Mutation siteFAS2-1250S ∆NC

NdeI

Af l I I

Amp

ori

AUR1-C

GIN11

GAL10promoter

pAURFAS2-6

12566 bp

*

除去選択マーカー（増殖阻害遺伝子）

導入用マーカー

染色体への挿入　

染色体DNA

YPgal培地で選択

GIN11 AUR1

除去選択用マーカー 導入用マーカー

AUR1 GIN11

相同組換え

AUR1 GIN11

不要配列が脱落

FAS2-1250S変異株

正常FAS2遺伝子

S

S

S

S

GIN11 AUR1

S

遺伝子導入体の選択（オーレオバシジン培地）

GIN11 AUR1

遺伝子除去体の選択（ガラクトース培地）

S

pAURFAS2-6

第１段階遺伝子導入

第２段階不要配列の除去

遺伝子組換えで評判の清酒酵母株と全く同じ株を作成できる

A/G

変異株の塩基配列

⇨変異遺伝子

GTTCTGGTATG　⇨正常遺伝子

GTTCTAGTATG　

G

A

T

C

S

FAS2-1250SS

FAS2-1250S

FAS2-1250S 酵母兄弟

薬剤耐性遺伝子 薬剤耐性遺伝子

セルレニン耐性変異株スクリーニングで作成

２段階遺伝子組換えで作成

S

弟兄

醸造した芳醇な清酒は市販中 厚生労働省確認済

セルフクローニングと呼ぶ（自分に自分の遺伝子を入れること）

表3．セルフクローニング審査事情

審査年月日 申請者 審査対象 審査結果 備考

13.2.2 山口県産業技術センター セルフクローニング清酒酵母 追加資料 再検討

13.4.27 山口県産業技術センター セルフクローニング清酒酵母 該当する

ジェネンコア α-アミラーゼ，グルコースイ

ソメラーゼ生産菌

追加資料 再検討

協和醗酵工業 イノシン酸二ナトリウム，グア

ニル酸二ナトリウム生産菌

該当する

13.6.26

ノボザイムジャパン グルコアミラーゼ生産菌 該当しない

味の素 酸性フォスファターゼ生産菌 該当する13.9.18

ジェネンコア グルコースイソメラーゼ生産菌 該当する

13.11.13 ジェネンコア α-アミラーゼ生産菌 該当する

14.1.30 三栄源エフ・エフ・アイ キサンタンガム生産菌 該当する

世界最初に市販された遺伝子組換え酵母のお酒

表示の義務はないのだが，見せられないのが悲しい。

2003年春

今までと同じ酵母なら意味がない？

実用化のための酵母遺伝子組換え技術開発

プラスミド

（1）導入用マーカー

プラスミド

有用遺伝子マーカー遺伝子

プラスミド

薬剤耐性遺伝子

（2）マーカー除去法　　　［GALp-GIN11］

Start Ｇｏａｌ

方法をシェイプアップ

Table 1. Drug resistance markersMarker Selection drug Referencekanr G418 Hadfield et al., 1990; Wach et al., 1994Mdhfr methotrexate Zhu et al., 1986CAT chloramphenicol Hadfield et al., 1986aroA glyphosate Kunze et al., 1989hph hygromycin B Gritz and Davies, 1983cyh2 cycloheximide Del Pozo et al., 1991Tn5ble phleomycin Wenzel et al., 1992PDR4 cerulenin Nakazawa et al., 1993P45014DM triazole Doignon et al., 1993ARO4 fluorophenylalanine Shimura et al., 1993? lipid hydroperoxide Inoue et al., 1993AUR1 aureobasidin A Hashida-Okado et al., 1996SMR1 sulfometuron methylCasey et al., 1988; Xie and Jiménez, 1996SFA1 formaldehyde Van den Berg et al., 1997LEU4-1 trifluoroleucine Bendoni et al., 1999FZF1-4 sulfite Park et al., 1999PDR3-9 cycloheximide Lacková and Subík, 1999hphMX hygromycin B Goldstein and McCusker, 1999natMX nourseothricin Goldstein and McCusker, 1999patMX bialaphos Goldstein and McCusker, 1999

導入用マーカー

薬剤耐性マーカーによる形質転換の問題点

1.　低い形質転換効率

2.　バックグラウンド耐性変異株の出現

3.　蛋白合成阻害剤とマーカー遺伝子発現の拮抗作用

4.　プレーティング前の非選択培地での培養

5.　酵母遺伝子との相同組換え（酵母変異遺伝子マーカー）

高発現YAP1カセット

恒常的高発現

PGKプロモーター

YAP1

YAP1プロモーター

YAP1

金属耐性cadmium

薬剤耐性

cycloheximidesulfometuron methyl1,10-phenanthroline

酸化ストレス耐性H2O2

diamide

URA3

PGK3 '

YAP1PGK5 '

Or iYCp- PGKp- YAP1

Amp

ARS/ CEN

YCpプラスミド

PGKプロモーター

URA3

PGK3 '

YAP1PGK5 '

Or iYCp- PGKp- YAP1

Amp

ARS/ CEN

YCpプラスミド

PGKプロモーター

URA3

PGK3 '

YAP1

PGK5 '

O r i

Amp

YIp- PGKp- YAP1

YIpプラスミド

PGKプロモーター

URA3

PGK3 '

YAP1

PGK5 '

O r i

Amp

YIp- PGKp- YAP1

YIpプラスミド

PGKプロモーター

W303-1A (control)0.5 10.1 5

Cycloheximide10 0.5 1 2 4

Cerulenin8

5 10 20Nystatin

1 5 10AmphotericinAureobasidin

0.05 0.1 0.2 0.4 200100 400Geneticin

(µg/ml)

YAP1はcycloheximideとceruleninに耐性を示すが他の薬剤には耐性能を示さない。

YCp-PGKp-YAP1

YIp-PGKp-YAP1

W303-1A (control)

YCp-PGKp-YAP1

YIp-PGKp-YAP1

0

20

40

60

80

100

120 YCp

YIp

-Ura0.5 0.5 1 2 4 21 0.5 1 (μg/ml)SDSD YPD培地

薬剤シクロヘキシミド セルレニン選択培地

高発現型YAP1の形質転換効率

形

質

転

換

効

率

(%)

YPD

セルレニン

1.0 μg/ml

脂肪酸合成阻害剤セルレニンで高率の形質転換が可能しかし、濃度が低いとバックがでる

プラスミドあり プラスミドなし

シクロヘキシミド形質転換用セルレニンプレート

他の薬剤培地へのレプリカによる真の形質転換体の確認

レプリカ レプリカ

あり

オーレオバシジン

プラスミド導入体はシクロヘキシミドに耐性だが，ほとんどの耐性変異体は感受性

プラスミドなしにもコロニーが出現する=薬剤耐性変異体

プラスミド導入体はオーレオバシジンに感受性だが，シクロヘキシミド耐性変異体はこれにも耐性

なし

プラスミド

プラスミド

遺伝子導入と除去選択が可能なpGG119ベクター

PGKp-YAP1

除去選択マーカー

導入選択マーカー

GALp-GIN11M86

実用化のための酵母遺伝子組換え技術開発

プラスミド

（1）導入用マーカー　　 ［PGKp-YAP1］

プラスミド

有用遺伝子マーカー遺伝子

プラスミド

薬剤耐性遺伝子

（2）マーカー除去法　　　［GALp-GIN11Ｍ86］

Start Ｇｏａｌ

方法をシェイプアップ

今までと同じ酵母なら意味がない？

遺伝子組換えを使わなければできないおいしい清酒酵母

AlaSer Thr Cys1250GGly

1250S 1250A 1250T 1250C

HC

H

OH

H

CH

H

HC

HO

HC

H

H

H

CH

H

S

H

C

OH

N

C

H

O

C

H

C

H

H

HH H

C

O

N

O H

C

H

C NH

CH

C

H

C

H

S

H H

H

C

O

C

H

C

H

H

NC

C

N

H O

C

O

NC

H H

O

C

H

H

N

H

C H

C H

CH

H

H H

N末側⋯ Gly-Ser-Gly-Met-Gly-Gly-Val⋯ C末側

1250

1250番目の側鎖

野生型高生産

FAS2の1250番目をAla, Thr, またはCysにする

FAS2アミノ酸配列

カプロン酸エチル ？

1250G (Gly)野生型高生産型

PCRを利用した部位特異的変異導入

GGT TCT GGT ATG GGT GGT

Gly Ser Gly Met Gly Gly

--- --- AGT --- --- ------ --- GCT --- --- ------ --- ACT --- --- ------ --- TGT --- --- ---

1250S (Ser)1250A (Ala)1250T (Thr)1250C (Cys)

NheI

AflII

SphI

SalI/XhoI

XhoIApaI

GALp-GIN11M86

PGKp-YAP1

OriAmp

14.3 kb

r

pGG119FAS2

Mutation

FAS2-1250

NotI

108

76

kb

FAS2 probe pBluescript probeKy

okai

no.

7pG

G11

9-FA

S2A

inte

gran

t

FAS2

Aco

unte

r-sel

ecte

d

FAS2

Cco

unte

r-se

lect

ed

Kyok

ai n

o. 7

pGG

119-

FAS2

Ain

tegr

ant

FAS2

Aco

unte

r-sel

ecte

d

FAS

2Cco

unte

r-sel

ecte

d

除去選択株は野生型または変異型FAS2のどちらかを持つ

Southern analysisによるプラスミドの導入と除去の確認

FAS2 probe pBluescript probe

NruI NruI

*NruI NruI

*NruI NruI

*

22 kb

8 kb

8 kb

Integration

Homologousrecombination

or

NruI NruI8 kb

or

Wild-type FAS2 Mutant FAS2

Counter-selection

ｐGG119FAS2

*

菌株 K7 1250S　1250A　1250C

FAS2-1250 Gly Ser Ala Cys

もろみ日数 27 25 27 27

Alcohol (%) 15.5 15.3 15.2 15.5

日本酒度 +9.3 +8.9 +9.2 +11.4

カプロン酸エチル (ppm) 1.0 4.9 3.4 6.1

＜小仕込分析結果＞

おいしい酵母と実用的遺伝子操作技術

FAS2

S

FAS2-1250S

FAS2-1250 酵母兄弟

薬剤耐性遺伝子

薬剤耐性遺伝子

S

FAS2

AFAS2-1250A

薬剤耐性遺伝子

薬剤耐性遺伝子

A

C

FAS2-1250C

薬剤耐性遺伝子

薬剤耐性遺伝子

C

FAS2-1250S

FAS2-1250A FAS2-1250C

1.0 ppm 4.9 ppm

3.4 ppm 6.1 ppm

HC

H

OH

H

CH

H

H

CH

H

S

組換え技術を使わないと作れない

従来の変異選択法でもなんとかなる

アルコールアセチルトランスフェラーゼ（ATF1）の過剰発現をセルフクローニングで

SphI

SacISacIINotI

GALp-GIN11M86

ATF1? C

PGKp-YAP1

pGG119TDH3pATF1

11.2 kb

TDH3promoter

5' upstreamof ATF1

Ori

Ampr

XbaI

過剰発現プロモータのセルフクローニング

1809

1857

1858

1861

Counter-selected

Ladd

er

32

kb

Inte

gran

t

23kb

12

A B

1859

pBluescript KS+ probeATF1 probe

1807

Kyok

aino

.7

Kyok

aino

.7

1808

1809

1857

1858

1861

1807

1808

1809

1857

1858

1861

Counter-selectedIntegrated

Counter-selectedIntegrated

Strain Days Sake Alcohol Isoamylmeter (%) acetate

Kyokai no. 7 27 +9.3 15.5 4.9pGG119TDH3p-ATF1 27 +9.0 15.5 15.4TDH3p-ATF1 28 +8.8 15.5 24.2

醸造結果

(ppm)

協会７号

・FAS2-1250C・TDH3p-ATF1

まだ市販されていません。

扱いにくい

結局，実用酵母の遺伝子操作は研究室酵母に比べて

1990年代の酵母研究

実用酵母は二倍体多くは胞子形成能がなく一倍体が取れない遺伝的解析が不自由二倍体では劣性変異体取得が困難二倍体では交配も困難

１倍体酵母 ２　倍　体　酵　母

変異が取得できる 形質として現れない

２倍体で劣性変異が取れないと考えていたわけ

変異 変異 変異 変異

10-4 10-4変異が同時に起こる確率は

10-4 x 10-4 =10-8

UV照射

照射時間 (s)

0 5 10 15 20 25 300

20

40

60

80

100

･ｶ･ｶ･ｦ･i･･･j

１倍体２倍体

変異誘発による生存率

生存

率％

UV照射

酵母菌

培養

レプリカ

　YPD培地 （栄養培地）

　MM培地 （最小培地）

YPD培地に生育できてMM培地に生育できないものを探す

栄養要求性変異株

栄養要求性変異株の取得方法

UV照射による変異誘発率

親株 生存率(%) 調査数変異株数 変異取得率(%)

協会7号

協会7号Ｈ

協会9号

協会10号

協会701号

協会901号

22.0

19.3

13.4

9.9

8.1

3422

1885

1696

3046

2147

2998

2

1

1

2

3

6

0.06

0.05

0.06

0.07

0.14

0.20

17.8

変異

10-4

染色体欠失

遺伝子変換体細胞交叉

高頻度の「Loss of heterozygosity」で説明できる

10-1～10-2？

栄養要求性関連遺伝子を約100とすると

100 x 10-4 x 10-1=10-3 1000個に1個の割合

取得した栄養要求性変異株

取得株名 親株 栄養要求性の種類

RAK1536

RAK1537

RAK1546

RAK1763

RAK1764

RAK1785

RAK1786

RAK1787

RAK1788

RAK1922～RAK1927

協会7号

協会7号

協会7号

協会701号

協会701号

協会701号

協会10号

協会10号

協会9号

協会901号

Histidine

Methionine

Histidine+lysine

Leucine

Arginine

Uracil

Methionine

Tryptophan

Tryptophan

Tryptophan

栄養要求性相補遺伝子

取得株名 親株 栄養要求性と相補遺伝子

RAK1536

RAK1537

RAK1546

RAK1763

RAK1764

RAK1785

RAK1786

RAK1787

RAK1788

RAK1922～RAK1927

協会7号

協会7号

協会7号

協会701号

協会701号

協会701号

協会10号

協会10号

協会9号

協会901号

Histidine

Methionine

Histidine+lysine

Leucine

Arginine

Uracil

Methionine

Tryptophan

Tryptophan

Tryptophan

HIS3

LYS4

LEU4

TRP3

TRP3(RAK1926以外）

研究室酵母並みの遺伝子操作技術

PGKp-YAP1

プラスミド

導入用マーカー［PGKp-YAP1］

プラスミド

有用遺伝子の開発

プラスミド

効率よい確実な導入体選択法［セルレニンとシクロヘキシミド耐性］

GoalStart

薬剤耐性遺伝子

外来DNA除去［GALp-GIN11M86］

HIS3有用遺伝子

HIS3有用遺伝子

his3-変異株

１段階での実用化

除去の必要なし

90年代の方法

PGKp-YAP1

10865432

1.5

kb

Sac ISac IINot IXba I

Sal ISma I

BamH I

Sph I

Xho IApa I

pSKHIS3-ATF110649 bp

LEU2

ATF1 5' non-coding

ATF1

TDH3p

HIS3

TDH3p-ATF1の作成法も変わる

香気成分の測定（ppm）

K7 RAK1536 RAK1884K7 his3- K7

香気成分 TDHp-ATF1酢酸イソアミル 5.7 5.9 15.4カプロン酸エチル 0.65 0.64 0.89

研究室酵母並の遺伝子操作を清酒酵母で

不要なDNA配列を除去するセルフクローニング

DNAを除去する必要がないセルフクローニング

A.

プラスミド(大腸菌)

薬剤耐性遺伝子

不要配列

実用化可能

除去

有用遺伝子

栄養要求性変異（醸造酵母）

実用化可能

B.

栄養要求性相補遺伝子

有用遺伝子

栄養要求性遺伝子を利用した醸造酵母遺伝子操作

過剰発現型TDH3プロモータHIS3

酵母染色体

HIS3過剰発現型TDH3p-XXX1

Systematic Selfcloning!

酵母染色体

40mer 40mer

過剰発現プロモータHIS3

+40merプライマー +40merプライマー

PCR

2

3

RAK2196 kbHIS3 TDH3p

ATF1-401 ATF1-402

ATF1

HIS3 TDH3p

PCR

40 bp 40 bp

ATF1HIS3 TDH3p2.0 kb

TDH3-160 NotI-ATF1

PCR産物の挿入もできることはできるが

そんなにうまくはいかない

基本的な研究室酵母株

BY4741（１倍体）MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0

BY4742 （１倍体）MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 lys2Δ0

BY4743 （２倍体）MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0 LYS2+

MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 MET15+ lys2Δ0

２倍体以外に研究室酵母とどこが違う？

協会７号でこんな株を作れば自由自在な遺伝子操作ができる

基本的な研究室酵母株

BY4741MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0BY4742MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 lys2Δ0BY4743 MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0 LYS2+

MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 MET15+ lys2Δ0

１倍体で劣性変異が取得できる。１倍体同士の接合で２倍体ができる。２倍体の胞子形成で１倍体ができる。栄養要求性マーカーが揃っている。遺伝子操作ができる。

ura3Δ0

URA3ATG STOP

デルタ０ゼロ＝全くない

メリット１：URA3で形質転換ができる。メリット２：URA3マーカーはURA3に入ることがない。　　　　　　つまりターゲッティングができる。メリット３：5-FOA培地でURA3の除去ができる。

ura3Δ0

URA3

ura3変異ATG STOP

*

マーカー

URA3 マーカー

ura3変異株ではURA3マーカーが変異部位へ挿入されてしまう。

相同組換え

デルタ０ゼロ株には決して入らない⇒挿入したい場所へターゲッティングできる！

酵母株

テンプレートｐScHIS3TDH3p

URA3-401: atcaaagaaggttaatgtggctgtggtttcagggtccataggcgcgcccgURA3-402: ttttttcgtcattatagaaatcattacgaccgagattcccggcagtattg

URA3URA3-401 URA3-402

協会７号のura3Δ株の作製

プライマー設計

ｐScLYS4TDH3patcaaagaaggttaatgtggctgtggtttcagggtccataggcgcgcccg

tttttt

cgtcat

tataga

aatcat

tacgac

cgagat

tcccgg

cagtat

tg

atcaaagaaggttaatgtggctgtggtttcagggtccataggcgcgcccg

tttttt

cgtcat

tataga

aatcat

tacgac

cgagat

tcccgg

cagtat

tg

基本的な研究室酵母株

BY4741MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0BY4742MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 lys2Δ0BY4743 MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0 LYS2+

MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 MET15+ lys2Δ0

１倍体で劣性変異が取得できる。１倍体同士の接合で２倍体ができる。２倍体の胞子形成で１倍体ができる。栄養要求性マーカーが揃っている。遺伝子操作ができる。

LOH(Loss of heterozygosity)

MATa/MATaMATa/MATα ⇒ or

MATα/MATα

ヘテロはホモになりやすい

レプリカ

レプリカで混合する

栄養培地

UV照射(20秒間)栄養欠損培地

変異株からのａ型･α型株の取得方法

栄養培地

a/

ａ型

栄養培地 栄養培地

ロイシン要求性の醸造酵母

メチオニン要求性1倍体テスター株

交配可能変異株とテスター株との交配

協会701号由来ロイシン要求性株

スクリーニング数

20 15.4

α型 (%)UV（秒）生存率(%) a型 (%)　

RAK1763

0

864

639

32 (3.8)

1 (0.2)

38 (4.5)

0 (0)-

『桜酵母』と協会酵母の変異株

株名　 由来　 栄養要求性変異　　交配型

RAK2150 桜酵母 ウラシル 　　 a/a

RAK1595 協会7号 ヒスチジン・リジン α/α

RAK1600 協会701号 ロイシン 　　α/α

RAK1606 協会9号 トリプトファン 　　α/α

RAK1613 協会901号 トリプトファン 　　α/α

RAK1618 協会10号 トリプトファン 　　α/α

協会7号 　His-/Lys-

協会701号 Leu-

協会9号 　Trp-

協会901号 Trp-

協会10号 Trp-

桜酵母 Ura-

aa型

αα型

最少培地

K7 1562

1583 1562+1583

交配株

K7 his/lys a型

４倍体ができている

α/α体の取得 a/a体の取得

URA3をHIS3で置換

FOA

URA3を LYS4で置換

FOA

ウラシル、リジン要求性 ウラシル、ヒスチジン要求性

研究室酵母並の遺伝子操作を酵母ゲノムで利用すれば

出芽酵母

Saccharomyces cerevisiae

パン酵母清酒酵母ワイン酵母焼酎酵母ビール酵母

真核生物で最初のゲノムシークエンス

1996年　12,068ｋｂ

600人以上の研究者による国際プロジェクト

清酒ゲノムも完成

栄養要求性遺伝子を利用した醸造酵母の遺伝子操作

過剰発現型TDH3プロモータHIS3

酵母染色体

HIS3過剰発現型TDH3p-XXX1

酵母遺伝子6000個を操作できる技術

酵母染色体

過剰発現プロモータHIS3

プライマー プライマー

PCR

合成DNA 合成DNA 注文3日で1本約３000円

PCR機器で3時間

形質転換実験3時間

増殖3日

Chromosome 2 Chromosome 3Chromosome 1

TDH3pURA3 TDH3pURA3TDH3pURA3

Confirmation of URA3-TDH3p fragment insertion

Colony-PCR

ATF2ATF1 SLI1 ATF1 ATF2 SLI1

3

RAK2336 (α/α) RAK2359(a/a)

W T W T W T W T W T W T

0.5

markerkb

Mating

α/αura3Δ::HIS3/ura3Δ::HIS3

lys4/lys4

a/aura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3　

YYY1XXX1

α/α/a/a

Tetraploid

RAK2336

TDH3p-ATF1

TDH3p-ATF2

TDH3p-SLI1

RAK2359

TDH3p-ATF1

TDH3p-ATF2

TDH3p-SLI1

a/a his3/his3

α/ α

lys4

/lys

4

Minimal medium

・・・

Ethanol

Taste

Ethanol

Flavor Taste

XXX1

XXX2

YYY1

YYY2

ZZZ1

ZZZ2

ZZZ2

Flavor

・・・・

・・・・

・・・・

・・・・

・・・・

・・・・

・・・・・・

・・・・・・

・・・・・・

・・・・・・

・・・・・・

・・・・・・

・・・・

XXX1 XXX2 ZZZ1YYY2YYY1

・・・・・・・・・・・・

遺伝子１

遺伝子2

遺伝子１1

遺伝子3

遺伝子6000

遺伝子4

遺伝子5

遺伝子6

遺伝子7

遺伝子8

遺伝子9

遺伝子１0

遺伝子１2

お酒1

お酒2

お酒3

お酒4

お酒5

お酒6

お酒7

お酒8

お酒9

お酒10

お酒11

お酒12

お酒6000

PCR変異醸造酵母へ形質転換 醸造

ゲノム酒へ

おいしければ飲んでもらえるのか？

S-Adenosylmethionine

様々な肝臓疾患に治療効果エタノールによる肝障害が緩和肝硬変患者の死亡率減少鬱病治療骨関節症治療癌治療

大量生産が必要清酒酵母はもともと高生産さらなる高生産へ

sah1T279I

Mizunuma M, Miyamura K, Hirata D, Yokoyama H, Miyakawa T.

Involvement of S-adenosylmethionine in G1 cell-cycle regulation in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USA. 101: 6086-6091, 2004

分子生物学から清酒酵母育種へ

Mizunuma et al., PNAS 101, 6086, 2004

MSAPAQNYKIADISLAAFGRKEIELAEHEMPGLMAIRKAYGDVQPLKGARIAGCLHMTIQ

TAVLIETLVALGAEVTWSSCNIYSTQDHAAAAIAASGVPVFAWKGETEEEYLWCIEQQLF

AFKDNKKLNLILDDGGDLTTLVHEKHPEMLEDCFGLSEETTTGVHHLYRMVKEGKLKVPA

INVNDSVTKSKFDNLYGCRESLVDGIKRATDVMLAGKVAVVAGYGDVGKGCAAALRGMGA

RVLVTEIDPINALQAAMEGYQVVTMEDASHIGQVFVTTIGCRDIINGEHFINMPEDAIVC

NIGHFDIEIDVAWLKANAKECINIKPQVDRYLLSSGRHVILLANGRLVNLGCATGHSSFV

MSCSFSNQVLAQIALFKSNDKSFREKHIEFQKTGPFEVGVHVLPKILDEAVAKFHLGNLG

VRLTKLSKVQSEYLGIPEEGPFKADHYRY*

T279I

sah1T279I

Table 1. Cellular contents of AdoMet and AdoHcy in wild-type and sah1-1 cells

YPD O medium

Wild type sah1-1 Wild type sah1-1

AdoMet, nmol/mg cells ND 1.95 0.36 13.40

AdoHcy, nmol/mg cells ND 0.31 0.16 1.35

The content of AdoMet and AdoHcy were measured using early log-phase growing cells (OD660 of 0.2 0.3) of wild-type (DHT22—1b) and sah1—1 (YMM222) strains in YPD or O medium. The values are means from two independent experiments. ND, not detected.

Mizunuma et al., PNAS 101, 6086, 2004

Standard Name SAH1

Systematic Name YER043C

Feature Type ORF, Verified

Description

Name Description S-Adenosyl-l-Homocysteine hydrolase

Molecular Function adenosylhomocysteinase activity (ISS)

Biological Process methionine metabolic process (NAS)

selenocysteine metabolic process (NAS)

Pathways S-adenosylhomocysteine catabolism

Systematic deletion inviable

S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase, catabolizes S-adenosyl-L-homocysteine which is formed after donation of the activated methyl group of S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) to an acceptor

ATGTCTGCTCCAGCTCAAAACTACAAAATCGCTGATATCTCTTTGGCTGCCTTCGGTAGA

AAGGAAATCGAATTGGCTGAACATGAAATGCCAGGTTTGATGGCCATCAGAAAGGCTTAC

GGTGACGTCCAACCTTTGAAAGGCGCCCGTATTGCTGGTTGTTTGCACATGACCATTCAA

ACTGCTGTTTTAATTGAAACTTTAGTTGCTTTGGGTGCCGAAGTTACCTGGTCCTCTTGT

AACATCTATTCGACTCAAGATCATGCCGCCGCTGCTATTGCCGCTTCCGGTGTTCCAGTT

TTTGCCTGGAAGGGTGAAACTGAAGAAGAGTATTTGTGGTGTATTGAACAACAATTGTTT

GCCTTCAAGGACAACAAGAAATTGAACTTGATCTTAGATGATGGTGGTGATTTAACCACT

TTAGTTCATGAAAAGCACCCTGAAATGCTGGAAGACTGCTTTGGTCTTTCCGAAGAAACT

ACCACCGGTGTTCACCACTTATACAGAATGGTCAAAGAAGGCAAGTTAAAGGTTCCTGCC

ATTAACGTTAACGACTCCGTCACTAAGTCCAAGTTTGACAACTTGTACGGCTGTAGAGAA

TCCTTAGTCGACGGTATTAAGAGAGCCACTGATGTCATGTTGGCTGGTAAGGTTGCCGTT

GTTGCTGGTTACGGTGATGTCGGTAAGGGTTGTGCTGCTGCCTTAAGAGGAATGGGTGCT

CGTGTCTTGGTTACCGAAATTGACCCAATCAACGCTTTACAAGCTGCCATGGAAGGCTAC

CAAGTTGTTACCATGGAAGATGCATCCCACATTGGTCAAGTTTTCGTTACCACCACTGGT

TGTAGAGATATTATCAACGGTGAACATTTCATCAACATGCCAGAAGATGCCATTGTTTGT

AACATTGGCCATTTCGATATCGAAATTGATGTCGCCTGGTTAAAGGCTAACGCTAAAGAA

TGTATTAACATCAAACCACAAGTCGACCGTTACTTGTTGTCTTCTGGTAGACACGTCATC

TTGTTGGCTAACGGTAGATTAGTTAACTTGGGTTGTGCTACTGGTCACTCATCTTTCGTT

ATGTCTTGTTCCTTCTCTAACCAAGTCTTAGCTCAAATTGCTTTGTTCAAGTCTAACGAT

AAGTCTTTCAGAGAAAAGCACATTGAATTCCAAAAGACAGGCCCATTCGAAGTTGGTGTC

CACGTTTTGCCAAAGATCTTGGATGAAGCTGTCGCTAAGTTCCACTTGGGCAACTTGGGT

GTTAGATTGACTAAATTGAGTAAAGTCCAATCTGAATACTTGGGTATTCCAGAAGAAGGT

CCATTCAAGGCCGACCACTACAGATATTGA

ATT=Ile

AAGTATCCCTACCTCTCTCCTCTAACGCAGATATTTCTGTGCACGTGATCTCGTTGGCTTTTTTTTCGGCCGAAATTTTCACAGGCTAAGGCCGAAAAAGAAAGAAAATTTTCAGAGGAAAAAGAAAATTAAACGACCTCGAAGCCGTATTTTAGATTTTCCAATCTCTTATTTAGTAACGTGGTTTATTAACTCCATGATTCCATTCCTATTTGTTTTTCTTTCTTTCTGAAAATCCTCTTCTCCTCGAAATAACCCAACTGACAAAAAGAACAATTCCCAATGTCTGCTCCAGCTCAAAACTACAAAATCGCTGATATCTCTTTGGCTGCCTTCGGTAGAAAGGAAATCGAATTGGCTGAACATGAAATGCCAGGTTTGATGGCCATCAGAAAGGCTTACGGTGACGTCCAACCTTTGAAAGGCGCCCGTATTGCTGGTTGTTTGCACATGACCATTCAAACTGCTGTTTTAATTGAAACTTTAGTTGCTTTGGGTGCCGAAGTTACCTGGTCCTCTTGTAACATCTATTCGACTCAAGATCATGCCGCCGCTGCTATTGCCGCTTCCGGTGTTCCAGTTTTTGCCTGGAAGGGTGAAACTGAAGAAGAGTATTTGTGGTGTATTGAACAACAATTGTTTGCCTTCAAGGACAACAAGAAATTGAACTTGATCTTAGATGATGGTGGTGATTTAACCACTTTAGTTCATGAAAAGCACCCTGAAATGCTGGAAGACTGCTTTGGTCTTTCCGAAGAAACTACCACCGGTGTTCACCACTTATACAGAATGGTCAAAGAAGGCAAGTTAAAGGTTCCTGCCATTAACGTTAACGACTCCGTCACTAAGTCCAAGTTTGACAACTTGTACGGCTGTAGAGAATCCTTAGTCGACGGTATTAAGAGAGCCACTGATGTCATGTTGGCTGGTAAGGTTGCCGTTGTTGCTGGTTACGGTGATGTCGGTAAGGGTTGTGCTGCTGCCTTAAGAGGAATGGGTGCTCGTGTCTTGGTTACCGAAATTGACCCAATCAACGCTTTACAAGCTGCCATGGAAGGCTACCAAGTTGTTACCATGGAAGATGCATCCCACATTGGTCAAGTTTTCGTTACCACCATTGGTTGTAGAGATATTATCAACGGTGAACATTTCATCAACATGCCAGAAGATGCCATTGTTTGTAACATTGGCCATTTCGATATCGAAATTGATGTCGCCTGGTTAAAGGCTAACGCTAAAGAATGTATTAACATCAAACCACAAGTCGACCGTTACTTGTTGTCTTCTGGTAGACACGTCATCTTGTTGGCTAACGGTAGATTAGTTAACTTGGGTTGTGCTACTGGTCACTCATCTTTCGTTATGTCTTGTTCCTTCTCTAACCAAGTCTTAGCTCAAATTGCTTTGTTCAAGTCTAACGATAAGTCTTTCAGAGAAAAGCACATTGAATTCCAAAAGACAGGCCCATTCGAAGTTGGTGTCCACGTTTTGCCAAAGATCTTGGATGAAGCTGTCGCTAAGTTCCACTTGGGCAACTTGGGTGTTAGATTGACTAAATTGAGTAAAGTCCAATCTGAATACTTGGGTATTCCAGAAGAAGGTCCATTCAAGGCCGACCACTACAGATATTGATCAATTCAATTCCCATTTCAGTTCTTCTTTCTCACTATTTTTTAATGTTCAAAAACTCAACGGTTTGATCATCAAATAAAAGATCAAATAAATTGCAAATATAAAAACAACAGCTAACAATCCTATCACAGTATTAATAC

SAH1-282

SAH1-1450cSAH1d100-40cTDHu1 SAH1+1450+ASC

SAH1-401

変異遺伝子断片の作製

sah1T279I

SAH1-282 SAH1-1450c

HIS3

SAH1d100-40cTDHu1SAH1+1450+ASC

MIX

Fusion PCR

sah1T279ISAH1-282 SAH1d100-40cTDHu1

HIS3

sah1T279I HIS3

Template; pUC119-SAH1T279I Template; pScHIS3TDH3p

sah1T279I HIS3

SAH1

SAH1

協会７号RAK2359a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3

sah1T279I HIS3

SAH1

a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/SAH1+

協会７号

sah1T279I HIS3

a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/SAH1+

協会７号

URA3

SAH1

SAH1-401 SAH1d100-40cTDHu1

PCRURA3

形質転換（-U-H培地）

sah1T279I HIS3

a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/SAH1+

協会７号SAH1

URA3

sah1T279I HIS3協会７号

URA3

a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/sah1Δ::URA3

協会７号

a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/sah1Δ::URA3

・セルフクローニング・AdoMet高生産・肝臓によい・体によいかも

酒は百薬の長

謝　辞

広島大学水沼正樹先生宮川都吉先生

山口県産業技術センター有富和生氏

山口大学大学院医学系研究科生命機能工学研究室

末廣大輔

磐田化学工業阿野明彦氏