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Fluoreszenzpolarisation
Vortrag im Modul
biophysikalische Methode
Kathrin Helwig und
Franziska Schramm
Gliederung
• Einführung • Aufbau • Grundlagen• Vorgehensweise der Messung• Fluorophore • Vor- und Nachteile• Anwendungsbeispiele• Literatur
Einführung
• weitverbreitete Messtechnik in der biophysikalischen Chemie
• 1926 entwickelt
• Analyse von molekularen Bindungen
Einführung
• Beobachtung der molekularen Bewegung fluoreszierender Moleküle in Lösung
• direkte, nahezu momentane Messung
• Heutige Anwendung für die Wechselwirkungsstudien bspw.DNA-DNA-, DNA-Protein-, Protein-Protein-Bindungen
Aufbau
Grundlagen
Grundlagen
Grundlagen
Vorgehensweise der Messung
• Messung der Polarisation einer Lösung fluoreszenz-markierter Liganden
FP1
• Zugabe einer Probelösung mit bestimmter Konzentration in kleinen Voluminas, Inkubation FP2
• ΔFP = FP2- FP1 Änderung des molekularen Volumens
Vorgehensweise der Messung
• Wiederholung für verschiedene Konzentrationen der Probelösung
• Graphische Darstellung der Probenkonzentration-ΔFP-Beziehung
• Temperatur konstant halten
• Gesamtzeit der Messung: ~ 5 min
Fluorophore
ONH
N
CO2C2H5
H
BODIPY (Borandipyrromethandifluorid)
Fluorescein
Rhodamin 6G
N
B
N
F FR
Vor- und Nachteile
• homogene Technologie
• Reaktionen sind sehr schnell (Sekundenbereich) zur GGW-Einstellung
• Reagenzien sind stabil
• große Ansätze können gemacht werden
Vor- und Nachteile
• hohe Reproduzierbarkeit • keine Abtrennungsschritte• hoch automatisierte Technik • keine Waschschritte steigert Genauigkeit
schnellere Messung
weniger Abfall
• Limitiert auf kleine Molekulargewichte
Anwendung
DNA-DNA-WW
• Information über DNA-Proben nach Hybridisierung
• Oligothyminderivate mit EDA oder HMDA und FITC verwendet
Anwendung
Anwendungen
• Polarisationsmessungen markierter Antigene
• Polarisation einer Mischung: aus Polarisation freier und gebundener Antigene und deren relative Fluoreszenzintensität
FPIA: Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays
Anwendungen
• Bsp.: Antigen= Hormon Cortisol, Fluophor = Fluorescein
• Mischung aus fluoreszenzmarkierten Cortisol und spezif. Antikörper Zugabe von reinem Cortisol Verdrängung des markierten Antigens
Messung der Polarisation Bestimmung der Cortisolkonzentration, die von den Antikörper gebunden wurden und der Antikörperkonzentration
Anwendung
• Enzyme Activity Imaging
Literatur
• K.Kakehi et al.,Fluorescence polarization: Analysis of Carbohydrate-Protein-Interaction, Analyt.Biochem., 2001, 297, 111-116
• W.J.Checovich et al., Fluorescence poalrization-a new tool for cell and molecular biology, nature, 1995, 375, 254-256
• Xiangning Chen et al.: Fluorescence Polarization in Homogeneous Nucleic Acid Analysis, Genome Res. 1999, 9, 492-498
• www.biotek.de• www.jolley.com • www.iss.com• http://probes.invitrogen.com/handbook/boxes/1572.html• Murakami et al., Fluorescent-labeled oligonucleotide probes:
detection of hybrid formation in solution by fluorescence polarization spectroscopy, Nucleic Acids Research, 1991, 19 (15), 4097-4102
• W. Schmidt, Optische Spektroskopie, 2000, 2.Auflage, Wiley-VCH, S. 212 ff
Ende
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