GRUPO DE PATÓLOGOS DEL NOROESTE REUNIÓN ACADÉMICA 2013 BIOLOGÍA MOLECULAR BÁSICA PARA EL...

GRUPO DE PATÓLOGOS DEL NOROESTEREUNIÓN ACADÉMICA 2013

BIOLOGÍA MOLECULAR BÁSICA PARA EL PATÓLOGO

Luis Muñoz FernándezCentenario Hospital Miguel Hidalgo

Biopath MéxicoAguascalientes, Ags.

López-Corella E. Patología 1991; 29: 65-66.

EL CONOCIMIENTO DEL CÁNCER A LOS LARGO DEL TIEMPO

DeVita VT et al. Primer of the Molecular Biology of Cancer 2011: 4-5.

EL CONOCIMIENTO DEL CÁNCER A LOS LARGO DEL TIEMPO

De Vita VT el al. Primer of the Molecular Biology of Cancer 2011: 4-5.

LiVolsi V, Upton MP. Am J Clin Pathol 2012;137: 341-342.

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 62.

BIOMARCADORES• Es una característica que se mide objetivamente

como un indicador de:• Un proceso biológico normal.• Una enfermedad.• Las respuestas farmacológicas a una intervención

terapéutica.• Tipos:• Biomarcador pronóstico: evolución.• Biomarcador predictivo: sensibilidad a cierto

tratamiento.• Biomarcador de monitorización: respuesta a un

tratamiento.

Jaffe CC. Arch Pathol Lab Med 2009; 133: 547-549.

BIOMARCADORES• Biomarcadores pronósticos:• La mayoría de los que detectamos en patología.• Un buen ejemplo son los índices mitósicos o de

proliferación (PCNA, Ki 67).• Biomarcadores predictivos:• Her2-neu en cáncer de mama.• Mutación de KRAS en cáncer de colon.

• Biomarcadores de monitorización:• Fluorodesoxiglucosa en tomografía por emisión

de positrones (PET scan).Jaffe CC. Arch Pathol Lab Med 2009; 133: 547-549.

BIOMARCADORES PRONÓSTICOS EN NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS

Bahler D. Molecular Pathology of Hematolymphoid Diseases 2010: 66.

FIJADORES USADOS EN PATOLOGÍA

Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008; 132: 251.

TÉCNICAS MOLECULARES EN TEJIDOS FIJADOS EN FORMOL Y EMBEBIDOS EN PARAFINA

• Hibridación in situ fluorescente o cromógenica (FISH, CISH).

• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).• Secuenciación del ADN.• Pruebas en ARN, como la PCR con

transcripción reversa (RT-PCR).• Microarreglos para determinar la expresión

génica.

Dry, S et al. Am J Clin Pathol 2012; 137: 346-355.

DEGRADACIÓN DEL ADN EN TEJIDOS FIJADOS EN FORMOL Y EMBEBIDOS EN PARAFINA

• Para los estudios moleculares, el tiempo de fijación en formol debe ser entre 6 y 24 horas.

• El formol establece enlaces cruzados con el ADN, las histonas y otras proteínas, fraccionando las moléculas:

• Este proceso prosigue en los bloques tisulares a lo largo de los años:• Después de 10 a 20 años, la degradación puede

impedir la amplificación con PCR.

Dry, S et al. Am J Clin Pathol 2012; 137: 346-355.

Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008; 132: 250.

PROTOCOLOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 62.

EXTRACCIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Hunt JL , Sanja D. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 70.

FLUJO UNIDIRECCIONAL EN EL LABORATORIO DE PATOLOGÍA MOLECULAR

Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008, 132: 256.Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 67.

REACTIVOS DE LA PCR

• Polimerasa termoestable: Taq polimerasa u otra:• Pfu, Pwo, Tgo, Tli, Tth.

• Cebadores (primers).• Desoxinucleótidos.• Solución amortiguadora (buffer).• Magnesio.

Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 77-78.

PCR

Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008 132: 254.

PCR: CICLOS TÉRMICOS

Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 75.

Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 74.

Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 75.

DETECCIÓN Y ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS DE LA PCR (“AMPLICONES”)

Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 62.

VARIEDADES DE PCR

• Hot start: mayor especificidad.• Nested: mayor producción y especificidad.• Específica para metilación.• Multiplex: se amplifican varias regiones

simultáneamente.• PCR con transcripción reversa (RT-PCR):

amplificación de secuencias de ARN.

Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 78-79.

PCR EN TIEMPO REAL

Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 80.

PCR EN TIEMPO REAL

Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 80.

MATRICES DE ADN (MICROARRAYS)

Quackenbush J. N Engl J Med 2006, 354: 2463-2472.

MATRICES DE ADN (MICROARRAYS)

http://www.columbia.edu/~bo8/undergraduate_research/projects/sahil_mehta_project/work.htm

APLICACIONES DE LAS MATRICES DE ADN

Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 66.

Perou ChM et al. Nature 2000, 406: 747-752.

PERFILES DE EXPRESIÓN GENÉTICA EN CANCER DE MAMA

Lester SC. Pathologic Basis of Disease 2010.

ONCOTYPE PARA CÁNCER DE MAMA

http://www.oncotypedx.com/en-US/Breast.aspx

CÁNCER COLORRECTAL: UNA ENFERMEDAD HETEROGÉNEA

• Diferentes vías moleculares de la carcinogénesis:• Vía supresora convencional (60%):

• APC/β-catenina/Wnt.• Vía de inestabilidad hereditaria de microsatélites (Lynch,

2 al 7%) :• MSH2, MLH1, MSH6, PSM2.

• Vía de la mucosa aserrada (35%):• Silenciamiento epigenético (metilación de islas CpG). TGFβ y

BAX.

Shi Ch, Washington K. Am J Clin Pathol 2012, 137: 847-859.

Shi Ch, Washington K. Am J Clin Pathol 2012, 137: 847-859.

TRATAMIENTO DEL CARCINOMA DE PULMÓN QUE NO ES DE CÉLULAS PEQUEÑAS (NSCLC)

• La neoplasia maligna que se diagnostica con mayor frecuencia en el mundo.

• Más del 50% de los pacientes están en etapa IV cuando se les hace el diagnóstico.

• En el 10 al 15% de los casos de carcinoma que no es de células pequeñas (NSCLC) existen mutaciones del EGFR: gefitinib, erlotinib.

• Rearreglos del gen ALK (gen de fusión EML4-ALK) en el 5% de los NSCLC: crizotinib.

Aisner DL, Marshall CB. Am J Clin Pathol 2012, 138: 332-346.

Aisner DL, Marshall CB. Am J Clin Pathol 2012, 138: 332-346.

TRATAMIENTO DEL CARCINOMA DE PULMÓN QUE NO ES DE CÉLULAS PEQUEÑAS (NSCLC)

• La mutación de KRAS es un predictor negativo de las mutaciones de EGFR y de los rearreglos de ALK.

• La amplificación de MET se asocia a la resistencia al tratamiento con inhibidores de EGFR.

Aisner DL, Marshall CB. Am J Clin Pathol 2012, 138: 332-346.