Genética molecular. Trataron los pneumococos S muertos por calentamiento con detergente para...

Genética molecular

Trataron los pneumococos S muertos por calentamiento con detergente para obtener un lisado celular (un extracto libre de células que contenía el FT).

Este lisado contiene (entre otras cosas) el polisacárido de la superficie celular, las proteínas, el ARN y el ADN de los neumococos S.

Sometieron al lisado a diversos tratamientos enzimáticos Inyectaron en ratones los neumococos de tipo R vivos junto con una fracción del lisado modificada enzimáticamente

EL EXPERIMENTO DE HERSHEY Y CHASE Como los virus de la progenie heredan los caracteres fenotípicos del virus

primitivo, Alfred Hershey y Martha Chase diseñaron un sistema para averiguar si la herencia era comunicada por el DNA o por las proteínas. Utilizaron técnicas de marcaje radioactivo para construir dos tipos de fagos distintos.

Una población de fagos creció en un medio que contenía 35S. El 35S marca a las proteínas que contienen residuos de Cys o Met y por lo tanto, esta población contiene proteínas radioactivas y DNA no radioactivo, ya que el DNA no contiene S.

La segunda población de virus creció en un medio que contenía 32P. El 32P marca los ácidos nucleicos, pero no a las proteínas, de forma que esta población contiene DNA radioactivo y proteínas no radioactivas.

Ambos tipos de virus fueron utilizados por separado para infectar a células de E. coli susceptibles.

Infección de la célula huésped

Reproducción y lisis bacteriana

Después de la infección, y antes de que se completara el ciclo lítico sometían a las células a una fuerte agitación mecánica para desprender de la superficie de la célula a todos los virus que pudiesen estar adheridos, y después, por centrifugación separaban las células de las partículas víricas: Las células se acumulan en el sedimento, y los fagos permanecen en el sobrenadante.

A continuación medían la radioactividad asociada a las células. Las células presentaban radioactividad únicamente cuando se hacía el experimento con virus 32P. Cuando se realizaba el experimento con virus 35S, las células no contenían radioactividad. Como los virus que surgen de ambos ciclos líticos son absolutamente normales, este experimento indica que las características genéticas del virus han sido comunicadas a la progenie mediante el DNA, no mediante la proteína.

ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO

ADN

ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO

ADN

Función mensajero: un mononucleótido monofosfatado como el AMPc

tiene funciones de mensajero intracelular de señales, como en el caso de las hormonas proteicas.

Funciones biológicas de los nucleótidos:

Metabolismo (cadena transportadora

de electrones)

Función estructural

La adenina, la guanina y la citosina se encuentran tanto en el DNA como en el RNA, mientras que la timina se encuentra sólo en el DNA y el uracilo sólo en el RNA.

derivadas de la pirimidina:

C, T, U

derivadas de la purina:

A, G

Bases nitrogenadas

pirimidina purina

(tomado de “Lehninger, Principles of Biochemistry”, Nelson. D.L. and Cox, M.M.,W.H. Freeman and Company, New York, fifth edition, 2009)

Bases púricas

adenina (A) guanina (G)

(tomado de “Lehninger, Principles of Biochemistry”)

Bases pirimidínicas

citosina (C) timina (T)en DNA

uracilo (U) en RNA

(tomado de “Lehninger, Principles of Biochemistry”)

Azúcar : ribosa : D-aldopentosa

D-ribosa estructura

abierta

-D-ribosa cíclica-D-ribofuranosa)

(tomado de “Lehninger, Principles of Biochemistry”)

Azúcar: 2-desoxi-ribosa y ribosa

Azúcares

-2-desoxi-D-ribosa en DNA

-D-ribosa en RNA

¿QUÉ ES EL GRUPO FOSFATO

ES ÁCIDO FOSFÓRICO:

MOLÉCULA INORGÁNICA.

DE LA UNIÓN DE ESTOS TRES COMPONENTES SE ORIGINA:

fosfatoazúcar: pentosa

base: nitrogenada

UN NUCLEÓTIDO: TRIFOSFATADO

NUCLEÓTIDO: MONOFOSFATADO

¿CÓMO SE FORMA CADA UNO DE LOS POLÍMEROS?

•Se establece un enlace fosfodiester: entre el carbono de la azúcar del primer nucleótido con el carbono de la azúcar del siguiente y así sucesivamente

•Así, se forma una larga cadena de ADN o polímero de nucleótidos

53

53

Unión entre nucleótidos: enlace fosfodiéster

enlace

fosfodiéste

r

extremo 5’

extremo 3’

extremo 5’

extremo 3’

5’

3’

Direcciónde la cadena

(tomado de “Lehninger, Principles of Biochemistry”)

Las bases enfrentadas se aparean y permanecen unidas por puentes de hidrógeno.

Estos puentes son débiles . Siempre se une una base púrica con una

pirimídica: A – T, G – C. La unión A – T es por 2 puentes de H. La unión C – G es por 3 puentes de H.

Cada cadena es una secuencia repetida azúcar-fosfato-azúcar-fosfato que forma el esqueleto de la molécula. Cada grupo fosfato está unido al carbono 5' de una subunidad de azúcar y al carbono 3' de la subunidad de azúcar del nucleótido contiguo.

Así, la cadena de DNA tiene un extremo 5' y un extremo 3' determinados por estos carbonos 5' y 3'.

Las cadenas son antiparalelas, es decir, la dirección desde el extremo 5' a 3' de una es opuesta a la de la otra.

Levene: 1920Analiza los componentes del ADN, describiéndose una pentosa (desoxirribosa), un grupo fosfato y 4 bases nitrogenadas y que la base se enlaza en el C1´ y el fosfato en el C5´

Erwin Chargaff: 1949

Analizó el contenido molar de las bases de DNA procedente de diversos organismos y descubrió que en todos los casos: [A]=[T] y [G]=[C] =1

Esta es la llamada ley de Chargaff.

Maurice Wilkins y Rosalind Franklin: 1950Realizaron los primeros estudios físicos sobre el DNA mediante la técnica de difracción de rayos X y observaron que:

1. la molécula de DNA es una cadena extendida con una estructura altamente ordenada

2. La molécula de DNA es helicoidal y tiene 20 Å de diámetro.

3. la hélice del DNA está compuesta por dos hebras helicoidales.

4. las bases de los nucleótidos están apiladas con los planos separados por una distancia de 3,4 Å.

J.Watson y F.Crick:1953 Dedujeron la estructura del ADN

Francis Crick y James Watson, en Cambridge, Inglaterra, 1953. Fotografía del archivo del Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA

Watson y Crick eran investigadores teóricos que integraron todos los datos disponibles en su intento de desarrollar un modelo de la estructura del ADN. Los datos que se conocían por ese tiempo eran:

•que el ADN era una molécula grande , ácida, también muy larga y delgada. (1869,Miescher)• Tinción del ADN con fucsina (1914; Fuelgen)• Se analizan los componentes del ADN, describiéndose una pentosa (desoxirribosa), un grupo fosfato y 4 bases nitrogenadas y que la base se enlaza en el C1´ y el fosfato en el C5´(1920; Levene)•(1920; Griffith) , descubre que una molécula transmite características hereditarias• Análisis de las cantidades de nucleótidos presentes en el ADN proporcionados por Chargaff; 1940 y encontró una regularidad singular (A=T y C=G) ;( purinas/pirimidinas=1) para una misma especie = LEY DE CHARGAFF• La molécula que transmite las características hereditarias es el ADN (1944; Avery et al y 1952;Hershey y Chase)•los datos de la difracción de los rayos-x de Franklin y Wilkins; 1950. (King's College de Londres). Que determinaron que la molecula de ADN es helicoidal, tiene un diametro uniforme de 2nm y que está compuesta de subunidades que se repiten

LEY DE CHARGAFF

• La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). A = T . • La relación entre Adenina y Timina es igual a la unidad (A/T = 1). • La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). G= C. La

relación entre Guanina y Citosina es igual a la unidad ( G/C=1). • La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases

pirimidínicas (T+C). • (A+G) = (T + C). La relación entre (A+G) y (T+C) es igual a la

unidad (A+G)/(T+C)=1. • Sin embargo, la proporción entre (A+T) y (G+C) era característica de

cada organismo, pudiendo tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada. Este resultado indicaba que los ácidos nucleicos no eran la repetición monótona de un tetranucleótido. Existía variabilidad en la composición de bases nitrogenadas. 

Denaturación del DNA : Tm según elcontenido de (G + C)

(tomado de “Lehninger, Principles of Biochemistry”)

Proporciones relativas (%) de bases en ADNSegún estudios de Chargaff

2 cadenas de polímeros de nucleótidos unidos entre si

Unión de nucleótidos enlace fosfoéster.

Unión de bases por puentes de hidrogeno

El ADN es una doble hélice, con las bases dirigidas hacia el centro.

Las dos cadenas de polinucleótidos se mantienen equidistantes.

Las hebras se enrollan sobre un eje imaginario.

La secuencia fosfato azúcar va por la cara externa.

Las bases van enfrentadas internamente formado los pares de bases.

Pares de bases siempre una púrica con una pirimidina.

Ambas cadenas están equidistantes a 11A.

Puentes de H

A=T C G

La doble hélice de DNA

(tomado de “Lehninger, Principles of Biochemistry”)

10,5 nucleótidos/vuelta

“right-handed”

DNA: 2 cadenas antiparalelas y complementarias, formando una doble hélice que tiene 10,5 nucleótidos/vuelta

ADN ácido desoxirribonucleico

• Un nucleótido está formado por:

Una base nitrogenada + una molécula de azúcar + un fosfato

Bases complementarias

2 puentes de hidrógeno

3 puentes dehidrógeno

(tomado de “Lehninger, Principles of Biochemistry”)

Estabilidad de la doble hélice

La estabilidad de la doble hélice está dada por

1. interacción entre las bases complementarias de las 2 hebras a través de puentes de hidrógeno.

2. “apilamiento” de las bases de una misma hebra: interacciones hidrofóbicas.

3. interacción de los grupos fosfato con el medio acuoso.

Enlaces en un nucleótido

ésteranhídridoanhídrido

-N-glicosídico fosfato

fosfato

fosfato

Enlace éster: entre grupo alcohol del C5’ de la ribosa o d-ribosa y ácido fosfórico.

Enlaces anhídridos: entre 2 moléculas de ácido fosfórico.

Miescher: 1869 ADN era una molécula grande ácida, también muy larga y delgada.

Fuelgen: 1914Tinción del ADN con fucsina.

Levene: 1920 Describe componentes (pentosa, fosfato y bases nitrogenadas.

Griffith: 1920 descubre que una molécula transmite características hereditarias.

Chargaff; 1940 Análisis de las cantidades de nucleótidos presentes en el ADN proporcionados y encontró una regularidad singular

(A=T y C=G) ;( purinas/pirimidinas=1) para una misma especie = LEY DE CHARGAFF

Avery et 1944 y 1952;Hershey y Chase: La molécula que transmite las características hereditarias es el ADN

.

Franklin y Wilkins; 1950 los datos de la difracción de los rayos-x determinaron que la molécula de ADN es helicoidal, tiene un diámetro uniforme de 2nm y que está compuesta de subunidades que se repiten

Francis Crick y James Watson: 1953 modelo de la doble hélice

http://www.bionova.org.es/biocast/tema19.htm

Una ayuda para estudiar: