I9. Citometría de fllujomedpuj2012.wikispaces.com/file/view/I9.+Citometría+de+fllujo.pdf ·...

Múltiples características físicas de cada sola célula en forma simultanea.

Estas características de las células son evaluadas debido a que las células pasan de forma individual por un sistema de fluido que permite un flujo de 500 a 4,000 células por segundo.

Citometría de flujo

Muestra

Fluido

Cámara defluido

LentesRayo deLuz

QUE NOS PUEDE DECIR LA CITOMETRIA DE FLUJO DE CADA CELULA?

� Su tamaño relativo. (Forward scatter-FSC)

� Su granularidad o su complejidad citoplasmática. (Side scatter-SSC)

� Su intensidad de fluorescencia relativa. (FL1, FL2, FL3 o FL4)

COMO DETECTA EL CITOMETRO ESTAS CARACTERISTICAS SOBRE LA CELULA?

El citómetro de flujo detecta la interacción entre una célula y un rayo láser. La forma que la célula:

� Desvía la luz incidente.

� Emite fluorescencia.

El como la célula desvía los rayo de luz nos da información acerca del tamaño y la granularidad de cada célula.

Dispersión lateral (SSC)

Dispersión frontal(FSC)LASER

Laser

Amplificador Lentes

Muestra

PRINCIPIOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Flu

jo

Dispersion

Lateral

Frontal

¿Qué es un fluorocromo?

• El fluorocromo absorbe la luz del láser

• El fluorocromo emite un rayo luminoso de diferente longitud de onda

488 nm

Luz Luz Fluorescente Fluorescente

EmitidaEmitida

Luz Luz IncidenteIncidente

Molécula de

Fluoresceína

530 nmHO

CO2H

O

Fluorescencia

Intensidad de Fluorescencia Emitida = Sitios de Unión

FITCFITC FITCFITC

FITC

FITCFITC

FITCFITC

FITCFITC

FITCFITC

FITCFITC

FITCFITC

FITCFITC

Intensidad Fluorescente

Número de Eventos

TABLA DE PRINCIPALES FLUOROCROMOS UTILIZADOS EN CIT OMETRÍA DE FLUJO

Fluorocromos Aplicación Excitación (nm)

Emisión (nm)

7-amino Actinomycin D 7-AAD ADN, viabilidad 546 647 Aloficocianina APC IF proteínas 650 660 DAPI ADN 345 455 Fluoresceína FITC IF proteínas 495 519 Ficoeritrina PE IF proteínas 480 ; 565 578 Hidroxicumarina IF proteínas 325 386 Hoechst 33342 ADN 343 483 Mitramicina ADN 445 575 Naranja de Acridina AND/ARN 503 530/640 Peridinina Clorofila PerCP IF proteínas 490 675 Rojo Texas IF proteínas 589 615 Yoduro de Propidio PI ADN, viabilidad 536 617 X-Rodamina XRITC Mitocondría 495 519

FL1FL1

SSCSSC

FL3FL3

670LP

585/42

488/10

488/10

.488 nmLaser azul

FL2FL2

530/30

CCáámaramaraDe flujoDe flujo

FSCFSC

Optica – Fluorescencia

Finalmente la señal análoga de voltaje es pasada a una señal digital numérica que se expresa

en “Canales”

Event 1

Event 2

Event 3

FSC SSC FL1 FL2

30 60 638 840

100 160 245 85

300 650 160 720

List-Mode

Señal digital Resolución0 – 256 0 –1024

Fotones

PRESENTACION DE LOS DATOS

• Gráficas: Histograma y de distribuciónen dos dimensiones.

• Tablas de números

• Valores relativos y absolutos (perlas)

HistogramaHistograma

10005000

Nú

mer

o d

e C

élu

las

510500490

Incremento en intensidad

Voltios transformados a “Canales de intensidad”

IgM (-) IgM (+)

M1M2

Negativas Low Intemediate High

M1

FL-4

FSC

FL-3

FL-2

FL-1

SSC

eje xE

je y

Tamaño relativoFSC

Com

plej

idad

inte

rna

SS

C

Gráfica de puntos

L

G

M

L G M

GG

MM

LL

Como se ubicanespacialmentelas poblacionesde leucocitos

de sangre periférica?

LinfocitosLinfocitos

MonocitosMonocitos

GranulocitosGranulocitos

DetritosDetritos

R1

R1 30%

MARCAJE CON 1 SOLO FLUOROCROMOFLUOROCROMO

Se quiere saber cuantas células CD3+ hay en sangre periférica.

Anticuerpo anti-CD3 marcado con fluorescefluoresce íína FITCna FITC

1. Muestra de sangre periférica.2. Mezcla de la muestra con el antianti --CD3 FITCCD3 FITC.3. Incubar en oscuridad.4. Lisar los glóbulos rojos.5. Lavar con solución tampón.6. Fijar con paraformaldehido.7. Leer en el citómetro de flujo.

Anti-CD3 FITCControl de isotipo

Com

plej

idad

inte

rna

SS

C

Tamaño relativoFSC

Región 1

Control de isotipo

Fluorescencia verde (FL1)Anti-CD3 FITC

Flu

ores

cenc

ia n

aran

ja (

FL2

) Gráfica de puntos

Anti-CD3 FITC

Células marcadas

Fluorescencia verde (FL1)Anti-CD3 FITC

Flu

ores

cenc

ia n

aran

ja (

FL2

)

Gráfica de puntos

UL UR

LL LR

UL 0%UR 0%LL 10% CD3-LR 90% CD3+

Gate: G1

Quad Events % Gated % TotalUL 0 0.00 0.00

UR 0 0.00 0.00LL 931 20.03 3.54LR 3716 79.97 14.14

UL UR

LL LR

CD3+79.97% de R1

CD3+14.14% Población

celular total

MARCAJE CON 2 FLUOROFLUOROCROMOSCROMOS

Se quiere saber cuantas células CD3+ y CD19+ hay hay en sangre de un individuo.

Anticuerpo anti-CD3 marcado con fluorescefluoresce íína FITCna FITCAnticuerpo anti-CD19 marcado con ficoeritrinaficoeritrina PEPE

Tamaño relativoFSC

Com

plej

idad

inte

rna

SS

C

Gráfica de puntos

Región 1

Anti-CD3 FITC

Células marcadas

Anti-CD19 PE

Anti-CD3 FITC

Células marcadas Fluorescencia verde (FL1)Anti-CD3 FITC

Flu

ores

cenc

ia n

aran

ja (

FL2

)A

nti-C

D19

PE

Gráfica de puntos

Anti-CD19 PEUL UR

LL LR

UL 14% CD3- CD19+UR 0% CD3+ CD19+LL 10% CD3- CD19-LR 76% CD3+ CD19-

Gate: G1

Quad Events % Gated % TotalUL 696 16.30 2.71UR 7 0.16 0.03LL 461 10.79 1.80LR 3107 72.75 12.10

CD3+72.75% R1

12.10% Total

CD19+16.30% R12.71% Total

MARCAJE CON 3 FLUOFLUOROCRROCROMOSOMOS

Se quiere saber cuantas células T CD3+/CD4+/CD8+ hay hay en sangre de un individuo.

Anticuerpo anti-CD3 marcado con fluorescefluoresce íína FITCna FITCAnticuerpo anti-CD4 marcado con ficoeritrinaficoeritrina PEPEAnticuerpo anti-CD8 marcado con PeridininaPeridinina clorofila clorofila PerCPPerCP

Anti-CD3 FITCAnti-CD4 PE

Anti-CD8 PrCP

CD3+

CD3+ CD8+

CD3+ CD4+

CD3- CD4- CD8-

Gráfica de puntos

Tamaño relativoFSC

Com

plej

idad

inte

rna

SS

C

Región 1

Fluorescencia verde (FL1)Anti-CD3 FITC

Flu

ores

cenc

ia n

aran

ja (

FL2

)A

nti-C

D4

PE

Gráfica de puntos

UL UR

LL LR

UL 5% CD3- CD4+UR 60% CD3+ CD4+LL 10% CD3- CD4-LR 25% CD3+ CD4-

Anti-CD3 FITCAnti-CD4 PE

Anti-CD8 PrCP

Fluorescencia verde (FL1)Anti-CD3 FITC

Flu

ores

cenc

ia n

aran

ja (

FL3

)A

nti-C

D8

Per

CP

Gráfica de puntos

UL UR

LL LR

UL 5% CD3- CD8+UR 25% CD3+ CD8+LL 10% CD3- CD8-LR 60% CD3+ CD8-

Anti-CD3 FITCAnti-CD4 PE

Anti-CD8 PrCP

Anti-CD3 FITC

Fluorescencia verde (FL3)Anti-CD8 PrCP

Flu

ores

cenc

ia n

aran

ja (

FL3

)A

nti-C

D4

PE

Gráfica de puntos

Anti-CD4 PE

Anti-CD8 PrCP

UL UR

LL LR

UL 65% CD4+ CD8-UR 0% CD4+ CD8+LL 10% CD4- CD8-LR 25% CD4- CD8+

R1

PrC

P

Fluorescencia verde (FL3)Anti-CD3 FITC

Com

plej

idad

inte

rna

SS

C

Región 2

UL UR

LL LR

UL 0% UR 0% LL 25% CD3-LR 75% CD3+

Com

plej

idad

inte

rna

SS

C

Tamaño relativoFSC

Región 1

R1

File: Leydi Vasquez.001 Gate: G1

Quad Events % Gated % TotalUL 0 0.00 0.00UR 0 0.00 0.00LL 592 25.25 9.05LR 1753 74.75 26.79

R2

GRAFICAS

Determinar la proporción relativa de una característica para una población celular, con respecto a la población total.

Ubicación en la gráfica

CD10CD34

CD8

HLA-DR

NK MADUROCD2CD8+/-CD16CD56CD57

TIMOCITO CD1 CD8CD2 CD71CD3 CD38CD4 TCR

LINFOCITO T COOPERADOR

CD4 CD3CD28 TCR

CD5

LINFOCITO T CITOTOXICO

CD8CD3

CD28

CD5

LINFOCITO PRE BCD10CD19CD34CD38

LINFOCITO BCD19CD20CD22IgM

Leucocitos 5800/µlLinfocitos 30%Células CD3+ 70% de los linfocitosCélulas CD4+ 30%Células CD8+ 65%

Cual es el valor absoluto de cada subpoblación en los linfocitos y cual es el significado clínico delresultado.

Aplicaciones de la Citometría de

Flujo en investigación

Monocitos DC inmadura DC madura

Estímulo de maduracióny/o antígeno de pulga

IL-4

GM-CSF

Células dendríticas derivadas de monocitos

CBACD14CD86

HLA-DRCD83

CD14+ CD14- CD14-CD83- CD83- CD83+

0.5%

99.5%

0.5%

99.5%

R1

96.5%

R1

96.5%

R1

96.5%

A

B

A.

B.

A.

B.

HLA-DR

CD

86

CD83

CD

14

CD derivadas de monocitos

CDm Lin- HLA-DRalto CD11c+ CD123int

CDp Lin- HLA-DRalto CD11c- CD123alto

Subpoblaciones de CD

R3

R4 R5

R2

R1

CMSP

NE SEB P

αCD28/αCD49d

12 hBFA x 9 h

Marcaje Citometría

Detección intracelular de citocinas

Selección de la población de LT CD4+

No estimulado SEB Pulga 20 µg/ml

Células T efectoras secretoras de IL17

0.017 0.096 0.064

0.5850.2110.000

No estimulado SEB Pulga 20 µg/ml

Células T reguladoras secretoras de IL-10

0.020 0.492 0.212

0.000 1.178 0.613

IL-10

IL-1

3

IL-2

IL-10

Evaluación de células T multifuncionales

Seder RA. Nat Rev Immunol 2008

LT CD4+

Análisis: Esquema de jerarquías

Betts MR. Blood 2006

Perfil de LT multifuncionales en pacientes con diferentes

estadíos de enfermedad. Ej HIV

El perfil multifuncional de los LT varía de acuerdo con el estadio de la enfermedad

La multifuncionalidad se asocia con menor carga viral

Seder RA. NRI 2008

Virus

VacciniaCMV HIV-2 HIV-1

(LTNP)

HIV-1

Progresores

Carga antigénica y duración

Replicación viral Número de

funciones

Células T reguladoras naturales

IL-12TNFαIL-10IL-6IL-1βIL-8

MIF

per

las

en F

L3 6 perlas con diferente MIFen FL3

Cada perla con acp de capturapara una citocina diferente.

Adición de la muestraO el standard (citocina)

Revela la reacción con unconjugado anti citocina

MIF en FL2

Cuantificación de citocinas en fluidos