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Eletroforese de Proteínas em Gel de Poliacrilamida
1-Introdução2-Determinação da Malha no Gel3-Eletroforese em condições
desnaturantes SDS-PAGE4-Visualização das proteínas separadas
por SDS-PAGE
Edmar Vaz de Andrade
1-introduçao
Poros (malha) com dimensões moleculares, onde a separação no gel ocorre de acordo com a filtração em gel e com mobilidade eletroforética das moléculas.
Indicada para separação de:DNAProteínas
PAGE: Polyacrylamide gel electrophoresis
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
2-Determinação da Malha no Gel
acrilamida
N, N’-metilenobisacrilamida
Ligação cruzada Acri-Bis
Acri-Bis: acrilamida ligada a N, N’-metilenobisacrilamida
MonômerosPolímero formado pela reação entre Acri-Bis
2-Determinação da Malha no Gel
A polimerização entre Acri-Bis é catalisada por radicais livres
APS: persulfato de amônio. Se decompõe naturalmente formando radicais livres.
TEMED: estabiliza os radicais livres formados a partir do APS.
2-Determinação da Malha no Gel
A formação do polímero entre acrilamida ligada a N, N’-metilenobisacrilamida determina a dimensão dos poros formados (malha) no gel.
Depende da quantidade de ligações cruzadas:
Varia em função da concentração de acrilamida e N, N’-metilenobisacrilamida
3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE
3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE
SDS-PAGE
SDS: dodecil sulfato de sódio. Detergente aniônico forte.
Interage com a proteína de modo independente da seqüência primária (proporcional a massa molecular)
1 molécula de SDS para cada 2 resíduos de aminoácidos
Desnaturação da proteína:
Aquecimento a 100 °C
β-mercaptoetanol: agente redutor
3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE
Desnaturação da proteína
Ligaçao de SDS com a / proteína
Efeito do SDS sobre as proteínas desnaturadas:
Conformação linearizada
Carga líquida negativa
3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE
Gel separador
Gel concentrador
Aparato para eletroforese em SDS-PAGE
3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE
4-Visualização das proteínas separadas por SDS-PAGE
Coloração por azul brilhante de Coomassie
4-Visualização das proteínas separadas por SDS-PAGE
Coloração por azul brilhante de Coomassie
75
50
35
30
25
Quitinase de Crhomobacterium violaceum expressa em Escherichia coli
kDa
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