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Facultad de Ciencias Naturales y Ambientales
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LA MICROALGA Scenedesmus sp DE LA LAGUNA DE LIMONCOCHA PARA
APLICACIÓN EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA
Autora: Laura Fernández Almache
Director: Pablo Castillejo
Revisores: Emma Carrillo, Jefferson Rubio
Quito, abril 2018
INTRODUCCIÓN
• Chlorophyceae
• Hileras d 4 ó 16 células
• Obicuas,nomóviles
• Cultivo de microalgas
• Parámetros físico-químicos
• Producción Laboratorio
• Autótrofos
• Unicelulares
• Fotosíntesis oxigénica
• Macromoléculas
• Aminoácidos esenciales
• SCP
PROTEINAS VEGETALES
LAS MICROAGAS
Scenedesmussp
PROCESO PRODUCCION MICROALGAS
Objetivo General:
Aislar de una cepa pura de la especie Scenedesmus sp de un consorcio procedente de la Laguna de Limoncocha para su posterior cuantificación de contenido proteico y su aplicación en la industria alimentaria
Objetivos específicos:
• Identificar por observación al microscopio óptico y el uso de claves dicotómicas la especie de Scenedesmus sp.
• Cultivar en laboratorio Scenedesmus sp en medio de cultivo Bristol y BG11
• Determinar la cinética de crecimiento de Scenedesmus sp por conteo celular y densidad óptica.
• Obtener biomasa y determinar la productividad de los medios de cultivos Bristol y BG11
• Determinar contenido proteico de Scenedesmus sp
OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio
El consorcio de microalgas provienende la laguna de Limoncocha, que seencuentra ubicada en la ReservaBiológica Limoncocha del cantónShushufindi de la provincia deSucumbíos, en la región amazónicanortoriental del Ecuador, concoordenadas geográficas:
Latitud: -0.466667
Longitud: -76.4667
Altitud: 220 msnm
Temperatura anual: 24.9 °C
AISLAMIENTO
ENRIQUECIMIENTO
1mL en 100mL, 20°C, 12:12, 10 días
DILUCIONES SERIADAS
1mL cultivo en 9mL agua estéril, siembra en medio sólido, 10 días, 20°C, 12:12
CAPILARIDAD
Tomar una colonia y sembrar en medio sólido.
ADHESION A VIDRIO CIBREOBJETOS
PROPAGACION
MEDIOS DE CULTIVO
• Bristol
• BG11
ACONDICIONAMIENTO
• Temperatura
• Fotoperiodos
• Agitación
• Inóculo inicial 150ooo cel/mL
CONTROL
• Contaje celular, cámara Neubauer
• Densidad óptica, espectrofotómetro 675nm
Diseño
Experimental
AAx1 Ax2 Ax3
Ay1 Ay2 Ay3
BBx1 Bx2 Bx3
By1 By2 By3
OBTENCIO DE BIOMASA
CENTRIFUGADO
2000 rpm por 10 minutos
LISIS CELULAR
Ondas ultrasónicas, 60 seg 2 periodos
SECADO
Estufa 3 horas, 105°C
CUANTIFICACION DEL CONTENIDO PROTEICO
MÉTODO BIURET
ACONDICIONAMIENTO
25mg en 1mL buffer, centrifugar, reposar 60min
MEDICION
Amplitud de onda 540 nm
y = 0,1168x + 0,0062
R² = 0,9965
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0,3000
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Absorbancia BSA mg/mL
RESULTADOS
Según las micrografías obtenidas de lasplacas 105,106 y las claves dicotómicas(Wehr, Sheath, & Kociolek, 2015), sepuede identificar que la especiepredominante es perteneciente al géneroScenedesmus, de la división Chlorophyta.
En la Figura se observa coloniasformadas por grupos de 4 células, conuna organización en zigzag, cuerpo celularalargado con pared celular lisa,presentando las células externas unacurvatura hacia dentro, y células esféricasde 4µm de diámetro, agrupas en cenobiosde 2 a 4 cenobios organizados en línea oen forma alterna.
IDENTIFICACION
16 µm
PROPAGACION
0,00
1000000,00
2000000,00
3000000,00
4000000,00
5000000,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
célu
las/
mL
Días cultivo
Contaje Medio Cultivo Bristol
0,2800
0,3000
0,3200
0,3400
0,3600
0,3800
0,4000
0,4200
0,4400
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ab
sorb
an
cia
Días de cultivo
Absorbancia Medio Cultivo Bristol
0,00
500000,00
1000000,00
1500000,00
2000000,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
célu
las/
mL
Días cultivo
Contaje Medio Cultivo BG-11
0,2600
0,2800
0,3000
0,3200
0,3400
0,3600
0,3800
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ab
sorb
an
cia
Días cultivo
Absorbancia Medio Cultivo BG-11
Curvas de crecimiento de Scenedesmus sp en medio de cultivo Bristol y BG11 determinadas por contaje celular y densidad óptica
Fase adap: 170000cel/mLFase exponencial: 700000cel/mL
Fase adap: 50000cel/mLFase exponencial: 300000cel/mL
0,00
500000,00
1000000,00
1500000,00
2000000,00
2500000,00
3000000,00
3500000,00
4000000,00
4500000,00
5000000,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
célu
las/
mL
días cultivo
Medio Cultivo Bristol vs BG-11
BRISTOL
BG11
N= 𝑁𝑜 ∗ (2)𝑛BRISTOL
NO 108833
N 4202333
n 5,22
BG11
NO 113000
N 1813166
n 2,04
Comparativo de crecimiento celular Bristol vs BG11
En ambos medios de cultivo las curvas de crecimiento presentan definidas las fases de crecimiento celular con una fase exponencial de 3 días. En el medio de cultivo Bristol el crecimiento en la fase exponencial fue 52.12% mayor que en medio de cultivo BG11.
Los porcentajes sales de cloruro de sodio y magnesio, y sulfatos son mayores en un 25,26% en el medio Bristol
R² = 0,9876
y = 3E+07x - 1E+07
0,00
600000,00
1200000,00
1800000,00
2400000,00
3000000,00
3600000,00
4200000,00
4800000,00
0,2800 0,3000 0,3200 0,3400 0,3600 0,3800 0,4000 0,4200 0,4400
Co
na
taje
Absorbancia
Contaje vs Absorbancia (Bristol)
y = 2E+07x - 7E+06
R² = 0,9761
0,00
500000,00
1000000,00
1500000,00
2000000,00
0,2800 0,2900 0,3000 0,3100 0,3200 0,3300 0,3400 0,3500 0,3600 0,3700
Co
nta
je
Absorbancia
Contaje vs Absorbancia (BG11)
Correlación de determinación de crecimiento celular por densidad óptica
PRODUCTIVIDAD DE BIOMASA SECA
Productividad de biomasa seca de
Scenedesmus sp en medio de cultivo BRISTOL
CULTIVO g L g/L
A1 0,0225 0,05 0,450
A2 0,0257 0,05 0,514
A3 0,0261 0,05 0,522
TOTAL 0,0743 0,15 0,495
Productividad de biomasa seca de
Scenedesmus sp en medio de cultivo BG11
CULTIVO g L g/L
B1 0,0134 0,05 0,2680
B2 0,0129 0,05 0,2580
B3 0,0138 0,05 0,2760
TOTAL 0,0401 0,15 0,2673
Productividad de biomasa seca en Bristol Productividad de biomasa seca en BG11
La productividad de biomasa seca de Scenedesmus sp en medio de cultivo Bristol, fue mayor en un 46,02% en relación con la biomasa seca obtenida en el medio de cultivo BG11
CONTENIDO PROTEICO
Contenido de proteína (BG11)
CULTIVO Abs 540nm Proteina g/L %Proteina
B1 0,0171 0,0933 34,82%
B2 0,0165 0,0882 34,18%
B3 0,0174 0,0959 34,74%
PROMEDIO 0,0925 34,58%
Contenido de proteína (BRISTOL)
CULTIVO Abs 540nm Proteina g/L %Proteina
A1 0,0275 0,1824 40,53%
A2 0,0282 0,1884 36,65%
A3 0,0289 0,1943 37,23%
PROMEDIO 0,1884 38,13%
Contenido proteico de Scenedesmus sp en medio Bristol
Contenido proteico de Scenedesmus sp en medio BG11
Los valores proteicos obtenidos difieren en un 3.58%, que se considera una variación no significativa; el contenido proteico para Scenedesmus sp. El ratio de contenido proteico en el medio de cultivo Bristol es de 2,89 y en el medio de cultivo BG11 es de 2,62.
CONCLUSIONES
- La combinación de técnicas de enriquecimiento condiluciones seriadas resulta un método idóneo paraobtener un cultivo axénico de un consorcio nosaturado.
- Las condiciones de cultivo dispuestas a unatemperatura de 20°C, con fotoperiodos de 12:12(luz-oscuridad) favorecen el crecimiento exponencialde la cepa Scenedesmus sp.
- Tener un cultivo axénico favorece la aplicaciónde un método indirecto para la determinacióndel crecimiento celular mediante densidadóptica al tener correlaciones altas.
- En relación a la productividad de biomasamicroalgal, para Scenedesmus sp, un medio decultivo rico en sales favorece su rendimiento aescala laboratorio.
- El método de ruptura celular por ondas ultrasónicascomo pretratamiento para determinación deproteínas por el método de Biuret resulta una opciónaceptable ya que los valores obtenidos soncomparables a los resultados obtenido por González& Cañizares (1998) en su estudio sobre la incidenciadel N2 en la producción de proteína algal .
- La aplicación a gran escala de la microalgaScenedesmus sp. como una fuente efectiva deproteína, no está limitada por acondicionamientosde producción y técnico, con lo que concluimos queestos resultados la hacen una especie recomendadapara la producción industrial orientada al usoalimentario.
¡MUCHAS GRACIAS!
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