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ESTUDO DA OBTENO DE BIOCATALISADORES COM MATRIZES
DE ALGINATO DE CLCIO VISANDO A PRODUO DE BIODIESEL
VNEA FERREIRA TRRES TEIXEIRA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
FEVEREIRO - 2011
ii
ESTUDO DA OBTENO DE BIOCATALISADORES COM MATRIZES
DE ALGINATO DE CLCIO VISANDO A PRODUO DE BIODIESEL
VNEA FERREIRA TORRES TEIXEIRA
Dissertao apresentada ao Centro de Cincias e Tecnologias Agropecurias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigncias para obteno do titulo de Mestre em Produo Vegetal.
Orientador: Prof. Ndia Rosa Pereira
Co-orientador: Prof. Victor Haber Perez
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ FEVEREIRO 2011
iii
ESTUDO DA OBTENO DE BIOCATALISADORES COM MATRIZES
DE ALGINATO DE CLCIO VISANDO A PRODUO DE BIODIESEL
VNEA FERREIRA TORRES TEIXEIRA
Dissertao apresentada ao Centro de Cincias e Tecnologias Agropecurias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigncias para obteno do titulo de Mestre em Produo Vegetal.
Orientadora: Prof. Dr. Ndia Rosa Pereira
Aprovada em 23 de fevereiro de 2011
Comisso Examinadora:
Prof. Walter Ruggeri Waldman (D.S., Cincia dos Materiais) UFSCAR - SP
Prof. Rubn Jesus Snchez Rodrguez (D.S., Cincia dos Materias) UENF - RJ
Prof. Victor Haber Prez (Co-orientador) (D.S., Engenharia de Processos) UENF -
RJ
Prof. Nadia Rosa Pereira (Orientador) (D.S., Engenharia Quimica) UENF - RJ
iv
Dedico... s minhas filhas, Laura e Julia
v
Muitas so Senhor meu Deus, as maravilhas que tens operado para comigo, eu quisera
anunci-las e manifest-las, mas so mais do que se podem contar (Salmos 40.5)
AGRADECIMENTOS
Agradeo ao meu Senhor e salvador Jesus Cristo, por seu grande amor e
proteo a cada minuto. Obrigada Senhor, por me amar tanto e por me presentear
constantemente como tens feito. Eu tambm o amo muito, no pelo que tens feito
na minha vida, mas por tudo que tu s. Essa conquista envolveu muitas lutas e
muito aprendizado que me fizeram crescer e te conhecer ainda mais de perto.
Agradeo a minha famlia, minha amada famlia. sem vocs eu no teria
conseguido. Meu esposo, companheiro inseparvel, que sempre me apoiou e que
soube, com muito amor, compreender a minha ausncia e encher de ateno e
carinho as nossas princesas quando eu no podia estar por perto. Minhas
Tchutchucas, Laurinha e Juju, como eu amo vocs! Sei como foi difcil tambm
para vocs, o que por muitas vezes me fez pensar em desistir, mas sabia que essa
conquista seria importante para ns. Obrigado minhas lindas! Amores de mame!
Meus amados papito e mami. Vocs so os grandes responsveis por eu ter
chegado at aqui. Vocs, com muita sabedoria, souberam me dar razes e asas.
Obrigada por estarem sempre presentes e serem to dedicados a nossa famlia.
Obrigada pelas oraes, pelos conselhos e por manterem os meus tanques de
amor sempre repletos. Amo muito vocs!
minha irm e melhor amiga Ksia, que mesmo estando distante
fisicamente, soube me apoiar, me encorajar e ouvir os meus desabafos nos
momentos difceis.
Obrigado ao meu grande amigo Paulo Henrique, para mim, Paulo Henrico
(super cunhado), pelo inscansvel apoio na vida acadmica. Voc um grande
profissional. Seus conselhos e suas orientaes sempre fizeram diferena na minha
vida. Obrigado de corao por tudo.
Ao meu amado irmo Jansen e a Glaucy, minha irm do corao, pelo apoio
e carinho que sempre recebo de vocs, Amo vocs!
vi
A minha Tia Rute, tio Darci e Rosane que tenho certeza que nunca se
esquecem de orar por mim e me abenoam constantemente com palavras de
carinho e muito incentivo. Amo vocs!
Aos meus companheiros de trabalho, Ana Luiza, Geraldo e Waldinia, que ao
longo da caminhada se tornaram amigos. Vocs fazem parte desse trabalho.
Obrigada de corao.
minha parceira e grande amiga Juliana, que viveu junto comigo essa
experincia. Obrigada amiga, por tudo.
Ao meu co-orientador e amigo Victor, por seu constante apoiou e incentivo e
por sua grande participao no desenvolvimento deste trabalho. Admiro o tamanho
do seu corao, que sem medir esforos, est sempre pronto a ajudar. Que Deus te
ilumine, sempre. Obrigada.
minha orientadora Nadia, pela confiana, compreenso e conhecimentos
compartilhados. Reconheo e admiro o seu profissionalismo e sua inteligncia.
Sinto-me privilegiada por ter sido sua primeira orientada e tenho certeza que fao
parte do inicio da caminhada brilhante de uma excelente pesquisadora. Obrigada
por tudo.
Aos amigos de laboratrio, velin, Lara, Clara, Natalia, Shaline, Lorena, Joo
e Simone pelo companheirismo e apoio.
Ao amigo Accio, pela grande ajuda nas anlises de Absoro Atmica.
Aos professores Rubn e Walter, pela parceria no desenvolvimento do
trabalho e por terem aceitado fazerem parte da banca avaliadora desta dissertao.
UENF pelo suporte financeiro e oportunidade de desenvolver este trabalho.
Enfim, a todos que de alguma forma contriburam, de maneira direta ou
indireta, para que este projeto fosse realizado. Que Deus a todos abenoe rica e
abundantemente.
vii
NDICE
1. INTRODUO ................................................................................................................. 3
2. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 4
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ..................................................................... 5
3. REVISO BIBLIOGRFICA ............................................................................................ 5
3.1 CATLISE ENZIMTICA ......................................................................... 5
3.2 LIPASES ............................................................................................. 7
3.3 SUPORTES PARA IMOBILIZAO ............................................................ 8
3.4 ALGINATOS ......................................................................................... 9
3.4.1 Fonte de Obteno .............................................................................................. 9
3.4.2 Constituio Qumica e Fsica do alginato ........................................................ 10
3.4.3 Caractersticas dos Gis de Alginato ................................................................ 11
3.4.4 Produo das Partculas de Alginato de Clcio ................................................ 14
3.4.5 Produo dos suportes hbridos de alginato com quitosana............................. 16
3.5 IMOBILIZAO ................................................................................... 17
3.5.1 Tipos de imobilizao ........................................................................................ 18
4. MATERIAIS E MTODOS ............................................................................................. 22
4.1 MATERIAIS........................................................................................ 22
4.2 MTODOS ........................................................................................ 23
4.2.1 Preparao dos suportes de alginato ................................................................ 23
4.2.2 Cintica de gelificao ....................................................................................... 24
4.2.3 Preparao dos suportes de alginato com ferro ............................................... 25
4.2.4 Produo dos suportes hbridos de alginato com quitosana............................. 26
4.2.5 Secagem das partculas de Alginato ................................................................. 26
4.2.6 Imobilizao enzimtica..................................................................................... 27
4.2.7 Caracterizao dos suportes ............................................................................. 29
4.2.8 Caracterizao dos derivados imobilizados ...................................................... 31
5. RESULTADOS E DISCUSSO ..................................................................................... 33
5.1 ESTUDO DAS CONDIES DE PRODUO DAS PARTCULAS DE ALGINATO 33
5.1.1 Cintica de gelificao ....................................................................................... 35
5.1.2 Preparao dos suportes................................................................................... 41
5.1.3 Produo dos suportes hbridos de alginato ..................................................... 43
5.1.4 Secagem ............................................................................................................ 45
5.2 CARACTERIZAO DOS SUPORTES PARA IMOBILIZAO ........................ 48
5.2.1 Resistncia a agitao....................................................................................... 48
5.2.2 Solubilidade dos suportes em diferentes meios ................................................ 48
viii
5.2.3 Anlise granulomtrica ...................................................................................... 49
5.2.4 Anlise Termogravimtrica ................................................................................ 51
5.2.5 Morfologia .......................................................................................................... 55
5.2.6 Imobilizao ....................................................................................................... 57
5.3 CARACTERIZAO FSICA DOS BIOCATALISADORES IMOBILIZADOS .......... 57
6. CONCLUSO ................................................................................................................. 68
7. RECOMENDAES PARA TRABALHOS FUTUROS ................................................ 69
8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................................. 70
1
RESUMO
TEIXEIRA, V.F.T. MSc.; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; Fevereiro de 2011; Estudo da obteno de biocatalisadores com matrizes de alginato de clcio visando a produo de biodiesel; Professora Orientadora: Ndia Rosa Pereira, D.Sc.; Professor Co-orientador: Victor Haber Perez, D.Sc.; Banca Avaliadora: Rubn Jesus Snchez Rodriguez, D.Sc.; Walter Ruggeri Waldman, D.Sc.; Victor Haber Prez, D.Sc.
Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de biocatalisadores com
propriedades magnticas visando aplicaes futuras na produo de biodiesel em
biorreatores assistidos por campos eletromagnticos. O trabalho experimental
envolveu a preparao de suportes de alginato de clcio e hbridos de alginato de
clcio/quitosana com incluso de partculas magnticas seguida da imobilizao
de lpases nestes suportes. Os suportes foram produzidos pelo mtodo de
gotejamento em soluo de cloreto de clcio. No desenvolvimento do trabalho
foram estudadas as condies operacionais que permitissem a obteno de
suportes com boa rigidez, esfericidade e tamanho uniforme; o processo de
gelificao das partculas de alginato de clcio por meio da cintica de troca
inica dos ons envolvidos na formao do gel; a cintica de secagem dos
suportes sob diferentes condies de temperatura e o efeito do teor de ferro nos
suportes atravs de testes operacionais em biorreator assistido por campo
eletromagntico. Os suportes produzidos foram caracterizados quanto a:
umidade, resistncia a agitao, solubilidade, degradao trmica, distribuio
granulomtrica e morfologia. Os biocatalisadores imobilizados foram preparados
utilizando uma lpase comercial de Pseudomonas fluorescences (lpase AK) por
trs diferentes procedimentos de imobilizao: aprisionamento em gel, adsoro
fsica e ligao covalente. No primeiro caso, os rendimentos de imobilizao
foram menores que 10%, provavelmente devido a limitaes difusionais, enquanto
que os derivados imobilizados por interao direta da enzima com os suportes
(adsoro fsica e ligao covalente) apresentaram rendimentos da ordem de
30% e as melhores atividades hidrolticas foram alcanadas pelos derivados
imobilizados por ligao covalente nos suportes de alginato com quitosana
ativados com glutaraldedo, os quais alcanaram rendimentos da ordem de 50%.
2
ABSTRACT
TEIXEIRA, V.F.T. MSc.; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; February, 2011; Study about the obtainment of biocatalysts with calcium alginate matrices in order to produce biodiesel; Teacher Advisor: Ndia Rosa Pereira, D.Sc.; Teacher Co-advisor: Victor Haber Perez, D.Sc.; Banking Appraiser: Rubn Jesus Snchez Rodriguez, D.Sc.; Walter Ruggeri Waldman, D.Sc.; Victor Haber Prez, D.Sc.
This work presents a study about magnetic biocatalysts development seeking its
applications on the biodiesel production in bioreactors assisted by electromagnetic
fields. The experimental efforts were towards the preparation of supports of
calcium alginate and calcium alginate/chitosan beads with addition of magnetic
particles and the immobilization of lipases on these supports. The beads were
produced by the dripping method in solution of calcium chloride. About this issue
it was investigated the following: a) operational conditions to attain supports with
good rigidity, spherical shape and uniform size; b) the process of gelification of
calcium alginate beads through ionic exchange kinetics of the involved ions in the
gel formation; c) drying kinetics of the supports under natural convection at
different temperature and alginate concentration and d) effect of magnetic particles
into the supports through operational tests in the bioreactor assisted by
electromagnetic field. The supports were characterized in terms of their moisture
content, resistance to agitation, solubility, thermogravimetric degradation,
morphology and size distribution. The immobilized biocatalysts were prepared
using a commercial lipase from P. fluorescences (lipase AK) for three different
immobilization procedures: entrapping, physical adsorption and covalent binding.
In the first case, the immobilization yields were lower than 10%, probably due to
diffusion limitations, while the immobilized biocatalysts by direct interaction
between enzyme and supports, i.e., physical adsorption and/ or covalent binding,
reached coupling yield around 30%. In addition, immobilization method by
covalent binding in alginate-chitosan supports activated with glutaraldehyde
presented coupling yield more than 50% and consequently the highest hydrolytic
activities.
3
1. INTRODUO
Nos ltimos anos, pode-se observar uma intensa atividade a nvel mundial
pelo uso de energias renovveis em virtude dos graves problemas associados
emisso de gases poluentes que resultam no aquecimento global. Neste contexto,
a obteno de biocombustveis (etanol, biodiesel, etc.) se apresenta como uma
alternativa muito atrativa em substituio aos combustveis fsseis. Esse
interesse se justifica pelo fato dos biocombustveis serem uma alternativa menos
agressiva ao meio ambiente, economicamente competitivos alm de serem
biodegradveis e derivados de matrias-primas renovveis de ocorrncia natural
(Felizardo, 2003; Ferrari et al., 2005).
A tecnologia mundialmente estabelecida para a produo industrial de
biodiesel baseia-se na transformao qumica (alcolise) de leos vegetais com
um lcool (geralmente o metanol) usando catalisadores cidos ou bsicos, que
atuam na quebra de molculas de triglicerdeos gerando uma mistura de steres
de cidos graxos, denominada biodiesel (Marchetti et al., 2007). Apesar do bom
rendimento proporcionado por essa via, o uso de catalisadores qumicos gera
problemas ao meio ambiente e dificuldades de recuperao e purificao do
produto final (Ferrari et al., 2005). Estas dificuldades justificam o grande nmero
de pesquisas em busca de vias alternativas como a substituio do metanol
(obtido do petrleo) por etanol e o uso de catalisadores enzimticos
(biocatalisadores) que possuem alta seletividade e formam um produto final com
maior grau de pureza.
Na busca por novas tecnologias, tem-se pesquisado a utilizao de
catalisadores biolgicos imobilizados em suportes diversos. Estes apresentam
como vantagens facilidade de separao e reutilizao tornando sua utilizao
bastante promissora. Muitas pesquisas tm sido realizadas com relao aos tipos
de materiais utilizados como suporte e aos diferentes mtodos de imobilizao de
enzimas e clulas que podem ser utilizados (Moraes et al., 2002; Lagoa e
Rodrigues, 2009; Wang et al., 2005).
Vrios grupos de pesquisa no Brasil e no mundo tm trabalhado
intensamente em atividades de pesquisa para o desenvolvimento de
biocatalisadores a partir de enzimas ou clulas imobilizadas em matrizes de
http://www.google.com.br/dictionary?source=translation&hl=pt-BR&q=&langpair=pt|en
4
diferentes origens para utilizao em diversos processos fermentativos e em
reaes de esterificao para produo de biodiesel.
Dentre os diversos materiais utilizados como suportes, destaca-se a
utilizao do alginato que um polmero biodegradvel facilmente encontrado na
natureza e sua utilizao como suporte para imobilizao de enzimas e clulas
dentre outras aplicaes tem sido alvo de muitos estudos. O alginato, quando em
contato com ctions divalentes, forma um gel com caractersticas interessantes
como, uniformidade, biocompatibilidade e porosidade da matriz formada.
Este trabalho prope o desenvolvimento de suportes de alginato de clcio
com caractersticas magnticas para imobilizao de enzimas lpases visando a
utilizao dos biocatalisadores obtidos em processo de produo de biodiesel por
mtodo no convencional utilizando reatores assistidos por campo
eletromagnticos. Estes reatores podem alcanar maiores taxas de reao sob
menores resistncias transferncia de calor e massa. Quando um campo
magntico externo aplicado a um reator que contenha catalisadores
magnticos, possvel modificar a distribuio das partculas e com isso alcanar
condies mais eficientes de contato entre estas e o meio reacional, resultando
em maiores taxas de reao. Para que isso acontea imprescindvel que o
biocatalisador apresente permeabilidade magntica, as quais podem ser
conferidas pela incorporao de partculas magnticas (por exemplo, magnetita
ou ferro metlico) na matriz porosa. Portanto, a proposta deste trabalho tem como
objetivo o estudo da obteno de biocatalisadores heterogneos formados por
partculas de alginato de clcio e hbridos de alginato com incorporao de ferro
metlico para imobilizao de enzimas visando sua utilizao em processo de
produo de biodiesel nestes reatores assistidos por campo magntico.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Estudo da produo de suportes de alginato de clcio com propriedades
magnticas, para imobilizao de lipase, visando produo de biodiesel em
bioreatores assistidos por campo eletromagntico.
5
2.2 Objetivos especficos
1. Determinar as condies de produo das partculas de alginato de
clcio pelo mtodo de gotejamento, visando obteno de suportes
rgidos, com boa esfericidade e tamanho uniforme;
2. Produzir suportes de alginato e hbridos de alginato/quitosana e
alginato/quitosana com incorporao de ferro;
3. Determinar a cintica de gelificao dos suportes de alginato de
clcio;
4. Caracterizar os suportes produzidos com relao a: umidade,
resistncia a agitao, solubilidade, granulometria, morfologia e
estabilidade trmica.
5. Testar a imobilizao da lpase de Pseudomonas fluorences nas
partculas produzidas por aprisionamento, por adsoro fsica e por
ligao covalente com e sem ativador.
6. Caracterizar os biocatalisadores com relao morfologia, atividade
enzimtica e eficincia de imobilizao.
3. REVISO BIBLIOGRFICA
3.1 Catlise enzimtica
Tecnicamente, o biodiesel definido como steres alqulicos de cidos
graxos, obtidos na reao de transesterificao de qualquer triglicerdeo (leos e
gorduras vegetais ou animais) com lcool de cadeia curta (Pinto et al., 2005).
A produo de biodiesel economicamente competitiva devido a utilizao
de fontes renovveis de matria-prima e catalisadores de baixo custo, alm deste
combustvel ser tecnicamente e ambientalmente aceitvel. Os mtodos para a
obteno de biodiesel podem diferenciar na escolha da matria-prima e na via de
obteno. A transesterificao o processo mais utilizado atualmente e pode ser
definida como sendo a etapa de converso de triglicerdeos, na presena de
6
catalisador, em uma mistura de steres alqulicos de cidos graxos (biodiesel) e
glicerina (
Figura 1). Na reao de transesterificao podem ser usados catalisadores
qumicos (cidos ou bsicos) ou catalisadores enzimticos (Ferrari et al., 2005).
Figura 1. Reao de transesterificao (Moreira, 2007).
Atualmente os processos industriais de produo de biodiesel utilizam
catalisadores qumicos como o hidrxido de sdio e potssio, devido ao maior
rendimento em steres em menor tempo de reao. Todavia, este processo
apresenta alguns problemas, dentre eles a reao de saponificao ocasionada
pela presena de gua na matria-prima e cidos graxos livres e a necessidade
de passos adicionais de neutralizao e lavagem para reduo dos teores de
substncias indesejveis no biodiesel pronto, alm de no permitir a recuperao
do catalisador utilizado. Neste sentido a catlise enzimtica, utilizando lipases,
aparece como uma opo promissora na produo do biodiesel (Moreau et al.,
2008). O processo de transesterificao enzimtica, se otimizado, oferece
inmeras vantagens ao processo qumico, pois permite maior controle sobre a
distribuio posicional dos cidos graxos no produto final, devido seletividade e
regioespecificidade das lipases (Bornscheuer, 1998; De Castro et al., 2004). A
Tabela 1 apresenta as vantagens e desvantagens dos processos de obteno de
biodiesel por via qumica e enzimtica.
7
Tabela 1: Catlise qumica X catlise enzimtica (Nascimento et al., 2001).
Processo Vantagens Desvantagens
Qumico
Simplicidade Alto rendimento Curto tempo de reao
Dificuldade de separao do catalisador
Impossibilidade de reutilizao do catalisador
Dificuldade de utilizao do etanol hidratado
Obteno de produtos com menor grau de pureza
Enzimtico
Facilidade de separao do catalisador (suporte)
Obteno de produtos com maior grau de pureza
Possibilidade de utilizar etanol hidratado na reao
Longo tempo de reao Baixo rendimento Custo das enzimas
3.2 Lipases
As lipases (triglicerol acil-hidrolases. E.C 3.1.1.3) so classificadas como
enzimas hidrolticas que atuam na interface orgnico-aquosa, catalisando a
hidrlise de ligaes ster-carboxlicas de acilglicerois liberando cidos orgnicos
e glicerol. (De Castro et al., 2004). Elas no requerem co-fatores, so
regioespecficas e atuam em uma larga faixa de pH (Dalla-vecchia et al., 2004).
As lipases so encontradas largamente distribudas na natureza em
animais (lpases lcteas e lipase pancretica), vegetais (extradas da soja, do
centeio e do algodo) e as microbianas (leveduras, fungos e bactrias) (Paques;
Macedo, 2005). As lipases provenientes de micro-organismos so as mais
utilizadas industrialmente porque alm de apresentarem procedimentos mais
simples de isolamento so, geralmente, mais estveis e com propriedades mais
diversificadas que as lipases de outras fontes. Estas enzimas so em sua maioria
extracelulares, o que favorece sua extrao, isolamento e purificao (Brockman,
1984). Nos ltimos anos, muitos trabalhos foram apresentados na literatura com o
intuito de viabilizar a utilizao de lipases em processos industriais. Dentre eles,
destacam-se os estudos dos procedimentos de imobilizao enzimtica os quais
envolvem diferentes graus de complexidade e eficincia. Moreira (2007) estudou
o desempenho de diferentes lipases na reao de transesterificao enzimtica
8
do leo de palma com etanol visando produo de biodiesel. Entre as lipases
testadas, a lipase de Pseudomonas fluorescens teve um desempenho destacado
com relao a atividade de transesterificao, convertendo 90,98% do leo de
palma nos steres etlicos correspondentes em 72h.
Lipase AK AMANO 20 uma preparao enzimtica produzida por um
nico processo de fermentao de uma linhagem selecionada de Pseudomonas
fluorescences. Como a maioria das lipases microbianas, as preparaes
comerciais disponveis destas lpases possuem preferncia estereoqumica para
hidrlise de steres de alcois secundrios (Faber, 1997). A lipase AK AMANO
20 tem uma elevada atividade lipoltica e estabilidade trmica (Amano Enzyme,
2006) e possui sete resduos de lisina em sua estrutura (Palomo et al., 2005).
O mecanismo de ao das lpases baseado nas reaes de ativao
interfacial e umas das principais dificuldades na compreenso dos mecanismos
de hidrlise esto relacionadas ao fato de que a atividade das lpases depende
das propriedades fsicas da emulso, ou seja, da disposio de substratos
disponveis lpase (Brockman, 1984). O mtodo mais utilizado para determinar a
atividade das lpases a titulao dos cidos graxos formados pela hidrlise do
triglicerdeo produzidos em uma emulso (leo/gua) estabilizada com um agente
tensoativo (Soares et al., 1999). A goma arbica o agente mais utilizado,
conduzindo elevada atividade lipoltica (Verger, 1997). A lipase na ausncia de
tensoativos se encontra em uma conformao fechada, com seu stio cataltico
indisponvel. Com a adio de tensoativos, ela adquire uma conformao aberta,
atingindo mxima atividade cataltica (Fernandez-Lorente et al., 2007).
3.3 Suportes para imobilizao
A escolha e o uso adequado dos suportes de imobilizao so
fundamentais para que se consiga alcanar todas as vantagens oferecidas pela
utilizao de biocatalisadores imobilizados, que so facilidade de recuperao,
reutilizao da enzima e a melhoria das propriedades desejveis como
estabilidade frente s condies reacionais e seletividade (Villeneuve et al., 2000;
Dalla-Vecchia et al., 2004)
9
As principais caractersticas a serem observadas na seleo de um suporte
para imobilizao de enzimas so: rea superficial, permeabilidade, capacidade
de regenerao, solubilidade, morfologia, composio, resistncia mecnica,
custo dentre outras, destacando-se a importncia da avaliao das possibilidades
de regenerao e reutilizao do material analisado (Dalla-Vecchia et al, 2004).
Para a reutilizao de derivados imobilizados, geralmente, h a
necessidade do uso de operaes como filtrao, centrifugao e agitao que
requerem do suporte boa resistncia mecnica. A estabilidade trmica tambm
uma caracterstica importante, visto que suportes sensveis termicamente, quando
submetidos a variaes de temperatura, podem sofrer distores ou modificaes
em sua estrutura, destruindo o stio ativo da enzima (Kennedy,1987).
Segundo Messing (1975), os suportes para imobilizao de enzimas
podem ser classificados conforme sua composio podendo ser orgnicos e
inorgnicos e quanto a sua morfologia como porosos, no porosos e de estrutura
de gel (Dalla-Vecchia et al, 2004). Apesar dos suportes inorgnicos apresentarem
uma srie de vantagens em relao aos suportes orgnicos como: elevada
resistncia mecnica, estabilidade trmica, fcil regenerao por processo de
pirlise e resistncia em uma larga faixa de temperatura, presso e pH, a
utilizao de suportes orgnicos no campo da imobilizao de biocatalisadores
tem se destacado, provavelmente devido grande variedade de grupos
funcionais reativos que podem ser introduzidos nos suportes orgnicos
(Kennedy, 1987) e por apresentarem baixo custo e serem facilmente degradados
no causando danos ao meio ambiente. Dentre os suportes orgnicos naturais
mais utilizados na imobilizao de enzimas destacam-se a agarose, o alginato, a
quitosana e os polieletrlitos de quitosana vistos pelo grande nmero de trabalhos
encontrados na literatura (Torres et al., 2003; Mendes et al., 2006; Mateo et al.,
2007; Rodrigues et al., 2008; Adriano et al., 2008).
3.4 Alginatos
3.4.1 Fonte de Obteno
O alginato um biopolmero, derivado do cido algnico, encontrado na
natureza, extrado principalmente de algas marinhas marrons, pertencentes
10
classe Phaeophiceae, que constituem a principal fonte de obteno de alginatos.
Existe uma grande variedade de espcies que variam em tamanho, forma, assim
como em porcentagem e qualidade do alginato que produzem, sendo que as
principais algas utilizadas para a produo comercial de alginatos so espcies
de Macrocystis, Laminaria e Ascophyllum (Mchugh, 1987).
3.4.2 Constituio Qumica e Fsica do alginato
O cido algnico um polissacardeo que contm, naturalmente, grupos
carboxlicos em cada constituinte residual, e possui vrias habilidades funcionais
(Ikeda et al., 2000). Uma importante propriedade a sua capacidade de reagir
com ctions polivalentes, especialmente ons clcio, para produzir gis fortes ou
polmeros insolveis (Grant et al., 1973; King, 1983).
Os alginatos so constitudos por duas unidades monomricas, o acido -
D-manurnico (M) e o cido -L-cido gulurnico (G) e possuem grande variao
em sua composio e estrutura sequencial (Figura 2). Esses cidos so unidos
por ligaes glicosdicas entre os carbonos 1,4 das unidades monomricas (King,
1983; Moe et al., 1995). Estes monmeros so organizados em blocos ao longo
da cadeia, que podem ser compostos por blocos de homopolmeros (GG e MM)
junto com blocos alternados (MG) na mesma molcula, o que pode ser visto na
Figura 3. As configuraes espaciais que os blocos M e G adotam,
juntamente com a proporo, distribuio e comprimento destes blocos,
determinam as propriedades fsicas e qumicas do alginato (Smidsrd, 1974).
Figura 2: Estrutura Qumica do alginato (Kimica, 2007).
11
As diferentes sequncias de blocos MG e GG que iro determinar a
flexibilidade da cadeia, influenciando na solubilidade e estabilidade do gel que
ser formado. Blocos MG, por exemplo, formam cadeias mais flexveis e mais
solveis em pHs baixos e a estabilidade do gel est diretamente relacionada ao
contedo de blocos G (Ertesvg e Valla, 1998).
Segmento de bloco M-M
Segmento de bloco G-G
Segmento de bloco M-G
Figura 3: Estrutura dos blocos que constituem a molcula de alginato. M: cido
manurnico e G: cido gulurnico (Kimica, 2007).
Quanto maior o peso molecular de um alginato solvel, maior a viscosidade
de sua soluo. O alginato de sdio, que possui viscosidade de 200-400 mPa.s,
chamado de alginato de "mdia viscosidade" e possui uma maior aplicao
comercial.
3.4.3 Caractersticas dos Gis de Alginato
Solues de alginato possuem a capacidade de reagir com muitos ctions
di e trivalente e formar gis que se formam em temperatura ambiente ou em
12
qualquer temperatura at 100 C. Esses gis, possuem aplicaes em diversos
setores tecnolgicos, particularmente quando o clcio usado como on
divalente. Allen et al., (1963) classificaram o cloreto de clcio como o agente
gelificante mais efetivo. O efeito desses ons estabelecer ligao entre as
cadeias de alginato atravs de interaes inicas. Essa estrutura reticulada
formada tem uma grande capacidade de reter gua, formando assim um gel muito
estvel.
Solues de alginato tambm podem formar gis ao serem
cuidadosamente acidificadas, os quais, ao contrrio do gel de clcio, so mais
frgeis e possuem muitas aplicaes na indstria de alimentos por darem a
sensao de derretimento quando levados boca (Morris, 1985).
Para que o alginato tenha a capacidade de formar um gel ele precisa ter
um nmero suficiente de monmeros gulurnicos que se alinham lado a lado
formando uma estrutura parecida com um bero, que tem a dimenso ideal para
acomodar em seu interior um ction (geralmente Ca2+), gerando uma estrutura
dimrica. Os grupos carboxlicos de alginato tm afinidade por uma vasta
variedade de ctions e quando em contato com solues aquosas de metais
divalentes, suas caractersticas mudam significativamente. Um modelo utilizado
para descrever a formao do gel de alginato de clcio o modelo egg-box
(caixa de ovo), que considera a associao de duas ou mais cadeias resultando
em uma estrutura bidimensional similar a uma caixa de ovo, como descrita na
Figura 4, onde nos interstcios encontram-se os ons clcio (Grant et al.,
1973).
Figura 4: Rearranjo das cadeias de alginato com clcio (Zambon et al., 2002).
13
O modelo egg-box permite verificar a importncia das unidades G na
gelificao do alginato. Alginatos contendo maiores concentraes de blocos GG
formam gis mais rgidos e resistentes. Os blocos M tambm formam ligaes
intermoleculares, embora sejam menos efetivos que os blocos G, portanto a
formao e a fora do gel esto diretamente ligadas com a quantidade de
resduos G e o comprimento mdio destes blocos. Quanto maior o contedo de
blocos G, maior o potencial de formao de gel e maior sua fora.
A estrutura do gel de alginato governada no somente pela concentrao
e estrutura qumica do material do gel, mas tambm pela cintica de formao do
mesmo, que depende da concentrao do ction, da fora inica e do pH. A
afinidade entre ons metlicos e o alginato varia de acordo com as propriedades
dos ons, como raio inico, efeitos estricos, fora inica e eletronegatividade.
Segundo Davis et al (2003) a seletividade do alginato por ons metlicos
divalentes a seguinte:
Mg < Mn= Fe < Co < Ni < Zn < Ca < Cd < Sr < Cu < Pb < Ba
A diferente afinidade por ons metlicos faz com que o alginato seja
utilizado em processos de tratamento de efluentes contaminados atravs de troca
inica entre os ons divalentes, que esto ligados s molculas do cido, pelos
ons que se encontram na soluo aquosa que possuem maior afinidade pelo
alginato. A troca inica um processo de adsoro de espcies inicas
acompanhado simultaneamente pelo processo de dessoro de outras espcies
inicas em quantidades equivalentes. No decorrer dos processos, ocorre a
competio entre os ons, sendo que a espcie ligante a de maior afinidade ao
trocador inico. Outros fatores tambm podem influenciar na gelificao do
alginato como: a concentrao do alginato, presena de impurezas, concentrao
e natureza dos ons gelificantes e mtodo de preparao.
A literatura descreve dois mtodos convencionais para o preparo de gis
de alginato de clcio que sero descritos a seguir.
14
3.4.3.1 Mtodo da gelificao interna
Smidsrod e Draget (1997) descrevem o mtodo da gelificao interna
baseados na liberao controlada de on clcio, proveniente da dissociao dos
seus sais. Para que a ligao no ocorra muito rapidamente, os ons clcio so
adicionados na forma de CaCO3 insolvel, CaSO4 levemente solvel ou
complexados com agente quelante como EDTA ou citrato. medida que o clcio
ionizado na soluo interage com polmeros de cido algnico, mais sal ser
solubilizado, resultando na formao de um gel homogneo. Alteraes no pH ou
temperatura tambm podem ser utilizadas para controlar a liberao de ons de
clcio por toda a soluo de alginato.
3.4.3.2 Mtodo de difuso
O mtodo de formao de gis por difuso tambm chamado de mtodo
de gelificao rpida. A formao do gel se d por atomizao ou gotejamento da
soluo de alginato de sdio em uma soluo contendo ons clcio, formando
partculas nicas e independentes. Nesta tcnica criada uma zona de
gelificao da superfcie em direo ao centro do gel. A homogeneidade do gel
pode ser alcanada com alginato de alta massa molar e altas concentraes de
ons gelificantes (Smidsrod e Draget, 1997).
3.4.4 Produo das Partculas de Alginato de Clcio
A produo das partculas de alginato de clcio pode ser feita por
diferentes tcnicas, sendo que a mais utilizada por difuso pelos mtodos de
atomizao ou gotejamento da soluo de alginato de sdio em soluo
gelificante contendo ons clcio. Na atomizao a soluo de alginato de sdio
atomizada atravs de um bico atomizador, na soluo de cloreto de clcio. As
partculas formadas por atomizao possuem dimetros menores que 0,2mm
sendo que a viscosidade e temperatura da soluo de alginato de sdio, a
presso do gs inerte; o dimetro de abertura do bico atomizador e a altura entre
15
o bico atomizador e a soluo de CaCl2 so fatores que precisam ser controlados
por exercerem grande influncia no tamanho e caractersticas das partculas
produzidas (Tu et al., 2005 e Fundueanu et al., 1999). Para obteno de
partculas de dimetros maiores utiliza-se o mtodo de gotejamento. Nesta
tcnica, a soluo de alginato de sdio gotejada em soluo de clcio (ou outro
ction divalente de maior afinidade) sob constante agitao (agitador magntico).
Aps o perodo de agitao e contato, a difuso do clcio nos interstcios das
gotas de alginato forma partculas de alta viscosidade e insolveis em gua
(Fundueanu et al., 1999; Daz et al., 2007; Papageorgiou et al., 2006).
Fundueanu et al., (1999) aps inmeras tentativas obtiveram partculas de
dimetro entre 1000 e 1400 m e de boa esfericidade. Atravs de seu trabalho
verifica-se que a altura do bico de gotejamento um dos critrios mais
importantes para a obteno de partculas com boa esfericidade, pois, para
baixas alturas, as partculas apresentaram uma cauda acentuada.
Welter (2009) testou diferentes concentraes para soluo de alginato de
sdio e diferentes alturas referente distncia percorrida pela gota. Para as
condies analisadas, foi concludo que a concentrao de alginato de sdio de
2% e altura do bico de gotejamento de 30 cm foram as condies mais
adequadas para produo de partculas esfricas.
Vreeker et al. (2008) realizaram um estudo para avaliar a capacidade de
reidratao de partculas de alginato de clcio secas. As esferas foram produzidas
pelo mtodo de gotejamento, utilizando seringa de 500 mL para gotejar a soluo
de alginato de sdio 1% em soluo de cloreto de clcio 1%. As partculas foram
produzidas utilizando alginato com alta concentrao de blocos G (alto G) e com
alginatos de baixa concentrao de blocos G (baixo G). A reidratao das esferas
de alginato de clcio secas em ar temperatura ambiente com umidade relativa
de 11% foi testada em gua destilada e em solues salinas de diferentes
concentraes. As partculas produzidas a partir do alginato com alto G
apresentaram menores taxas de reidratao que as de baixo G, porm para
ambas a massa das partculas hidratadas foi maior que a massa inicial. As taxas
de reidratao aumentaram com o aumento da concentrao do sal e no ocorreu
reidratao em gua pura para nenhuma das partculas, o que sugere que a
reidratao das partculas de alginato de clcio depende da fora inica do meio
de reidratao e que as zonas de juno formadas durante a secagem so
16
estveis em gua pura impedindo a entrada de gua. Durante a reidratao, ons
clcio foram liberados para a soluo circundante e esta liberao ocorreu antes
de iniciado o aumento de volume das partculas.
3.4.5 Produo dos suportes hbridos de alginato com quitosana
Os suportes de alginato com quitosana so produzidos com o objetivo de
se obter hidrogis mais versteis, com diferentes estruturas qumicas e fsicas, o
que pode melhorar a sua atuao em uma determinada aplicao (Berger et al.,
2004). O complexo quitosana-alginato formado por interaes inicas entre os
grupos carboxlicos do alginato e os grupos amino da quitosana (Figura 5) (Tapia
et al., 2004). O alginato por ser insolvel em pH cido atua minimizando a
solubilidade da quitosana nestes meios, fazendo com que o complexo
alginato/quitosana possa ser usado em uma ampla faixa de pH (George e
Abraham, 2006). A estabilidade qumica e fsica dos hidrogis de alginato pode
ser aumentada por modificao qumica empregando agentes funcionais. Essa
modificao pode ser realizada com diferentes espcies qumicas tais como
glutaraldeido, epicloridina, glioxal, formaldedo e outros (Mendes et al., 2006).
Figura 5: Sistema alginato/quitosana (Finotelli, 2006).
Ca+2
17
3.5 Imobilizao
A imobilizao de enzimas tem sido considerada como uma alternativa
vivel e de grande aplicao. Muitas snteses qumicas apresentam melhores
taxas de converso quando realizadas utilizando biocatalizadores, tais como
enzimas ou clulas ntegras, no lugar dos catalisadores qumicos convencionais.
Um importante diferencial da catlise enzimtica a especificidade com que as
enzimas atuam Para realizar tais processos em mdia e grande escala
importante que esses biocatalizadores contenham altas concentraes de
enzimas e que possam ser recuperados ao final do processo para reutilizao
(Van Der Padt, 1993).
O processo de imobilizao se caracteriza por restringir a mobilidade da
enzima em um definido espao, provendo altas concentraes das mesmas, com
preservao de sua atividade cataltica (Guisn, 2006). Biocatalisadores tm sido
amplamente utilizados em diversos processos, seja em escala laboratorial ou
industrial. H muitos anos esforos intensivos tm sido empreendidos no
desenvolvimento de biocatalizadores utilizando tcnicas que permitam o seu uso
repetido ou em processos contnuos. As principais vantagens obtidas pelo
processo de imobilizao so o aumento da estabilidade trmica do biocatalisador
e possibilidade de recuperao e reutilizao sem perda significativa da sua
atividade cataltica (Guisn, 2006). As principais desvantagens so a alterao da
conformao nativa na enzima; o custo do suporte e a atividade durante o
processo de imobilizao (Arroyo, 1998). A seleo do mtodo de imobilizao
deve ser baseada em parmetros como atividade recuperada do derivado
imobilizado; caractersticas de regenerao e inativao; custo do procedimento
de imobilizao e a finalidade desejada para a enzima imobilizada (Malcata et al.,
1990).
A eficincia do processo de imobilizao pode ser avaliada pela
capacidade do suporte e do mtodo utilizado em aprisionar a maior quantidade de
enzimas possvel. Diferentes mtodos de imobilizao tm sido utilizados na
obteno de sistemas eficientes para utilizao nos processos biotecnolgicos em
reatores industriais, tornando-os economicamente viveis e apresentando melhor
produtividade. Porm, a escolha de uma matriz adequada para a imobilizao
de fundamental importncia para a obteno do produto desejado (Petre et al.,
18
1999). A porosidade, o tamanho dos poros e o grau de hidrofobicidade da matriz
interferem na intensidade da adeso celular (Silva et al., 2006).
O gel de alginato de clcio apresenta caractersticas interessantes como
resistncia mecnica, uniformidade, biocompatibilidade e porosidade da matriz
formada, o que tem despertado grande interesse no uso deste material como
suporte para imobilizao de enzimas e clulas dentre outras aplicaes. A
imobilizao de enzimas por aprisionamento em gel de alginato de clcio oferece
vantagens como simplicidade, baixo custo e a imobilizao pode ser realizada sob
condies moderadas (Gryta, 2002).
A utilizao de biocatalizadores heterogneos na produo de biodiesel
surge como uma alternativa bastante vivel porque alm de evitar o problema de
saponificao, gerado pela catlise qumica, possvel a utilizao do etanol
hidratado na reao e os produtos obtidos apresentam maior grau de pureza.
Pode-se encontrar na literatura muitos trabalhos que utilizam lpases imobilizadas
em diferentes matrizes porosas, para produo de biodiesel. Cruz Jr. (2000)
imobilizou lpases em matriz de quitosana para obteno de biodiesel por
transesterificao de leo de mamona e obteve valores de converso de steres
etlicos superiores a 90%.
3.5.1 Tipos de imobilizao
Na literatura, encontram-se muitos mtodos descritos e utilizados para
imobilizao de enzimas. As tcnicas de imobilizao podem ser classificadas em
naturais e artificiais. As naturais incluem a formao de biofilmes e a
adeso/adsoro de enzimas em suportes sintticos ou naturais e ocorrem
espontaneamente por meio de interaes eletrostticas. As artificiais incluem a
encapsulao ou aprisionamento em matrizes polimricas como o alginato ou
atravs de ligaes covalentes utilizando-se agentes ligantes multifuncionais
como o glutaraldeido ou carbodiimida (Figura 6).
Figura 6. Esquema mostrando os diferentes mtodos para imobilizao de enzimas com
destaque para os mtodos de
covalente no suporte (Dalla
3.5.1.1 Imobilizao por aprisionamento em matriz
O mecanismo clssico de imobilizao por aprisionamento a mistura de
enzimas ou clulas microbianas com um composto polimrico com cargas
negativas como o alginato, pectato, ou outro polmero orgnico. Esta mistura
gotejada em uma soluo
resultam na formao de um gel consistente e insolvel, o qual imobiliza
ou o microrganismo. O tamanho da barreira de conteno formada em torno das
enzimas ir depender da velocidade de fluxo, da
polimrica, da concentrao da soluo inica e do tempo de imerso nesta
soluo na qual o gel ser formado
Essa tcnica apresenta como vantagem o fato da enzima no interagir
quimicamente com o polmero evitando,
tcnica apresenta total eficincia de imobilizao. Contudo, a velocidade de
difuso dos substratos e produtos atravs da membrana pode ser um problema.
As enzimas encapsuladas apresentam atividade mais elevada em su
baixa massa molar, pois estes compostos se difundem pela membrana e se
aproximam com mais facilidade do stio ativo do biocatalisador
Esquema mostrando os diferentes mtodos para imobilizao de enzimas com
destaque para os mtodos de encapsulao (ou aprisionamento) em matriz
alla-Vecchia et al, 2004).
Imobilizao por aprisionamento em matriz polimrica
O mecanismo clssico de imobilizao por aprisionamento a mistura de
enzimas ou clulas microbianas com um composto polimrico com cargas
negativas como o alginato, pectato, ou outro polmero orgnico. Esta mistura
gotejada em uma soluo gelificante para formao de ligaes inicas, que
resultam na formao de um gel consistente e insolvel, o qual imobiliza
o microrganismo. O tamanho da barreira de conteno formada em torno das
ir depender da velocidade de fluxo, da densidade da soluo
polimrica, da concentrao da soluo inica e do tempo de imerso nesta
soluo na qual o gel ser formado (Wang et al., 2005).
Essa tcnica apresenta como vantagem o fato da enzima no interagir
quimicamente com o polmero evitando, assim, a desnaturao
tcnica apresenta total eficincia de imobilizao. Contudo, a velocidade de
difuso dos substratos e produtos atravs da membrana pode ser um problema.
As enzimas encapsuladas apresentam atividade mais elevada em su
baixa massa molar, pois estes compostos se difundem pela membrana e se
aproximam com mais facilidade do stio ativo do biocatalisador
19
Esquema mostrando os diferentes mtodos para imobilizao de enzimas com
em matriz e por ligao
polimrica
O mecanismo clssico de imobilizao por aprisionamento a mistura de
enzimas ou clulas microbianas com um composto polimrico com cargas
negativas como o alginato, pectato, ou outro polmero orgnico. Esta mistura
ligaes inicas, que
resultam na formao de um gel consistente e insolvel, o qual imobiliza a enzima
o microrganismo. O tamanho da barreira de conteno formada em torno das
densidade da soluo
polimrica, da concentrao da soluo inica e do tempo de imerso nesta
Essa tcnica apresenta como vantagem o fato da enzima no interagir
assim, a desnaturao; e em geral esta
tcnica apresenta total eficincia de imobilizao. Contudo, a velocidade de
difuso dos substratos e produtos atravs da membrana pode ser um problema.
As enzimas encapsuladas apresentam atividade mais elevada em substratos de
baixa massa molar, pois estes compostos se difundem pela membrana e se
aproximam com mais facilidade do stio ativo do biocatalisador (Dalla-Vecchia et
20
al, 2004). Moraes et al.(2002) estudaram a produo de isomaltulose a partir de
sacarose, utilizando-se clulas de Erwinia sp. D12 imobilizadas em alginato de
clcio, em colunas de leito empacotado e obtiveram em torno de 50% de
converso, usando solues de sacarose entre 20-30% a 35 C.
Tanriseven e Dogan, (2001) imobilizaram a enzima de Saccharomyces
cereisiae por aprisionamento em matriz de alginato. A imobilizao resultou em
87% de atividade recuperada nos suportes midos, permanecendo inalterada por
36 dias.
Li et al., 2003, imobilizaram a bactria Klebsiella sp. LX3 produtora de
enzima denominada isomaltulose sintase, capaz de converter sacarose em
isomaltulose e trealulose, por aprisionamento em gel de alginato de clcio 2%
(p/v). Utilizaram soluo 10% de sacarose como substrato e obtiveram 87% de
isomaltulose, 11,6% de trealulose e 1% de glicose.
Como visto, muitos relatos so encontrados na literatura de trabalhos que
obtiveram excelentes resultados utilizando enzimas ou clulas integras
imobilizadas em matrizes de alginato de clcio, por aprisionamento, para
utilizao em processos fermentativos, nos quais o substrato aquoso, no
havendo a necessidade de retirada de umidade dos suportes. Segundo Lagoa e
Rodrigues (2009), os suportes de alginato de clcio hidratados (forma de gel)
apresentam estrutura altamente porosa quando observados por microscopia
eletrnica de varredura aps preparao da amostra por meio de tcnicas
especiais que preservam a arquitetura do gel, o que facilita a difuso do substrato
no interior do suporte at contato com a enzima imobilizada, garantindo os altos
rendimentos alcanados. No entanto, aps secagem, apresentam baixa
porosidade, com poros localizados prximos superfcie e ncleo compacto o
que pode dificultar os fenmenos de transferncia de massa e interferir na
atividade final do biocatalisador.
3.5.1.2 Imobilizao por Adsoro fsica
A adsoro fsica de enzima em suportes uma tcnica de imobilizao
antiga e muito utilizada. A enzima imobilizada em um suporte slido por
interaes de Van der Walls, ligaes de hidrognio ou inicas.
21
Neste mtodo, a quantidade de enzima imobilizada bem como sua
atividade aps imobilizao depende da natureza do suporte utilizado e de suas
caractersticas como: tamanho, rea superficial, caracter hidrofbico/ hidroflico e
composio qumica. A porosidade do suporte importante e melhora a
eficincia de imobilizao por que a enzima fica adsorvida no interior dos poros,
sendo que a quantidade de enzima adsorvida depende do tamanho dos poros e
da concentrao enzimtica (Villeneuve et al., 2000).
Estudos reportados na literatura mostram que um pr-tratamento do
suporte com aditivos ou solventes orgnicos, ou o uso destes durante o processo
de imobilizao melhora a eficincia do processo. Kogusi et al., (1995)
imobilizaram lipase de Pseudomonas fluorescens em resina de troca inica
Dowex 66 sem um pr-tratamento do suporte e obtiveram baixos rendimentos de
imobilizao. Porm, ao adicionarem 50% de um solvente polar (etanol ou iso-
propanol) alcanaram rendimentos da ordem de 96 a 97%. Da mesma forma
Montero et al., (1993) observaram que o pr-tratamento do suporte com solvente
orgnico afetou a adsoro da lipase de Candida rugosa melhorando sua
atividade na hidrlise de azeite de oliva. Os autores sugeriram que o solvente
polar absorve as molculas de gua do suporte, favorecendo a adsoro da
protena.
3.5.1.3 Imobilizao por ligao covalente
A imobilizao por ligao covalente envolve a formao de ligaes
covalentes entre os grupos funcionais presentes na superfcie do suporte e os
grupos funcionais dos resduos de aminocidos da enzima os quais, geralmente,
no esto envolvidos no stio ativo da enzima.
Em alguns casos, guando os grupos funcionais do suporte no possuem a
capacidade de ligarem enzima, eles precisam passar por um procedimento de
ativao (reticulao), no qual seus grupos funcionais so ativados por reagentes
especficos como, por exemplo, o glutaraldeido, que introduz um grupo carbonila,
altamente susceptvel a reaes com os grupos nucleoflicos da enzima. A
imobilizao covalente evita o fenmeno de dessoro, diminui a velocidade de
desativao espontnea e resiste a valores extremos de pH e temperatura.
(Cardoso et al., 2009).
22
importante que as condies de ativao sejam bem estabelecidas
porque a eficincia deste procedimento diretamente proporcional ao tipo e
concentrao do agente de reticulao, tempo de contato e temperatura (Berger
et al., 2004). Algumas estratgias tm sido utilizadas na tentativa de se proteger o
sitio ativo das enzimas durante os processos de imobilizao, dentre elas,
destaca-se a utilizao do polietilenoglicol (PEG-1500), que tem sido
extensivamente utilizado como um modificador de protenas (Sharma et al.,
(2001) e Soares et al., (2003).
A Figura 7 mostra as reaes envolvidas no mtodo de imobilizao
covalente em suportes aminopropilados. Naturalmente estes suportes no
conseguem se ligar enzima e por isso precisam passar pela etapa de ativao,
que introduz grupamentos aldedos em sua superfcie para ento se ligarem
enzima.
Os hidrogis formados por reticulao devem ser isentos de agentes de
reticulao que no reagiram e para isso precisam passar por diversas etapas de
lavagem.
Figura 7: Reao de suportes aminopropilados para imobilizao covalente,
usando o glutaraldeido como agente de ativao (Cardoso et al., 2009).
4. MATERIAIS E MTODOS
4.1 Materiais
A enzima utilizada neste trabalho foi lpase microbiana comercial de
Pseudomonas fluorescences (Lipase AK) produzidas pela Amano
Pharmaceuticals.
23
Foram utilizados na produo dos suportes para imobilizao: alginato de
sdio comercial Protanal LF 20/40 fornecido pela FMC BioPolymer, cujas
especificaes do fabricante so: massa molecular de 200.000 400.000g.mol-1,
viscosidade 198mPa.s (1% (m/v) soluo aquosa 20C) e pH 6,7 (1% soluo
aquosa 20C), quitosana de alto massa molecular e cloreto de clcio dihidratado
PA adquiridos da Sigma-Aldrich e glutaraldeido 25% da Vetec. Todos os outros
reagentes utilizados foram de grau analtico.
Os reagentes utilizados no processo de imobilizao foram: hexano, etanol
PA e polietilenoglicol (PEG 1500) (Vetec); acetona, hidrxido de potssio,
indicador cido-base (fenolftalena) e goma arbica em p (Sigma-Aldrich), azeite
de oliva comercial com baixo teor de acidez e gua destilada para a realizao da
atividade hidroltica da enzima.
4.2 Mtodos
4.2.1 Preparao dos suportes de alginato
As solues de alginato de sdio foram preparadas adicionando-se o
alginato em p diretamente em gua destilada, ficando a mistura sob agitao
magntica por 6 horas para total dissoluo dos grnulos formados. A soluo
formada foi sonicada por 10 minutos para retirada de bolhas previamente
produo das partculas.
As partculas de alginato foram obtidas por gotejamento da soluo aquosa
de alginato de sdio em soluo gelificante de cloreto de clcio 0,1Molar. Para
isto, foi utilizado um sistema de gotejamento da soluo de alginato de sdio
(Figura 8), composto por um tubo de ao inox com 0,7 mm de dimetro de sada,
denominado bico gotejador, uma bomba peristltica Bomba Peristltica
MasterFlex Cole-Parmer - modelo 7553-70 para bombeamento da soluo de
alginato de sdio at o bico gotejador e sistema de agitao magntica da
soluo gelificante. As gotas formadas caram diretamente em um bquer
contendo soluo de cloreto de clcio 0,1 Molar, sob agitao magntica, para
gelificao por troca inica dos ons sdio por clcio. As partculas formadas
foram retiradas da soluo com auxlio de uma peneira, lavadas abundantemente
24
em banho de gua corrente e secas superficialmente com papel toalha. Em
seguida, foram secas em estufa a 100C, sob presso atmosfrica, at umidade
de equilbrio.
Segundo Torres (2006), dentre os parmetros que influenciam no tamanho
da gota formada esto a temperatura e concentrao da soluo de alginato de
sdio (viscosidade), vazo de bombeamento da bomba peristltica e altura
percorrida pela gota at contato com a soluo gelificante. Baseados nestes
parmetros foram testados trs concentraes (1%, 2% e 3%) de soluo aquosa
de alginato de sdio, trs vazes de escoamento da soluo de alginato de sdio
(4,2; 3,0 e 1,7mL/min), sendo que para cada vazo foram testadas trs alturas de
gotejamento (18, 24 e 30cm).
Figura 8: Esquema geral do sistema experimental empregado na preparao de
partculas de alginato de clcio. 1- Soluo de alginato de sdio; 2- Bomba peristltica; 3-
Bico gotejador; 4- Soluo de cloreto de clcio; 5- Agitador magntico.
4.2.2 Cintica de gelificao
Foram preparadas partculas de alginato de clcio nas concentraes de
1%, 2% e 3%. O acompanhamento da cintica de liberao de sdio e adsoro
de clcio foi feito por meio da quantificao de ons sdio e clcio nas partculas
por fotometria de chama e por absoro atmica (amostras previamente
digeridas) em diferentes tempos de imerso em soluo de clcio. Para cada
25
tempo, foram produzidas 20 partculas em 50 mL de soluo de cloreto de clcio
0,1 molar. A quantificao dos ons foi realizada nos tempos 10, 20, 30, 45, 60,
120, 180, 240, 300 e 1440 minutos de imerso em soluo gelificante. Em cada
tempo determinado as partculas foram escorridas e lavadas abundantemente
com gua destilada. Depois de pesadas foram digeridas em capela de exausto
com aquecimento, acido ntrico e perxido de hidrognio (conforme mtodo da
AOAC, 2000). A soluo resultante da digesto (aproximadamente 1 mL) foi
diluda para 50 mL e realizada a leitura de sdio e clcio em equipamento de
absoro atmica. Todo este procedimento foi realizado para cada concentrao
de alginato de sdio em triplicata.
Os dados experimentais resultantes da cintica de troca inica foram
submetidos anlise estatstica para avaliar a significncia estatstica da varivel
tempo nas concentraes de ons Ca2+ absorvido pelas partculas de alginato.
Foi realizada uma Anlise de Varincia (ANOVA) para um nvel de confiana de
95% (p < 0,05), seguida de um Teste de Tukey, para comparao entre as
mdias.
4.2.3 Preparao dos suportes de alginato com ferro
Preparou-se uma soluo aquosa de alginato de sdio 2% (p/v) e aps
completa solubilizao do alginato adicionou-se ferro metlico em p nas
concentraes de 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1% (p/v).
A homogeneizao do ferro na soluo de alginato foi feita por agitao
com basto de polietileno e por tratamento ultrassnico usando banho de
ultrassom a uma frequncia de 40khz, com potncia de 100 W temperatura
ambiente. As partculas foram produzidas por gotejamento da soluo de alginato
com ferro em soluo gelificante de cloreto de clcio conforme descrito no item
4.2.1. As partculas com diferentes concentraes de ferro foram testadas em
reator assistido por campo magntico, sob diferentes condies de vazo do ar e
induo magntica, para verificar a resposta dos suportes ao campo magntico
aplicado. Este teste foi utilizado para determinar a concentrao de ferro a ser
utilizada na produo dos biocatalisadores, visando sua utilizao em reao de
biodiesel no referido reator.
26
4.2.4 Produo dos suportes hbridos de alginato com quitosana
Aps determinadas as condies de produo de suportes de alginato,
com e sem ferro, foram produzidos suportes hbridos de alginato e quitosana com
e sem incorporao de ferro. Estas partculas foram sintetizadas segundo
metodologia descrita por Methal et al (2000) com modificaes. Inicialmente,
preparou-se uma soluo de quitosana 1% (p/v) em acido actico 5% (v/v). A esta
soluo adicionou-se soluo de cloreto de clcio para concentrao final de 0,1
molar de clcio e 0,5% (p/v) de quitosana. Os suportes foram produzidos
gotejando-se a soluo de alginato de sdio 2% (com ferro e sem ferro) na
soluo de cloreto de clcio com quitosana onde permaneceram por 1h, sob
agitao magntica, para gelificao dos suportes.
4.2.5 Secagem das partculas de Alginato
Para a realizao do estudo da cintica de secagem dos suportes de
alginato utilizou-se secagem em estufa convencional sem circulao de ar por ser
um processo que simula o tipo de secagem comumente utilizado nos trabalhos de
laboratrio que utilizam alginato.
Inicialmente, determinou-se a umidade do material mido por
termogravimetria em estufa presso atmosfrica na temperatura de 105C at a
amostra atingir peso constante. Realizou-se o acompanhamento da perda de
massa dos suportes preparados com alginato a 1, 2 e 3% a 100C para
verificao da interferncia dessas concentraes na cintica de secagem do
material. Os suportes preparados com alginato a 2% foram secos nas
temperaturas de 70, 100 e 120C para estudo da cintica de secagem nestas
condies. Realizou-se tambm a secagem dos suportes de alginato 2% com
incorporao de ferro e dos suportes hbridos de alginato 2% com quitosana.
As amostras foram colocadas em cadinhos posicionados em sentido
diagonal no interior da estufa, ficando uma amostra posicionada na frente, uma no
centro e outra no fundo da estufa, na tentativa de minimizar os problemas
relacionados s possveis diferenas de temperatura e circulao de ar, visto que
a distribuio espacial dentro da estufa exerce influncia na secagem das
27
amostras. Utilizou-se amostras de aproximadamente 4 gramas para
acompanhamento da perda de massa durante 240 minutos.
4.2.6 Imobilizao enzimtica
Foram testados diferentes mtodos de imobilizao da lpase AK nos
suportes produzidos, tais mtodos foram escolhidos de acordo com as
caractersticas de cada suporte e o principal objetivo foi comparar a eficincia de
imobilizao dos diferentes biocatalisadores. Nos suportes de alginato (puro e
com ferro) foram testados os mtodos de imobilizao por aprisionamento e por
adsoro fsica / ligao covalente e nos suportes hbridos de alginato (alginato e
quitosana puro e com ferro) foi testada a imobilizao por ligao covalente com
presena de ativador.
4.2.6.1 Por aprisionamento
Foi adicionada lpase AK em p nas concentraes 5mg/mL, 10mg/mL e
15mg/mL (massa de enzima/ volume soluo alginato) diretamente em 200 mL de
soluo de alginato de sdio 2%. Aps homogeneizao manual com basto de
polietileno, as partculas foram produzidas por gotejamento da soluo aquosa de
alginato de sdio em soluo gelificante de cloreto de clcio 0,1 molar no sistema
descrito no item 4.2.1, com vazo de 3,0 mL/min e altura de 24 cm e tempo de
imerso das partculas de 1 hora. As partculas gelificadas foram lavadas
exaustivamente com gua destilada e secas a vcuo temperatura ambiente. O
mesmo procedimento foi realizado para a imobilizao da enzima por
aprisionamento nos suportes de alginato com magnetita. A magnetita foi
adicionada na concentrao de 0,6% (concentrao determinada no estudo
realizado com partculas com diferentes concentraes de ferro no reator
assistido por campo magntico) na soluo de alginato de sdio e enzima.
28
4.2.6.2 Por ligao covalente sem presena de ativador
Os suportes de alginato secos ficaram imersos em hexano (razo da massa
de suporte : soluo de hexano de 1:10) sob agitao por 2 horas. Adicionou-se a
soluo enzimtica na concentrao 5mg/mL na proporo 10 mL de soluo
para cada grama de suporte. O sistema ficou sob agitao por 4 horas
temperatura ambiente seguido de contato esttico por um perodo de 18 horas a
4C. Os derivados imobilizados foram recuperados por filtrao a vcuo, com
sucessivas lavagens com gua destilada e armazenados em geladeira.
4.2.6.3 Por ligao covalente com presena de ativador
Quando os grupos funcionais do suporte no possuem a capacidade de se
ligarem enzima, os suportes precisam passar por um procedimento de ativao,
no qual seus grupos funcionais so ativados por reagentes especficos como, por
exemplo, o glutaraldeido, que introduz um grupo aldedo, altamente susceptvel a
reaes com os grupos nucleoflicos da enzima. Devido s caractersticas
qumicas da quitosana presente nos suportes hbridos de alginato e quitosana,
estes suportes precisaram passar por uma etapa inicial de ativao para posterior
imobilizao.
Os suportes hbridos foram inicialmente ativados com glutaraldeido. Para a
ativao, os suportes foram embebidos em soluo de glutaraldeido 2,5% (v/v)
em tampo fosfato de sdio 0,1 Molar e pH 7 por 1 hora a 25C sob agitao
branda (razo massa de suportes : volume total de 1:10). Aps este perodo, o
suporte foi lavado exaustivamente com gua destilada sendo em seguida levado
estufa (60C) por 2 horas (Paula et al., 2008).
Os suportes previamente ativados foram embebidos em hexano em uma
razo de 1:10 e mantidos sob agitao branda por 2 horas. Aps este perodo,
para cada grama de suporte ativado (matria seca), foram adicionados 50mg de
lpase AK em p e 0,1mL de soluo aquosa contendo 5mg/mL de
polietilenoglicol (PEG-1500). As suspenses contendo enzima e suportes foram
mantidas sob suave agitao temperatura ambiente por 2 horas, seguido de
armazenamento sem agitao por um perodo adicional de 18 horas a 4C. Os
29
derivados imobilizados foram recuperados por filtrao a vcuo, com sucessivas
lavagens com gua destilada e armazenados em geladeira.
4.2.7 Caracterizao dos suportes
Os suportes de alginato puros, alginato com ferro e alginato com quitosana
foram caracterizados quanto umidade, resistncia mecnica e trmica,
solubilidade, granulometria e morfologia.
4.2.7.1 Determinao de Umidade
A umidade dos suportes foi determinada pelo mtodo gravimtrico em
estufa de conveco natural a 105C at peso constante.
4.2.7.2 Resistncia a agitao
A resistncia mecnica dos suportes a agitao foi determinada por imerso
de exatamente 1g de suporte seco em 200 mL de gua destilada por um perodo
de 72 horas sob agitao vigorosa temperatura ambiente. Os suportes foram
retirados da gua com o auxlio de peneira metlica, secos at peso constante em
estufa convencional a 105C e em seguida pesados para verificao de perda de
massa por comparao com a massa inicial.
Segundo a metodologia proposta por Alzate (2008), a resistncia pode ser
divida em trs categorias de acordo com a perda de massa do suporte seco
(considerando a massa antes e depois do teste de agitao), as quais esto
apresentadas na Tabela 2.
.
Tabela 2: Resistncia a agitao dos suportes segundo Alzate (2008)
Resistncia a agitao Satisfatria Moderada Insatisfatria
Perda de massa (%) < 2 2 a 5 > 5
30
4.2.7.3 Solubilidade dos suportes em diferentes meios
A solubilidade dos suportes foi avaliada por imerso de 1g de suporte seco
em 100 mL de diferentes solventes, durante 72 horas, a 25C sob agitao
branda. Em seguida os suportes foram filtrados a vcuo e lavados com gua
destilada. Foi realizada uma avaliao visual e microscpica do estado de
conservao da estrutura dos suportes. Os diferentes meios foram gua, hexano,
etanol, cido actico e mistura de etanol anidro com leo vegetal na proporo
1:1.
4.2.7.4 Distribuio granulomtrica
A distribuio de tamanhos das partculas de alginato de clcio com e sem
incorporao de ferro foi determinada pelo mtodo de difrao a laser usando um
Analisador de partculas modelo SALD-3101 (SHIMADZU) que permite analisar
uma ampla faixa de tamanhos de partculas entre 0.05 e 3000 m de dimetro.
A metodologia de anlise consiste em dispersar uma massa de partculas
em um sistema de amostragem em fase aquosa constitudo por uma espcie de
banho termosttico, equipado com uma bomba para ajuste do fluxo de ar que
movimenta as partculas atravs de um nico sistema tico e nica fonte de luz,
sendo o princpio da medio o espalhamento desta luz ao incidir sobre as
partculas em suspenso.
4.2.7.5 Anlise morfolgica
A anlise da morfologia dos suportes e biocatalisadores foi realizada com
auxlio da microscopia ptica (MO) e da Microscopia Eletrnica de Varredura
(MEV). Para anlise por microscopia ptica, as partculas secas foram colocadas
em placa de petri e analisadas usando estereoscpio com cmera digital
acoplada. A microscopia eletrnica de varredura foi realizada em equipamento da
marca SHIMADZU, sendo as amostras metalizadas com ouro e as imagens
geradas a partir de eltrons secundrios sob vcuo. Esta tcnica essencialmente
31
permite investigar aspectos morfolgicos dos materiais, utilizando principalmente
detalhes da imagem topogrfica da superfcie examinada.
4.2.7.6 Anlise termogravimtrica (TGA)
Termogravimetria a tcnica na qual a mudana da massa de uma
substncia (em atmosfera controlada) medida em funo da temperatura, esta
submetida a uma programao controlada (Edith, 1997). uma tcnica muito
utilizada na caracterizao do perfil de degradao de polmeros. A exposio
temperatura elevada pode, algumas vezes, alterar a estrutura qumica e, por
consequncia, as propriedades dos materiais.
A anlise termogravimtrica (TGA) foi empregada para caracterizar os
suportes de alginato de clcio com e sem a incorporao de ferro. As anlises
foram conduzidas usando o Sistema Termogravimtrico SDT 2960 (TA
Instruments) com uma balana de termo sensibilidade de 0,1 g. As amostras
secas (aprox. 16,0 mg) foram analisadas sob atmosfera dinmica de nitrognio
(P.A.) com fluxo de 100 mL.min-1, entre 20 e 1150C, operando com uma taxa de
aquecimento de 20C min-1. Os dados foram processados usando o software
Universal V3 System Analysis (TA Instruments).
4.2.8 Caracterizao dos derivados imobilizados
Os biocatalisadores imobilizados foram caracterizados quanto
atividade enzimtica recuperada e eficincia de imobilizao.
4.2.8.1 Determinao da atividade hidroltica
A atividade enzimtica da enzima livre e imobilizada foi determinada pelo
mtodo de hidrlise de azeite de oliva de acordo com a metodologia adaptada de
Soares et al (1999). Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de
enzima necessria para liberar 1mol de cido graxo por minuto de reao.
32
Foram misturados 5 mL de uma emulso de azeite de oliva (50% azeite:
gua e 2,5% de gama arbica) e 4 mL de tampo fosfato 0,1M pH 7,0. A fim de
garantir homogeneizao do meio, o sistema reacional foi mantido sob agitao
(150 rpm) a 37C por 10 minutos. Em seguida adicionou-se a amostra que ficou
sob agitao de 200rpm durante o tempo determinado para a reao. Aps o
perodo de incubao, adicionou-se 10 mL de uma mistura de etanol e acetona
(1:1) com o objetivo de cessar a reao. A amostra foi titulada com soluo de
KOH (0,02 N) com o auxlio de um agitador magntico e indicador fenolftalena. O
volume gasto na titulao foi anotado para realizao dos clculos. A atividade foi
calculada considerando o volume gasto na titulao segundo a equao (1).
(1)
Em que: A atividade hidroltica em U/g sendo U definida como unidades de
atividade em mols/ min; Va, Vb so volumes de KOH gastos na titulao da
amostra e do branco em mL, respectivamente; CKOH a concentrao da soluo
de KOH usada na titulao em mol/L; t tempo de incubao em min; m a
massa de biocatalizador adicionado usada em g.
4.2.8.2 Clculo do rendimento de imobilizao
O rendimento de imobilizao (j) foi calculado com base na atividade
enzimtica oferecida e a atividade enzimtica residual presente no meio reacional
aps o processo de imobilizao, como mostra a equao (2).
Em que: Uo a atividade oferecida no incio da imobilizao (U/g) e Uf a
atividade residual presente no sobrenadante aps a imobilizao (U/g).
33
4.2.8.3 Clculo da atividade recuperada
O clculo da atividade recuperada foi determinado pela relao entre a
atividade contida nos biocatalisadores e as atividades inicial e final presentes no
sobrenadante, conforme mostrado na equao (3).
3)
Em que: AR a atividade recuperada (%); Us a atividade hidroltica contida no
derivado imobilizado (U/g); Uo a atividade oferecida no incio da imobilizao
(U/g) e Uf a atividade residual presente no sobrenadante aps a imobilizao
(U/g).
5. RESULTADOS E DISCUSSO
5.1 Estudo das condies de produo das partculas de alginato
Foram realizados experimentos para verificar os parmetros que influenciam
nas caractersticas fsicas das partculas produzidas por gotejamento, visando
determinao das condies experimentais que proporcionem a produo de
partculas com boa esfericidade e com distribuio granulomtrica uniforme ou
estreita. Posteriormente, foi realizado um estudo para determinao da
capacidade de troca inica e do tempo necessrio para total gelificao das
partculas.
Para a produo das partculas de alginato de clcio temperatura
ambiente, foram testadas trs concentraes (1%, 2% e 3% p/v) de soluo
aquosa de alginato de sdio. Para cada concentrao de alginato de sdio
utilizada foram testadas trs alturas de gotejamento (18, 24 e 30 cm), sendo
necessria a realizao de ajustes na vazo de escoamento da bomba
peristltica. As vazes utilizadas para o gotejamento das solues de alginato de
sdio 1, 2 e 3% foram de 4,2; 3,0 e 1,7mL/min, respectivamente. O aumento da
concentrao do alginato leva a um aumento da viscosidade da soluo que
exerce grande interferncia no processo de formao das gotas em uma mesma
temperatura. Segundo Torres (2006), o dimetro de abertura do bico gotejador e
34
a temperatura da soluo de alginato de sdio (consequentemente na viscosidade
da soluo) interferem no tamanho da gota formada. Para um mesmo dimetro de
abertura do bico, solues de maior viscosidade formam gotas maiores. Foi
possvel observar que a altura do bico de gotejamento at o contato com a
soluo gelificante de cloreto de clcio foi uma das principais variveis na
obteno de partculas de boa esfericidade. A altura percorrida pela gota
determina a velocidade no momento de impacto da partcula com a superfcie da
soluo gelificante de modo que para menores alturas, as partculas
apresentaram uma cauda acentuada e para maiores alturas, houve a formao
de partculas achatadas, conforme mostrado na Tabela 3. Para as diferentes
concentraes da soluo de alginato de sdio (diferentes viscosidades), foi
necessrio se fazer ajustes de vazo da bomba peristltica de forma que, quanto
maior a vazo da bomba, menos uniformes foram as partculas produzidas.
Portanto, para a produo de partculas uniformes utilizou-se baixas vazes. As
partculas de alginato de clcio midas formadas apresentaram formato esfrico,
com dimetro da ordem de 4 a 5 mm .
Tabela 3: Ensaios para obteno de partculas com boa esfericidade por
gotejamento.
Ensaio
CAlginato de
Sdio
(% mssica)
Altura do bico gotejador*
(cm)
Forma
1
1%
18 Esfrica
24 Esfrica
30 Achatada
2
2%
18 Formao de cauda
24 Esfrica
30 Achatada
3
3%
18 Formao de cauda
24 Esfrica
30 Achatada
*Altura do trajeto percorrido pela gota
Para todas as condies analisadas, o ensaio 2, no qual foi utilizado
concentrao mssica de 2%, vazo da bomba peristltica de 3,0mL/mim e altura
do bico de gotejamento de
nestas condies apresentaram boa esfericidade, dimetro mdio de 4 a 5 mm
(partculas midas) e dimetro md
Figura 9: Fotografias digitais dos suportes de alginato
5.1.1 Cintica de gelificao
O estudo da cintica de gelificao das partculas de alginato de clcio foi
realizado com o objetivo de determinar exatamente o tempo necessrio para que
ocorra a total gelificao destas partculas.
sdio so liberados para a soluo gelificante enquanto
estrutura do polmero para a formao do gel
estudo do processo de gelificao do alginato para determinao da cintica de
entrada dos ons clcio e cons
Avaliou-se tambm neste estudo a interferncia
gelificao como: a concentrao da soluo de alginato de sdio e a
incorporao de ons ferro na estrutura do alginato
O presente estudo foi realizado atravs da quantificao dos ons sdio e
clcio presentes nas partculas de alginato ao longo do tempo de gelifica
realizada em equipamento de absoro atmica.
quantificao dos ons s
tempo de gelificao.
Para todas as condies analisadas, o ensaio 2, no qual foi utilizado
concentrao mssica de 2%, vazo da bomba peristltica de 3,0mL/mim e altura
do bico de gotejamento de 24 cm, foi o mais adequado. Os suportes preparados
nestas condies apresentaram boa esfericidade, dimetro mdio de 4 a 5 mm
(partculas midas) e dimetro mdio entre 1 e 2 mm depois de seco
digitais dos suportes de alginato sem ferro e com ferro,
secos em estufa convencional a 100C.
Cintica de gelificao
O estudo da cintica de gelificao das partculas de alginato de clcio foi
realizado com o objetivo de determinar exatamente o tempo necessrio para que
ocorra a total gelificao destas partculas. Durante o processo de gelificao ons
dos para a soluo gelificante enquanto os ons clcio se ligam a
polmero para a formao do gel. Neste contex
estudo do processo de gelificao do alginato para determinao da cintica de
entrada dos ons clcio e consequente determinao do tempo de gelificao.
se tambm neste estudo a interferncia de duas variveis no processo de
gelificao como: a concentrao da soluo de alginato de sdio e a
incorporao de ons ferro na estrutura do alginato.
estudo foi realizado atravs da quantificao dos ons sdio e
clcio presentes nas partculas de alginato ao longo do tempo de gelifica
realizada em equipamento de absoro atmica. Inicialmente
quantificao dos ons sdio nas partculas de alginato 1, 2 e 3%
tempo de gelificao. Os resultados mostraram que,
35
Para todas as condies analisadas, o ensaio 2, no qual foi utilizado
concentrao mssica de 2%, vazo da bomba peristltica de 3,0mL/mim e altura
cm, foi o mais adequado. Os suportes preparados
nestas condies apresentaram boa esfericidade, dimetro mdio de 4 a 5 mm
io entre 1 e 2 mm depois de secos.
sem ferro e com ferro, hidratados e
O estudo da cintica de gelificao das partculas de alginato de clcio foi
realizado com o objetivo de determinar exatamente o tempo necessrio para que
Durante o processo de gelificao ons
ons clcio se ligam a
. Neste contexto, realizou-se um
estudo do processo de gelificao do alginato para determinao da cintica de
ente determinao do tempo de gelificao.
de duas variveis no processo de
gelificao como: a concentrao da soluo de alginato de sdio e a
estudo foi realizado atravs da quantificao dos ons sdio e
clcio presentes nas partculas de alginato ao longo do tempo de gelificao,
Inicialmente, fez-se a
1, 2 e 3% ao longo do
independente da
36
concentrao de alginato utilizada, praticamente todo o sdio presente nas
partculas foi liberado durante o processo de gelificao (Figura 10).
0 50 100 150 200 250 300 350 400
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Alginato 1% Alginato 2% Alginato 3%
Na
(mg/
kg-1)
Tempo (min)
Figura 10: Cintica de reduo de ons sdio nas partculas de alginato 1, 2 e 3% ao
longo do tempo de gelificao.
De acordo com Blandino et al (1999), na formao de partculas de alginato
pelo mtodo de gotejamento, o processo de formao do gel comea
imediatamente aps o contato da soluo de alginato de sdio (em formato de
gota) com a soluo catinica. Neste momento, forma-se instantaneamente uma
membrana capsular que vai aumentando sua espessura medida que os ons
clcio difundem em direo ao centro da gota. Estes autores, estudaram a
influncia da concentrao de alginato de sdio e cloreto de clcio na cintica de
gelificao de membranas de alginato de clcio formadas pelo mtodo de
extruso e observaram que o processo de formao do gel controlado pela
difuso dos ons clcio. Em razo de o clcio ser um ction metlico menor que a
molcula do polmero ele que se difunde atravs da cadeia do alginato se
ligando aos stios de ligao do polmero que esto livres.
37
0 50 100 150 200 250 300
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
A lg inato 1% A lg inato 2% A lg inato 3%
Ca(
mg/
kg-1)
Tem po(m in)
Figura 10. Cintica de absoro de ons clcio nas partculas de alginato 1, 2 e 3% ao
longo do tempo de gelificao.
A figura 11 mostra a cintica de absoro de ons clcio pelas partculas de
alginato ao longo do tempo de gelificao. Inicialmente, possvel observar um
rpido aumento na concentrao dos ons clcio, indicando um intenso processo
de difuso na fase inicial de formao do gel. Isso ocorre porque o gradiente de
concentrao existente entre as solues favorece a difuso dos ons clcio que
se ligam rapidamente aos stios de ligao da cadeia polimrica que esto
desocupados. medida que estes stios vo sendo ocupados, nas regies mais
externas, os ons clcio precisam se difundir atravs do gel que j est formado
para ento se ligar aos stios que ainda esto livres na zona de gelificao mais
interna, o que provoca uma diminuio na velocidade de formao do gel.
Na figura 10, uma comparao entre as curvas permite dizer que as
concentraes de ons clcio absorvidos pelas partculas de alginato 2% so
consideravelmente maiores que para alginato 1%. No entanto, o mesmo no
acontece quando a concentrao do alginato elevada de 2% para 3%, no qual
possvel observar um discreto aumento da concentrao do clcio. Possivelmente
este fenmeno se justifique pelo fato de que, com o aumento da concentrao do
alginato, aumenta-se tambm o nmero de stios de ligao por unidade de
volume na regio superficial das partculas, o que pode dificultar a difuso dos
ons clcio por esta membrana superficial j reticulada.
A cintica de gelificao das partculas de alginato com ferro permitiu
verificar a influncia da incorporao do ferro no processo de formao do gel. Os
38
resultados ilustrados na figura 12, mostram uma discreta diferena entre as
concentraes de sdio liberado das partculas de alginato com ferro e sem ferro
que tambm podem ser resultado de dificuldades difusionais provocadas pela
presena do ferro na estrutura do alginato. No entanto, as diferenas existentes
entre as concentraes de clcio absorvido por estas partculas so claras e bem
expressivas (Figura 13).
-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
Alginato 2% Alginato 2% +Fe
C N
a (m
ol/K
g)
Tempo(m in)
Figura 12. Cintica de liberao de ons sdio das partculas de alginato 2% e alginato 2% com ferro.
0 50 100 150 200 250 300
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Alginate 2%+Fe 0,6% Alginate 2%C
Cal
cio
(mol
/Kg)
Tempo (min)
Figura 13. Cintica de absoro de ons clcio pelas partculas de alginato 2% e
alginato 2% com ferro.
39
Na tentativa de tentar entender estas diferenas, algumas hipteses so
levantadas e discutidas. Segundo Davis et al (2003), o alginato possui afinidade
qumica pelos ons ferro divalentes, que de forma semelhante ao clcio, se ligam
aos stios de ligao do alginato formando gel. Durante o processo de produo,
percebeu-se a ocorrncia de oxidao de ferro ao longo do processo de
gelificao o que leva a possibilidade da ocorrncia de possveis trocas entre os
ons clcio j ligados aos stios de ligao com os ons ferro ou at mesmo a
ligao direta dos ons ferro, oxidados nos stios de ligao ainda desocupados.
Porm, a princpio, o ferro presente nas partculas no est na forma de ons e
por isso a possibilidade de ligao qumica com o suporte seria mnima.
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