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UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO
Efeito do veneno bruto e da L-aminocido oxidase de Bothrops
pirajai em clulas BCR-ABL positivas
*Verso corrigida da Dissertao apresentada ao Programa de
Ps-Graduao em Biocincias Aplicadas Farmcia. A verso original
encontra-se disponvel na Faculdade de Cincias Farmacuticas de
Ribeiro Preto/USP*.
Sandra Mara Burin
Ribeiro Preto
2011
UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO
Efeito do veneno bruto e da L-aminocido oxidase de Bothrops
pirajai em clulas BCR-ABL positivas
Ribeiro Preto
2011
Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Biocincias Aplicadas Farmcia para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias rea de Concentrao: Biocincias Aplicadas Farmcia.
Orientado(a): Sandra Mara Burin
Orientador(a): Profa. Dra. Fabola Atti de Castro
AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Burin, Sandra Mara
Efeito do veneno bruto e da L-aminocido oxidase de Bothrops pirajai em clulas Bcr-Abl positivas. Ribeiro Preto, 2011.
71 p. : Il. ; 30cm Dissertao de Mestrado, apresentada Faculdade de Cincias
Farmacuticas de Ribeiro Preto/USP. rea de concentrao: Biocincias Aplicadas Farmcia.
Orientadora: Castro, Fabola Atti. 1. Leucemia Mielide Crnica. 2. BCR-ABL 3. Apoptose 4. L-aminocido
oxidase 5. Bothrops pirajai.
FOLHA DE APROVAO
Sandra Mara Burin Efeito do veneno bruto e da L-aminocido oxidase de Bothrops pirajai em clulas Bcr-Abl positivas
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. _____________________________________________________
Instituio: _________________________Assinatura: _________________
Prof. Dr. _____________________________________________________
Instituio: _________________________Assinatura: _________________
Prof. Dr. _____________________________________________________
Instituio: _________________________Assinatura: _________________
Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Biocincias Aplicadas em Farmcia para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias rea de Concentrao: Biocincias Aplicadas Farmcia.
Orientador(a): Profa. Dra. Fabola Atti de Castro
Dedico este trabalho...
... aos meus pais com muito carinho
AGRADECIMENTOS
Deus por ter me dado esta oportunidade e ter me guiado em todos os
momentos para que eu chegasse at aqui.
Profa Dra Fabola Atti de Castro, minha orientadora, pela amizade e
ensinamentos, essenciais para meu crescimento cientfico e pessoal, pela
ateno, dedicao e por estar sempre presente durante o decorrer deste
trabalho.
Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto da Universidade de
So Paulo, pela oportunidade da realizao do mestrado.
Ao CNPq e Fapesp pelo apoio financeiro, concedido para a realizao desta
pesquisa.
Profa Dra Suely Vilela e Dr. Andreimar Soares pela colaborao com este
projeto, cedendo-nos os venenos .
Dra. Simone Kashima Haddad, por disponibilizar o Laboratrio de Biologia
Molecular do Hemocentro de Ribeiro Preto para a realizao dos experimentos.
Fabiana, responsvel pela Citometria de Fluxo, por sua grande colaborao,
essencial durante todo o curso.
Luciana, tcnica do laboratrio de Hematologia da FCFRP, pela amizade e
ajuda com os experimentos, principalmente com os Westerns.
s amigas Raquel, Natlia, Lvia, Aline e Renata do laboratrio de Hematologia
da FCFRP, pela amizade, apoio e colaborao.
Lorena e Maria Augusta, minhas grandes amigas e companheiras desde a
Faculdade por tantos momentos de convvio e experincias trocadas.
s novas amigas Aline e Luiza pela amizade, fora e incentivo.
A todos os amigos e familiares que estiveram comigo durante esta jornada.
O importante no parar de questionar
(Albert Einstein)
i
RESUMO
BURIN, S.M. Efeito do veneno bruto e da L-aminocido oxidase de Bothrops
pirajai em clulas BCR-ABL positivas. 2011. 71f. Dissertao (Mestrado).
Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto Universidade de So
Paulo, Ribeiro Preto, 2011.
A leucemia mielide crnica (LMC) uma doena mieloproliferativa caracterizada citogeneticamente pela presena do cromossomo Philadelfia (Ph) e molecularmente pelo neogene bcr-abl1 que codifica a oncoprotena BCR-ABL com alta atividade de tirosina-quinase. A clula leucmica BCR-ABL+ apresenta baixa adeso ao estroma medular, resistncia apoptose e potencial mitognico exacerbado. A LMC possui curso evolutivo trifsico (fase crnica, acelerada e blstica) e seu tratamento pode ser realizado por meio de diferentes modalidades teraputicas, destacando-se o mesilato de imatinibe (MI) que inibe a TK BCR-ABL induzindo altas taxas de remisso citogentica dos pacientes na fase crnica da doena. Apesar do MI ser eficiente, os pacientes na fase acelerada e blstica da doena so comumente refratrios a essa terapia e na fase crnica h casos de resistncia ao MI descritos. Nesse contexto, potenciais novos frmacos so investigados para melhorar a eficincia da terapia da LMC. Nesse estudo, investigamos o efeito do veneno bruto (VB) e da enzima L-amino-cido-oxidase (LAAO) da Bothrops pirajai em desencadear apoptose em clulas BCR-ABL+. A apoptose das clulas HL-60 e HL-60.BCR-ABL foi quantificada pela deteco da percentagem de clulas com ncleos hipodiplides pela da citometria de fluxo e confirmada pela observao da ativao das caspases 3, 8 e 9 por western-blot. Os resultados obtidos indicam que a LAAO capaz de induzir apoptose em clulas HL-60 e HL-60.BCR-ABL por ativao das vias extrnseca e intrnseca. Alm disso, foi verificado que a LAAO diminui a fosforilao de BCR-ABL em clulas HL-60.BCR-ABL e quando associada ao MI potencializou a inibio da atividade quinase de BCR-ABL. Os dados da presente investigao indicaram ainda que a LAAO capaz de modular a expresso de bad, bak, bax, bid, bimel, fas,fasl, a1, bcl-2, bcl-xl, bcl-w e c-flip, genes reguladores da apoptose celular. Apesar do pouco conhecimento acerca do mecanismo de ao dessa toxina, os dados obtidos sugerem que a LAAO possui o potencial de estimular a apoptose nas linhagens HL-60 e HL-60.BCR-ABL e aumentar o efeito do inibidor da atividade quinase, MI, dados relevantes para estudos futuros associados a descrio de novos frmacos contra leucemia mielide crnica. . Palavras chaves: Leucemia Mielide Crnica, BCR-ABL, Apoptose, L-aminocido oxidase e Bothrops pirajai.
ii
ABSTRACT
Burin, S.M. Effect of Bothrops pirajai crude venom and L-amino acid
oxidase in BCR-ABL positive cells. 2011. 71f. Master. Faculdade de Cincias
Farmacuticas de Ribeiro Preto Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto,
2011.
Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder cytogenetically
characterized by the presence of Philadelphia chromosome (Ph) and molecularly
by bcr-abl1 neogene that encodes the BCR-ABL oncoprotein with high tyrosine
kinase (TK) activity. The leukemic cell BCR-ABL+ presents poor adhesion to bone
marrow stroma, resistance to apoptosis and exacerbated mitogenic potential. The
CML has a three-phase course (chronic, accelerated and blastic phase) and its
treatment can be performed by different therapeutic modalities, especially the
imatinib mesylate (IM) that inhibits the TK BCR-ABL inducing high rates of
cytogenetic remission in chronic phase. Although MI is effective, patients in
accelerated and blastic phases of the disease are often refractory to this therapy
and there are also cases of resistance to MI described in chronic phase. In this
context, potential new drugs are investigated to improve the efficiency of the
therapy of CML. In this study, we investigated the effect of crude venom (CV) and
of the enzyme L-amino acid oxidase (LAAO) from Bothrops pirajai in triggering
apoptosis in BCR-ABL+. The apoptosis of HL-60 cells and HL-60. BCR-ABL was
quantified by detecting the percentage of cells with hypodiploid nuclei by flow
cytometry and confirmed by observation of the activation of caspases 3, 8 and 9
by Western blot. The results indicate that LAAO is able to induce apoptosis in HL-
60 cells and HL-60. BCR-ABL by activation of the extrinsic and intrinsic
pathways. Furthermore, it was found that LAAO decreases phosphorylation of
BCR-ABL in HL-60 cells. BCR-ABL when associated with MI potencialized the
inhibition of kinase activity of BCR-ABL. The data from this study also indicated
that the LAAO is able to modulate the expression of bad, bak, bax, bid, bimel, fas,
FasL, A1, bcl-2, bcl-xl, bcl-w and c-flip, regulatory genes of apoptosis. Even
though there is little knowledge about the mechanism of action of this toxin, the
data obtained suggests that LAAO has the potential to stimulate apoptosis in HL-
60 lines and HL-60. BCR-ABL and increase the effect of the inhibitor of protein
kinase activity, MI, relevant data for future studies associated with the description
of new drugs against chronic myeloid leukemia.
Keywords: chronic myeloid leukemia, BCR-ABL, apoptosis, L-amino acid oxidase
and Bothrops pirajai.
iii
RESUMEN
BURIN, S.M. Efecto del veneno bruto y de la L-aminocido oxidasa de
Bothrops pirajai en clulas BCR-ABL positivas. 2011. 71f. Tesis (Maestra).
Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto Universidade de So
Paulo, Ribeiro Preto, 2011.
La leucemia mieloide crnica (LMC) es una enfermedad mieloproliferativa
caracterizada citogenticamente por la presencia del cromosoma Philadelfia (Ph)
y molecularmente por el neogen bcr-abl1 que codifica la oncoprotena BCR-ABL con alta
actividad de tirosina-cinasa. La clula leucmica BCR-ABL+ presenta baja adhesin al
estroma medular, resistencia a la apoptosis y el potencial mitognico alterado. La LMC
posee un curso evolutivo trifsico (fase crnica, acelerada y blstica) y su tratamiento
puede ser realizado por medio de diferentes modalidades teraputica, destacndose el
mesilato de imatinibe (MI) que inhibe la TK BCR-ABL induciendo altas tasas de remisin
citogentica de los pacientes en la fase crnica de la enfermedad. A pesar del MI ser
eficiente, los pacientes en la fase acelerada y blstica de la enfermedad son
comnmente reflejados a esa terapia y en la fase crnica hay casos de resistencia al MI
descriptos. En este contexto, potenciales nuevos frmacos son investigados para
mejorar la eficiencia de la terapia de la LMC. En este estudio, investigamos el efecto del
veneno bruto (VB) y de la enzima L-amino-cido-oxidasa (LAAO) de Bothrops pirajai en
desencadena apoptosis en clulas BCR-ABL+. La apoptosis de las clulas HL-60 y HL-
60.BCR-ABL fue cuantificada por la deteccin de clulas nucleadas hipodiploides por
citometra de flujo y confirmada por la activacin de las caspasas 3, 8 y 9 por western-
blot. Los resultados obtenidos indicaron que la LAAO es capaz de inducir la apoptosis
en clulas HL-60 y HL-60.BCR-ABL por activacin de las vas intrnsecas y extrnsecas.
Adems de esto, fue verificada que la LAAO disminuye la fosforilacin de BCR-ABL en
clulas HL-60.BCR-ABL y cuando est asociada al MI fue potencializada la inhibicin de
la actividad cinasa de BCR-ABL. Los datos de la presente investigacin indicaron que la
LAAO es capaz de modular la expresin de: bad, bak, bax, bid, bimel, fas,fasl, a1, bcl-2,
bcl-xl, bcl-w y c-flip, los cuales son genes reguladores de la apoptosis celular. Apesar
del poco conocimiento acerca del mecanismo de la accin de esta toxina, los datos
obtenidos sugieren que la LAAO posee el potencial de estimular la apoptosis en los
linajes celulares HL-60 y HL-60.BCR-ABL, as como tambin aumenta el efecto del
inhibidor de la actividad cinasa, MI, datos relevantes para estudios futuros asociados a
la descripcin de nuevos frmacos contra la leucemia mieloide crnica.
Palabras claves: Leucemia Mieloide Crnica, BCR-ABL, Apoptosis, L-aminocido oxidasa y Bothrops pirajai.
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Caritipo de paciente com LMC indicando a presena do Cromossomo Philadphia..................................................................................
4
Figura 2 - Esquema representando a via extrnseca da apoptose.................. 8
Figura 3 Esquema representando a via intrnseca da apoptose................... 9
Figura 4 Anlise da percentagem dos ncleos hipodiplides de clulas HL-60.BCR-ABL pelo mtodo HFS por citometria fluxo..........................................
20
Figura 5 - RNAs extrados de amostras de HL-60 e HL-60 BCR-ABL cultivadas na presena e ausncia da LAAO e submetidos eletroforese em gel red 1,5%.......................................................................................................
23
Figura 6 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 12 e 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB)...........................................
29
Figura 7 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB)...................................................
30
Figura 8 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.Bcr-Abl aps 12 e 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB)............................
31
Figura 9 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB)...................................................
32
0Figura 10 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 18 horas de incubao com a L-aminocido oxidase........................................
33
Figura 11 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.Bcr-Abl aps 18 horas de incubao com a L-aminocido oxidase...............................
34
Figura 12 Ativao da caspase 3 pela LAAO em clulas HL-60.................... 35
Figura 13 Ativao da caspase 8 pela LAAO em clulas HL-60.................... 35
Figura 14 Ativao da caspase 9 pela LAAO em clulas HL-60.................... 36
Figura 15 Ativao da caspase 3 pela LAAO em clulas HL-60.Bcr-Abl....... 36
Figura 16 Ativao da caspase 8 pela LAAO em clulas HL-60.Bcr-Abl....... 37
Figura 17 Ativao da caspase 9 pela LAAO em clulas HL-60.Bcr-Abl....... 37
Figura 18 - Anlise da porcentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com LAAO, MI e LAAO associada ao MI por 18h..........
38
Figura 19 Expresso da protena fosfotirosina, c-abl e de BCR-ABL em clulas HL-60.BCR-ABL sem tratamento, tratadas com MI, LAAO e LAAO associada ao MI por 18 horas............................................................................
41
v
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Seqncia dos oligonucleotdeos utilizados na amplificao dos
cDNAs das molculas envolvidas na apoptose celular, tamanho do
fragmento amplificado e temperatura de anelamento (TA)..............................
25
Tabela 2 - Concentrao dos oligonucleotdeos e Programa das reaes de
amplificao dos genes avaliados...................................................................
26
Tabela 3 - Expresso gnica em clulas HL-60 tratadas com LAAO nas
concentraes de 0,5 e 1,0g/mL....................................................................
43
Tabela 4 - Expresso gnica em clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com
LAAO nas concentraes de 1,0 e 1,5g/mL..................................................
45
vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Abl Ableson leukemia
ACT-D Actinomicina -D
APAF-1 Apoptosis Protease- Activator Facto1
ATP Trifosfato de adenosina
bad bcl-2 antagonist of the cell death
bak bcl-2 homologous antagonist / killer
bax bcl-2 associated x protein
bcl-xl bcl-2 related gene
bcl-w antiapoptotic bcl-2 family member
bcl-2 b-cell lymphoma
bcr Breakpoint cluster region
bcr-abl1 gene resultante da translocao t(9;22)q(34;11)
BCR-ABL protena resultante da expresso do gene bcr-abl1
bid bh3-interacting domain against
bim bcl-2 interacting mediator
BpirLAAO L-aminocido oxidase de Bothrops pirajai
BSA Albumina de soro bovino
cDNA DNA complementar
CT - controle
DD death domain
vii
DISC Death Inducing Signaling Complex
DNA cido desoxirribonuclico
DMSO Dimetilssulfxido
DR Death receptor
FADD Fas- Associated Death Domain
Fas/CD95 receptor de morte
FasL Fas ligand
Flip Flice-inhibitory protein
H2O2 - Perxido de Hidrognio
HEPES - Hidroxietilpiperazina
HFS Hypotonic Fluorescent Solution
HL-60 linhagem celular de leucemia pr-mieloctica
HL-60.BCR-ABL linhagem HL-60 transfectada com o gene bcr-abl1
IAP Proteina Inibidora da Apoptose
IL - Interleucina
INF- Interferon
kDa quilodaltons
LAAO L-aminocido oxidase
LMC Leucemia Mielde Crnica
MI Mesilato de Imatinibe
Ph Cromossomo Philadelphia
viii
PI Iodeto de propdeo
PY - fosfotirosina
PVDF DifluoridoPolividileno
RNA cido Ribonuclico
STAT - Signal transducer and activator of transcription
STI571 Signal Transduction Inhibitor 571
TA Temperatura Ambiente / Temperatura de Anelamento do primer
TBS Salina tamponada com Tris
TK Tirosina quinase
TMO Transplante de Medula ssea
TNF Fator de necrose tumoral
Tris HCl Tris hidroclordrico
t(9;22)q(34;11) translocao entre os braos longos do crmossomos 9 e 22.
SUMRIO
1. INTRODUO................................................................................................. 2
1.1. Leucemia Mielide Crnica............................................................................ 2
1.1.1. Caractersticas Gerais................................................................................................ 2
1.1.2. Leucemia Mielide Crnica e o BCR-ABL............................................................... 3
1.1.3. Leucemia Mielide Crnica e Apoptose................................................................... 5
1.1.4. Tratamento da LMC..................................................................................... 9
1.2. Venenos, L-aminocido-oxidase, e Apoptose................................................ 11
2. OBJETIVOS..................................................................................................... 15
2.1. Geral............................................................................................................... 15
2.2. Especficos..................................................................................................... 15
3. MATERIAL E MTODOS................................................................................. 17
3.1. Linhagens celulares, veneno bruto e L-aminocido oxidase de Bothrops pirajai.....................................................................................................................
17
3.2. Cultivo celular................................................................................................. 17
3.3. Ensaios de Induo de Apoptose.................................................................. 18
3.4. Deteco das caspases 3, 8 e 9 por western-blot......................................... 20
3.5. Deteco do efeito da associao do Mesilato de Imatinibe com a LAAO.....................................................................................................................
21
3.6. Extrao de RNA, sntese de cDNA e PCR em tempo real........................... 23
3.7. Anlise Estatstica.......................................................................................... 27
4. RESULTADOS.................................................................................................. 29
4.1. Induo de Apoptose da linhagem HL-60 pelo Veneno Bruto de Bothrops pirajai.....................................................................................................................
29
4.2. Induo de Apoptose na linhagem HL-60.BCR-ABL pelo Veneno Bruto de Bothrops pirajai................................................................................................................
30
4.3. Induo de Apoptose na linhagem HL-60 pela L-aminocido oxidase de Bothrops pirajai......................................................................................................
32
4.4. Induo de Apoptose na linhagem HL-60.BCR-ABL pela L-aminocido
oxidase de Bothrops pirajai...........................................................................................................
33
4.5. Ativao das Caspases 3, 8 e 9 por western blot.................................................... 34
4.5.1. Anlise da expresso protica das caspases 3, 8 e 9 nas clulas HL-60........................ 35
4.5.2. Anlise da expresso protica das caspases 3, 8 e 9 nas clulas HL-
60.BCR-ABL..........................................................................................................
36
4.6. Deteco da percentagem de ncleos hipodiplides e da atividade de
fosfotirosina na linhagem HL-60.BCR-ABL tratada com Mesilato de Imatinibe e
L-aminocido oxidase.........................................................................................................
37
4.7. Anlise da expresso gnica por PCR em tempo real................................... 41
5. DISCUSSO..................................................................................................... 47
5.1. Deteco do efeito da associao do Mesilato de Imatinibe com a L-
aminocido oxidase...............................................................................................
51
5.2. Anlise da expresso gnica por PCR em tempo real................................... 54
6 . CONCLUSES................................................................................................ 57
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..................................................................... 59
INTRODUO
_______________________________________________________________Introduo 2
1. INTRODUO
1.1. Leucemia Mielide Crnica
1.1.1. Caractersticas Gerais
A Leucemia Mielide Crnica (LMC) uma doena mieloproliferativa,
resultante da expanso clonal de uma clula tronco hematopotica pluripotente
alterada (SAWYERS, 1999; FRAZER et al., 2006; MELO et al., 2007).
Caracteriza-se laboratorialmente por apresentar aumento da produo de
granulcitos maduros, culminando com a leucocitose exacerbada (CHEN, et al.,
2010). Constitui 14% de todas as leucemias e sua incidncia anual de 1 a 2 casos
por 100.000 pessoas, acometendo principalmente os homens em relao as
mulheres (na proporo de 2:1) e mais freqentemente indivduos na faixa etria
entre 45 e 55 anos (FADERL et al., 1999).
O nico fator de risco comprovado para a LMC a exposio radiao
ionizante (DOLL; SMITH, 1968; HEHLMANN et al., 2007).
Baseado em achados clnico-laboratoriais, a LMC apresenta trs estgios de
evoluo distintos: fase crnica, acelerada e blstica. A maioria dos pacientes com
LMC diagnosticada na fase crnica, na qual se observa a elevao do nmero de
granulcitos jovens que preservam suas funes (MELO et al., SHERBENOU;
DRUKER, 2007). Na fase crnica grande parte dos pacientes assintomtica (20-
40% dos casos) ou apresenta sinais e sintomas inespecficos, tais como fadiga,
anorexia, cansao e sudorese.
Os fentipos das fases acelerada e blstica so mais diversos quando
comparados a fase crnica (CHEN et al., 2010; WONG; WITTE, 2004).
A fase acelerada pode surgir em meses ou anos depois do diagnstico da
doena, dependendo principalmente da resposta do paciente ao tratamento
institudo na fase crnica. Esta fase caracteriza-se pelo aumento do nmero de
blastos e basfilos circulantes e alterao significante na contagem de trombcitos.
Na medula ssea h blastos, porm a contagem fica abaixo de 20% (COTTA e
BUESO-RAMOS, 2007).
_______________________________________________________________Introduo 3
A fase blstica caracteriza-se pelo aumento de blastos (>20%) na medula
ssea e sangue perifrico, leucocitose e basofilia no sangue perifrico, anemia e
trombocitopenia (FADERL et al., 1999). Nessa fase, ocorre falha na maturao dos
precursores mielides malignos, que frequentemente possuem anormalidades
citogenticas adicionais o que resulta na agudizao da LMC, a doena progride
para leucemia linfide ou mielide aguda (HEANEY et al., 2007; CHAUFFAILLE,
2009).
O fentipo agressivo da crise blstica sugere que diferentes anormalidades
oncognicas como trissomia do cromossomo 8, perda da funo de genes
supressores de tumor como p16 e p53 poderiam levar transio da fase crnica
para a blstica (CHEN et al., 2010; MICHOR, 2007; MITELMAN, 1993, JENNINGS &
MILLS, 1998).
1.1.2. Leucemia Mielide Crnica e o BCR-ABL
Em 1960, o sinal patognomnico da LMC foi descrito por Nowel e Hungerford,
o cromossomo Philadelphia (Ph). Esta descoberta foi a primeira demonstrao de
um rearranjo cromossomal ligado a patognese de um cncer especfico. Esse
marcador citogentico da LMC, foi identificado como resultante de uma translocao
recproca entre os braos longos dos cromossomos t(9;22)q(34;11). Dessa
translocao surge o cromossomo 22 encurtado, denominado cromossomo
Philadelphia (NOWEL; HUNGERFORD, 1960; WESTBROOK, 1992) (Figura 1), e o
neogene bcr-abl1 que codifica a oncoprotena BCR-ABL com elevada e constitutiva
atividade tirosina-quinase (DI BACCO et al., 2000; NEVIANI et al, 2007).
Assim, o neogene bcr-abl1 o responsvel pelo fentipo maligno das clulas
leucmicas, pois determina a transformao da clula progenitora hematopotica
nomal em maligna por meio de trs mecanismos principais: induz na clula a
resistncia apoptose, adeso alterada ao estroma medular e alto potencial
mitognico. Portanto, pacientes com LMC, apresentam clulas precursoras
hematopoticas e do sangue perifrico malignas mais resistentes apoptose do que
as clulas normais, devido expresso da tirosina-quinase Bcr-Abl Estas alteraes
nos mecanismos reguladores da proliferao e morte da clula progenitora culminam
_______________________________________________________________Introduo 4
no acmulo de clulas leucmicas BCR-ABL positivas encontradas na LMC.
(NEVIANI, 2007).
Daley e colaboradores, em 1990, por meio de experimentos com modelos
murinos que mimetizavam a doena, detectaram que a protena quimrica BCR-ABL
estava associada ao desenvolvimento da LMC. Nesses modelos, o camundongo,
aps ter sido transplantado com medula ssea, cujas clulas apresentavam um vetor
retroviral com Bcr-Abl, desenvolveu sndrome mieloproliferativa com as
caractersticas da LMC.
A instabilidade gentica, conseqncia da translocao que originou o
cromossomo Ph, provavelmente a responsvel pelas aberraes cromossmicas
ou mutaes adicionais nas clulas leucmicas (CILLONI; SAGLIO, 2009)
Ao ocorrer a translocao entre os cromossomos 9 e 22, diferentes tamanhos
de protenas como p190, p210 e p230 kDa, podem ser originados, dependendo do
stio de quebra do gene Bcr. A protena de tamanho p210 a mais freqente e est
associada com a patognese da LMC e induo de apoptose por drogas
citostticas e radiao ionizante (NISHII et al, 1996), enquanto a p190 est ligada ao
pior prognstico da doena. A p230 est associada com a leucemia neutroflica
crnica, forma mais indolente da doena (BRECCIA et al., 2011; DI BACCO et al.,
2000; NEVIANI et al., 2007).
Figura 1 Caritipo de paciente com LMC indicando a presena do Cromossomo Philadelphia. As setas representam os cromossomos originados pela translocao t(9;22)q(34;11). Figura adaptada de: www.fleury.com.br (acessado em fevereiro, 2011).
http://www.fleury.com.br/
_______________________________________________________________Introduo 5
1.1.3. Leucemia Mielide Crnica e Apoptose
A apoptose, processo fisiolgico de morte celular programada, desempenha
importante papel na homeostase dos diferentes tecidos e controla, inclusive, o
sistema hematopotico (MAURILLO et al., 2001).
A resistncia anormal apoptose pode conduzir ao aparecimento de
neoplasias e doenas auto-imunes (RAMENGHI et al., 2000) devido a persistncia
de clulas mutantes ou transformadas, enquanto que sua exacerbao acarreta o
surgimento de doenas agudas neurodegenerativas e neuromusculares
(RATHMELL; THOMPSON, 2002).
O fenmeno da apoptose celular quando iniciado promove a ativao de
eventos moleculares, que culminam na ativao de certas proteases, denominadas
caspases, as quais so responsveis pelo desmantelamento e morte celular
(AMARANTE-MENDES; GREEN, 1999). A regulao deste processo realizada por
fatores inibidores e ativadores da cascata apopttica, entre os quais podemos
destacar os receptores de morte (death receptors) pertencentes famlia do
receptor de TNF- (SUDA et al., 1993), as protenas pertencentes s famlias Bcl-2,
IAPs, FLIPs, Caspases, ou ainda fatores de supresso de tumores com p53, entre
outros. (HALE et al., 1996; BORNER, 2003). O equilbrio das interaes entre as
protenas pro- e anti-apoptticas definem a ocorrncia da morte celular.
A apoptose pode ser desencadeada por duas vias, a via extrnseca (figura 2)
e a via intrnseca (figura 3). A chamada via extrnseca iniciada pela ligao dos
receptores de morte (DR, Death Receptors - Fas/CD95, TNFRI, DR3, DR4, DR5 e
DR6), aos seus respectivos ligantes. Os DR so molculas existentes na superfcie
celular que apresentam um domnio extracelular rico em cistena e um domnio
intracelular denominado DD (death domain). A interao receptor-ligante leva a
uma interao homoflica de receptor-adaptador citoplasmtico de domnio de morte.
O adaptador de protena Fas associado ao DD (FADD) permite o recrutamento da
pro-caspase 8, formando o complexo DISC (Death-inducing signaling complex). A
pr-caspase 8 autoclivada e transformada em caspase 8 ativa, sendo ento
liberada para o citoplasma, onde poder agir diretamente na ativao da caspase 3
(fase executora do processo de apoptose), ou ento agir na clivagem da molcula
Bid, a qual se dirige mitocndria, induzindo a liberao de citocromo c e SMAC. A
_______________________________________________________________Introduo 6
clivagem de Bid representa um ponto de interconeco entre as vias extrnseca e
intrnseca da apoptose (AMARANTE-MENDES; GREEN 1999; ZIVNY et al., 2010).
Por outro lado, a via intrnseca comea pela ao de diferentes sinais de estresse
intracelular, tais como irradiao, agentes quimioterpicos, vrus, bactrias e
ausncia de fatores de crescimento celular, os quais convergem para a mitocndria,
induzindo a translocao de citocromo c e SMAC (second mitochondria-derived
activator of caspases) destas organelas para o citosol, resultando, na presena de
APAF-1, na ativao de molculas de caspase-9. A via executora do processo de
apoptose comum a ambas vias iniciadoras caracteriza-se pela ativao das
caspases executoras, a saber, caspases-3, -6 e -7, e pelo desmantelamento celular
caracterstico da apoptose (DU et al., 2000 ; SHARMA et al., 2000; SUSIN et al.,
1999).
A regulao da via mitocondrial realizada pelos membros da famlia Bcl-2,
protenas citoplasmticas capazes de integrar sinais de sobrevida ou morte celular
gerados nos meios intra e extracelulares (BORNER, 2003). Essa famlia subdivide-
se em duas classes: protenas anti-apoptticas (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 e A1),
cuja funo proteger a clula da morte, e pro-apoptticas (Bax, Bak, Bad, Bid, Bmf
etc), que sensibilizam ou conduzem a clula apoptose (BORNER, 2003). As
protenas inibidoras interferem na formao do complexo APAF-1/caspase 9 por
meio do bloqueio da liberao do citocromo C ou SMAC/DIABLO da mitocndria
(BORNER, 2003). As protenas pr-apoptticas (Bax, Bak e Bad) ativam-se quando
interagem com a molcula tBid, liberada pela clivagem da protena Bid pela caspase-
8. A via mitocondrial tambm susceptvel a regulao negativa pelas protenas da
famlia dos IAPs (c-IAP-1 e -2, X-IAP e Survivina), as quais podem inibir as
caspases-3 e -9, mas so bloqueadas pelo SMAC (HUANG 2002; SHI 2002).
Como citado anteriormente, a ausncia ou diminuio da expresso das
protenas pr-apoptticas esto associadas ao aparecimento de infeces
recorrentes, doenas hematolgicas (linfomas e leucemias), autoimunes e
resistncia a drogas (SHARMA et al., 2000). Em contraste, a exacerbao dessa
expresso obtida por meio da utilizao de radioterapia, antineoplsicos,
imunoterpicos no tratamento de tumores slidos ou leucemias conduz a cura de
doenas (GUILHOT; LACCOTTE 1998; SHARMA et al., 2000). Ainda neste contexto,
anormalidades concernentes expresso das protenas anti-apoptticas tambm
culminariam em doenas.
_______________________________________________________________Introduo 7
A elucidao dessas anomalias em diferentes doenas poderia colaborar com
a escolha e/ou modulao do tratamento dessas doenas. Por exemplo, o proto-
oncogene bcl-2, presente na membrana mitocondrial interna de vrias linhagens
celulares, inibe a ativao do fenmeno da apoptose, com o aumento de sua
expresso em linfcitos, clulas precursoras hematopoticas e tumorais,
promovendo a resistncia celular apoptose (HOCKENBERY, et al., 1991).
Outro dado a ser ressaltado, o fato de que a citotoxicidade mediada pelas
clulas T e NK contra clulas tumorais pode ser exercida pela via de ativao do
sistema Fas-FasL, todavia clulas tumorais podem evadir da resposta imune pela via
Fas-FasL. Assim, clulas leucmicas ou tumorais que secretam ou expressam o
antgeno FasL podem promover a apoptose de clulas efetoras, impedindo que
estas atuem na erradicao do clone tumoral (LICKLITER, et al., 1999). O antgeno
FasL presente nas clulas tumorais, quando ligado ao antgeno Fas das clulas
efetoras, conduziria apoptose da clula efetora, diminuindo o pool circulante de
clulas da resposta imune. Por isso, a necessidade da observao do nvel de
expresso dos antgenos Fas nas clulas da resposta imune e FasL nas clulas
precursoras malignas.
sabido que, na LMC, as clulas precursoras hematopoticas malignas so
mais resistentes apoptose do que as clulas normais, devido expresso da
tirosina-quinase bcr-abl1 que prolonga a sobrevida da clula. A protena BCR-ABL
parece exercer sua capacidade antiapopttica, por meio do aumento da expresso
das protenas BCL-2 e BCL-XL nas clulas malignas (SANCHEZ-GARCIA ;MARTIN-
ZANCA, 1997).
Handa e colaboradores (1997) relataram que, na LMC, a expresso da
protena Bcl-2 aumenta com a progresso da doena, o que suporta a hiptese de
que seja a expresso desta protena, em altos nveis, que prolongaria a sobrevida da
clula leucmica e a torna resistente a apoptose enquanto que Wei et al (2007)
demonstraram que o perfil das protenas reguladoras da apoptose tem relao com
a resposta aos inibidores de TK. O antgeno Fas parece estar expresso em nveis
normais nas clulas malignas dos pacientes portadores de LMC na fase crnica,
mas devido a alta expresso do BCL-2, as clulas malignas apresentam resistncia
apoptose (RAVANDI, et al., 2001). A correlao entre a patognese/prognstico da
LMC com as demais protenas reguladoras do processo de apoptose tem sido pouco
_______________________________________________________________Introduo 8
investigada, no entanto como a clula precursora maligna presente na doena
resistente apoptose, esta abordagem precisa ser melhor explorada.
Algumas modalidades de tratamento da LMC, como os inibidores da tirosina-
quinase, parecem objetivar a inibio da proliferao celular, da atividade quinase e
potencializao da apoptose. Mesmo com a eficincia dessa terapia h ainda
pacientes que apresentam progresso da doena ou mesmo refratariedade s
terapias.
Assim sendo, a descrio de substncias capazes de tornar essas clulas
mais sensveis apoptose poderiam colaborar no aumento da eficcia dos inibidores
de tirosina quinase no tratamento dessa doena.
Figura 2 Esquema representando a via extrnseca da apoptose. Figura adaptada de PEREIRA e AMARANTE-MENDES, 2011.
Apoptose
Tipo I Tipo II
_______________________________________________________________Introduo 9
Figura 3 Esquema representando a via intrnseca da apoptose. Figura adaptada de PEREIRA e AMARANTE-MENDES, 2011.
1.1.4. Tratamento da LMC
O tratamento clnico da LMC pode ser realizado por meio da quimioterapia
(hidroxicarbamida), inibidores da enzima tirosina-quinase (STI571 ou mesilato de
imatinibe ou Glivec; dasatinibe e nilotinibe) e transplante de medula ssea (TMO).
Dentre esses, o mesilato de imatinibe (MI) escolhido como primeira linha do
tratamento de LMC para a maioria dos pacientes diagnosticados na fase crnica
(BRECCIA et al., 2011).
O MI demonstrou ser 10 vezes mais potente do que IFN- no controle da
doena (GOLDMAN, 2004). Seu mecanismo de ao consiste em ocupar, e
conseqentemente bloquear, o stio cataltico da molcula BCR-ABL na regio de
ligao ao ATP. Dessa forma, a atividade enzimtica da protena BCR-ABL
suprimida e a clula leucmica morre. Um dos grandes trunfos do mesilato de
imatinibe sua alta especificidade; ele liga-se quase que exclusivamente a BCR-
ABL, alm de algumas outras tirosina-quinases, como c-kit e receptor de PDGF
(BRECCIA et al., 2011; BUCHDUNGER et al., 2000), com o que praticamente no
provoca efeitos colaterais (JOHN et al., 2004). Alm de impedir o avano da
Apoptose
Clivagem de substratos
Apoptose
Apoptossomo
Rompimento
citoesqueleto
Retirada do fator
de crescimento
Protenas
BH3-only
Membrana plasmtica
Danos DNA
Ativao p53
Expresso de NOXA e PUMA
_______________________________________________________________Introduo 10
leucemia, por bloquear a progresso para a fase acelerada ou blstica, o mesilato
de imatinibe normaliza a contagem de leuccitos no sangue perifrico em 98% dos
casos, o que configura remisso hematolgica (KANTARJIAN et al., 2002 e 2003).
Os pacientes nas fases acelerada e blstica apresentam boa resposta inicial
ao mesilato de imatinibe, aps 4 semanas, 69% dos pacientes que comearam a ser
tratados na fase acelerada e 15% daqueles j na fase blstica respondem ao
tratamento, o que at ento no havia sido reportado para nenhum outro frmaco
(TALPAZ, 2002; SESSIONS, 2007). Apesar dos avanos obtidos com a utilizao do
MI no tratamento dos pacientes com LMC, vrios mecanismos de resistncia das
clulas leucmicas a esse tratamento j foram descritos e clulas BCR-ABL
positivas persistem na medula ssea e sangue perifrico mesmo aps a terapia. As
principais causas dessa resistncia so: presena de mutaes no stio cataltico de
Bcr-Abl, duplicao do cromossomo Philadelfia, superexpresso do gene bcr-abl e
reduo na captura do composto devido a superexpresso de glicoprotena P (Pgp)
ou, alternativamente, por metabolizao excessiva (RADICH, 2010; MAHON et al.,
2000; GORE et al., 2001; SHAH et al., 2002; AZAM et al., 2003).
Outras opes para o tratamento dos pacientes resistentes ao MI seriam o
dasatinibe e o nilotinibe. Medicamentos mais potentes que o MI, mas que tambm
so ineficientes nos pacientes em fases acelerada, blstica ou portadores da
mutao T315I (SHERBENOU; DRUKER, 2007). Um nmero de novos inibidores de
TK, como o Bosutinibe e Sarafenib, esto em desenvolvimento (JABBOUR et al.,
2009).
A persistncia de clulas BCR-ABL positivas nos pacientes em tratamento
com o mesilato de imatinibe indica que a inibio da atividade de tirosina-quinase de
Abl talvez no seja suficiente para erradicar todas as clulas leucmicas. Assim
sendo, a identificao de novos frmacos que induzam a morte da clula leucmica
BCR-ABL positiva ou potencializem a ao do mesilato de imatinibe seria de
fundamental importncia para o tratamento de pacientes com LMC resistentes ao
inibidor de tirosina-quinase.
_______________________________________________________________Introduo 11
1.2. Venenos, L-aminocido-oxidase, e Apoptose
As toxinas animais tm sido importantes instrumentos para ampliar os
conhecimentos sobre a fisiologia humana e farmacologia. Informaes sobre a
natureza e mecanismos de ao das toxinas permitiram a evoluo do tratamento de
suas intoxicaes baseada em informaes mais cientficas e, portanto, mais
eficientes (BERTAZZI et al., 2005).
Os venenos da maioria das serpentes so constitudos por toxinas, em
concentraes variadas, as quais incluem: neurotoxinas, citotoxinas, cardiotoxinas,
protenas que agem na hemostasia (proteases) e peptdeos (desintegrinas,
peptdeos potenciadores da bradicinina/inibidores da enzima conversora de
angiotensina), oxidases (L-aminocido oxidase), hialuronidases, metaloproteases e
lectinas (DUERRE et al.,1975; MATSUI et al., 2000, RAMOS e SELISTRE-DE-
ARAJO, 2006; SARRAY et al., 2004).
O gnero Bothrops encontrado em todo o Brasil o responsvel pela maioria
dos acidentes ofdicos brasileiros (EVANGELISTA, et al., 2010). A ao de seu
veneno proteoltica, coagulante e hemorrgica (RAMOS; SELISTRE-DE-ARAJO,
2006; QUEIROZ et al., 2008).
Da Silva e colaboradores, em 1996, mostraram que o veneno de Bothrops
jararaca apresentou efeito antitumoral nas clulas de Tumor Asctico de Ehrlich e
que este efeito antitumoral deve ser devido ao efeito anti-proliferativo celular
associado indiretamente com a resposta inflamatria mediada por IL-2, IL-8 e TNF-.
Outros pesquisadores demonstraram, por exemplo, a atividade
anticarcinognica do veneno da cobra Indiana monocellate, estudada recentemente
em modelos de leucemia, carcinoma e sarcoma (GOMES et al., 2010; DEBNATH et
al., 2007; KARTHLEYAN et al., 2008).
Os componentes biologicamente ativos que se encontram em maior quantidade
nos venenos das serpentes do gnero Bothrops so: fosfolipase A2,
metaloproteases, serinoproteases, LAAOs, fatores de crescimento dos nervos (NGF)
e lectina tipo C, protenas ricas em cistena (CORREA-NETTO et al., 2010). Dentre
este conjunto complexo de componentes txicos e no txicos destaca-se a LAAO,
_______________________________________________________________Introduo 12
que representa de 1 a 9% do total das protenas do veneno (IZIDORO et al., 2006).
As L-Aminocido Oxidases (LAAOs, EC 1.4.3.2) so flavoenzimas que
catalizam a deaminao oxidativa de L-aminocidos em -cetocido com a
produo de amnia e perxido de hidrognio. As LAAOs so usualmente
glicoprotenas homodimricas ligantes de FAD, com uma massa molecular entre 110
e 150 kDa, quando medidas por filtrao em gel em condies no-desnaturantes.
Esta verstil classe de enzimas est amplamente distribuda em vrias
espcies de seres vivos, como nas peonhas de serpentes, insetos, fungos,
bactrias e at mesmo plantas (TAN ;FUNG, 2008; DU & CLEMETSON, 2002).
As LAAOs so substncias de grande interesse na rea cientfica, por
apresentarem alto potencial citotxico sobre diversos patgenos, linhagens celulares
tumorais, fungos e vrus (LEE et al., 2011; SUN et al., 2010; WEI et al., 2009;
ZULIANI et al., 2009; DU e CLEMETSON, 2002). O efeito farmacolgico desta
enzima ainda incerto (TORRES et al., 2010; TORII et al.,1997), contudo trabalhos
recentes descrevem amplos efeitos biolgicos e farmacolgicos como, induo de
apoptose (YAN, 2006; 2005), citotoxicidade, induo e/ou inibio de agregao
plaquetria, hemorragia, hemlise, edema, atividade bactericida, leishmanicida e
anti-HIV (SUN et al., 2011; STILES et al., 1991; SUHR e KIM, 1996; SOUZA et al.,
1999; SAKURAI et al., 2001 e 2003; DU e CLEMETSON, 2002; SAMEL et al., 2006;
STABELI et al., 2007). Muitos dos efeitos biolgicos de LAAOs so creditados aos
efeitos secundrios do perxido de hidrognio (H2O2), produzido durante a reao
enzimtica e que induz a apoptose celular (RODRIGUES et al., 2009; DU;
CLEMETSON, 2002; LEWIS; GARCIA, 2003; ANDE et al., 2006).
Apesar dos numerosos estudos publicados sobre as LAAOs e suas atividades
biolgicas, pouco se sabe sobre a ao do veneno e da LAAO de B. pirajai,
conhecida popularmente como jararacussu da Bahia (COSTA et al., 1999).
Investigaes demonstraram o efeito citotxico da LAAO de Bothrops pirajai
(BpirLAAO) em linhagens celulares de tumor S180, cncer de mama, leucemia
aguda de clulas T e tumor Asctico de Erlich (IZIDORO et al., 2006). O efeito
observado nesse ltimo caso foi dose dependente sobre as clulas tumorais e
parece estar relacionado tambm a produo de perxido de hidrognio (IZIDORO
et al.,2006).
_______________________________________________________________Introduo 13
Nesse contexto, a L-aminocido oxidase de Bothrops pirajai torna-se
interessante para a investigao sobre clulas leucmicas BCR-ABL positivas para
possvel descrio de tratamento mais eficiente para pacientes com LMC.
OBJETIVOS
________________________________________________________________Objetivos 15
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Avaliar o potencial do veneno bruto e da enzima LAAO de Bothrops pirajai em
induzir apoptose nas clulas BCR-ABL positivas.
2.2. Especficos
A) determinar as doses do veneno bruto e da LAAO de Bothrops pirajai capazes de
induzir apoptose em clulas HL-60 e HL-60.BCR-ABL;
B) verificar se a morte celular nessas linhagens desencadeada pela via intrnseca
ou extrnseca da apoptose;
C) checar se a LAAO sensibiliza a morte de clulas HL-60.BCR-ABL pelo inibidor de
tirosina-quinase mesilato de imatinibe
D) avaliar se a LAAO, em baixas concentraes, modula a expresso de genes pr e
anti-apoptticos que controlam a apoptose celular em clulas HL-60 e HL-60.BCR-
ABL.
MATERIAL E MTODOS
_________________________________________________________Material e Mtodos 17
3. MATERIAL E MTODOS
3.1. Linhagens celulares, veneno bruto e L-aminocido oxidase de Bothrops
pirajai
Foram empregadas nesse estudo as linhagens celulares HL-60 (clula derivada
de leucemia pr-mieloctica) e HL-60.BCR-ABL. Esta ltima, cedida gentilmente pelo
Prof. Dr. Gustavo Amarante Mendes do Departamento de Imunologia do Instituto de
Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo.
A HL-60.BCR-ABL originada da infeco de clulas HL-60 selvagens com
retrovrus recombinante, obtidas por meio da transfeco por eletroporao da
combinao de clulas empacotadoras das linhagens PA317 e 2 com o plasmdeo
pSRMSVp185bcr-abl tkneo, contendo o gene bcr-abl. Quando comparada a clula
HL-60 vetor e selvagem, essa clula transfectada com o gene bcr-abl
extremamente resistente apoptose induzida por agentes apoptognicos clssicos
como actinomocina-D, teniposdeo, etoposdeo, vincristina, citarabina,
estaurosporina e ciclofosfamida (BRUMATTI et al., 2003; AMARANTE-MENDES, et
al., 1997 e 1998 ).
O veneno bruto e o componente biologicamente ativo L-aminocido oxidase
(LAAO) da Bothrops pirajai foram fornecidos pela Profa. Dra. Suely Vilela da FCFRP-
USP e pelo Dr. Andreimar Martins Soares. A enzima LAAO purificada e utilizada
nesse estudo apresentou grau de pureza superior a 95%.
3.2. Cultivo celular
As linhagens celulares encontravam-se congeladas em nitrognio lquido e
continham aproximadamente 1x107 clulas/mL de soluo de congelamento (soro
bovino fetal, 10% DMSO). O descongelamento deu-se submergindo o flaconete com
as clulas em recipiente de gua a 37C at que as mesmas se desgrudassem da
parede do tubo. Assim sendo, as clulas foram depositadas em 10 mL de meio
RPMI completo (suplementado com 10% soro bovino fetal, 2mM glutamina,
100UI/mL penicilina, 100 g/mL estreptomicina e 25mM HEPES) e centrifugadas a
_________________________________________________________Material e Mtodos 18
240 x g a 4C por dez minutos. Aps esse procedimento as clulas foram
ressuspensas em 1mL de meio RPMI, contadas em azul de tripan na cmara de
Newbauer e plaqueadas para cultivo.
Aps estabelecimento do crescimento celular de modo exponencial, as
linhagens celulares foram empregadas nos experimentos com o veneno bruto e
LAAO. Os ensaios foram realizados somente quando a viabilidade celular, verificada
pelo mtodo do azul de tripan, estava superior a 95%.
3.3. Ensaios de Induo de Apoptose
Esses experimentos foram realizados para avaliar se o veneno bruto e a
LAAO eram capazes de induzir a apoptose nas linhagens celulares HL-60 e HL-
60.BCR-ABL. As clulas foram plaqueadas na concentrao de 2x104 por poo em
placas de 96 poos na presena e na ausncia do VB e da LAAO de Bothrops pirajai
para padronizao da tcnica e das doses a serem utilizadas nos experimentos
subseqentes.
Foram utilizadas durante a padronizao dos ensaios as concentraes de
0,05 g/mL, 0,1 g/mL, 0,5 g/mL, 1,0 g/mL, 5,0 g/mL, 7,5 g/mL, 10 g/mL, 25
g/mL, 50 g/mL e 100 g/mL do veneno bruto e 0,5 g/mL, 1,0 g/mL, 1,5 g/mL,
2,0 g/mL, 2,5 g/mL e 5 g/mL de LAAO, alm da realizao dos controles
negativo (somente clulas) e positivo (clulas na presena do indutor de apoptose
clssico).
As clulas HL-60 e HL-60.BCR-ABL foram plaqueadas na concentrao de
2x104 /poo e incubadas na presena ou ausncia dos tratamentos citados
anteriormente por 12 e 18 horas.
O controle positivo de induo de apoptose foi realizado com clulas
plaqueadas com o agente apoptognico Actinomicina (ACT-D) (Sigma, St Louis,
Missouri, EUA) na concentrao de 1M. Todos os testes foram realizados em
triplicatas.
Aps a incubao das clulas com o VB e LAAO por 12 e 18 horas as clulas
foram recuperadas dos poos, centrifugadas e submetidas avaliao da apoptose
celular pelo mtodo de Hypotonic-Fluorescent-Solution (HFS, soluo hipotnica
_________________________________________________________Material e Mtodos 19
fluorescente). Os resultados obtidos foram expressos pela mdia da percentagem de
ncleos hipodiplides das amostras obtidas em trs experimentos independentes.
Aps padronizao dos testes foram iniciados os ensaios para
determinao do efeito da LAAO sobre as linhagens celulares.
Foram plaqueadas as clulas HL-60 e HL-60.BCR-ABL na concentrao de
1x105 por poo e incubadas durante 18 horas com os diferentes tratamentos. Aps
esse perodo, as clulas foram recuperadas dos poos, centrifugadas por 240 x g a
4C durante dez minutos e submetidas avaliao da apoptose pelo mtodo HFS.
As clulas recuperadas dos poos da cultura aps exposio ao veneno
bruto, LAAO e agente apoptognico foram incubadas com soluo HFS (iodeto de
propdeo 50 g/mL em citrato de sdio 0,1% e Triton X-100 0,1%) por 15 minutos e
analisadas por citometria de fluxo (FACSCanto, BD) pelo software DiVa.
A percentagem de morte celular destes ensaios foi quantificada avaliando-se
o contedo de DNA genmico (percentagem de ncleos hipodiplides), visto que as
clulas foram marcadas com iodeto de propdio (PI) e os espectros de emisso de
luz pelos fluorocromos foram analisados no citmetro de fluxo (FACSCanto, BD, San
Jose, Califrnia, EUA), detector FL2, com gate retirando apenas debris . Foram
adquiridos e analisados cinco mil eventos da gate por meio de grficos em formato
de histograma. A avaliao do contedo de DNA foi feita por meio da incorporao
de PI em ncleos isolados. Dessa forma, os ncleos de clulas saudveis exibem
incorporao compatvel com contedo diplide ou tetraplide, presente em clulas
em fase G0-G1 ou G2-M, enquanto que ncleos apoptticos aparecem na regio
hipodiplide do histograma, devido fragmentao ou maior condensao da
cromatina (NICOLETTI et al, 2006; ,BRUMATTI et al., 2003).
A figura 4 mostra os grficos de citometria de fluxo obtidos durante a anlise
da percentagem de clulas em ncleos hipodiplides pelo mtodo de HFS. Na figura
4A o histograma refere-se ao controle negativo do experimento, ou seja, o HFS de
clulas HL-60.BCR-ABL no tratadas, enquanto que a figura 4B ilustra a anlise de
clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com LAAO. Observa-se na figura 3B que a LAAO
induziu a apoptose nas clulas HL-60.BCR-ABL, pois h marcao dos ncleos
hipodiplides com iodeto de propdio.
_________________________________________________________Material e Mtodos 20
Figura 4 Anlise da percentagem dos ncleos hipodiplides de clulas HL-60.BCR-ABL pelo mtodo HFS por citometria fluxo. 4A) Controle negativo do ensaio. 4B) Clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com LAAO na concentrao de 2,5g/mL. O histograma indica a intensidade de fluorescncia (percentagem) dos ncleos hipodiplides (clulas em apoptose) marcados com iodeto de propdio (P2) e ncleos diplides (P1, clulas viveis).
3.4. Deteco das caspases 3, 8 e 9 por western-blot
A deteco da ativao das caspases 3, 8 e 9 por western-blot foi realizada
com o intuito de confirmar a induo de apoptose das clulas HL-60 e HL-60.BCR-
ABL pela LAAO e determinar se a ativao da morte foi desencadeada pela via
extrnseca ou intrnseca da apoptose.
Assim sendo, 1x106 cellas HL-60 e HL-60.BCR-ABL foram cultivadas com as
diferentes concentraes de LAAO (0,5 g/mL, 1,0 g/mL, 1,5 g/mL, 2,0 g/mL e
2,5 g/mL), sem estmulo (controle negativo) e estimuladas com ACT-D 1M
(controle positivo) por 18h. Aps esse perodo as clulas foram coletadas e
ressuspensas em tampo de amostra para western-blot (5% de mercaptoetanol, 4%
de SDS, 20% de glicerol e 100mM Tris-CL-pH 6).
O lisado protico das linhagens HL-60 e HL-60.BCR-ABL foram separadas
por SDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF para deteco das
caspases. As membranas de western-blot foram bloqueadas em tampo de lavagem
com 5% de leite desnatado por 12 horas temperatura ambiente (TA) e
subseqentemente incubadas com os anticorpos primrios especficos desejados.
A) B)
P2
P1 P1
P2
_________________________________________________________Material e Mtodos 21
Os anticorpos primrios utilizados foram: anticorpo monoclonal de camundongo anti-
caspase 8 humano na diluio de 1:1000 (cdigo 551243; BD Pharmingen, San
Diego, Califrnia, EUA), anticorpo policlonal de coelho anti-caspase 3 humano na
diluio 1:1000 (cdigo 235412, Calbiochem, Darmstadt, Germany), anticorpo
monoclonal de camundongo anti-caspase 9 humano na diluio 1:250 (cdigo
63103; SIGMA, San Louis, Missouri, EUA) e anticorpo policlonal de coelho anti
tubulina 1:5000, (cdigo T3320; SIGMA, San Louis, Missouri, EUA), empregada para
marcar a protena endgena das amostras investigadas.
Esses anticorpos foram diludos, nas concentraes indicadas em soluo
de bloqueio contendo 0,01% azida por perodo que variou de 16h 72h, em
temperatura ambiente. Aps trs lavagens das membranas com tampo TBS-T
(20 mM de Tris-CL-pH 6, 137 mM NaCl e 0,1% de Tween), essas foram incubadas
com os anticorpos secundrios anti-camundongo e anti-coelho conjugados
peroxidase na diluio de 1:2000 (Amersham Biosciences, GE Healthcare Life
Science, Pittsburgh, Pensilvnia, EUA) por uma hora a temperatura ambiente (TA). A
deteco da marcao foi realizada pelo mtodo de quimioluminescncia
(Amersham ECL Plus, GE Healthcare Life Science, Pittsburgh, Pensilvnia, EUA).
3.5. Deteco do efeito da associao do Mesilato de Imatinibe com a LAAO
O efeito da LAAO e da LAAO associada ao Mesilato de Imatinibe (MI)
(Novartis Pharma AG, Suia) sobre a atividade quinase de BCR-ABL e quanto ao
potencial indutor de apoptose foi avaliado em clulas HL-60.BCR-ABL.
Clulas HL-60.BCR-ABL na concentrao de 1x106 foram plaqueadas em
placas de 24 poos da seguinte forma: controle negativo; clulas com MI na
concentrao de 10 M por 18h; clulas, MI na concentrao de 10uM e LAAO nas
concentraes de 0,5 g/mL, 1,0 g/mL, 1,5 g/mL, 2,0 g/mL e 2,5 g/mL por 18
horas. Paralelamente, 1x106 dessas clulas foram cultivadas junto ao MI na
concentrao de 10 M por 2h horas para observar diferena do perfil de inibio
da atividade quinase entre 2 e 18h de incubao com o frmaco.
Aps os perodos correspondentes de incubao, as clulas foram coletadas
dos poos, colocadas em tampo HFS e de amostra de western-blot.
_________________________________________________________Material e Mtodos 22
A quantificao da apoptose das clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com a
associao LAAO e MI, nas diferentes concentraes por 18h, foi determinada pelo
mtodo de HFS, cuja tcnica est descrita no item III.3 dessa dissertao.
Para avaliar a potencial inibio da atividade quinase de BCR-ABL pela LAAO
foi realizado o western-blot nos lisados proticos celulares para deteco de
fosfotirosina.
Assim, amostras da enzima LAAO previamente incubadas (nas
concentraes: 0,5 g/mL; 1,0 g/mL; 1,5 g/mL; 2,0 g/mL e 2,5 g/mL) por 18h
foram utilizadas.
O lisado protico das amostras foi submetido ao SDS-PAGE para separao
das protenas, que foram posteriormente transferidas para membrana de PVDF
(BRUMATTI et al., 2003). As membranas de western blot foram bloqueadas em
tampo de lavagem com 5% de BSA por 3 horas TA e subseqentemente
incubadas com o anticorpo monoclonal anti-fosfotirosina (PY) (UpstateBiotech Inc.,
Lake Placid, NY, USA, gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Gustavo Amarante-
Mendes, do Instituto de Cincias Biomdicas / USP) diludo 1:2000 em tampo de
bloqueio (por 12 horas, em temperatura ambiente. Aps trs lavagens de 10
minutos com TBS-T, os blots foram incubados com anticorpo secundrio anti-
camundongo conjugados peroxidase na diluio de 1:2000 (Amersham
Biosciences, GE Healthcare Life Science, Pittsburgh, Pensilvnia, EUA) por uma
hora a TA. A deteco da marcao foi realizada pelo mtodo de
quimioluminescncia (Amersham ECL Plus, GE Healthcare Life Science,
Pittsburgh, Pensilvnia, EUA).
Aps os experimentos descritos acima neste item, as amostras utilizadas nos
ensaios de associao LAAO + MI; LAAO sem MI e amostras de HL-60 j
armazenadas em tampo de amostra foram novamente transferidas para
membrana de PVDF. Como descrito anteriormente, as membranas de western blot
foram bloqueadas em tampo de lavagem com 5% de BSA por 3 horas TA e
subseqentemente incubadas com o anticorpo monoclonal ant-c-abl (cdigo
MAB1130; Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) diludo 1:250 em tampo de
bloqueio por 5 horas, em temperatura ambiente. Aps trs lavagens de 10
minutos com TBS-T, os blots foram incubados com anticorpo secundrio anti-
camundongo conjugados peroxidase na diluio de 1:3000 (Amersham
Biosciences, GE Healthcare Life Science, Pittsburgh, Pensilvnia, EUA) por uma
_________________________________________________________Material e Mtodos 23
hora a TA. A deteco da marcao foi realizada pelo mtodo de
quimioluminescncia (Amersham ECL Plus, GE Healthcare Life Science,
Pittsburgh, Pensilvnia, EUA.
3.6. Extrao de RNA, sntese de cDNA e PCR em tempo real
Para a extrao do RNA total, 3x106 clulas das linhagens previamente
plaqueadas em placas de 24 poos e incubadas por 18 horas na ausncia e na
presena da LAAO (concentraes selecionadas: 0,5 g/mL e 1,0 g/mL para HL-60
e 1,0 g/mL e 1,5 g/mL para HL-60.BCR-ABL), foram coletadas dos poos aps
este perodo e lisadas com 500L de Trizol (Invitrogen, Life Technologies,
Carlsbad, Califrnia, EUA), conforme protocolo do fabricante. O RNA foi recuperado
da fase aquosa pela adio de clorofrmio e centrifugao. Em seguida, a fase
aquosa contendo o RNA foi submetida precipitao com isopropanol e
centrifugao. O precipitado foi lavado com etanol 70% e ressuspenso em 13 L de
gua livre de RNAses e DNAses. A concentrao de RNA total foi quantificada em
espectrofotmetro a 260 nm e 280 nm.
O RNA extrado das clulas foi submetido eletroforese em gel de agarose
1,5%, que foi realizada corrente eltrica de 80 Volts durante 50 minutos e as
bandas 28S, 18S e 5S. Devido utilizao do corante gel-red (Biotium, Hayward,
Califrnia, USA), as bandas do RNA foram visualizadas em transiluminador UV.
(Figura 5)
_________________________________________________________Material e Mtodos 24
Figura 5. RNAs extrados de amostras de HL-60 e HL-60 BCR-ABL cultivadas na presena e ausncia da LAAO e submetidos eletroforese em gel red 1,5%. Observa-se a visualizao das bandas 28S, 18S e 5S do RNA.
Para obteno do cDNA, foi utilizado o kit High Capacity cDNA Archive Kit
(Applied Biosystems, Foster City, Califrnia, EUA), sendo utilizado 1g de RNA por
reao e o seguinte ciclo: 25C por 10 minutos e a 37C por duas horas no
equipamento Mastercycler (Eppendorf AG, Hamburg, Germany ).
Os cDNA das linhagens foram utilizados nos ensaios de PCR em tempo real
para quantificao da expresso dos genes pr e anti-apoptticos. Para a
amplificao e quantificao dos cDNA por real time PCR utilizou-se o Kit SybrGreen
Quantitect (Applied Biosystems, Foster City, Califrnia, EUA) e o aparelho ABIPrism
7700 (Applied Biosystems, Foster City, Califrnia, EUA).
Para tanto, oligonucleotdeos (primers) especficos foram desenhados para
a amplificao dos genes pr-apoptticos (fas, fasl, bax, bad, bak, bimEL, bid) e anti-
apoptticos (a1, bcl-w, bcl-xL, bcl-2, c-flip) (Invitrogen, Carlsbad, Califrnia, EUA)
(tabela 1). Os programas utilizados no processo de amplificao das amostras foram
padronizados anteriormente pela equipe do laboratrio. Foram empregados como
controle da qualidade da amplificao e sntese de cDNA o gene actina, como
housekeeping gene (gene endgeno). Os resultados foram expressos pelos 2-ddCt,
que calculado considerando-se a razo entre o gene testado e o gene endgeno (
-actina) em relao linhagem HL-60 (calibrador) ou HL-60.BCR-ABL (calibrador).
28S
18S
5S
_________________________________________________________Material e Mtodos 25
Tabela 1 - Seqncia dos oligonucleotdeos utilizados na amplificao dos cDNAs das molculas envolvidas na apoptose celular, tamanho do fragmento amplificado e temperatura de anelamento (TA).
Oligonucleotdeo
Sequncias (53) Produto
(Pb)
TA
(C)
bax F: CCC TTT TGC TTC AGG GTT TC
R: TCT TCT TCC AGA TGG TGA GTG
501 56
bad F: CCG AGT GAG CAG GAA GAC TC
R: GGT AGG AGC TGT GGC GAC T
209 60
bak F: TCT GGC CCT ACA CGT CTA CC
R: ACA AAC TGG CCC AAC AGA AC
201 60
bid F: GCT TCC AGT GTA GAC GGA GC
R: GTG CAG ATT CAT GTG TGG ATG
203 62
bimEL F: GCC CCT ACC TCC CTA CAG AC
R: AAG ATG AAA AGC GGG GAT CT
152 59
bcl-2 F: ACG AGT GGG ATG CGG GAG ATG
TG
R: GCG GTA GCG GCG GGA GAA GTC
245 67
bcl-w F: AGT TCG AGA CCC GCT TCC
R: CCC GTC CCC GTA TAG AGC
308 60
bcl-xL F: CTG AAT CGG AGA TGG AGA CC
R: TGG GAT GTC AGG TCA CTG AA
211 60
a1 F: GGC TGG CTC AGG ACT ATC
R: CCA GTT AAT GAT GCC GTC
227 50
fas F: CAA GGG ATT GGA ATT GAG GA
R: TGG AAG AAA AAT GGG CTT TG
203 55
fasL F: AGG AAA GTG GCC CAT TTA AC
R: CAA GAT TGA CCC CGG AAG TA
176 55
c-flip F: GCC GAG GCA AGA TAA GCA
R: GCC CAG GGA AGT GAA GGT
464 54
-actina F: GCC CTG AGG CAC TCT TCC A
R: CCA GGG CAG TGA TCT CCT TCT
192 58
_________________________________________________________Material e Mtodos 26
Tabela 2 - Concentrao dos oligonucleotdeos e Programa das reaes de amplificao dos genes avaliados.
Gene Ciclo Concentrao do
primer
bax 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;
56C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM
bad 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;
60C - 1 min. 6,0 pM
bak 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;
60C - 1 min. 8,0 pM
bid 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;
63C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM
bimEL 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;
59C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM
bcl-2 50C - 2 min; 95C - 10 min/55x: 95C - 15 seg;
67C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM
bcl-w 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;
60C - 1 min. 8,0 pM
bcl-xL 50C - 2 min; 95C - 10 min/55x: 95C - 15 seg;
60C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM
a1 50C - 2 min; 95 - 10 min/50x: 95 - 15 seg;
50C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM
fas 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;
55C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM
fasL 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;
55C - 25 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM
c-flip 50C - 2 min; 95C - 10 min/50x: 95C - 15 seg;
54C 34 seg; 72C - 34 seg. 10,0 pM
-actina 50C - 2 min; 95C - 10 min/40x: 95C - 15 seg;
58C - 1 min. 2,5 pM
_________________________________________________________Material e Mtodos 27
3.7. Anlise Estatstica
A comparao dos valores da percentagem de ncleos hipodiplides entre as
clulas tratadas e no tratadas com VB, LAAO e LAAO associada ao MI em
diferentes concentraes e no perodo de 18 horas foi realizada por meio da
aplicao do teste t.
As anlises estatsticas dos resultados dos ensaios das clulas HL-60.BCR-
ABL tratadas com a LAAO e com a LAAO associada ao MI e das clulas HL-60 e
HL-60.BCR-ABL com VB em diferentes concentraes e nos perodos de incubao
de 12 e 18 horas foram realizadas por meio da anlise de varincia (ANOVA). Foram
consideradas estatisticamente significantes as anlises cujo valor de p foi menor do
que 0,05.
RESULTADOS
_______________________________________________________________Resultados 29
4. RESULTADOS
4.1. Induo de Apoptose da linhagem HL-60 pelo Veneno Bruto de Bothrops
pirajai
As clulas foram tratadas em diferentes concentraes do veneno bruto
(0,05 g/mL, 0,1 g/mL, 0,5 g/mL, 1,0 g/mL, 5,0 g/mL, 7,5 g/mL, 10 g/mL,
25 g/mL, 50 g/mL e 100 g/mL) e Actinomicina-D (ACT-D) na concentrao de
1M (controle positivo de morte) por 12 e 18 horas. Os resultados obtidos indicam
que o veneno bruto capaz de induzir apoptose em clulas HL-60 partir da
concentrao de 0,1 g/mL, contudo somente nas concentraes de 7,5, 10, 25, 50
e 100 g/mL que se verifica um perfil dose-dependente de veneno quanto induo
de apoptose nas clulas tratadas e incubadas por 12 e 18 horas (Figura 6).
Analisando-se os tempos de incubao, observa-se que a morte celular foi maior
quando as clulas foram cultivadas nas concentraes de 10 ug/mL a 100 ug/mL do
veneno por 18h (Figura 6).
Assim sendo, 18h de incubao foi o perodo escolhido para o tratamento das
clulas com o veneno bruto para realizao dos ensaios subseqentes.
Figura 6 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 12 e 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB). C: clulas sem tratamento (controle negativo); ACT-D: clulas tratadas com actinomicina-D (controle positivo). Os valores apresentados correspondem mdia da porcentagem de clulas em apoptose obtidas em trs experimentos independentes para cada tempo de incubao. * diferena significante, com valor de p
_______________________________________________________________Resultados 30
Neste ensaio, com 18 horas de incubao, observou-se induo significativa
da apoptose com o VB a partir da concentrao de 0,1 g/mL. Como esperado para
esta clula, a ACT-D induziu significativamente a apoptose, uma vez que a HL-60
sensvel morte celular estimulada por essa substncia, inibidora da RNA
polimerase (Figura 7).
Figura 7 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB). C: clulas sem tratamento (controle negativo); ACT-D: clulas tratadas com actinomicina (controle positivo). Os valores apresentados correspondem mdia da porcentagem de clulas em apoptose obtidas em trs experimentos independentes para 18 horas de incubao. * diferena significante, com valor de p
_______________________________________________________________Resultados 31
Figura 8 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.BCR-ABL aps 12 e 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB). C: clulas sem tratamento (controle negativo); ACT-D: clulas tratadas com actinomicina-D (controle positivo). Os valores apresentados correspondem mdia da porcentagem de clulas em apoptose obtidas em trs experimentos independentes para cada tempo de incubao. * diferena significante, com valor de p
_______________________________________________________________Resultados 32
Figura 9 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.BCR-ABL aps 18 horas de incubao com o veneno bruto (VB). C: clulas sem tratamento (controle negativo); ACT-D: clulas tratadas com actinomicina-D (controle positivo). Os valores apresentados correspondem mdia da porcentagem de clulas em apoptose obtidas em trs experimentos independentes para cada tempo de incubao. * diferena significante, com valor de p
_______________________________________________________________Resultados 33
Figura 10 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60 aps 18 horas de incubao com a L-aminocido oxidase. C: clulas sem tratamento (controle negativo); ACT-D: clulas tratadas com actinomicina-D (controle positivo). Os valores apresentados correspondem a mdia da porcentagem de clulas em apoptose obtidas em trs experimentos independentes para cada tempo de incubao. * diferena significante, com valor de p
_______________________________________________________________Resultados 34
Figura 11 Percentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.BCR-ABL aps 18 horas de incubao com a L-aminocido oxidase. C: clulas sem tratamento (controle negativo); ACT-D: clulas tratadas com actinomicina-D (controle positivo). Os valores apresentados correspondem mdia da porcentagem de clulas em apoptose obtidas em trs experimentos independentes para cada tempo de incubao. * diferena significante, com valor de p
_______________________________________________________________Resultados 35
4.5.1. Anlise da expresso protica das caspases 3, 8 e 9 nas clulas HL-60
O tratamento das clulas HL-60 com a LAAO por 18 horas estimulou a
ativao das caspases 3 (Figura 12), 8 (Figura 13) e 9 (Figura 14), sendo possvel
detectar esta ativao pelo desaparecimento sequencial das bandas especficas das
caspases inativas. A ativao ocorreu de modo dose dependente da concentrao
de LAAO, ou seja quanto maior a concentrao de LAAO maior ativaao.
Conforme descrito, no item 3.4 em Material e Mtodos, a expresso protica
do protena endgena tubulina foi utilizada para a normalizao dos valores da
densidade das bandas das protena-alvo.
CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ACT-D
Figura 12 Ativao da caspase 3 pela LAAO em clulas HL-60. A diminuio da pr-caspase 3 (PM=32kDa), no lisado celular, indica ativao da apoptose das clulas HL-60 pela enzima LAAO. A figura mostra que a ativao da caspase 3 foi diretamente proporcional a dose da LAAO empregada no ensaio.
CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ACT-D
Figura 13 Ativao da caspase 8 pela LAAO em clulas HL-60. A diminuio da pr-caspase 8 (PM=55kDa), no lisado celular, indica a ativao da apoptose de clulas HL-60 pela enzima LAAO. A figura mostra que a ativao da caspase 8 foi diretamente proporcional a dose da LAAO empregada no ensaio.
32kDa Pr-Caspase 3
Tubulina 48kDa
Pr-Caspase 8
Tubulina 48kDa
55kDa
LAAO (ug/ml)
LAAO (ug/ml)
_______________________________________________________________Resultados 36
CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ACT-D
Figura 14 Ativao da caspase 9 pela LAAO em clulas HL-60. A diminuio da pr-caspase 9 (PM=37kDa), no lisado celular, indica a ativao da apoptose da clulas HL-60 pela enzima LAAO. A figura mostra que a ativao da caspase 9 foi diretamente proporcional a dose da LAAO empregada no ensaio.
4.5.2. Anlise da expresso protica das caspases 3, 8 e 9 nas clulas HL-
60.BCR-ABL
Nesta linhagem, o tratamento com a LAAO por 18 horas tambm culminou
com o desencadeamento da apoptose celular verificada pela ativao das caspases
3 (Figura 15), 8 (Figura 16) e 9 (Figura 17). Foi possvel avaliar esta ativao pelo
desaparecimento de bandas especficas das proformas destas protenas por meio de
western blot. Conforme descrito no item 3.4 em Material e Mtodos, a expresso
protica da tubulina (PM=48kDa) foi utilizada para a normalizao dos valores da
densidade das bandas das protena-alvo.
CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ACT-D
Figura 15 Ativao da caspase 3 pela LAAO em clulas HL-60.BCR-ABL. A diminuio da pr-caspase 3 (PM=32kDa), no lisado celular, indica a ativao da apoptose da clula HL-60.BCR-ABL pela enzima LAAO. A figura mostra que a ativao da caspase 3 foi diretamente proporcional a dose da LAAO empregada no ensaio.
Pr- Caspase 9 37kDa
Tubulina 48kDa
Pr-Caspase 3
Tubulina
32kDa
48kDa
LAAO (ug/ml)
LAAO (ug/ml)
_______________________________________________________________Resultados 37
CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ACT-D
Figura 16 Ativao da caspase 8 pela LAAO em clulas HL-60.BCR-ABL. A diminuio da pr-caspase 8 (PM=55kDa), no lisado celular, indica a ativao da apoptose me clulas HL-60.BCR-ABL pela enzima LAAO. A figura mostra que a ativao da caspase 8 foi diretamente proporcional a dose da LAAO empregada no ensaio.
CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 ACT-D
Figura 17 Ativao da caspase 9 pela LAAO em clulas HL-60.BCR-ABL. A diminuio da pr-caspase 9 (PM=37kDa), no lisado celular, indica a ativao da apoptose em clulas HL-60.BCR-ABL pela enzima LAAO. A figura mostra que a ativao da caspase 9 foi diretamente proporcional a dose da LAAO empregada no ensaio. 4.6. Deteco da percentagem de ncleos hipodiplides e da atividade de
fosfotirosina na linhagem HL-60.BCR-ABL tratada com Mesilato de Imatinibe e
L-aminocido oxidase
Nesta etapa, nosso objetivo foi avaliar o potencial efeito da LAAO quando
associada ao inibidor de tirosina quinase (MI) em clulas HL-60.BCR-ABL e o
consequente efeito desta associao sobre a atividade tirosina quinase de BCR-
ABL. A induo de apoptose em clulas HL-60.BCR-ABL foi avaliada por citometria
de fluxo. Foi detectada nesse ensaio a percentagem de ncleos hipodiplides das
clulas HL-60.BCR-ABL tratadas por 18 horas com 10M de mesilato de imatinibe
associado a LAAO nas concentraces de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 g/mL.
Os resultados obtidos mostraram aumento significativo da percentagem de
apoptose celular das clulas HL-60.BCR-ABL, em relao aos dados obtidos quando
as clulas foram tratadas apenas com o MI (Figura 18A) ou somente com a LAAO
Caspase 9 37kDa
Pr-Caspase 8
Tubulina 48kDa
55kDa
Tubulina 48kDa
LAAO (ug/ml)
LAAO (ug/ml)
_______________________________________________________________Resultados 38
(Figura 18B). Importante ressaltar que o MI sozinho e com 18h de incubao, no
induziu a apoptose em clulas BCR-ABL+
Figura 18 Anlise da porcentagem de ncleos hipodiplides em clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com LAAO, MI e LAAO associada ao MI por 18h. (A) Comparao entre a porcentagem de ncleos hipodiplides das clulas HL-60.BCR-ABL tratadas com MI e com LAAO associada ao MI por 18 horas. * valor de p
_______________________________________________________________Resultados 39
A partir dos resultados obtidos pela citometria de fluxo e na tentativa de
melhor elucidar o mecanismo pelo qual a LAAO associada ao MI exerce esse efeito
sobre clulas HL-60.BCR-ABL, foi observada a ao dessa associao sobre a
atividade tirosina quinase de BCR-ABL. Assim sendo, foi detectada a expresso da
fosfotirosina (PY) nos lisados proteicos das clulas HL-60.BCR-ABL tratadas por 18
horas com a LAAO nas concentraes (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 g/mL) e MI 10 M
por western-blot. Paralelamente ao ensaio de 18 horas de incubao, verificamos o
perfil de atividade do MI sobre a a tividade tirosina quinase das clulas HL-60.BCR-
ABL, tratando-as por apenas 2 horas com o MI. O resultado indicou que no h
diferena do efeito do MI sobre a atividade quinase de BCR-ABL entre 2 e 18 horas,
sendo assim, ambos perodos so suficientes para inibir a atividade quinase de
BCR-ABL.
Os dados obtidos por western blot da associao da LAAO com o MI
evidenciaram que a LAAO potencializou a inibio da atividade quinase de BCR-ABL
pelo MI na linhagem HL-60.BCR-ABL. O efeito da potencializao da inibio da
atividade fosforilativa foi observado de forma dose-dependente de LAAO e ocorreu
de forma mais proeminente a partir da concentrao de LAAO de 1,5 g/mL,
confirmando os resultados obtidos pela citometria de fluxo (Figura 19A).
Uma vez observado este efeito interessante da associao da LAAO com o
MI, foi checado a ao da LAAO na atividade quinase de BCR-ABL, sem o MI. Para
isto, um novo western blot para fosfotirosina foi realizado com os lisados proticos
das clulas HL-60.BCR-ABL cultivadas com a LAAO nas mesmas concentraes
(0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 g/mL) por 18 horas. Neste ensaio, observou-se que a partir
da concentrao de 1,5 g/mL uma diminuio da intensidade das bandas
referentes atividade fosforilativa de BCR-ABL, sugerindo-nos realmente o efeito
inibitrio sobre a atividade quinase de BCR-ABL (Figura 19B)
Sabendo-se que o MI possui um efeito inibidor apenas sobre a atividade TK de
BCR-ABL, ou seja no afeta a expresso da protena BCR-ABL, realizamos a
marcao com o anticorpo c-abl para constatarmos que a expresso de BCR-ABL
(185kDa) no havia sido afetada (figura 19C). Verificamos, como esperado, que a
expresso de BCR-ABL no foi afetada pelo tratamento com o MI, no entanto, para
nossa surpresa, quando associamos a LAAO, esta expresso apresentou-se
_______________________________________________________________Resultados 40
diminuda a partir da concentrao de 1,5g/mL, a partir da qual observou-se a
diminuio da intensidade das bandas correspondentes expresso protica de
BCR-ABL.
48kDa
Anti-c-abl
A) CT 2h 18h 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
c-abl (120kDa)
BCR- ABL(185kDa)
Protenas Fosforiladas
Anti- fosfotirosina
MI 10M MI 10M + LAAOg/mL
48kDaTubulina
Anti-c- abl
B) CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
c-abl (120kDa)
BCR-ABL (185kDa)
LAAOg/ml
Protenas
FosforiladasAnti- fosfotirosina
LAAO (g/mL)
Tubulina
_______________________________________________________________Resultados 41
48kDa
C) CT 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Tubulina
Anti-c- ablc-abl (120kDa)
BCR-ABL (185kDa)
LAAOg/ml
Figura 19 Expresso da protena fosfotirosina, c-abl e de BCR-ABL em clulas HL-60.BCR-ABL sem tratamento, tratadas com MI, LAAO e LAAO associada ao MI por 18 horas. A) Clulas HL-60.BCR-ABL sem tratamento (CT); tratadas com MI por 2 e 18 horas e tratadas com MI associado LAAO por 18 horas. As clulas foram marcadas com o anticorpo anti-c-abl e anti-fosfotirosina. B) Clulas HL-60.BCR-ABL sem tratamento (CT) e tratadas com LAAO por 18 horas. As clulas foram marcadas com o anticorpo anti-c-abl e anti-fosfotirosina. C) Clulas HL-60 sem tratamento (CT) e tratadas com LAAO por 18 horas. As clulas foram maracadas com o anticorpo anti-c-abl.
Conforme descrito no tem 3.4 em Material e Mtodos, a expresso protica
do gene endgeno utilizada para a normalizao dos valores da densidade das
bandas das protena-alvo. Nesses experimentos a tubulina (48kDa), foi empregada
como protena endgena .
4.7. Anlise da expresso gnica por PCR em tempo real
Com o objetivo de checar se a LAAO capaz de modular a expresso de
molculas que controlam a apoptose celular foi realizada a quantificao da
expresso dos genes pr e anti-apoptticos da famlia BCL-2 e via extrnseca em
clulas HL-60 e HL-60.BCR-ABL tratadas com LAAO em dose que no induziram a
apoptose celular.
Assim sendo, a anlise da expresso gnica foi realizada nas amostras de
cDNA de clulas HL-60 tratadas com LAAO nas concentraes de 0,5 g/mL e
1,0 g/mL (Tabela 3) e de clulas HL-60.BCR-ABL cultivadas com LAAO nas
concentraes de 1,0 g/mL e 1,5 g/mL (Tabela 4).
Para o melhor entendimento dos resultados, os mesmos esto descritos
separadamente para a HL-60 e HL-60.BCR-ABL e conforme as concentraes de
LAAO utilizadas para cada linhagem.
Os resultados obtidos na HL-60 tratada com LAAO na concentrao de
0,5g/mL de LAAO foram:
- diminuio da expresso de bad, fasl, bcl-2 e bcl-w;
LAAO (g/mL)
_______________________________________________________________Resultados 42
- aumento da expresso de bid e fas.
Os genes a1, bak , bax, bim, bcl-xLe c-flip no foram modulados pela LAAO
nesta concentrao.
Os dados obtidos na HL-60 tratada com LAAO na concentrao de 1,0g/mL
foram:
-diminuio da expresso de bax, bak, bid, bimel e bcl-2;
- aumento da expresso de bad, fas, fasl, a1, bcl-w e c-flip.
O gene bcl-xl no foram modulados nesta concentrao.
_______________________________________________________________Resultados 43
Tabela 3- Expresso gnica em clulas HL-60 tratadas com LAAO nas concentraes de 0,5 e 1,0g/mL.
Genes Pr-apoptticos Genes Anti-apoptticos
CT/conc
LAAO(g/mL)
-2ddct Resultado CT/conc
LAAO(g/mL)
2-ddct Resulta
do
bad CT
0,5
1,0
1,00
0,41
1,90
------
a1 CT
0,5
1,0
1,00
1,12
4,43
-----
AM
bak CT
0,5
1,0
1,00
0,98
0,53
AM
bcl-2 CT
0,5
1,0
1,00
0,30
0,23
------
bax CT
0,5
1,0
1,00
1,01
0,29
------
AM
bcl-xl CT
0,5
1,0
1,00
1,10
1,17
------
AM AM
bid CT
0,5
1,0
1,00
2,50
0,08
------ bcl-w CT
0,5
1,0
1,00
0,25
1,76
------
bimel CT
0,5
1,0
1,00
0,96
0,77
-----
AM
c-flip CT
0,5
1,0
1,00
1,10
1,46
-----
AM
fas CT
0,5
1,0
1,00
1,50
7,82
------
fasl CT
0,5
1,0
1,00
0,11
4,67
------
CT= controle; AM= ausncia modulao. As flechas indicam aumento ou diminuio da expresso.
Os dados obtidos na HL-60.BCR-ABL tratada com LAAO na concentrao de
1,0 g/mL foram:
-diminuio da expresso de bad, bax, bimel e bcl-xl;
-aumento da expresso de bid, fasl, a1, bcl-2 e bcl-w.
_______________________________________________________________Resultados 44
Os genes bak, fas e c-flip no foram modulados pela LAAO nesta
concentrao. Os resultados obtidos na HL-60.BCR-ABL tratada com LAAO na
concentrao de 1,5 g/mL foram:
- diminuio da expresso de bad, bak, bax, fas,
- aumento da expresso de bid, fasl, a1, bcl-2 bcl-xL e bcl-w;
Os gene bim e c-flip no foram modulados pela LAAO nesta concentrao.
_______________________________________________________________Resultados 45
Tabela 4- Expresso gnica da clula HL-60.BCR-ABL tratada com LAAO nas concentraes 1,0 e 1,5g/mL.
Genes Pr-apoptticos Genes Anti-apoptticos
CT/conc
LAAO(g/mL)
-2ddct Resultado CT/conc
LAAO(g/
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