タンパク質の立体構造決定と インタラクトーム解析 -...

タンパク質の立体構造決定とインタラクトーム解析

―発現・精製が簡便なタンパク質タグつき目的タンパク質を用いることで、迅速

な創薬ターゲットの選定を可能に―

鳥取大学 大学院医学系研究科

機能再生医科学専攻

飯塚 舜介

タンパク質の構造 と 機能

構造から生体のしくみの理解構造から生体のしくみの理解

生命の営みは蛋白質の働き生命の営みは蛋白質の働き

（（百聞は百聞は 構造を構造を 一見に如かず一見に如かず））

ＤＮＡ タンパク質

なぜタンパク質立体構造なのか？

遺伝情報はＤＮＡ 生命の営みは蛋白質

１次構造（順序） ３次、４次構造（立体構造）

ゲノム科学からタンパク質科学へ

タンパク質の立体構造解析

タンパク質発現 精製

結晶 X線結晶解析

水溶液 多次元NMR解析

水素原子Hの座標は決ま

らない。

核オーバーハウザー効果（NOE）の水素原子間距離

情報から、水素の座標を決める。

なぜ相互作用なのか？

生体制御はタンパク質の相互作用で営まれている

タンパク質-タンパク質

タンパク質-DNA （アプタマー）

タンパク質-RNA (ncRNA）

タンパク質-活性物質

インターラクトｰム解析 （interaction + ome）

タンパク質－タンパク質相互作用を特定

ゲノム科学の方法. ハイスルｰプット２）ゲノム相互作用解析（Ｙ２Ｈ）

機能未知分子 ⇨ 機能推定

機能既知分子 ⇨ 新局面の展開

遺伝子ネットワーク（遺伝的相互作用）

分子生物学（分子で生命現象を説明する．分子の相互作用）

機能ゲノミクス（相互作用を標的）

１）アフィニティ精製法 タンパク質科学の方法. ロースルｰプット

キネティックス, 相互作用部位, 特異性

２．単独では構造をもたないタンパク質機能ドメイン (IUP)

特異的タンパク質の相互作用

１．安定な構造を持つタンパク質ドメイン

タンパク質-タンパク質複合体を形成してはじめて構造をもつ

生体情報伝達に重要

ドラッグデザインドラッグデザイン

治療薬、診断薬

新しい医療への期待

構造ゲノム

遺伝子医療

再生医療

オーダーメード医療

ゲノム創薬

医療のゲノム革命抗体医薬 RNA医薬

ゲノム情報

ゲノム情報 蛋白質の構造

生命

生命現象の解明

病気の原因の解明

病気の原因蛋白質の構造に基く

医薬開発

ポストゲノムの課題： ゲノム創薬

蛋白質

細胞分化

分化の制御

転写因子の活性制御

幹細胞 前駆細胞 成熟細胞

再生医療

多数の遺伝子に発現変化

目的細胞を生産

ES 神経幹細胞 神経細胞

筋肉幹細胞 筋肉(心筋）

血管内皮幹細胞 血管内皮細胞

造血幹細胞 赤血球

白血球

血小板

骨、腎臓、肺、肝臓

膵臓等

分化を制御する転写因子分化を制御する転写因子

BL21(DE3)pLysS

Affinity chromatography

Gel chromatography

タンパク質ドメインの大量生産と精製

１３Ｃ,１５Ｎ 標識

N-HSQC of Hex-C

The measurement conditions were ni=512, nt=32 in H2O at 25℃and 500MHz.

15N

(ppm

)

1H (ppm)

＜タグを切り離すと会合する＞

表面電荷 疎水性コア

相互作用の機能解析

シグナルの帰属決定

複合体の立体構造決定

定量的解析・

キネティクス

選択的阻害

相互作用の部位決定

相互作用の構造

解離定数の決定

交換速度の推定

特効薬の開発

anti-GST-antibody

PTUM1

BIACORE chip

BIACORE chip

anti-GST-antibody

PTU

HD

GST-

GST-

表面プラズマ共鳴実験

（SPR), Biacore

PTUM1

BIACORE chip

BIACORE chipPTU

HD

抗GST抗体を用いる方法 従来の直接法

SPR 測定

GST-PTU (リガンド）+ M1（アナライト）

domain ka C kd Chi^2 Kd

M1752+/-34

5.42E-05

0.00307+/-0.117 0.0719

4.08E-06

M2109+/-11

5.42E-05

0.0242+/-0.0945 0.0578

2.22E-04

M1（アナライト）

＜吸着性が強くタグを切り離すと精製が困難＞

＜タグを切り離すと沈殿する疎水性タンパク質ドメイン＞

＜本来構造をもたないドメイン（IUP)＞

＜タグを切り離すと会合するタンパク質＞

遊離のドメインと同様の構造をとる場合が多い

容易に長時間安定したＮＭＲ測定が出来る

シグナル帰属ができる

構造決定が可能である

相互作用測定がし易い

タンパク質のＮＭＲを巨大タグ付きで解析する今回の提案

今回の提案：

扱いが難しくて放置されているタンパク質はありませんか？

構造決定と相互作用解析の問題点を

一挙に解決

迅速な創薬ターゲットの選定

発明の名称 ：ポリペプチドのNMRスペクトル測定・解析法、その方法に用いる試料、装置およびプログラム

出願番号 ：特願2007-55145出願人 ：鳥取大学発明者 ：飯塚舜介

本技術に関する知的財産権

お問い合わせ先

鳥取大学産学・地域連携推進機構

知的財産管理運用部門長・教授

佐々木茂雄

ＴＥＬ 0857-31-6000ＦＡＸ 0857-31-5474E-mail s.shigeo@cjrd.tottori-u.ac.jp