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GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
DOCENTES:
• ALICIA LUQUE
• MARISA BIASOLI
• MARÍA ELENA TOSELLO
• SUSANA AMIGOT
• SILVANA RAMADÁN
• LUCÍA BULACIO
• MAXIMILIANO SORTINO
• CARLOS GÓMEZ
• MIRTA TARTABINI
• HERNÁN DALMASO
• EDUARDO CODINO
• VIRGINIA PODESTÁ
MICOLOGIA
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
MARISA BIASOLI
MARÍA ELENA TOSELLO
SUSANA AMIGOT
SILVANA RAMADÁN
MAXIMILIANO SORTINO
MIRTA TARTABINI
HERNÁN DALMASO
EDUARDO CODINO
VIRGINIA PODESTÁ
-AÑO 2014-
1
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
2
TRABAJO PRÁCTICO N° 1
TEMA: ZIGOMICOSIS
Objetivos;
� Reconocer en cortes histológicos de materiales clínicos la morfología de los
hongos causantes de Zigomicosis.
� Reconocer la macromorfología de cepas de Rhizopus, Mucor, Absidia y
Cunninghamella.
� Reconocer la micromorfología diferencial de los cultivos de Rhizopus, Mucor,
Absidia y Cunninghamella.
Materiales:
� Caja de trabajo.
� Microscopio.
� Cultivos de cepas de Rhizopus, Mucor, Absidia y Cunninghamella.
� Placas de Petri con Agar Sabouraud-glucosa.
� Placas de Petri estériles.
� Soportes en V.
� Agua destilada estéril.
� Vaspar.
� Cortes histológicos de tejidos de pacientes con Zigomicosis teñidos por las
técnicas de Hematoxilina-Eosina y Groccott.
� Lupa estereoscópica.
Actividades;
� Observar y describir la macromorfología de las colonias de Rhizopus, Mucor,
Absidia y Cunninghamella.
� Observar las colonias con Lupa estereoscópica.
� Aplicar técnica de microcultivo y observar la micromorfología de las cepas
estudiadas.
� Establecer similitudes y diferencias entre las características morfológicas de
las cepas de Rhizopus, Mucor, Absidia y Cunninghamella.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
3
TRABAJO PRÁCTICO N° 2
TEMA: INFECCIONES POR ESPECIES DE MALASSEZIA
Objetivos:
� Reconocer en examen microscópico directo de escamas la forma parasitaria
del agente etiológico de pitiriasis.
� Conocer la macro y micromorfología de especies de Malassezia spp.
� Conocer los fundamentos e interpretación de pruebas fisiológicas utilizadas
para la identificación de las distintas especies Malassezia.
Materiales:
� Caja de trabajo
� Materiales clínicos: escamas de piel.
� Cultivos en Agar Dixon modificado (ADm) de Malassezia spp.
� Preparados de especies de Malassezia.
� Cultivos en CHROMAgar Malassezia de especies de Malassezia
� Tubos con Agar-Esculina en columna sembrados con especies de
Malassezia.
� Peróxido de hidrógeno 10%- Pipetas Pasteur de vidrio o palillos de madera.
Actividades:
� Realizar exámenes directos con KOH 20 % y Azul de lactofenol de escamas
de piel.
� Observar y describir la macromorfología de las colonias de Malassezia spp.
� Observar y describir la micromorfología de las diferentes especies de
Malassezia spp.
� Realizar prueba de la Catalasa:
La presencia de catalasa en la cepa en estudio se determina por el agregado de
una gota de peróxido de hidrógeno 10 vol. a una ansada de cultivo sobre un
portaobjeto nuevo y limpio. La aparición de burbujas es considerada una prueba
positiva, sin importar la magnitud de éstas.
� Interpretar los resultados de la prueba de desdoblamiento de la esculina:
Se evalúa la actividad ββββ-glucosidasa usando tubos de agar-esculina. Una ansada
de levaduras jóvenes se inocula por punción en el agar y se incuba 5 días a 32º C.
4
El desdoblamiento de la esculina en esculetina + glucosa se revela por el
oscurecimiento del medio, con liberación de sales de hierro soluble que se
encuentran incorporadas al medio.
� Interpretar los desarrollos obtenidos en placas de CHROMAgar-Malassezia
modificado. Registrar los colores obtenidos, tamaño, producción o no de
precipitado.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
5
TRABAJO PRÁCTICO N° 3
TEMA: DERMATOFITOSIS: GENEROS MICROSPORUM Y EPIDERMOPHYTON
Objetivos:
� Extraer material de las dermatofítias de las zonas convenientes y en forma
correcta para asegurar la mayor probabilidad de éxito en el examen
micológico.
� Conocer y realizar correctamente el procedimiento para la observación
microscópica del material de las lesiones.
� Reconocer las formas parasitarias en material de piel y faneras,
diferenciándolas de las formas saprofíticas, sobre material queratinoso.
� Ser capaz de sembrar el material proveniente correctamente en los medios de
cultivos adecuados, conociendo la composición y razón de uso de cada uno
de ellos.
� Conocer las características macromorfológicas típicas (aspecto, color,
superficie, etc.) y las posibles variaciones (pleomorfísmo) de las colonias de
dermatofitos (géneros Microsporum y Epidermophyton) más comúnmente
aisladas de las lesiones humanas en nuestro medio.
Materiales:
� Caja de trabajo: ansa, espátula, gancho, hilo, portaobjetos, cubreobjetos,
papel de filtro, gasa, colorante Gueguén, líquido de montar, KOH 20% P/V,
Tinta china (1:2 con agua destilada), pinza, espátula de Drigalsky.
� Microscopios.
� Colonias en Sabouraud-glucosa de; Microsporum canis, Microsporum
gypseum y Epidermophyton floccosum.
� Preparados provenientes de cultivos de adhesión de: Microsporum canis,
Microsporum gypseum y Epidermophyton floccosum.
� Escamas de piel y faneras con elementos fúngicos provenientes de
dermatofitias.
Actividades;
� Observar y describir macromorfológicamente las colonias de Microsporum
canis, Microsporum gypseum y Epidermophyton floccosum.
6
� Observar y describir micromorfológicamente cepas de Microsporum canis,
Microsporum gypseum y Epidermophyton floccosum.
� Observar exámenes directos de escamas de piel, pelos y uñas parasitados.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
7
TRABAJO PRÁCTICO N° 4
TEMA: DERMATOFITOSIS: GÉNERO TRICHOPHYTON
Objetivos:
� Extraer material de las dermatofitias de las zonas convenientes y en forma
correcta para asegurar la mayor probabilidad de éxito en el examen
micológico.
� Conocer y realizar correctamente el procedimiento para la observación
microscópica del material de las lesiones.
� Reconocer las formas parasitarias en material de piel y faneras,
diferenciándolas de las formas saprofíticas sobre material queratinoso.
� Ser capaz de sembrar el material proveniente correctamente en los medios
de cultivos adecuados, conociendo la composición y razón de uso de cada
uno de ellos. Conocer las características macromorfológicas típicas
(aspecto, color, superficie, etc.) y las posibles variaciones (pleomorfísmo) de
las colonias de dermatofitos (género Trichophyton) más comúnmente
aisladas de las lesiones humanas en nuestro medio.
� Reconocer por observación microscópica los elementos estudiados del
micelio vegetativo y de reproducción asexuada del género Trichophyton.
� Conocer el fundamento y ser capaces de realizar las siguientes técnicas
para: formación de órganos perforadores sobre pelos estériles in vitro,
comprobación de la capacidad de síntesis de la ureasa determinación de
requerimientos nutricionales utilizando los medios:"Trichophyton agar" y
utilización del medio de agar púrpura de Bromo-cresol, glucosa leche.
� Aplicar los resultados obtenidos del estudio morfológico y fisiológico a
claves taxonómicas con el objeto de ubicar un dermatofito dado en el
género y especie correspondiente,
� Saber aplicar los recursos con que cuenta el laboratorio micológico en el
diagnóstico de casos de cronicidad y de portador sano.
� Conocer los criterios a tener en cuenta en los diagnósticos diferenciales.
Materiales:
� Caja de trabajo.
� Microscopios.
8
� Colonias en Sabouraud-glucosa de: T. rubrum, T. interdigitale y T.
tonsurans.
� Preparados provenientes de cultivos de adhesión de: T. rubrum, T.
interdigitale y T. tonsurans.
� Escamas de piel y faneras con elementos fúngicos provenientes de
dermatofitias.
� Medio de agar púrpura de Bromo-cresol, glucosa, leche.
� Medio de Christensen.
� Medio diferencial "Trichophyton agar":
• -N° 1: Caseína agar
• -N° 2: Caseína + Inositol agar
• -N° 3 : Caseína + Inositol + Tiamina agar
• -N° 4 - Caseína + Tiamina agar
• -N° 5.- Caseína + ácido nicotínico agar
• -N° 6: Nitrato de amonio agar
• -N° 7: Nitrato de amonio + Histidina agar
Actividades;
� Observar y describir macromorfológicamente las colonias de T. rubrum, T.
interdigitale y T. tonsurans.
� Observar y describir micromorfológicamente cepas de T. rubrum, T.
interdigitale y T. tonsurans.
� Realizar exámenes directos de materiales parasitados: escamas de piel,
pelos y uñas.
� Realizar la siembra de T. rubrum, T. interdigitale en medio de Christensen.
Incubar durante 4 días a 28 °C.
� Sembrar las cepas de T. rubrum, T. interdigitale por la técnica del anzuelo
queratinoso. Incubar durante 4 semanas a 28 °C.
� Realizar la siembra de T. rubrum, T. interdigitale en medio de agar púrpura
de Bromo-cresol, glucosa, leche. Incubar durante 7 días a 28 °C.
� Utilizar el test de Trichophyton agar": Nº1 y Nº4 (Incubado durante 15 días
a 28 °C) para diferenciar: T. rubrum, T. interdigitale y T. tonsurans.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
9
TRABAJOS PRÁCTICOS N° 5
TEMA: CANDIDIASIS
Objetivos:
� Reconocer la presencia de levaduras, pseudomicelio y/o filamentos
en materiales biológicos por exámenes directos o coloración.
� Conocer la macro y micromorfología de los agentes productores de
Candidiasis.
� Utilizar medios cromogénicos para la detección de mezcla de
levaduras.
� Utilizar técnicas rápidas para la identificación de Candida albicans y
Candida dubliniensis.
� Utilizar otros métodos de identificación para especies de levaduras no
Candida albicans.
� Interpretar los resultados del laboratorio para los distintos materiales
clínicos y relacionarlos con las posibles causas predisponentes en una
ficha de anamnesis.
Materiales:
� Caja de trabajo
� Materiales clínicos; secreción vaginal, orina, escamas de piel o uñas,
hisopados de mucosa, hemocultivos.
� Extendidos de materiales clínicos teñidos con GN, MGG y ZN.
� Cultivos en Sabouraud glucosa de C albicans, C. dubliniensis, C
glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis.
� Cultivos en CHROMagar Candida de C albicans, C. krusei, C.
tropicalis.
� Kit de identificación API 20 C Aux e ID32.
� Placas de Petri con Agar Harina de Maíz (AHM).
� Tubos de hemólisis con 0,5 ml de suero.
� Microscopio-
� Placas de CHROMagar Candida
10
Actividades:
� Análisis micológico de materiales clínicos y realización de las pruebas
bioquímicas para la identificación de las levaduras aisladas.
� Observar y describir los extendidos de materiales profundos teñidos con
GN, MGG y ZN.
� Observar y describir la macromorfología de las colonias de Candida.
Efectuar un preparado directo de estas colonias con Líquido de montar y
Gueguén. Describir la micromorfología.
� Observar los diferentes colores de las colonias de Candida en medio
CHROMagar Candida.
� Sembrar las diferentes especies de Candida en suero. Incubar
durante 2 hs 30 ' a 37 °C y observar la formación de tubos
germinativos,
� Observar y describir la micromorfología de las colonias de Candida
en AHM.
� Leer los resultados obtenidos para una levadura incógnita en un blister de
ID 32 C. Realizar la identificación de las levaduras utilizando el soporte
informático correspondiente.
� Observar los cultivos correspondientes a diferentes materiales clínicos con
desarrollo de colonias de levaduras e interpretar los resultados.
� En una ficha de anamnesis, señalar las posibles causas predisponentes,
los materiales a extraer y qué resultados se esperan obtener en caso de
una Candidiasis.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
11
TRABAJO PRÁCTICO N° 6
TEMA: TRICHOSPORONOSIS - GEOTRICOSIS
Objetivos:
� Conocer la macro y micromorfología de Trichosporon sp. y Geotrichum
sp. agentes productores de Trichosporinosis y Geotricosis.
� Reconocer la micromorfología de Trichosporon sp., Geotrichum sp. por
observación del desarrollo en agar harina de maíz, preparados directos
de las colonias y cultivos de adhesión.
Materiales:
� Caja de trabajo
� Cultivos en Sabouraud glucosa de Trichosporon sp. y Geotrichum sp.
� Placas de Petri con Agar Harina de Maíz (AHM) sembrado con
Trichosporon sp y Geotrichum sp.
� Cultivos en CHROMagar Trichosporon sp. y Geotrichum sp.
Actividades:
� Observar y describir la macromorfología de las colonias de
Trichosporon sp. y Geotrichum sp.
� Observar y describir la micromorfología de Trichosporon sp. y
Geotrichum sp. en AHM.
� Observar los diferentes colores de las colonias en medio CHROmagar
Candida.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
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TRABAJO PRÁCTICO N° 7
TEMA: CRIPTOCOCOSIS
Objetivos:
� Reconocer en examen microscópico directo de LCR, con tinta china y
Gueguén, la forma parasitaria del agente etiológico de la Criptococosis.
� Conocer y describir la macro y micromorfología de Cryptococcus
neoformans en medio Sabouraud glucosa.
� Conocer y describir la micromorfología de Cryptococcus neoformans en
medio agar chocolate y AHM.
� Desarrollar habilidad para identificar en forma presuntiva y definitiva las
levaduras de este género.
Materiales:
� Caja de trabajo
� Materiales clínicos: LCR.
� Cultivos en Sabouraud glucosa de Cryptococcus neoformans.
� Placas de Petri con Agar Harina de Maíz (AHM) sembrado con
Cryptococcus neoformans.
� Placas de Petri con Agar chocolate sembrado con Cryptococcus
neoformans.
� Placas con Agar Semilla de girasol
Actividades:
� Realizar exámenes directos con tinta china y Gueguén de LCR.
� Observar y describir la macromorfología de las colonias de Cryptococcus
neoformans.
� Observar y describir la micromorfología de Cryptococcus neoformans en
Sabouraud, agar chocolate y AHM.
� Realizar pruebas bioquímicas mínimas para identificación presuntiva
� Prueba de ureasa
� Siembra en medio semilla de girasol
� Siembra en medio CGB, (diferencial de C neoformans y C gatti)
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
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Técnicas: Pruebas bioquímicas necesarias para la identificación del género
Cryptococcus
� Siembra de levaduras en el medio diferencial Agar semillas de girasol.
La técnica se basa en la detección de la actividad de la enzima fenoloxidasa
presente en estas levaduras, dando un compuesto de color marrón.
� Determinación de la producción de ureasa en medio de Christensen (medio
empleado en pruebas bioquímicas bacteriológicas). Incubar por 4 días a 28º C
� Prueba rápida para la detección de actividad ureasa en levaduras.
Reactivos:
Solución A: (guardar en frasco color caramelo) REACTIVO 1 WIENER
Fenol 50g
Nitropursiato de sodio 0.25 gr
Agua destilada csp 1000ml
Solución B: (no usar luego de 3 meses) REACTIVO 2 WIENER
NaOH 25gr
Hipoclorito de Na 80g/00 26.5 ml
Agua destilada csp 1000ml
Solución de urea 0.6 g% en agua destilada (preparar en el momento)
Técnica:
Se parte de un cultivo de 24-48 hs, en Sb-G.
1. Suspender colonia en 0.5 ml de solución de urea 0.6%,
2. Incubar 10’ a 37ºC
3. Agregar 0.5 ml Rvo A REACTIVO 1 WIENER
4. Agregar 0.5 ml Rvo B REACTIVO 2 WIENER
5. Incubar 5’
6. Usar controles positivo C neoformans, negativo C albicans
Interpretación de los resultados:
POSITIVO: Azul intenso
NEGATIVO. Celeste o verde pálido
14
� Prueba para diferenciar C neoformans de C gatti
Medio canavanina-glicina-azul de bromotimol (medio CGB)
El evaluar la capacidad de asimilar la L-canavanina y la glicina, nos permite realizar
la determinación de la variedad del Cryptococcus en estudio. Datos todos estos,
importantes en lo referente, al estudio epidemiológico de la criptococosis
Reactivos:
Solución A: glicina 10 g;
fosfato de potasio monobásico KH2PO4 1 g;
sulfato de magnesio MgSO4 1 g;
tiamina-HCl 1 mg;
sulfato de L-canavanina 30 mg;
agua destilada 100 ml;
pH 5,6.
Se esteriliza por filtración (0,45 m).
Solución B:
azul de bromotimol 0,4%;
agua destilada 100 ml.
Para 100 ml del medio:
• solución B 2 ml; agua destilada 88 ml; agar 2 g;
• solución A 10 ml.
Se mezcla la solución B con el agua destilada y el agar. Se esteriliza en autoclave y,
al entibiar, se agrega la solución A. Se distribuye a razón de 4 ml por tubo, dejando
solidificar con taco y bisel.
A partir de un cultivo de 48 horas de crecimiento a 35°C en medio de SbGl, se
procedió a realizar la siembra en la superficie del bisel. Se dejaron a temperatura
ambiente y se observaron diariamente hasta un máximo de 5 días.
Interpretación de los resultados:
• Color amarillo o amarillo-verdoso = C. neoformans;
• Color azul de cobalto = C. gattii.
15
TRABAJO PRÁCTICO N° 8:
TEMA: NEUMOCISTOSIS
Objetivos:
� Realizar una observación / mostración de coloraciones de materiales
respiratorios, (BAL, esputo), provenientes de pacientes con esta micosis, para
adquirir conocimiento sobre las formas parasitarias de la misma.
Materiales:
� Extendidos de materiales profundos teñidos con Azul de toluidina.
� Microscopios.
Actividades;
� Observación microscópica con aumento 100 x
Técnica: Búsqueda de Pneumocystis en Materiales Biológicos
Técnica de Tinción Azul de Toluidina
Preparación de reactivos
� Reactivo de Sulfatación
• Acido Acético Glacial 45 ml
• Acido Sulfúrico 15 ml
� Reactivo Azul de Toluidina
• Azul de Toluidina 0.16 gr.
• Agua Destilada 60 ml
• Acido Clorhídrico 2 ml
� Alcohol Etílico Absoluto 140 ml
Preparación de la muestra a procesar:
� Lavado broncoalveolar: centrifugar a 2.500 rpm 5 min. Y realizar con el
sedimento al menos tres frotis
� Esputo ó secreción bronquial: Agregar perlas de vidrio y dos o tres gotas de
hidróxido de sodio al 10 %. Realizar al menos 6 frotis.
16
Técnica de coloración
1. Reactivo de Sulfatación 10 minutos
2. Agua corriente bajo la canilla (lado opuesto al preparado) 1 minuto
3. Reactivo azul de toluidina 5 minutos o 10 minutos o mas según la antigüedad del
reactivo
4. Alcohol etílico al 95 % 10 segundos
5. Alcohol etílico puro 10 segundos
6. Alcohol etílico puro 10 segundos
7. Xilol (no es indispensable) 10 segundos
17
TRABAJO PRÁCTICO N° 9
TEMA: SENSIBILIDAD A ANTIFÚNGICOS
Objetivos:
� Conocer las distintas metodologías utilizadas para la determinación de
sensibilidad antifúngica para hongos filamentosos y levaduriformes.
� Utilizar le método de Difusión en Disco para la determinación de actividad
antifúngica de levaduras del género Candida.
� Interpretar los resultados de las distintas metodologías y evaluar su
importancia en el tratamiento del paciente.
Materiales:
� Caja de trabajo.
� Microscopio.
� Cultivos de cepas de Candida
� Placas de Petri con Agar Muëller Hinton modificado.
� Discos conteniendo Anfifúngicos comerciales
� Escala de Mac Farland
Actividades:
� Aplicar la técnica de Difusión en Disco para levaduras del género Candida.
� Interpretar los resultados obtenidos de determinaciones realizadas por el
método de Difusión en Disco, de Microdilución en Caldo y E-test.
� Evaluar ventajas y desventajas de las distintas metodologías.
Problemas
Problema 1
Se determinó la sensibilidad antifúngica, por el método de difusión en agar, de
dos cepas de Candida causantes de Candidiasis orofaríngea aisladas de pacientes
HIV positivo.
a) Se determinaron los diámetros de los halos de inhibición para los distintos
microorganismos frente a los antifúngicos estudiados. Complete el cuadro con la
interpretación de esos hallazgos.
18
Anfotericina Fluconazol Itraconazol
Halo Interpret. Halo Interpret. Halo Interpret.
Cepa 1 22 mm 20 mm 18 mm
Cepa 2 20 mm 10 mm 8 mm
Cepa 3 24 mm 12 mm 17 mm
C. parapsilosis ATCC 22019 22 mm 22 mm 20 mm
C. krusei ATCC 6258 20 mm 20 mm
b) ¿De acuerdo a los resultados obtenidos con las cepas control de calidad, puede
afirmar que el método fue realizado de forma correcta?
c) ¿Qué puede concluir sobre la susceptibilidad antifúngica de las cepas aisladas?
d) En pacientes infectados con HIV la infección oral causada por C. albicans es un
cuadro recidivante que suele precisar tratamientos con azoles de larga duración
o de numerosos ciclos para conseguir su remisión. El crecimiento de la
población con SIDA multitratada con azoles ha dado lugar a un aumento notable
de las descripciones de casos de candidosis oral o esofágica que no responden
al tratamiento con fluconazol. ¿Qué importancia tiene la determinación de
susceptibilidad antifúngica en estos casos?
Problema 2
Se determinó la susceptibilidad antifúngica de dos cepas de C. albicans provenientes
de flujo vaginal a través del método de microdilución en caldo.
El diseño de las microplacas se encuentra debajo.
- Filas A y B: C. albicans. Cepa 1
- Filas C y D: C. albicans. Cepa 2
- Filas E y F: C. parapsilosis ATCC 22019
- Filas G y H: C. krusei ATCC 6258
a) ¿Cuáles fueron las CIMs para las distintas cepas estudiadas frente a Fluconazol
e Itraconazol?
b) De acuerdo a los resultados obtenidos con las cepas control de calidad, puede
afirmar que el método fue realizado de forma correcta?
c) ¿Qué puede concluir sobre la susceptibilidad antifúngica de las cepas aisladas?
19
Fluconazol Itraconazol
Fluconazol Itraconazol
CIM Interpretación CIM Interpretación
Cepa 1 16 0,125
Cepa 2 1 0,06
Candida parapsilosis ATCC 22019 1 0,25
Candida krusei ATCC 6258 32 1
d) Algunos autores consideran que se está produciendo un cambio en los agentes
etiológicos de Candidiasis vaginales siendo cada vez es más frecuente la
implicación de especies menos sensibles a los azoles o que desarrollan
fácilmente resistencia. Se piensa que puede existir una relación entre
resistencia secundaria a los azoles en las cepas de C. albicans procedentes de
mujeres inmunocompetentes, tratadas con fluconazol y la recidivas de las
vaginitis fúngicas. ¿Qué importancia tiene la determinación de la susceptibilidad
antifúngica en estos casos? ¿A qué puede atribuir los resultados obtenidos para
la cepa 2? ¿Qué antifúngico utilizaría en cada caso?
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03
Control de crecimiento Control de esterilidad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12
Control de crecimiento Control de esterilidad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12
Control de crecimiento Control de esterilidad
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TRABAJO PRÁCTICO N° 10
TEMA: HISTOPLASMOSIS
Objetivos:
� Reconocer la macro y micromorfología de Histoplasma capsulatum.
� Reconocer la forma parasitaria de Histoplasma capsulatum.
Materiales:
� Colonias de Histoplasma capsulatum en Sabouraud-glucosa cultivadas a
28°C.
� Colonias de Histoplasma capsulatum en Sabouraud-glucosa cultivadas a
37°C.
� Preparados directos de las colonias del hongo a 28° y 37°C.
� Coloraciones con la técnica de Giemsa y May Grunwald Giemsa de
materiales obtenidos de pacientes.
� Caja de trabajo
� Microscopio
Actividades
� Observar y describir la forma parasitaria a partir de materiales clínicos.
� Observar y describir la macromorfología de este hongo a 28° y 37°C.
� Observar y describir la micromorfología en los preparados directos de las
colonias a 28° y 37°C.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
21
TRABAJO PRÁCTICO N° 11
TEMA: INMUNODIAGNOSTICO
Objetivos:
� Conocer los métodos de preparación de los antígenos usados en reacciones
serológicas para el estudio de las micosis
� Aprender a realizar la técnica de inmunodifusión de Outcherlony
� Conocer la técnica inmunológica de aglutinación de partículas de látex para el
diagnóstico de Criptococosis
� Interpretar los resultados obtenidos en el estudio del estado inmunológico de
pacientes afectados con las micosis sistémicas.
Materiales:
� Portaobjetos con capa delgada de agar precipitinas. Tubos con agar
precipitinas
� Antígenos y antisueros fúngicos. Sueros de pacientes.
� Plantilla y sacabocado, Agua destilada, cajas de Petri.
� Caja de trabajo.
� Kit comercial de aglutinación de partículas de látex para diagnóstico de
Criptococosis
Actividades
� Armado de los portaobjetos con la placa delgada de agar precipitinas.
� Preparación de agar precipitinas y realizar con la plantilla las perforaciones
correspondientes.
� Observar e interpretar resultados de reacciones inmunológicas practicadas
según técnica de Inmunodifusión de Outcherlony.
� Conocer y desarrollar técnicas auxiliares de diagnóstico: “producción de
exoantígenos.
Técnica: INMUNODIFUSION DE OUTCHERLONY
Preparación de los portaobjetos:
Se diluye 1 ml de agar para inmunodifusión en 7 ml de agua destilada y se coloca en
baño de agua a 70 ºC; se cubre los portaobjetos perfectamente limpios y
22
desengrasados con alcohol; con una película de esta preparación, se desparrama
con el dedo para que quede rugoso y se deja secar en la estufa de 37 ºC hasta que
se forme una capa seca y opaca. Luego se agregan entre 2.5 y 2.8 ml de agar para
inmunodifusión sin diluir por portaobjetos. Una vez solidificados se los colocan en
cámara húmeda y se conservan en heladera hasta el momento de su uso. Pueden
guardarse hasta una semana en estas condiciones.
Realización de la prueba:
Con un sacabocados de 4 mm, se cortan el agar de acuerdo con un esquema de 6
hoyos periféricos y uno central. Previo El cortador se usa en posición vertical.
Los cilindros de agar se retiran con aguja o espátula. En el orificio central se coloca
el antígeno correspondiente y en los periféricos los sueros problema y un suero
control positivo. Todas las cavidades se llenan hasta el borde
La incubación se hace a temperatura ambiente durante 72 horas, pero es
conveniente observar diariamente la reacción.
Finalizada la incubación, los portaobjetos se cubren con una solución de citrato de
sodio pH 8.2 durante 2 horas con el objeto de hacer desaparecer los halos formados
por los sueros que dificultan la observación de las bandas de precipitación y para
eliminar las bandas producidas por una proteína llamada sustancia C. Luego de ese
lapso se vuelca el tampón y se procede a ver la existencia de bandas de
precipitación que indican presencia de anticuerpos precipitantes en el suero
estudiado. Es necesario colocar una fuente de iluminación debajo de la placa para la
mejor visualización de los resultados. En casos de pruebas positivas se debe realizar
una titulación, efectuando diluciones seriadas al doble y repitiendo la prueba.
Siempre se debe realizar una coloración final, sobre todo en casos de pruebas
negativas (para confirmarlas), y en casos de titulaciones; se observa que bandas
muy débiles se observan luego de esta maniobra.
23
TRABAJO PRÁCTICO Nº 12
TEMA: PARACOCCIDIOIDOMICOSIS
Objetivos:
� Reconocer la macro y micromorfología de Paracoccidioides brasiliensis.
� Reconocer las formas parasitarias de Paracoccidioides brasiliensis.
Materiales:
� Caja de trabajo
� Microscopios
� Colonias de P. brasiliensis en Sabouraud glucosa cultivadas a 28°C y en
SABHI (Sabouraud glucosa: agar cerebro corazón) cultivadas a 37°C.
� Preparados directos de las colonias de P. brasiliensis a 28 y 37°C.
� Corte histológico teñido con Gomori-Groccott de testículo de cobayo infectado
con P. brasiliensis.
� Preparados de lesiones clínicas de pacientes teñidos con la técnica de May
Grunwald-Giemsa y Gomori-Groccott.
Actividades:
� Observar y describir la macromorfología de P. brasiliensis a 28 y 37°C.
� Observar y describir la micromorfología en los preparados directos de las
colonias correspondientes.
� Observar y describir las formas parasitarias de este hongo.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
.
24
TRABAJO PRÁCTICO N° 13
TEMA: COCCIDIOIDOMICOSIS
Objetivos:
� Reconocer la macro y micromorfología de colonias de Coccidioides sp. en
medio de Sabouraud-glucosa.
� Reconocer las formas parasitarias de Coccidioides sp.
Materiales:
� Colonias en Sabouraud-glucosa de Coccidioides sp.
� Cultivos de adhesión de Coccidioides sp.
� Preparados de esférulas de Coccidioides sp. en de cortes histológicos
realizados con material de testículo de cobayo con PAS, y de biopsia con
Giemsa.
� Preparados con KOH de Coccidioides sp. de biopsia
� Caja de trabajo
� Microscopio
Actividades
� Observar y describir la macromorfología del desarrollo de Coccidioides sp. En
Sabouraud-glucosa a 28°C.
� Observar y describir la micromorfología del desarrollo de Coccidioides sp. En
Sabouraud-glucosa a 28°C.
� Observar y describir las formas parasitarias de Coccidioides spp en cortes de
tejido en fresco y con coloraciones permanentes.
� En una ficha de anamnesis, señalar las posibles causas predisponentes, los
materiales a extraer y qué resultados se esperan obtener en caso de una
posible Coccidiodomicosis.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
25
TRABAJO PRÁCTICO N° 14
TEMA: ASPERGILOSIS
Objetivos:
� Reconocer la presencia de filamentos en materiales biológicos por exámenes
directos o coloración.
� Conocer la macro y micromorfología de los agentes productores de
Aspergilosis.
� Interpretar los resultados del laboratorio para los distintos materiales clínicos y
relacionarlos con las posibles causas predisponentes en una ficha de
anamnesis.
� Analizar la importancia de los estudios serológicos en pacientes
inmunocompetentes e inmunocomprometidos.
� Identificar taxonómicamente las especies frecuentemente involucradas en las
diferentes patologías en el hombre.
Materiales:
� Caja de trabajo.
� Extendidos de materiales profundos teñidos con GN, MGG y ZN.
� Cultivos en Czapek y APD de Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger y A.
terreus.
� Preparados de cultivos de adhesión de Asperillas fumigatus, A. flavus, A.
niger y A. terreus
� Microscopios.
Actividades;
� Observar y describir los extendidos de materiales profundos teñidos con GN,
MGG y ZN y Groccot.
� Observar y describir la macromorfología de las colonias de las especies de
Aspergillus.
� Observar y describir la micromorfología de las colonias de Aspergillus.
� Discutir resultados de pruebas micoserológicas.
� En una ficha de anamnesis, señalar las posibles causas predisponentes, los
materiales a extraer y qué resultados se esperan obtener en caso de una
posible Aspergillosís. Señalar la importancia del diagnóstico serológico.
26
� Identificar taxonómicamente una cepa del género Aspergillus aislada de
material clínico.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
27
TRABAJO PRÁCTICO N° 16
TEMA: HIALOHIFOMICOSIS
Objetivos:
� Reconocer la presencia de filamentos en materiales biológicos por exámenes
directos o coloración.
� Conocer la macro y micromorfología de los agentes productores de
Hialohifomicosis: Penicillium sp, Fusarium sp, Scopulariopsis sp. y
Acremonium sp.
� Interpretar el valor de los resultados del laboratorio en los distintos materiales
clínicos y relacionarlos con las posibles causas predisponentes en una ficha
de anamnesis.
� Identificar taxonómicamente las especies frecuentemente involucradas en las
diferentes patologías en el hombre.
Materiales:
� Caja de trabajo:
� Extendidos de materiales profundos teñidos con GN, MGG y ZN.
� Cultivos en Czapek, APD, MEA y SNA de Penicillium sp., Fusarium sp.,
� Scopulariopsis sp. y Acremonium sp.
� Preparados de cultivos de adhesión de Penicillium sp., Fusarium sp.,
Scopulariopsis sp. y Acremonium sp.
� Microscopios.
Actividades;
� Observar y describir los extendidos de materiales profundos.
� Observar y describir la macromorfologia de las colonias de las especies de
Penicillium sp., Fusarium sp., Scopulariopsis sp. y Acremonium sp.
� Observar y describir la micromorfología de las colonias de Penicillium sp.,
Fusarium sp. Scopulariopsis sp. y Acremonium sp.
� En una ficha de anamnesis, señalar las posibles causas predisponentes, los
materiales a extraer y qué resultados se esperan obtener en caso de una
posible Hialohifomicosis.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
28
TRABAJO PRÁCTICO N° 17
TEMA: MICETOMA.
Objetivos:
� Reconocer las formas parasitarias de actinomicetales y eumicetes
productores de micetomas.
� Aplicar los conocimientos de los pasos del análisis micológico a un examen
correcto de un presunto micetoma.
� Reconocer la macromorfología y micromorfología de Madurella mycetomatis,
M. grisea, Pseudoalescheria boydii (Scedosporium apiospermum)
� Usar e interpretar guías que permiten diferenciar a los agentes productores de
micetomas eumicóticos.
Materiales;
� Caja de trabajo.
� Microscopios.
� Colonias desarrolladas en Sabouraud glucosa, Agar harina de maíz y Agar
papa dextrosa de las cepas mencionadas.
� Preparados de cultivo de adhesión de M. mycetomatis, M. grisea y
Pseudoalescheria boydii (Scedosporium apiospermum).
� Frotis y cortes histológicos con elementos parasitarios actinomicetales y
eumicetes productores de micetomas.
� Gránulos de muestras de micetomas.
Actividades;
� Observar y describir macroscópicamente las colonias de las cepas
mencionadas.
� Diferenciar las formas parasitarias de actinomicetales y eumicetes
productores de micetomas.
� Observar microscópicamente los preparados provenientes de cultivos de
adhesión de M. mycetomatis, M. grisea y Pseudoalescheria boydii (S.
apiospermum).
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
29
TRABAJO PRÁCTICO N° 18
TEMA: CROMOBLASTOMICOSIS
Objetivos:
� Reconocer en cortes histológicos de materiales clínicos la forma parasitaria de
los agentes de Cromoblastomicosis.
� Reconocer la macromorfología de estos hongos dematiáceos.
� Reconocer microscópicamente los distintos tipos de reproducción de estos
hongos: Cladosporium, Phialophora y Rhinocladiella.
Materiales:
� Caja de trabajo.
� Microscopio.
� Cultivos de cepas de Phialophora verrucosa, Fonsecaea pedrosoi, Rhinocladiella
aquaspersa, Cladophialophora carionii.
� Cortes histológicos de pata de ratón inoculado, teñidos por las técnicas de
Groccott.
� Preparados obtenidos por la técnica de cultivo de adhesión de Phialophora
verrucosa, Fonsecaea pedrosoi, Rhinocladiella aquaspersa, Cladophialophora
carionii.
Actividades;
� Observar la forma parasitaria de los agentes de Cromoblastomicosis.
� Observar y describir la macromorfología y la micromorfología de estas
especies.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
30
TRABAJO PRÁCTICO N° 19
TEMA: FEOHIFOMICOSIS
Objetivos:
� Reconocer en cortes histológicos de materiales clínicos la forma parasitaria
de los agentes de Feohifomicosis.
� Reconocer la macromorfología de estos hongos dematiáceos.
� Reconocer microscópicamente los distintos tipos de reproducción de estos
hongos: anelides, fíalides, etc.
Materiales:
� Caja de trabajo.
� Microscopios.
� Cultivos de cepas de Curvularia Iunata, Alternaría sp., Wangiella dermatitidis.
� Cortes histológicos de pata de ratón, teñidos por las técnicas de Gomori-
Groccott.
� Preparados obtenidos por la técnica de cultivo de adhesión de Curvularia
Iunata, Alternaría sp., Wangiella dermatitidis.
Actividades:
� Observar la forma parasitaria de los agentes de Feohifomicosis.
� Observar y describir la macromorfología de estas especies.
� Observar y describir la micromorfología de estas especies obtenidas por cultivo
de adhesión.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
31
TRABAJO PRÁCTICO N° 20
TEMA: ESPOROTRICOSIS
� Objetivos:
�
� Reconocer microscópicamente las formas parasitarias de Sporothrix schenkii.
� Reconocer macro y micromorfológicamente las colonias de Sporothrix
schenkii.
� Relacionar las características morfológicas observadas con el dimorfismo de
Sporothrix schenkii
� Relacionar el cuadro clínico de la enfermedad con los factores predisponentes
y vías de infección del hongo.
Materiales:
� Caja de trabajo.
� Microscopio.
� Cortes histológicos de cola y pata de rata teñidos por las técnicas de PAS y
Groccott.
� Cultivos de Sporothrix schenkii en Sabouraud-glucosa a 28 °C.
� Preparados obtenidos por la técnica de cultivo de adhesión a 28 °C en
Sabouraud-glucosa y Agar-harina de maíz.
Actividades:
� Observar la forma parasitaria de Sporothrix schenkii en cortes histológicos y
coloraciones.
� Observar y describir macro y micromorfológicamente las colonias de
Sporothrix schenkii.
� Observar cola de rata inoculados en forma experimental.
� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas
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