View
222
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Enzimas Imobilizadas
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
DEFINIÇÕES E HISTÓRICO
Entende-se por enzima imobilizada, aquela física ou quimicamente associada a um suporte ou matriz, usualmente sólida, insolúvel em
água e inerte, que não seja essencial a sua atividade.
Objetivos da imobilização :
1- Reutizar a enzima
2-Aumento da estabilidade
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Histórico do Uso de Enzimas Imobilizadas
1916 - ocorreu a primeira utilização de enzima imobilizada (invertaseem carvão vegetal) por Nelson e Griffin.
1960 - Katchalski introduziu os primeiros suportes úteis.
1978 - os processos com enzimas imobilizadas também têm utilização industrial em larga escala - aminoacilase imobilizada em DEAE–Sephadex para produção L-aminoácidos.
Maior uso de enzimas imobilizadas é na produção de xaropes de frutose através da glicose-isomerase imobilizada é realizada em grande escala nos Estados Unidos
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Resolução de Misturas Racêmicas de Aminoácidos
aminoacilase - tanto L como D-aminoácidos são completamente convertidos a L-aminoácidos.
Produção de Ácido 6-Aminopenicilâmico (6-APA)
peniclina amidase e suporte bentonita entrecruzada .
Produção de leites e soros deslactosados
lactase imobilizada em fibras de acetato de celulose ou vidro poroso ativado.
Produção de xaropes de frutose a partir de glicose
glicose isomerase utilizando como suporte proteínas entrecruzadas ou vidro poroso ativado.
USOS EM ESCALA INDUSTRIAL DAS ENZIMAS IMOBILIZADAS
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Vantagens e Desvantagens
Vantagens Desvantagens
Desenvolvimento de sistemas
contínuos
Custo adicional de suportes,
reagentes e da operação de
imobilização
Maior estabilidade enzimática Perdas de atividade durante a
imobilização
Uso mais eficiente do catalisador
através de reutilizações
Possíveis exigências adicionais de
purificação do catalisador
Flexibilidade no projeto de reatores Técnica pouco adequada a substratos
insolúveis ou de alto peso molecular
Efluentes livres de catalisadores Maiores riscos de contaminação na
operação contínua dos reatores
Maior versatilidade na etapa de
separação
Restrições difusionais e impedimento
estéreo
Menor custo de mão de obra
Facilidade de Automação e controle
Possibilidade de utilização das
enzimas “in-natura”
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
ESCOLHA DE MÉTODOS E DO SUPORTE DE IMOBILIZAÇÃO
Dependerá das características da enzima e das condições de uso da enzima imobilizada.
Para uma escolha econômica do método de imobilização é necessário o conhecimento da reação desejada, o processo de aplicação da
enzima imobilizada, condições do meio, modificações causadas na estabilidade, atividade, pH e demais fatores.
O binômio suporte–método mais adequado será aquele que propiciar uma maior atividade após imobilização.
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Atividade da esterase de Bacillus subtilis imobilizada em vários suportes e por diferentes métodos
SUPORTE MÉTODO POROS
(A)
UI/g
Acetato de celulose Microencapsulamento 0,02 45
Poliacrilamida Microencapsulamento 2,5 50
Pérolas de vidro Ligação covalente 0,2-1,0 200
DEAE-Sephadex
A25
Adsorção 0,1 650
Dowex 1X1 Adsorção 0,4 820
DEAE- Celulose Adsorção 0,06 4200
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Suportes de Imobilização
Os suportes podem ser orgânicos ou inorgânicos, sintéticos ou naturais.
Suportes necessitam de mudanças ou inclusão de grupos reativos – ativação do suporte.
Classificação dos suportes utilizados na Imobilização de Enzimas
TIPO DE
SUPORTE
MATERIAIS POROSIDADE ESTABILIDADE
Não poroso Vidro, sílica, aço - Alta
Microencapsulado Triacetato de celulose 35 A Moderada
Entrelaçado Poliacrilamida, PVP Variada Baixa
Macroporoso Alumina, sílica 200-1000 A alta
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Tipos de Suporte para Imobilização
Vidro
Poliacrilamida
Aluminasílica
tela de nylon Fibra de casca de coco
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Critérios para avaliação de um sistema enzima-suporte
Estabilidade de fixação a enzima deve estar bem fixa ao suporte.
Estabilidade enzimática a enzima não deve sofrer modificações como desnaturação.
Resistência mecânica o suporte deve resistir a várias condições desfavoráveis como, o peso do suporte dentro do reator.
Capacidade de carga o suporte deve fixar um número elevado de unidades enzimáticas por unidade de área - um pequeno reator uma grande capacidade catalítica.
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Por Oclusão ou Aprisionamento - encapsulamento
Oclusão em matrizes: Podem ser géis (amido, borracha, nylon, poliacrilamida, sílica, alginato de cálcio, agarose, polietileno glicol) ou fibras. Nos géis ocorre o aprisionamento da enzima nos espaços intersticiais da rede polimérica (enzima confinada no interior de micelas), enquanto que nas fibras o aprisionamento se dá nas micro-cavidades.
Métodos de Imobilização da enzima por encapsulamento em gel de ágar
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Microencapsulamento:
A enzima é oclusa em membranas poliméricas de porosidade de 300 µm (celulose, policarbonato, colágeno, politereftalato, polímeros em geral), semi-permeáveis esféricas de pequeno diâmetro.
Microencapsulamento de enzima em material polimérico
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Reticulação ou Ligação Cruzada
Método que envolve o uso de agentes bifuncionais ou multi-funcionais, em geral diaminas alifáticas (di-isocianato) ou glutaraldeído, que induzem a auto-reticulação das enzimas, resultando assim na formação de uma rede tridimensional de moléculas de enzima
Ligação Covalente
A ligação covalente se dá pela reação de grupos reativos do suporte, matrizes como vidro, cerâmica, polímeros sintéticos, celulose, nylon e alumina, ativado ou não, com os grupos funcionais da enzima ligação de grupos - NH2, -COOH, -OH, -SH, entre outros, preferencialmente em condições fisiológicas brandas, baixa temperatura, baixa força iônica, pH ótimo e muitas vezes na presença do substrato, a fim de proteger o sítio ativo da enzima evitando que haja diminuição da atividade da mesma
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Adsorção FísicaUtiliza força de Van der Waals; método simples que se baseia na adsorção física em
superfícies sólidas, como alumina, carvão, argila, sílica gel, colágeno, vidro, por ligações iônicas, polares ou de Van der Waals.
Ligação IônicaLigação de grupos com cargas opostas através de forças eletrostáticas. Processo
simples, suave e não deletério para a maioria das enzimas, sendo inclusive desprezíveis os efeitos difusionais.
Ligação MetálicaForma quelatos pela ativação da superfície do suporte por meio do metal ou por seu
óxido.
Nos dois primeiros métodos por adsorção, as forças são fracas levando a pequenas modificações conformacionais na enzima e, conseqüente, possibilidade de
dissolução da mesma (perda).
De uma forma geral, os processos de imobilização por ligação são preferidos quando se confronta eficiência, apesar da inclusão em géis ou matrizes ser mais barato.
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Imobilização de -amilase por adsorção física em
carvão de casca de coco
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
EFEITOS CAUSADOS PELA IMOBILIZAÇÃO
Retenção da Atividade Enzimática
- algumas moléculas enzimáticas podem estar imobilizadas em uma configuração que impede completamente o acesso do substrato ao centro ativo;
- o grupo reativo do centro ativo pode estar envolvido a ligação ao suporte (a proteção do sítio ativo da enzima através de um inibidor reversível durante a ligação pode resultar em aumento na retenção da atividade;
- moléculas da enzima podem ter se ligado em uma configuração que as torne inativas;
- as condições de reação no processo de imobilização podem causar desnaturação ou inativação.
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase na forma solúvel e imobilizada em três diferentes suportes (alginato de cálcio, quitina e polietileno ativado, respectivamente)
PARÃMETRO INVERTASE SOLÚVEL INVERTASE IMOBILIZADA
Km 26,0 mM 8,1 mM52,2 mM32,2 mM
Vmáx 1,10 U 0,25 U
0,74 U
0,32 U
pH
(para atividade máxima)
4,6 4,6
4,0
4,6
pH
(maior estabilidade)
4,0-4,6 4,5 – 6,5
5,0 – 6,0
4,6
T
(para atividade máxima)
55-60 C 60 C
60 C
70C
T
(maior estabilidade)
25-37 C 45-50 C
25-40 C
25-40 C
Ea
(energia de ativação a 37C)
27,8 kJ/mol 24,4 kJ/mol
51,9 kJ/mol
37,5 kJ/mol
H
(variação de entalpia a 37C)
25,2 kJ/mol 21,9 kJ/mol
49,3 kJ/mol
34,9 kJ/mol
G
(variação de energia livre de
Gibs a 37C)
-13,6 kJ/mol -13,9 kJ/mol
-11,5 kJ/mol
-14,7 kJ/mol
S
(variação de entropia a 37C)
0,125 kJ/mol 0,115 kJ/mol
0,196 kJ/mol
0,160 kJ/mol
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Efeitos Difusionais
Quando a enzima é imobilizada, o substrato tem que difundir na solução através de um filme líquido estacionário presente nas superfícies do suporte e, se este é poroso, através dos poros até alcançar o sitio ativo das enzimas - pode restringir a taxa de reação
velocidade de difusão do substrato < velocidade de transformação pela enzima
Vmáx mais baixa
não se atinge a saturação.
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Resistência Difusional Externa
Surgem devido ao fato de que o substrato deve ser transportado do seio da solução até a superfície de catalise, devendo, por conseguinte
atravessar uma camada líquida, assim o consumo de substrato através da membrana líquida pode ser imaginado como resultado de
um gradiente.
A difusão do substrato e produtos dos centros ativos para a solução (ou vice-versa) ocorre através de mecanismos de difusão molecular e
convectiva.
Os efeitos de difusão externa afetarão o transporte de massa e podem ser minimizados tanto pelo aumento da agitação, caso de reatores continuamente agitados (CSTR), quanto pelo aumento do fluxo de
substrato, caso do reator pistonado (PFR).
Efeitos Difusionais Internos
Surgem devido à movimentação do substrato no interior do meio catalítico - difusão e reação ocorre simultaneamente
___________________________________________EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Efeitos Microambientais
A enzima ao ser imobilizada passa a ser circundada por um ambiente diferente do que quando estava livre, especialmente se a matriz ou suporte possui carga. Os efeitos de circunvizinhança, que dependem da natureza física e química do suporte, podem acarretar uma distribuição desigual do substrato, produtos e cofatores entre a região vizinha ao sistema imobilizado e o resto da solução.
Efeitos Estereoespecíficos
Existem situações onde a atividade da enzima frente a um substrato com elevado peso molecular é reduzida durante o processo de imobilização, de uma forma mais extensa que frente a um substrato com menor peso molecular - resultado de impedimento estéreo, formado pelo suporte, ao acesso de moléculas grandes ao centro ativo da enzima (impedimento estérico).
Recommended