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IDENTIFICACIÓN DE LAS PRINCIPALES ENFERMEDADES BACTERIANAS Y FUNGOSAS QUE AFECTAN AL TUBÉRCULO SEMILLA DE PAPA VARIEDAD
DIACOL CAPIRO EN COLOMBIA
SANDRA CATALINA SALGADO HERNÁNDEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar el título de
MICROBIÓLOGA AGRÍCOLA Y VETERINARIA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA Santafé de Bogotá, D.C. Noviembre 2000
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IDENTIFICACIÓN DE LAS PRINCIPALES ENFERMEDADES BACTERIANAS Y FUNGOSAS QUE AFECTAN AL TUBÉRCULO SEMILLA DE PAPA VARIEDAD
DIACOL CAPIRO EN COLOMBIA
SANDRA CATALINA SALGADO HERNÁNDEZ
______________________ ________________________ Director Trabajo de Grado Codirector Trabajo de Grado Dr. Luis Lago Castro Dra. Sandra Molina Doctorado en Ciencias Ingeniera Agrónoma Biológicas y Agrícolas PhD.
__________________ Asesora Dra. Marcela Franco Microbióloga
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA Santafé de Bogotá, D.C. Noviembre 2000
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IDENTIFICACIÓN DE LAS PRINCIPALES ENFERMEDADES BACTERIANAS Y FUNGOSAS QUE AFECTAN AL TUBÉRCULO SEMILLA DE PAPA VARIEDAD
DIACOL CAPIRO EN COLOMBIA
SANDRA CATALINA SALGADO HERNÁNDEZ
______________________ ________________________ JURADO 1 JURADO 2 Dra. Clemencia de la Rotta Dra. Jimena Sánchez
Ingeniera Agrónoma Bacterióloga, M.Sc. Microbiología- M.Sc. Fitopatología Fitopatología
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA Santafé de Bogotá, D.C. Noviembre 2000
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IDENTIFICACIÓN DE LAS PRINCIPALES ENFERMEDADES BACTERIANAS Y FUNGOSAS QUE AFECTAN AL TUBÉRCULO SEMILLA DE PAPA VARIEDAD
DIACOL CAPIRO EN COLOMBIA
SANDRA CATALINA SALGADO HERNÁNDEZ
______________________ ______________________ Dr. Carlos Corredor, PhD Dra. Aura Rosa Manascero
Decano Académico Directora Carrera Facultad Ciencias PUJ Facultad Ciencias PUJ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA Santafé de Bogotá, D.C. Noviembre 2000
5
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de julio de 1946:
¨La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus tesis de grado ̈
6
A Dios por ser mi guía.
A mis padres por permitirme la
oportunidad de realizar este sueño y
por su apoyo constante.
A mis amigos Lina y Cesar por su gran
amistad y ayuda incondicional.
A Mario por el esfuerzo y colaboración que
me proporcionó para culminar este trabajo.
7
RESUMEN
El presente estudio se realizó con la empresa Mc Cain Andina S.A. con el objetivo
de identificar y reportar las principales enfermedades causadas por bacterias y
hongos, que afectan al tubérculo semilla de papa Solanum tuberosum spp.
andigena variedad Diacol Capiro, categorías Básica, Registrada, Mejorada y
Certificada en los departamentos de Cundinamarca, Boyacá, Antioquia y Nariño.
Los tubérculos semilla se evaluaron por medio de la observación directa de los
signos y los síntomas. El método aplicado para tal fin se realizó por medio de la
implementación de escalas visuales de evaluación, que permitieron reportar el
grado de severidad de las enfermedades presentes, al igual que la incidencia de
cada enfermedad en la población observada, teniendo en cuenta las variables:
Zona geográfica de procedencia y Categoría de la semilla.
Para el diagnóstico de laboratorio de las diferentes patologías se llevaron a cabo
métodos de reconocimiento y muestreo haciendo una correlación de los síntomas
expresados tanto en condiciones de campo como en almacenamiento, junto con
8
técnicas de aislamiento y cultivo para microorganismos patógenos; estos se
aislaron, sembraron y multiplicaron para la posterior observación al microscopio.
Se practicaron pruebas de patogenicidad para la identificación de Erwinia y
pruebas bioquímicas para identificación de bacterias. Como resultado se obtuvo el
aislamiento de las bacterias: Erwinia carotovora var. carotovora, E. carotovora var.
atroseptica y E. chrysantemi, y de los hongos Rhizoctonia solani, Fusarium spp.,
F. oxysporum, F. avenaceum, Geotrichum spp., Spongospora subterranea fue
identificada a partir de agallas de raíces.
Para la bacteria Ralstonia solanacearum se aplicaron dos métodos de evaluación:
Primero, el Hot Box (caja caliente) a 30°C, metodología que se logró aplicar
gracias a la realización de este trabajo; empleada para minitubérculos semilla
Super Élite, como una herramienta que permite evidenciar la expresión de
síntomas causados por esta bacteria. Segundo, la Prueba Inmunoenzimática
(ELISA-NCM) aplicado en muestras procedentes de Antioquia y Cundinamarca,
con el fin de utilizarse como prueba de diagnóstico para detectar la presencia de la
bacteria.
9
AGRADECIMIENTOS
Expreso mis agradecimientos a:
Dr. LUIS LAGO CASTRO, Doctor en Ciencias Biológicas y Agrícolas y Director de
la investigación, por sus valiosas orientaciones, enseñanzas y su gran apoyo
durante la realización de este trabajo.
Dra. SANDRA MOLINA, Ingeniera Agrónoma, fitopatóloga de la Sección de
Sanidad Vegetal del ICA y Codirectora, por su dedicación y constante
colaboración en las labores realizadas en el laboratorio.
Dra. MARCELA FRANCO, Microbióloga, docente de la Pontificia Universidad
Javeriana y asesora, por facilitarme la debida orientación para la organización de
este trabajo.
Dra. JIMENA SÁNCHEZ, Bacterióloga. Msc., Profesora Fitopatología de la
Pontificia Universidad Javeriana, por estar siempre presta a ofrecerme su
10
incondicional ayuda y colaboración de forma constante para la investigación de
este proyecto.
A Mc Cain Andina por los aportes técnicos y científicos proporcionados para llevar
a cabo la realización de este trabajo.
A todo el personal del Laboratorio de Sanidad Vegetal del ICA por estar siempre
dispuesto a brindarme su apoyo y colaboración en las labores realizadas.
A todas aquellas personas que de una u otra forma colaboraron en la realización
del presente trabajo.
11
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
RESUMEN
1. INTRODUCCIÓN 1
2. REVISIÓN DE LITERATURA 4
2.1. GENERALIDADES DEL CULTIVO DE LA PAPA EN 4 COLOMBIA
2.1.1. Historia 4
2.1.2. Clasificación taxonómica 5
2.1.3. Morfología de la planta 6
2.2. PRINCIPALES ENFERMEDADES QUE AFECTAN AL 8 CULTIVO DE LA PAPA 2.3. PRINCIPALES ENFERMEDADES CAUSADAS POR 11 BACTERIAS Y HONGOS TRANSMITIDAS POR SEMILLA 2.3.1 Bacterias 11
2.3.1.1. Ralstonia solanacearum 11
2.3.1.2. Erwinia carotovora var. atroseptica - E. carotovora var. 14 carotovora - E.chrysantemi
12
2.3.1.3. Streptomyces scabies 18
2.3.2. Hongos 20
2.3.2.1. Rhizoctonia solani 20
2.3.2.2. Spongospora subterránea 23
2.3.2.3. Fusarium spp., F. oxysporum, F. avenaceum 26
2.3.2.4. Geotrichum spp. 28
2.4. VARIEDAD DE LA PAPA 30
2.5. SEMILLA DE PAPA 31
2.5.1. Importancia del cultivo de semilla de papa en Colombia 32
2.5.2. Categorías de la semilla de papa 33
2.5.3. Localización de los cultivos de semilla evaluados 34
2.6. IMPLEMENTACIÓN Y UTILIZACIÓN DE ESCALAS DE 37 INCIDENCIA Y SEVERIDAD 2.7. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO 38
2.7.1. Visual 38
2.7.2. Microbiológico 39
2.7.3. ELISA 39
2.7.4. PCR 40
3. JUSTIFICACIÓN 41
4. OBJETIVOS 44
4.1. GENERAL 44
4.2. ESPECÍFICOS 44
13
5. MATERIALES Y MÉTODOS 46
5.1. MATERIAL EXPERIMENTAL 46
5.2. MÉTODOS 47
5.2.1. Tratamiento de los tubérculos semilla de papa 47
5.2.2. Recolección de las muestras 48
5.2.3. Reconocimiento de las enfermedades 49
5.2.3.1. Reconocimiento visual o directo 50
5.2.3.2. Reconocimiento en el laboratorio 51
5.2.4. Técnica de aislamiento 51
5.2.5. Pruebas bioquímicas para identificación de bacterias 53
5.2.6. Pruebas de patogenicidad para identificación de Erwinia 56
5.2.7. Métodos de evaluación para Ralstonia solanacearum 57
5.2.7.1. Hot box 57
5.2.7.2. ELISA (NCM) 58
5.2.8. Análisis de los datos 60
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 61
6.1. RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LOS PATÓGENOS EN EL LABORATORIO 61
6.1.1. Bacterias 61
6.1.2. Hongos 64
6.2. EVALUACIÓN DE ENFERMEDADES MEDIANTE LAS 73
14
ESCALAS DE SEVERIDAD 6.2.1. Grados de severidad de las escalas visuales 73
6.2.2. Incidencia de las enfermedades según la distribución 73 Geográfica
6.2.3. Incidencia de las enfermedades según la categoría de la 82
semilla
6.2. EVALUACIÓN DE Ralstonia solanacearum 85
6.3. APORTES DE LA TESIS A McCAIN ANDINA 86
7. CONCLUSIONES 88
8. RECOMENDACIONES 90
BIBLIOGRAFÍA 92
15
ÍNDICE DE TABLAS
Pág.
TABLA 1. Enfermedades bacterianas del cultivo de la papa 9
TABLA 2. Enfermedades fungosas del cultivo de la papa 10
TABLA 3. Enfermedades virosas del cultivo de la papa 10
TABLA 4. Cultivos localizados en Cundinamarca 35
TABLA 5. Cultivos localizados en Boyacá 35
TABLA 6. Cultivos localizados en Antioquia 36
TABLA 7. Cultivo localizado en Nariño 36
TABLA 8. Resultados pruebas bioquímicas para bacterias 63
TABLA 9. Grado de severidad en la escala de Rhizoctonia solani 73
TABLA 10. Grado de severidad en la escala de Spongospora
Subterránea 74
TABLA 11. Incidencia de las enfermedades en campo en Cundinamarca 75
TABLA 12. Incidencia de las enfermedades en campo en Boyacá 75
TABLA 13. Incidencia de las enfermedades en campo en Nariño 75
16
TABLA 14. Incidencia de las enfermedades en bodega en Boyacá 79
TABLA 15. Incidencia de las enfermedades en bodega en Antioquia 79
TABLA 16. Incidencia de las enfermedades en campo según la 83 categoría en Cundinamarca
TABLA 17. Incidencia de las enfermedades en campo según la 83 categoría en Boyacá
TABLA 18. Incidencia de las enfermedades en campo según la 83 categoría en Nariño
TABLA 19. Incidencia de las enfermedades en bodega según la 83 categoría en Boyacá
TABLA 20. Incidencia de las enfermedades en bodega según la 84 categoría en Antioquia
17
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
FIGURA 1. Ralstonia solanacearum. Síntomas en tubérculos 13
FIGURA 2. Erwinia carotovora var. atroseptica. Pata negra en el tallo 17
FIGURA 3. Erwinia carotovora var. atroseptica. Pudrición en 17 tubérculos
FIGURA 4. Streptomyces scabies. Síntomas en tubérculos. 19
FIGURA 5. Esclerocios de Rhizoctonia solani en tubérculos. 22
FIGURA 6. Rhizoctonia solani. Agrietaduras en tubérculos. 22
FIGURA 7. Spongospora subterranea. Agallas en raíces 24
FIGURA 8. Spongospora subterranea. Verrugas en tubérculos. 24
FIGURA 9. Fusarium. Síntomas en tubérculos. 27
FIGURA 10. Geotrichum spp. Síntomas en tubérculos 29
FIGURA 11. Desarrollo de la coloración de ELISA (NCM). 59
FIGURA 12. Colonias de Erwinia. 62
FIGURA 13. Erwinia. Coloración de Gram 62
FIGURA 14. Prueba de patogenicidad de Erwinia 63
18
FIGURA 15. Rhizoctonia solani en PDA. 65
FIGURA 16. Hifas de Rhizoctonia solani. 65
FIGURA 17. Quistosoros Spongospora subterranea. 66
FIGURA 18. Fusarium spp. en PDA. 67
FIGURA 19. Fusarium oxysporum en PDA. 68
FIGURA 20. Fusarium avenaceum en PDA. 68
FIGURA 21. Conidias de Fusarium spp. 69
FIGURA 22. Clamidosporas Fusarium oxysporum . 70
FIGURA 23. Macroconidias de Fusarium avenaceaum. 70
FIGURA 24. Geotrichum spp. en PDA. 71
FIGURA 25. Geotrichum spp. Observación microscópica. 72
19
ÍNDICE DE ANEXOS
Pág.
ANEXO 1. Ciclo de la enfermedad de Erwinia. 98
ANEXO 2. Ciclo de la enfermedad de Rhizoctonia solani. 99
ANEXO 3. Ciclo de la enfermedad de Spongospora subterránea 100
ANEXO 4. Ciclo de la enfermedad de Fusarium oxysporum 101
ANEXO 5. Mapa zonas productoras de papa en Colombia 102
ANEXO 6. Escala de severidad para Rhizoctonia solani (Kühn) 103
ANEXO 7. Escala de severidad para Spongospora 104
subterranea (Wallr).
ANEXO 8. Agar PDA. 105
ANEXO 9 Agar Nutritivo. 106
ANEXO 10. Coloración de Gram. 107
ANEXO 11. Prueba Oxido/Fermentación (O/F). 109
ANEXO 12. Caldo para producción de indol - Reactivo Kovac´s. 110
ANEXO 13. Prueba de reducción de compuestos de sacarosa – 111 Reactivo Benedict.
ANEXO 14. Soluciones empleadas en la prueba ELISA (NCM). 112
20
ÍNDICE DE GRÁFICAS
GRÁFICA 1. Grados de severidad de la escala de Rhizoctonia solani
GRAFICA 2. Grados de severidad de la escala de Spongospora subterranea
GRAFICA 3. Incidencia de las enfermedades en campo en Cundinamarca
GRÁFICA 4. Incidencia de las enfermedades en campo en Boyacá
GRÁFICA 5. Incidencia de las enfermedades en campo en Nariño
GRÁFICA 6. Incidencia de las enfermedades en bodega en Boyacá
GRÁFICA 7. Incidencia de las enfermedades en bodega en Antioquia
21
1. INTRODUCCIÓN
La papa es un cultivo que se siembra en casi todo el mundo y es afectado por
infinidad de patógenos, entre ellos las bacterias y los hongos. Generalmente se ha
reportado que la semilla de papa se mueve activamente dentro de un país a otro y
de un continente a otro y puede transmitir las enfermedades de generación en
generación, por lo tanto, muchos de los patógenos que en la actualidad
conocemos, están presentes donde quiera que se cultive papa.
La papa forma parte de las 20 especies que alimentan al 90% de la población
mundial y está dentro de las 6 que constituyen la fuente vital de la mitad de los
habitantes del mundo, ocupando el tercer lugar después del trigo y el arroz
(Carranza, J. 1995). Aproximadamente 90.000 productores cultivan anualmente en
Colombia cerca de 180.000 has de papa, de las cuales se usan 250.000 toneladas
para semilla. De ésta cerca del 97% es de sanidad dudosa. Los cultivadores
utilizan de 1 a 2.5 toneladas de semilla/ha equivalente al 10% de la producción
total nacional (Dilmer, J. 1997). Actualmente la producción total de papa en
Colombia es de 3 millones de toneladas: 80% para consumo fresco, 8% para
22
procesamiento, 8% para semilla y un 3-7% queda desperdiciado en el suelo
(Papa. 1999).
La producción anual de papa en Colombia es de 2´750.000 ton, de las cuales solo
el 1% (27.500 ton), es semilla Certificada. Los agricultores que utilizan la papa
como un renglón importante en sus actividades económicas, no utilizan semilla
Certificada, únicamente un 3% lo hace, por lo tanto un alto porcentaje de
agricultores en el país se ve obligado a sembrar semestre tras semestre la misma
semilla, trayendo como consecuencia la degeneración de la misma, el
establecimiento de patógenos y la disminución de los rendimientos de las
cosechas (Zapata, J. L.1999).
Las enfermedades bacterianas y fungosas, aunque en pocos casos son de
carácter letal, generalmente reducen el vigor y las posibilidades de usar los
tubérculos como semilla; además os problemas de origen viral son una de las
principales causas de disminución en la productividad de esta especie vegetal.
Algunos microorganismos dependen de la papa para su supervivencia y
diseminación, probablemente fueron introducidos con el material inicial traído
desde su centro de origen; estos microorganismos usualmente son comunes en
cualquier sitio en donde se cultive papa, otros son encontrados en algunas
especies vegetales, cultivadas o no y afectan la papa en condiciones favorables
(Zapata, 1999).
23
Cuando los tubérculos son infectados por bacterias y hongos, las semillas
vegetativas que se utilizan, dan lugar a plantas infectadas en la siguiente etapa;
estas en su mayoría se ven anormales y producen mucho menos que las plantas
sanas. Uno de los principales objetivos en la producción de semilla de papa es
obtener tubérculos libres de patógenos, por tales razones es importante tener en
cuenta las condiciones sanitarias óptimas que debe tener el tubérculo semilla,
para evitar la transmisión y diseminación de enfermedades causadas por hongos y
bacterias, que disminuyen la productividad del cultivo y permiten establecer un
sistema de control de calidad en la producción de semilla de papa en Colombia.
Adicionalmente los aspectos sociales juegan un papel importante, ya que la
mayoría de los cultivos en Colombia se ubican en áreas de minifundio,
caracterizado por estar en manos de campesinos de bajos recursos y tecnología
de producción muy escasa.
24
2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. GENERALIDADES DEL CULTIVO DE LA PAPA EN COLOMBIA
2.1.1. HISTORIA
La papa es nativa de la Cordillera Andina de Sudamérica, este cultivo es propio de
regiones frías o templadas. Es la planta dicotiledónea más importante como fuente
de alimentación humana; fue introducida en España pero no se conoce la fecha en
que esto sucedió. Se considera que las papas introducidas a Europa fueron del
grupo Andígena, conclusión que se dedujo por el tipo disponible en Europa en el
siglo XVI. La papa llegó a Irlanda en 1663 y fue allí aparentemente donde fue
cultivada por primera vez, con el fin del aprovechamiento de los tubérculos. En
aquel tiempo la papa llegó a ser un producto muy importante en la alimentación de
los habitantes (FEDEPAPA, 1997).
25
2.1.2. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA
El cultivo de papa está constituida por un número de especies o híbridos que
pertenecen a la familia solanaceae, sección tuberarium, con aproximadamente
150 especies tuberíferas. La más común es Solanum tuberosum compuesta por
las subespecies andígena y tuberosum. La clasificación taxonómica de la papa se
basa en caracteres florales, lo que permite clasificarla de la siguiente forma (Luján,
L. 1991):
DIVISIÓN: Angiospermas
CLASE: Dicotiledónea
SUBCLASE: Metaclamidea
ORDEN: Tubifloras
FAMILIA: Solanaceae
SUBFAMILIA: Solanoideae
TRIBU: Solaneae
GÉNERO: Solanum
SUBGÉNERO: Papa
SECCIÓN: Petota
SUBSECCIÓN: Papa
26
2.1.3. MORFOLOGÍA DE LA PLANTA
RAÍCES: Cuando las plantas crecen a partir de tubérculos-semilla forman raíces
adventicias fibrosas, primero en la base de cada brote y luego encima de los
nudos en la parte subterránea de cada tallo. La papa tiene un sistema radicular
débil, por eso es necesario un suelo de buenas condiciones; un buen desarrollo
del sistema radicular proporciona una mayor área de absorción de agua y
nutrientes (FEDEPAPA, 1997).
TALLOS: El sistema de tallos de la papa consta de tallos principales o aéreos,
estolones y tubérculos:
• Tallos aéreos: Son herbáceos, erguidos y resultan del desarrollo de las yemas
localizadas en los ojos de los tubérculos, el número varía de acuerdo al tamaño
del tubérculo madre. Su función es transportar ascendentemente el agua y
nutrientes a través del xilema y la translocación de los productos fotosintéticos
por medio del floema.
• Estolones: Son tallos laterales que crecen horizontalmente dentro del suelo a
partir de las yemas de la parte subterránea de los tallos principales. La longitud
de los estolones es uno de los caracteres utilizados para diferenciar variedades.
27
• Tubérculos: Es un órgano de almacenamiento de materiales de reserva y por su
contenido de agua y nutrientes es el más apropiado para la propagación
vegetativa de la planta de papa. La producción asexual de la papa a partir de
tubérculos-semilla, permite mantener casi inalterable su constitución genética,
pero facilita el establecimiento y diseminación de enfermedades causadas por
virus que reducen la capacidad productiva de la planta (FEDEPAPA, 1997).
El tubérculo se compone de las siguientes zonas:
• Peridermo: Es la piel, controla la pérdida de humedad e impide la entrada de
patógenos.
• Corteza: Es una estrecha capa de tejido parenquimatoso que se encuentra
debajo del peridermo, contiene proteínas, gránulos de almidón y pigmentos.
• Anillo vascular: Es delgado y está formado por el xilema y floema por el cual
circula el agua y los elementos fotosintetizados respectivamente.
• Parénquima de reserva: Es el tejido de almacenamiento que abarca la mayor
parte del tubérculo (FEDEPAPA, 1997).
28
HOJAS: Son compuestas, la forma varía desde orbicular hasta lancelolada, de
color verde oscuro.
FLORES: Constan de un cáliz, corola , estambres, pistilo; el conjunto de estambres
forman el órgano masculino llamado androceo y el pistilo es el órgano femenino
llamado gineceo.
FRUTO: Es una baya esférica, globular, ovoide o cónico alargada. Color verde
pálido u oscuro (FEDEPAPA, 1997).
2.2. PRINCIPALES ENFERMEDADES QUE AFECTAN AL CULTIVO DE LA
PAPA
Las enfermedades de una planta pueden ser consideradas como una interacción
entre el hospedante (papa) y un agente causal de enfermedad, la cual afecta en
forma adversa la productividad y utilización del cultivo. Esta interacción está
influenciada por el medio ambiente que actúa ya sea sobre uno de ellos o sobre
ambos, planta y patógeno; frecuentemente los efectos adversos del medio
ambiente son suficientes para iniciar una enfermedad. Según la literatura se han
registrado a nivel mundial por lo menos 40 enfermedades fungosas, 6 bacteriales,
30 virales, 5 por nemátodos y 40 enfermedades no parasíticas. Obviamente no
todos se presentan en la misma distribución geográfica (FEDEPAPA. 1997).
29
Se denominan enfermedades no parasíticas o no infecciosas las que son
causadas por el ambiente, tales como heladas, temperaturas elevadas, deficiencia
o exceso de minerales en el suelo, anegamientos, gases industriales, entre otros,
siendo todos estos elementos estudiados por el área de fisiología vegetal
(FEDECAFE, 1990).
A continuación se mencionan las principales enfermedades y patógenos que
atacan el cultivo de la papa:
Tabla 1. Enfermedades bacterianas del cultivo de papa (Hooker, W.J. 1980).
ORGANISMO NOMBRE COMÚN Ralstonia solanacearum (E.F. Smith) Marchitez bacteriana,
Dormidera. Erwinia carotovora var. atroseptica (Van Hall) Dye
Pierna negra, pata negra.
Erwinia carotovora var. carotovora (Jones) Dye
Pudrición blanda.
Erwinia chrysantemi Pudrición blanda. Corynebacterium sepedonicum Pudrición anular. Streptomyces scabies (Thaxter) Sarna común.
Tabla 2. Enfermedades fungosas del cultivo de papa (Hooker, W.J. 1980).
ORGANISMO NOMBRE COMÚN Rhizoctonia solani (Kühn) Costra negra, Rhizoctoniasis. Spongospora subterranea (Wallr) Lagerth Roña polvosa. Fusarium spp., F. solani, (Mart) F. oxysporum, F. avenaceum
Pudrición seca, Marchitez por Fusarium.
Phytophtora infestans (Mont) De Bary Tizón tardío, gota. Verticillium albo-atrum (Reinke y Berth) Marchitez temprana. Rosellinia spp. Mortaja blanca, Torbó. Alternaria solani (Sorauer) Tizón temprano. Pythium spp. Pudrición acuosa. Synchytrium endobioticum (Schilb) Veruga. Roña negra. Tabla 3. Enfermedades virosas del cultivo de papa (Hooker, W.J. 1980).
30
CLASIFICACIÓN NOMBRE DEL AGENTE CAUSAL Luteovirus Virus del Enrollamiento de hojas de la papa.
PLRV Carlavirus Virus S de la papa. PVS Potexvirus Virus X de la papa. PVX Potyvirus Virus Y de la papa. PVY Closterovirus Virus del Amarillamiento de venas de la papa.
PYVV
2.3. PRINCIPALES ENFERMEDADES CAUSADAS POR BACTERIAS Y
HONGOS TRANSMITIDAS POR SEMILLA
Las enfermedades causadas por agentes transmisibles se llaman enfermedades
infecciosas o parasitarias, entre las principales enfermedades bacterianas y
fungosas transmitidas por la semilla se describen las siguientes:
2.3.1. BACTERIAS
2.3.1.1 Ralstonia solanacearum E.F. Smith
Nombre común: Marchitez bacteriana, pudrición parda (Holt, J. 1994).
REINO: Prokaryotae.
DIVISIÓN: Bacteria.
FAMILIA: Pseudomonaceae.
GÉNERO: Ralstonia.
ESPECIE: solanacearum.
31
Organismo causal (Agrios, G. 1996).
Esta bacteria inicialmente se llamaba Pseudomonas solanacearum pero su nueva
nomenclatura es Ralstonia solanacearum. Es un bacilo Gram-negativo recto o
curvo con dimensiones de 0.5 a 1 x 1.5 a 4 µm, se desplazan por medio de uno o
muchos flagelos polares, no produce pigmentos fluorescentes. Algunas razas son
habitantes comunes del suelo.
Razas de Ralstonia solanacearum en solanáceas (López, C. 1993):
• Raza 1 : Afecta solanaceas en general, muy virulenta para papa, es clásica en
tierras bajas tropicales y requiere temperaturas altas (sobre 28°C).
• Raza 2 : Afecta papas, en menor proporción tomate. Típica de tierras altas
tropicales. Algunas cepas pueden causar infecciones latentes a bajas
temperaturas, es muy virulenta en tierras cálidas. Las razas 1 y 2 son las que
más predominan en Colombia.
• Raza 3: Afecta papa y tomate pero no es de muy alta virulencia.
•• Raza 4: Es de baja virulencia en papa (López, C. 1993).
32
Síntomas (Hooker, 1980).
FOLLAJE: Se observa marchitez y amarillamiento. Las hojas marchitas palidecen,
toman una coloración verde claro y finalmente se tornan de color castaño.
TALLO: Flácidos. En los tallos jóvenes se puede observar unas rayas oscuras y
angostas que se producen por la colonización del microorganismo en los haces
vasculares infectados. Un signo propio es la presencia de gotitas brillantes de color
castaño grisáceo que exudan del xilema cuando se hace un corte transversal en el
tallo, hay hilos delgados de mucosidad.
TUBÉRCULOS: Se observa a través del peridermo como una decoloración gris
parduzca. Si se cortan transversalmente los tubérculos muestran una decoloración
vascular que puede extenderse desde el xilema hacia la médula y hacia la corteza.
Al hacer una ligera presión, emanan del anillo vascular gotitas blanquecinas de
mucus bacteriano. Los ojos que se encuentran en la base del
tubérculo se oscurecen formándose un exudado pegajoso en estos o en la unión
con el estolón.
33
Figura 1. Ralstonia solanacearum. Síntomas en tubérculos.
Ciclo de la enfermedad y diseminación (Hooker, 1980).
La bacteria es transmitida mediante la siembra de tubérculos infectados, por lo
que se establece cuarentena de tubérculos para semilla en las áreas donde se
presente, también por contacto entre raíces en el suelo, a través de agua que fluye
y mediante el movimiento de suelo contaminado sobre herramientas, equipo y
zapatos. Le favorecen las temperaturas altas, raramente se encuentra en áreas
donde la temperatura media del suelo está por debajo de 15 °C. El desarrollo
óptimo de la mayoría de las razas se realiza entre 30 a 32°C, sin embargo las
razas 1 y 2 de Colombia se desarrollan bien a temperaturas bajas. La enfermedad
se presenta en tipos diferentes de suelo, que varían de arenoso a arcilloso pesado
y en amplio rango de pH. En un campo dado, la enfermedad se localiza
generalmente por focos, asociados a menudo con mal drenaje.
34
Control (Hooker, 1980).
La enfermedad se controla por temperaturas de suelo altas o bajas (promedios
inferiores a 14ºC y superiores a 40ºC y su dispersión se reduce mediante el cultivo
asociado con otros cultivos no susceptibles. Se reduce con enmiendas de suelo
con mucha materia orgánica, solarización, fumigación, labranza mínima, control de
nemátodos, siembra en época fría y el uso de variedades resistentes. Usar semilla
libre de la enfermedad. Practicar rotación de cultivos.
2.3.1.2. Erwinia carotovora var. atroseptica. Eca. (Van Hall) Dye
Nombre común: Pierna negra, pata negra (Holt, J.1994).
REINO: Prokaryotae.
DIVISIÓN: Bacteria.
FAMILIA: Enterobacteriaceae.
GÉNERO: Erwinia.
ESPECIE: carotovora
VARIEDAD: atroseptica.
Erwinia carotovora var. carotovora. Ecc. (Jones) Dye.
Erwinia chrysantemi. Echr.
Nombre común: Pudrición blanda (Holt, J.1994).
35
REINO: Prokaryotae.
DIVISIÓN: Bacteria.
FAMILIA: Enterobacteriaceae.
GÉNERO: Erwinia.
ESPECIES: carotovora - chrysantemi.
VARIEDAD: carotovora.
Organismo causal (Agrios, G. 1996).
Son bacilos Gram-negativos rectos, con dimensiones de 0.5 a 1.0 x 1.0 a 3 µm, se
desplazan por medio de varios o muchos flagelos perítricos. Son las únicas
bacterias fitopatógenas que son anaeróbicas facultativas, son pectolíticas.
Síntomas (Hooker, 1980).
FOLLAJE: Clorótico, los foliolos tienden a enrrollarse, luego se marchitan y
mueren.
TALLO: Muestra una necrosis de apariencia de tinta negra (pata negra), el daño
puede abarcar todo el tallo o solo a unos pocos centímetros de la base. La parte
afectada toma consistencia blanda viscosa.
36
TUBÉRCULOS: Presentan una ligera decoloración vascular al extremo del estolón
que se comunica con la planta, en el estado inicial y una gran descomposición que
afecta todo el tubérculo en estado avanzado. Las lesiones son de formas
circulares, húmedas, ligeramente hundidas, de color canela a castaño. El centro
del tubérculo es hueco y el tejido tiene consistencia blanda, viscosa y pegajosa
producto del exudado bacteriano, este va de color crema a café oscuro. Olor
desagradable.
.
Figura 2. Eca. Pata negra en tallo. Figura 3. Eca. Pudrición en tubérculos.
Ciclo de la enfermedad y diseminación (López, C. 1993).
El inóculo primario se encuentra sobre o dentro de la semilla. Después de la
siembra, el tubérculo madre se va deteriorando durante el desarrollo de la planta,
liberando hacia el suelo gran cantidad de bacterias y produciendo plantas
infectadas. La bacteria puede movilizarse por medio de agua de riego y
contaminar los tubérculos de plantas vecinas. La infección comienza por la
penetración de la bacteria por las lenticelas, agrietaduras o heridas y puede
37
sobrevivir en tubérculos contaminados durante todo el período de almacenaje. La
bacteria persiste en el suelo por períodos cortos, pero esto depende de las
condiciones de temperatura y la humedad del suelo; ya que estos favorecen su
crecimiento. Eca crece en climas fríos y Ecc y Echr en temperaturas superiores a
10°C y climas templados. (Anexo 1). El ataque se produce en el almacén o en el
suelo antes de la cosecha y los tubérculos semilla se deterioran después de la
siembra. La invasión de Fusarium spp. a la semilla puede predisponer el tejido a
pudrición blanda y favorecer el desarrollo de Pierna negra.
Control (Hooker, W.J. 1980).
Usar semilla sana. Evitar inundaciones en el terreno o un riego excesivo. Eliminar
residuos de cosecha para que no sirvan de reservorio de la bacteria.
2.3.1.3. Streptomyces scabies (Thaxter).
Nombre común: Sarna Común (Agrios, G. 1996).
REINO: Prokaryotae.
DIVISIÓN: Bacteria.
CLASE: Actinomicetes.
GÉNERO: Streptomyces.
ESPECIE: scabies.
38
Organismo causal (Agrios, G. 1996).
Se encuentra registrada en Colombia. Los Streptomycetes están clasificados
como bacterias, pero tienen gran similitud con los hongos por su morfología
filamentosa. Este es un organismo aeróbico con micelio muy delgado, colonias
compactas. Produce un micelio aéreo que forma cadenas de conidios no móviles.
Las células constan de filamentos ramificados cenocíticos (no septados), los
cuales a menudo tienen forma de espiral y producen conidios en
cadena sobre hifas aéreas por la segmentación de las hifas. Es un habitante
común del suelo.
Síntomas (Hooker, W.J. 1980).
TALLO: Las lesiones son de color castaño a canela, cuando se originan en las
lenticelas tienen forma de lente alargado.
TUBÉRCULOS: Las lesiones son circulares entre 5 a 8 mm de diámetro, pueden
adoptar formas irregulares o como cráteres. El tejido toma coloración del canela
claro al castaño y puede ser como una capa corchosa superficial. Las lesiones
hundidas son de color castaño oscuro casi negro.
39
Figura 4. Streptomyces scabies. Síntomas en tubérculos.
Ciclo de la enfermedad y diseminación (Hooker, W.J. 1980).
Los tubérculos en crecimiento son infectados a través de las lenticelas jóvenes y
también a través de los estomas, además por las heridas. La enfermedad se
transmite debido al cultivo de semilla infectada. El organismo sobrevive en el suelo
por períodos largos sobre material vegetal en descomposición. La siembra
continua de papa en el mismo campo aumenta la severidad del problema. Se
establece mejor en suelos secos.
Control (Hooker, W.J. 1980).
Usar semilla libre de enfermedad. Prolongar el tiempo entre siembras sucesivas
de papa. Mantener niveles altos de humedad en el suelo durante y después del
establecimiento de los tubérculos por unas 4 a 9 semanas de acuerdo con la
variedad, prácticas culturales de cultivo y clima. Empleo de fertilizantes sulfurados
y ácido formantes para aumentar la acidez del suelo.
40
2.3.2. HONGOS
2.3.2.1. Rhizoctonia solani Kühn
Nombre común: Costra negra, Rhizoctoniasis (Agrios, G. 1996).
REINO: Fungi.
DIVISIÓN: Eumycota.
SUBDIVISIÓN: Deuteromycotina.
CLASE: Agonomycetes.
ORDEN: Agonomycetales (Myceliales).
GÉNERO: Rhizoctonia.
ESPECIE: solani.
Organismo causal (Barnett, H.L. 1972).
Es un hongo de micelio estéril por tener esporas ausentes. Las hifas son gruesas,
septadas, capaces de anastomosarse (fusión de hifas).
Síntomas (Hooker, W.J. 1980).
FOLLAJE: Las hojas se enrollan hacia arriba como si estuvieran cerrándose y
algunas veces tornan a amarillo.
41
TALLO: Se presenta estrangulamiento del tallo. En la superficie de los tallos,
exactamente por la línea del suelo, se forma una capa tenue blanco y le da una
apariencia polvorienta. Se presentan tubérculos aéreos a lo largo del tallo.
RAÍCES: Se observa un sistema radicular muy pobre, por consecuencia del
estrangulamiento del tallo.
TUBÉRCULOS: En la superficie de los tubérculos maduros se observan
esclerocios de color negro o castaño oscuro, estos son chatos y superficiales o
grandes e irregulares en forma de terrones (costra negra), difíciles de remover.
Además presentan agrietaduras, malformaciones (llamadas muñecos),
concavidades y necrosis en el extremo de unión con el estolón color castaño
rojizo.
Figura 5. Esclerocios de Figura 6. R. solani Agrietaduras R. solani. en tubérculos.
42
Ciclo de la enfermedad y diseminación (Hooker, W.J. 1980).
El patógeno es un habitante del suelo y se mantiene allí en forma de esclerocios y
sobre los tubérculos, o como micelio en restos vegetales en el suelo, los
esclerocios germinan e invaden los tallos de papa a través de las heridas. La
formación de esclerocios sobre los tubérculos depende de las condiciones
ambientales, el desarrollo máximo ocurre después de que se ha matado la planta,
cuando los tubérculos permanecen aún enterrados. La forma de transmisión es
por la siembra de tubérculos semilla fuertemente infestados con esclerocios que
además favorecen el incremento del inóculo en el suelo, al igual que almacenar
tubérculos con grandes cantidades de tierra. (Anexo2). La temperatura del suelo
baja (18°C), el alto nivel de humedad y sobre todo la falta de drenaje favorecen el
crecimiento del patógeno.
Control (Hooker, W.J. 1980).
Usar semilla libre de esclerocios en alto grado. Rotación de cultivos. Verdear la
semilla mediante almacenamiento con luz indirecta. Evitar excesos de humedad
en el suelo. No demorar la cosecha. Aplicación de fungicidas del grupo de los
benzimidazoles.
43
2.3.2.2. Spongospora subterranea f.sp. subterranea (Wallr)
Nombre común: Roña polvosa (Agrios, G. 1996).
REINO: Fungi
DIVISIÓN: Myxomycota
CLASE: Plasmodiophoromycetes
ORDEN: Plasmodiophorales
GÉNERO: Spongospora
ESPECIE: subterránea
Organismo causal (Hooker, W.J. 1980).
Este hongo es un parásito obligado y por esta razón no es posible aislarlo en
medios de cultivo. Aun cuando pueda sobrevivir en el suelo como esporas
latentes durante muchos años, solo pueden desarrollarse y reproducirse en un
número limitado de hospedantes.
Síntomas (Garcés, E. 1996).
RAÍCES: Se presenta inicialmente pequeñas manchas necróticas que se
transforman en verrugas color blanco crema, para luego convertirse en agallas
que se disponen en hilera en forma de rosario ubicadas en la parte axial de las
raíces, es decir a un lado. Son de color castaño oscuro cuando están
desarrolladas. Estas agallas se forman como resultado de la proliferación de las
44
células huésped (hiperplasia) por lo cual se forma un tejido tumoral sobre las
raíces.
TUBÉRCULOS: En la superficie se producen verrugas color castaño púrpura
formando lesiones levantadas en forma de granitos. La lesión se expande
formando áreas con cavidades o verrugas grandes generando así la forma
ulcerosa de la roña. Debajo de la lesión se forma una depresión superficial llena
de una masa polvorienta de esporas de color castaño oscuro a naranja.
Figura 7. S. Subterranea. Agallas Figura 8. S. Subterranea. Verrugas
en raíces. en tubérculos.
Ciclo de vida y diseminación (Hooker, W.J. 1980).
Cuando la temperatura es favorable y la humedad abundante, la espora latente
produce una zoospora que infecta a un pelo radical y produce un plasmodio, este
último se transforma en un zoosporangio que produce abundantes zoosporas
secundarias que, quizás después de haberse apareado, penetran en la raíz o en
45
los tejidos de un tubérculo, producen un plasmodio y ocasionan la enfermedad
característica. El plasmodio se propaga en los tejidos del hospedante y finalmente
produce esporas de reposo invernantes, las masas de esporas se conservan en el
suelo y diseminan la infección hacia las raíces y tubérculos, las lesiones
verrugosas facilitan el ingreso de otros patógenos. (Anexo 3). El inóculo se
disemina por el viento, el agua y por los tubérculos portadores de esporas. La
temperatura baja del suelo, el alto nivel de humedad favorecen al patógeno. Altos
contenidos de materia orgánica favorecen la acción del hongo. Durante el
almacenaje la roña puede derivar en pudrición seca (Fusarium spp.) o formar un
mayor número de pústulas.
Control (Hooker, W.J. 1980).
Los mejores estados para evaluar la presencia de roña en los cultivos son:
floración, post-floración y maduración. Usar semilla libre de la enfermedad. No
almacenar tubérculos enfermos junto con los sanos. La rotación de cultivos por 3 a
10 años que ha sido recomendada, depende de las condiciones de clima y suelo.
Siembra en suelos porosos y bien drenados. El azufre da buenos resultados pero
su uso es limitado porque acidifica demasiado el suelo. El remojo de los
tubérculos-semilla infectados en soluciones de formaldehído o bicloruro de
mercurio reduce la cantidad del inóculo.
46
2.3.2.3. Fusarium spp., F. oxysporum, F. avenaceum (Mart)
Nombre común: Pudrición seca, Marchitez por Fusarium (Agrios, G. 1996).
REINO: Fungi.
DIVISIÓN: Eumycota.
SUBDIVISIÓN: Deuteromycotina.
CLASE: Hyphomycetes.
ORDEN: Hyphales (Moniliales).
GÉNERO: Fusarium.
ESPECIES: oxysporum, avenaceum, spp.
Organismo causal (Barnett, H.L. 1972)
Hongo que produce esporas asexuales que se forman en esporodoquios, incluye
las macro y microconidias., algunas especies producen clamidosporas.
Síntomas (Hooker, W.J. 1980).
RAÍCES: Pudrición del sistema radicular.
FOLLAJE: Amarillamiento que comienza en las hojas inferiores y progresa hacia la
parte superior de la planta. Marchitez.
47
TALLO: Pudrición de la médula y amarillamiento de la parte inferior del tallo.
Formación de tubérculos aéreos. Decoloración vascular en las partes ubicadas por
encima o por debajo del suelo.
TUBÉRCULOS: La pudrición seca comienza en la porción próxima al estolón. En
la superficie de los tubérculos se forma una depresión y se arrugan. Además
lesiones decoloradas húmedas castaño a canela, de forma circular en cualquier
parte de la superficie del tubérculo. Al hacer un corte se observa que el tejido
vascular toma una coloración castaño, gris a rosado. En estado avanzado se
observan copitos blancos algodonosos en la superficie.
Figura 9. Fusarium. Síntomas en tubérculos.
Ciclo de vida y diseminación (Agrios, G. 1996).
Este hongo habita normalmente en el suelo y allí puede permanecer por varios
años, pero el inóculo primario se mantiene en la semilla a partir de la cual se
propaga en el almacenamiento. Se encuentra en el suelo en forma de micelio y en
48
cualquiera de sus formas de conidias, pero lo hace con mayor frecuencia en forma
de clamidosporas, sobre todo en las regiones templadas frías. (Anexo 4). La
enfermedad se transmite por el inóculo que se encuentra superficialmente o dentro
del tubérculo que se siembra y la infección se realiza a través de las raíces y
progresa hacia el tallo. El suelo, el viento y el agua que corren dispersan el
inóculo, crece a temperaturas de 20 a 30°C.
Control (Hooker, W.J. 1980).
Cicatrización oportuna de los tubérculos. Selección, manejo de semilla y
condiciones óptimas de almacenamiento que permitan una buena cicatrización de
las heridas. Tratamientos con fungicidas como carbendazim y metiltiofanato en
espolvoreo.
2.3.2.4 Geotrichum spp.
Nombre común: Pudrición gomosa o pegajosa (Agrios, G. 1996).
REINO: Fungi.
DIVISIÓN: Eumycota.
SUBDIVISIÓN: Deuteromycotina.
CLASE: Hyphomycetes.
ORDEN: Hyphales (Moniliales).
GÉNERO: Geotrichum
49
ESPECIE: spp.
Organismo causal (Barnett, H.L. 1972).
El micelio es septado, conidióforos ausentes. Las colonias llamadas artrosporas
son hialinas, cortas, cilíndricas y con las terminaciones cerradas formadas por la
segmentación de las hifas.
Síntomas (Asscheman, E. 1996).
TUBÉRCULOS: La pudrición se desarrolla desde la superficie hacia el interior del
tubérculo. Los tejidos afectados producen un olor típico parecido a leche agria,
toma una consistencia de goma o caucho que se torna a color rosado cuando se
expone al aire, los síntomas son similares a la pudrición rosada.
Figura 10. Geotrichum spp. Síntomas en tubérculos.
Ciclo de vida y diseminación (Asscheman, E. 1996).
Este hongo es un habitante común del suelo y es un patógeno débil ya que es un
organismo que afecta de forma secundaria en el proceso infeccioso. Penetra en
50
los tubérculos a través de heridas, después de la cosecha. Se comunmente en la
piel del tubérculos, afecta tubérculos que han estado saturados de agua en el
cultivo y por esta razón crece como microorganismo secundario cuando hay
pudriciones húmedas causadas por Erwinia carotovora. Igualmente aparece
cuando hay problemas de pudriciones secas causadas por Fusarium. El exudado
que se escapa de los tubérculos afectados puede causar pudrición húmeda a los
tubérculos adyacentes.
Control (Hooker, W.J. 1980).
Evitar estancamiento de aguas en el cultivo y realizar un efectivo drenaje.
Almacenar los tubérculos separadamente si es posible. Los tubérculos afectados
pueden colocarse a secar y ser almacenados en frío. El control químico no es
posible.
2.4. VARIEDAD DE LA PAPA
Colombia ha sido uno de los pocos países de América Latina que se inclinó desde
un comienzo por el establecimiento de un programa completo de producción de
semilla, incluyendo la creación de sus propias variedades mediante la
implementación de un programa de mejoramiento genético. El cultivo de la papa
ha sido sometido a mejoramiento de calidad por medio de la producción de
51
numerosas variedades en busca de tubérculos resistentes a determinadas
enfermedades y fenómenos ambientales que afectan su producción.
En este estudio se evaluó la variedad Diacol-Capiro: Conocida también como
R12 negra, utilizada como materia prima por la industria, como producto de
exportación y para consumo en fresco. Esta se cultiva en zonas altas, crece
lentamente y presenta mediana resistencia a la gota, a la marchitez bacteriana y a
los virus PVX y PVY, es susceptible a la roña polvosa. Para la industria de la papa
frita, esta variedad es muy apetecida (FEDEPAPA. 1997).
2.5. SEMILLA DE PAPA
La semilla de papa es una unidad biológica que tiene que cumplir un papel muy
importante, el cual es dar origen a una nueva planta productiva, es la estructura
botánica (en este caso asexual), capaz de reproducir la especie. La propagación
continua de papa por medio del tubérculo-semilla, sin la aplicación de un manejo
adecuado, facilita la transmisión y diseminación de enfermedades causadas por
microorganismos patógenos que afectan la calidad del cultivo (FEDEPAPA. 1997).
52
2.5.1. IMPORTANCIA DEL CULTIVO DE SEMILLA DE PAPA EN COLOMBIA
El cultivo de papa en Colombia es una de las principales fuentes de alimento,
debido a que está entre los países que tienen mayor producción de este tubérculo
en Latino América, principalmente en regiones frías o templadas y su cultivo es de
un gran valor económico a pesar de tener algunos problemas de producción,
almacenaje y utilización.
En el país se desarrolla el método de propagación de este producto por medio del
tubérculo-semilla de papa para la producción comercial, y una de las mayores
limitantes para la producción de semilla es encontrar suelos libres de problemas
fitosanitarios. Después del suelo, la semilla es el recurso natural más importante
para obtener un alto rendimiento por unidad de superficie y desde el punto de vista
de producción, la semilla representa cerca del 20% de los costos totales. El
incremento en los costos de producción, así como la diseminación de plagas y
enfermedades de importancia económica y la competencia con variedades
importadas para industria, nos lleva cada día a mejorar la calidad de la semilla de
papa en Colombia (Alvarado, L. 1998).
53
2.5.2. CATEGORÍAS DE LA SEMILLA DE PAPA
Según la Resolución No. 03303 del 20 noviembre 1997 del Instituto Colombiano
Agropecuario ICA División Semilla para la producción de semilla de papa, se
admiten las siguientes categorías:
Fase I: Material inicial Fase II: Básica
Super élite Registrada
Elite Mejorada
Certificada
Fase I:
Super élite: Los lotes de semilla estarán conformados por un número no superior
a 1000 minitubérculos.
Élite: Los lotes de semilla estarán conformados por un peso máximo de 100 Kg.
Fase II:
Semilla Básica o fundamental: Es la que se ha producido por la supervisión de
un programa técnico de mejoramiento y que constituye la fuente del aumento
inicial o recurrente de la semilla Básica (FEDEPAPA, 1997).
Semilla Registrada: Es la que se ha cosechado de plantas que proceden de
materiales de semilla Básica o Registrada y tratada con el fin de mantener la
identidad original y la pureza genética (FEDEPAPA, 1997).
54
Semilla Mejorada: Es la que no cumple los requisitos de la categoría Certificada,
mantiene la identidad varietal y buena capacidad de producción (FEDEPAPA,
1997).
Semilla Certificada: Es la producida bajo la supervisión de un servicio de
Certificación, puede originarse de una semilla Básica, Registrada o Certificada,
mantiene su identidad varietal y cumple los requisitos establecidos para esta
categoría. Se obtiene por empresas o agricultores y se constituye en la tercera
generación en campo de la semilla Elite que ha sido purificada y saneada por
técnicas de biotecnología (Pineda, R. 2000).
2.5.3. LOCALIZACIÓN DE LOS CULTIVOS
Las condiciones agroecológicas bajo las cuales se siembra papa en Colombia son
muy diversas. Se siembra desde los 2.000 hasta los 3.500 msnm con
temperaturas medias que oscilan entre los 10 y 15ºC y precipitaciones entre 500 y
2500 mm/año (Corpoica.1995). El principal sistema de producción de semilla de
papa en Colombia esta dado por las condiciones del clima, especialmente en los
páramos que están localizados a alturas superiores a los 3.000 metros sobre el
nivel del mar. Allí los productores siembran papa para utilizarla en sus cultivos
como semilla debido a los altos costos que conlleva obtener semilla Certificada
(Papa. 1997).
55
Los cultivos de Mc Cain de los cuales se tomaron las muestras evaluadas, se
encuentran ubicados en los siguientes departamentos (Anexo 5):
Cundinamarca: se encuentran páramos que se encuentran a alturas entre los
2.500 y 3.000 msnm. Su temperatura va de los 10 a 15 ºC.
Tabla 4. Cultivos localizados en Cundinamarca.
Municipio Altura (msnm)
Categoría semilla
Calera 3000 Certificada Chocontá 3000 Registrada, Certificada
Boyacá: Su temperatura va de los 10 a 15ºC. En el altiplano el clima es frío y seco
y en las partes más altas se presenta clima de páramo; el clima templado y menos
lluvioso es el más óptimo para el cultivo de la papa.
Tabla 5. Cultivos localizados en Boyacá
Municipio Altura (msnm) Categoría semilla Ventaquemada 3000 Básica, Registrada,
Mejorada Umbita 3000 Certificada Paipa 3100 Mejorada Tunja 2900 Mejorada
Antioquia: Su temperatura va de 15 a 20ºC, su clima va desde frío, hasta cálido y
húmedo, pasando por un amplio sector de clima templado.
56
Tabla 6. Cultivos localizados en Antioquia
Municipio Altura (msnm) Categoría semilla Jordán 2850 Básica
Nariño: Su temperatura va de 5 a 10ºC en algunas zonas y de 10 a 15ºC en otras;
las temperaturas son bajas en las cuencas medias de los ríos.
Tabla 7. Cultivo localizado en Nariño
Municipio Altura (msnm) Categoría semilla Pasto (Río Bobo) 2900 Certificada
Las bodegas donde se encuentra almacenada la semilla evaluada y los
invernaderos - casa malla de donde provenían las muestras de minitubérculos
Super Élite utilizadas para el Hot Box y ELISA, se encuentran ubicados en
Cundinamarca en Corpoica Tibaitatá. Las bodegas tienen una temperatura de
15ºC y una humedad relativa de 70 y 80%.
2.6. IMPLEMENTACIÓN Y UTILIZACIÓN DE ESCALAS DE SEVERIDAD
La observación de sintomatología y evaluación visual de las muestras, aunque en
la mayoría de los casos es subjetivo, son algunos de los métodos más empleados
al momento de realizar un diagnóstico debido a que permiten evidenciar los
efectos producidos por la acción del patógeno, y esto se convierte en una
57
herramienta útil para diferenciarlos. Aunque para ello es necesario realizar las
respectivas técnicas de laboratorio que brinden un resultado confirmatorio.
Las escalas proporcionaron una forma ágil para cuantificar los niveles de infección
producidos por Rhizoctonia solani (Anexo 5) y Spongospora subterranea. (Anexo
6); esta última se estableció con la realización de este trabajo. Las escalas
evalúan por síntomas la severidad de la enfermedad que presentan los tubérculos
en el momento de hacer el diagnóstico visual en niveles de 0 a 3 (Bucasof, S.M.
1972):
• Grado 0: Tubérculos sanos.
• Grado 1: La superficie del tubérculo presenta máximo (5) manchas o verrugas
producidas por el patógeno.
• Grado 2: La superficie del tubérculo presenta más de (5) manchas o verrugas
producidas por el patógeno, pero estas no ocupan más de la mitad de la
superficie.
• Grado 3: Las manchas ocupan más de la mitad de la superficie del tubérculo.
58
2.7. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
El proceso del diagnóstico está basado en una interacción entre la parte teórica de
la cual partimos inicialmente y la parte práctica por medio de un exámen detallado
de laboratorio para distinguir, determinar e identificar el agente causal de la
enfermedad. Es importante tener en cuenta que al diagnosticar una enfermedad
se debe determinar primero si ésta es ocasionada realmente por un patógeno o
por un factor fisiológico.
2.7.1. Visual
En algunas enfermedades, el diagnóstico puede realizarse rápidamente bajo
condiciones de campo al presentarse signos y síntomas visibles de la enfermedad,
por ejemplo con los hongos. El hecho de comparar estos síntomas observados,
con libros que incluyen las enfermedades que se sabe atacan a plantas de papa
hospedantes, permite reducir la gama de posibilidades y con frecuencia ayuda a
determinar la causa de las enfermedades.
2.7.2. Microbiolólogico
Para este tipo de diagnóstico algunas veces se aplican los Postulados de Koch, en
el caso de que una enfermedad no se encuentre registrada. Esto es necesario
para establecer la relación entre un microorganismo y una enfermedad específica.
Sin embargo, también se puede recurrir a pruebas más aclaratorias de laboratorio
59
y patogenicidad, para establecer la identidad del agente causal de la enfermedad
(French, R. E. 1982).
2.7.3. ELISA
Inicialmente se aplicaba únicamente para enfermedades virales, pero como se
puede ver con Ralstonia solanacearum se está aplicando también en bacterias
con la misma precisión, al igual que en Erwinia. Las ventajas de este método
radican en su gran sensibilidad, en el gran número de muestras que pueden
analizarse, y en que los resultados obtenidos son cuantitativos. Debido a ello esta
prueba está desplazando a las demás técnicas de serología para el diagnóstico
(Priou, S. 1999).
2.7.4. PCR
La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica capaz de generar “in
vitro” grandes cantidades de un determinado fragmento de DNA, a partir de
cantidades mínimas del mismo. La gran sensibilidad, versatilidad y sencillez de
este método ha revolucionado los procesos evolutivos de determinados aspectos
diagnósticos. Por ejemplo este método permite ejecutar rápidamente la
identificación de Ralstonia solanacearum aproximadamente 7 horas después de
su inoculación (Roncal, J. 1999).
60
3. JUSTIFICACIÓN
El cultivo de papa en Colombia es una de las principales fuentes de alimento
debido a que es uno de los países mayores productores de este tubérculo,
principalmente en las regiones de Cundinamarca y Boyacá. Su cultivo es de un
gran valor económico, es por esta razón que es necesario establecer y justificar
medidas preventivas apropiadas que solucionen los problemas tanto en la
producción de semillas de papa, como en su utilización.
Se hace necesario controlar la situación fitosanitaria de los tubérculos utilizados
como semilla, ya que en Colombia se desarrolla el método de propagación de este
producto por medio del tubérculo-semilla de papa para la producción comercial;
sin la aplicación de un manejo adecuado, se facilita la transmisión y diseminación
de enfermedades, que cultivo tras cultivo van reduciendo la capacidad productiva
(Hooker, W.J. 1980).
Las enfermedades pueden limitar severamente la eficiencia del cultivo expresada
en toneladas por hectárea, así como su calidad en una etapa posterior; es por esta
61
razón que se hace indispensable contribuir al conocimiento de las patologías que
afectan el tubérculo-semilla así como su diseminación en el país. Por ello la
realización de métodos de diagnóstico se efectúa con el fin de evaluar la presencia
de las enfermedades tanto bacterianas como fúngicas que afectan el valor del uso
del tubérculo semilla de papa para posteriormente adoptar un sistema de control
apropiado para la producción de semilla (Tamayo, A. 2000).
En el país, la papa es uno de los cultivos que consume el mayor volumen de
insecticidas y fungicidas; la labor de control de plagas y enfermedades representa
alrededor del 16% de los costos totales de producción del cultivo (Corpoica 1995).
La semilla además de ser el origen del cultivo, es el insumo más determinante en
el aumento de la productividad y competitividad. Si la semilla no se encuentra en
un óptimo estado fisiológico y libre de enfermedades y plagas, su desarrollo y tasa
de multiplicación se verán severamente reducidas ya que las enfermedades
constituyen un factor limitante real de la producción económica del cultivo.
El aporte de este trabajo es dar a conocer las patologías del tubérculo semilla de
papa, así como contribuir al desarrollo del conocimiento que estos temas
requieren. Esto repercutirá en un gran beneficio económico para la industria
productora de papa del país, pues se podrá contar con una valiosa herramienta
para el control oportuno de los patógenos .
62
4. OBJETIVOS
4.1. GENERAL
Conocer e identificar los principales problemas patológicos ocasionados por
bacterias y hongos que afectan los tubérculos semilla de papa variedad Diacol
capiro en Colombia, así como la severidad del problema.
4.2. ESPECÍFICOS
♣ Establecer escalas visuales de evaluación para severidad de las enfermedades
presentes en tubérculos-semilla y determinar el porcentaje de incidencia en la
población observada.
♣ Aplicar un procedimiento sencillo de evaluación de la infección latente de
bacterias y hongos mediante técnicas de laboratorio.
63
♣ Proponer un sistema de control de calidad en la producción de semilla de papa.
64
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. MATERIAL EXPERIMENTAL
• Tubérculos semilla de papa Solanum tuberosum spp. andigena, variedad Diacol
Capiro de las categorías: Básica, Registrada, Mejorada y Certificada.
• Raíces con agallas extraídas de la planta de papa.
Reconocimiento de los patógenos en el laboratorio
Se analizaron 23.400 muestras: 5400 a nivel de campo y 18.000 en bodegas.
Hot Box
120 muestras de minitubérculos-semilla categoría Super Élite procedentes de
Cundinamarca.
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ELISA (NCM)
408 muestras:160 de tubérculos-semilla Básica procedentes de Antioquia (Jordan)
y 248 de minitubérculos-semilla categoría Super Élite procedentes de
Cundinamarca.
5.2. MÉTODOS
5.2.1. TRATAMIENTO DE LOS TUBÉRCULOS SEMILLA DE PAPA
Los tubérculos semilla que llegan a las bodegas se someten a un proceso de
clasificación para separar los tubérculos que presentan daño mecánico,
descomposición, malformaciones, tamaños muy pequeños (llamados riche), etc,
para ser descartados; es importante anotar que las muestras se analizaron antes
de realizarse la clasificación. Los tubérculos seleccionados se vuelven a empacar
en sacos y son sometidos a tratamiento químico con ¨Vitavax¨ el cual protege los
tubérculos contra el daño de chizas, babosas y otros microorganismos
contaminantes; además se les aplica Baculovirus (Virus de la granulosis), es un
compuesto biológico que controla la polilla guatemalteca Tecia solanivora, se
utiliza en cantidades de 5gr por Kg de papa.
66
Después los sacos se almacenan en el cuarto frío a 6°C hasta que sea el tiempo
conveniente de comenzar la brotación; este método proporciona condiciones de
latencia con el fin de retardar el desarrollo de los brotes en las semilla (Potato
Research. 1990). Luego se sacan de allí y se trasladan a la bodega de brotación,
aquí permanen de uno a dos meses que es el tiempo sufiicente para que la semilla
haya brotado lo necesario para cuando sea el momento de ser sembrada.
5.2.2. RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS
Actualmente en Colombia no existe un método específico para realizar el proceso
de muestreo, por lo tanto se realizó uno con base en la metodología aplicada en la
República de Cuba.
En Campo
En cada uno de los cultivos de Cundinamarca, Boyacá y Nariño, el muestreo se
realizó recorriéndolos en zig-zag; en una hectárea a partir de una esquina se
escogieron 5 puntos al azar. De cada uno de los puntos se extrajeron las plantas
que se encuentran a lo largo de 3 m lineales de distancia. Se contaron el número
de plantas y tubérculos totales de cada punto, y el número de tubérculos que
presentaron sintomatología sospechosa de enfermedad se llevan para posterior
67
análisis de laboratorio. Algunos de los aspectos que se tomaron en cuenta para
tomar las muestras en campo fueron:
• Indispensable la observación de los síntomas generales de la planta completa,
para correlacionar los resultados tanto de parte aérea como de la parte
subterránea.
• Al extraer plantas enfermas, se observaron las plantas vecinas para relacionar
si hay diseminación del patógeno en ellas.
En bodega
En la recepción de los cargamentos de semilla de papa para almacenamiento, se
muestreó el 2% de los sacos que conformaban todo el lote, (antes de realizarse la
clasificación). Se contó el número total de tubérculos de cada saco y el número de
tubérculos con sintomatología sospechosa de cada enfermedad para llevar a
posterior análisis de laboratorio.
5.2.3. RECONOCIMIENTO DE LAS ENFERMEDADES
La evaluación e identificación de las enfermedades se llevó a cabo en dos etapas:
Primero, el reconocimiento visual o directo por medio de la observación de
68
síntomas con la utilización de las escalas visuales para calificar severidad y
segundo, la confirmación por medio del reconocimiento en el laboratorio.
5.2.3.1. Reconocimiento visual o directo
En campo: En los casos en que el cultivo no se encontraba en época próxima a
cosecha, se logró observar la sintomatología de la planta, siendo esto una
herramienta útil que facilitó evidenciar los problemas patológicos tanto en la parte
aérea como en los tubérculos. Estos se limpiaron totalmente retirando los excesos
de tierra para apreciar mejor los síntomas y se hicieron cortes transversales para
observar lesiones internas.
En bodegas: La evaluación de los tubérculos se hizo antes de realizar la
clasificación de la semilla. Se vaciaron totalmente los sacos sobre un costal y se
valoró visualmente uno por uno los tubérculos que conformaban la muestra. Se
hicieron cortes transversales para observar lesiones internas. Se contó el número
de tubérculos que presentaba cada una de las afecciones para calcular el
porcentaje de incidencia de cada enfermedad.
En ambos casos el estudio se basó en la observación de las muestras,
describiendo los signos y síntomas que éstos presentaban para caracterizar el tipo
de enfermedad. Para la evaluación y cuantificación se utilizaron documentos
ilustrados y principalmente las escalas de severidad para determinar el grado de
69
enfermedad; las escalas empleadas en este estudio, se aplicaron para evaluar las
enfermedades ocasionadas por Rhizoctonia solani y Spongospora subterranea;
para ésta última se creó una escala que no existía anteriormente y se introdujo
con la realización de este trabajo. (Anexo 7).
5.2.3.2. Reconocimiento en el laboratorio
Los análisis llevados a cabo para la identificación y confirmación de los agentes
etiológicos, se realizaron en el Laboratorio de División Sanidad Vegetal del ICA
Seccional Cundinamarca. El material recolectado se lavó con agua corriente y se
examinó al estereoscopio, con el fin de observar estructuras características del
patógeno y para seleccionar las partes del tejido más apropiadas para el
respectivo aislamiento. Para Rhizoctonia solani y Spongospora subterranea se
hicieron raspados y cortes muy finos del tejido afectado para hacer montajes
directos con azul de lactofenol para la posterior observación microscópica.
5.2.4. TÉCNICA DE AISLAMIENTO
Bacterias (Polo, C. 1997)
Las muestras se lavaron con agua corriente para retirar el exceso de suelo, se
hicieron cortes de tejido que incluyen material enfermo y sano, se sumergieron en
una solución jabonosa con agitación constante, se lavaron con agua destilada
70
estéril. A continuación los trozos se colocaron en un tubo con agua destilada
estéril y se agitaron para que la bacteria se homogenice en el líquido. Se tomó una
asada del inóculo, se hizo el aislamiento en agar nutritivo (Anexo 8) y se incubaron
a 22°C. Se realizaron observaciones a las 24, 48 y 72 horas.
Hongos (Polo, C. 1997)
Las muestras se lavaron con agua corriente para retirar el exceso de suelo, se
hicieron cortes de tejido que incluyen material enfermo y sano, se sumergieron en
una solución jabonosa con agitación constante, se lavaron con agua destilada
estéril. A continuación se pasaron por hipoclorito de sodio al 5% y luego se lavaron
dos veces con agua destilada estéril, se secaron sobre papel filtro estéril
previamente flameado al mechero; las herramientas empleadas se esterilizaron
frecuentemente. Por último se sembraron los trozos de tejido sobre la superficie
del Agar PDA (Anexo 9) y se incubaron a 22°C. Se realizaron observaciones a las
24, 48 y 72 horas.
Purificación de las colonias
Una vez observada la presencia de colonias se realizaron pases o repiques en
agar nutritivo y agar PDA, con el fin de obtener la purificación de las bacterias y
estimular la esporulación de los hongos respectivamente. Para las bacterias, en
71
ciertas ocasiones se realizaron diluciones del inóculo primario con el fin de obtener
una mayor purificación para verificar los bacilos gram-negativos.
Identificación de las colonias
Se observaron características macroscópicas de las colonias como: color,
aspecto, tipo de crecimiento, pigmentación del micelio, difusión de éste en el
medio, formación de estructuras reproductoras. A continuación se hicieron
observaciones microscópicas: en el caso de las bacterias, inmediatamente
después de la purificación se realizó coloración de Gram (Anexo 10) para
confirmar la presencia únicamente de bacilos Gram-negativos causantes de la
patología; y para los hongos se hicieron improntas con cinta transparente y
colorante azul de lactofenol para observar sus estructuras.
5.2.5. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
CATALASA (Schaad, N.W. 1988).
INOCULACIÓN: Se utilizaron cultivos jóvenes de 24-48 horas de crecimiento, se
tomó una colonia aislada y se colocó sobre unas gotas de peróxido de hidrógeno
(H2O2) al 3%, dispuesta en una lámina portaobjeto.
LECTURA: La reacción positiva se observó por la producción de burbujas.
72
OXIDASA (Schaad, N.W. 1988).
INOCULACIÓN: Se utilizó una cepa fresca con un crecimiento aproximado de 24
horas, se tomó una colonia aislada y se inoculó en la zona reactiva de la tira. Los
resultados falsos positivos pueden ser causados por el material del cual está
hecho el asa, por esto es conveniente usarlas desechables. Al cabo de 20 a 60
segundos se observó el color .
LECTURA: Comparar el resultado con la escala colorimétrica, si aparece un color
morado azuloso en la zona de inoculación indicó positivo y el color blanco - crema
indica negativo.
OXIDO / FERMENTACIÓN (O/F) (Koneman, E. 1983).
INOCULACIÓN: Se utilizó una cepa fresca con un crecimiento aproximado de 24
horas, se inocularon dos tubos por carbohidrato, Se cubrió uno de los tubos con 1
cm. de vaselina o parafina estéril, para crear condiciones de anaerobiosis. Se
incubó por 24 horas a 27 °C (Anexo 11).
LECTURA:
Reacción O
Tubo 1: Producción de ácido, color amarillo en el tubo sin parafina
Tubo 2: Color azul o verde en el tubo con parafina.
Positivo para Ralstonia.
73
Reacción F
Tubo 1 y 2: Producción de ácido, color amarillo en ambos.
Positivo para Erwinia.
Reacción negativa: Sin cambio en ninguno de los tubos.
PRODUCCIÓN DE INDOL (Concepción, S. 1981).
INOCULACIÓN: Se utilizó un cultivo joven de 24 horas de crecimiento y se sembró
e incubó a 35°C por 24 horas (Anexo 12).
LECTURA: Después del tiempo de incubación se agregó 1 ml del reactivo de
Kovac`s al tubo. Si se observa la producción de un anillo rojo en la superficie,
entonces demuestra un resultado positivo.
REDUCCIÓN DE COMPUESTOS A PARTIR DE SACAROSA (Concepción, S.
1981).
INOCULACIÓN: Se utilizó un cultivo joven de 24 horas de crecimiento y se sembró
en el caldo. Se incubó a 26 °C por 48 horas (Anexo 13).
LECTURA: Después del tiempo de incubación se agregó 1.5 ml del reactivo de
Benedict al tubo, se colocó en agua hirviendo y si al cabo de 10 minutos toma una
coloración amarillo lechoso, entonces evidencia el resultado positivo.
74
5.2.6. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD PARA IDENTIFICACIÓN DE Erwinia
El objetivo de esta prueba se basa en comprobar los postulados de Koch, los
cuales nos permiten establecer la relación causal entre el patógeno (Erwinia) y
una enfermedad específica (pata negra - pudrición blanda). Se busca confirmar
que los síntomas de la enfermedad presentes en los tubérculos enfermos de los
cuales se aisló inicialmente el patógeno, se manifiesten de igual manera en los
tubérculos inoculados (Garcés, E. 1996).
Se tomó un tubérculo sano de la misma variedad Diacol Capiro, se lavó con agua
jabonosa para remover residuos de suelo, se hizo una desinfección con hipoclorito
de sodio al 5%. Se cortaron varias rodajas del tubérculo y se hizo una pequeña
incisión con pinzas estériles en el centro de cada de ellas para inocular allí la
suspensión bacteriana, se colocaron en una cámara húmeda, Dicha suspensión
se obtuvo con una dilución 10º. Se incubó a 22°C por 48 a 72 horas y se observó
los síntomas de la pudrición causada por Erwinia. Enseguida se procedió a
realizar las respectivas bioquímicas (French, R.E. 1982).
75
5.2.7. MÉTODOS DE EVALUACIÓN PARA Ralstonia solanacearum
La marchitez bacteriana es una enfermedad de gran importancia en Colombia y es
por esta razón que se hizo necesario la aplicación de dos métodos de evaluación
para este patógeno: El Hot Box y el ELISA (NCM).
5.2.7.1. HOT BOX (Caja Caliente) (Lago, L. 1999).
Es un sistema de monitoreo de la semilla en el cual se pretendió crear una
situación anormal de almacenamiento para que aparecieran las patologías
causadas por Ralstonia solanacearum, se determinó el porcentaje de infección
latente que puede tener la semilla producida. Consistió en un cuarto oscuro de
30°C de temperatura con estantes que contienen pequeñas cajas plásticas sin
orificios para evitar contaminación de una muestra a la otra; en ellas se
depositaron las muestras. Se tomaron 20 tubérculos-semilla de cada lote de
Semilla Super Élite y se colocaron separadamente cada uno para evitar contacto
entre ellos. Después de 3 a 5 días se observaron las muestras. Si se observa que
los tubérculos han estallado indica resultado positivo para Ralstonia.
76
5.2.7.2. PRUEBA INMUNOENZIMÁTICA EN MEMBRANA NITROCELULOSA
ELISA-NCM PARA LA DETECCIÓN DE Ralstonia Solanacearum EN PAPA
(Priou, S. 1997).
El ELISA (NCM) es una prueba inmunoenzimática en la que se utilizaron
membranas de nitrocelulosa en lugar de placas de microtitulación como soporte
para las muestras y reactivos empleados. La realización de esta prueba es un
proceso esencial para el monitoreo de Ralstonia en tubérculos para certificación
de semilla y evaluación para la resistencia a la marchitez bacteriana.
Procedimiento:
1. Se colocó una pequeña cantidad de extracto del tubérculo (20µl) sobre la
membrana de nitrocelulosa (dot - blotting).
2. Se bloqueó el área de la membrana donde no están colocadas las muestras (1
hora de incubación).
3. Se añadió los anticuerpos de conejo específicos de Ralstonia solanacearum
(Rs). ( 2 horas de incubación).
4. Se añadió los anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados (=GAR-IgG
conjugado). (1 hora de incubación).
5. Se añadió el sustrato que reacciona con las enzimas y produce una reacción de
coloración ( de 5 a 20 min.) (Anexo 14).
77
Estos pasos se realizaron a temperatura ambiente. Antes de efectuar la prueba
ELISA-NCM se realizará un proceso de enriquecimiento incubando (48 hrs) los
extractos del tubérculo en un caldo semi-selectivo (SMSA modificado), esto
aumenta la sensibilidad.
Interpretación de resultados: La reacción enzimática produce una coloración
púrpura en las muestras positivas, las cuales varían en intensidad de claro a
oscuro según la concentración de Ralstonia en las muestras. Por consiguiente, el
control positivo (106 bact/ml) sería morado oscuro y el control diluido (108 bact/ml)
sería morado claro. Sólo las muestras de color morado oscuro de la misma
intensidad que los controles positivos (106 y 107 bact/ml) se consideran infectadas
con Ralstonia. la intensidad de la coloración es proporcional a la concentración de
bacterias.
Figura 11. Desarrollo de la coloración del ELISA (NCM).
78
5.2.8. ANÁLISIS DE LOS DATOS
Este es un estudio de tipo descriptivo y los datos se obtuvieron realizando un
muestreo al azar. El análisis estadístico aplicado en todos los resultados, se
obtuvo calculando la tasa de prevalencia expresada en porcentaje, de cada
enfermedad según la zona geográfica de procedencia y la categoría de la semilla.
79
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LAS PATÓGENOS EN EL
LABORATORIO
Con la realización de este estudio y mediante el diagnóstico visual y confirmatorio
en el laboratorio, se evidenció la presencia de los siguientes patógenos: Erwinia
carotovora var. atroseptica, E. carotovora var. carotovora y E. chrysantemi,
Rhizoctonia solani, Spongospora subteranea, Fusarium spp., F. oxysporum, F.
avenaceaum y Geotrichum spp., en los tubérculos-semilla de papa Solanum
tuberosum, variedad Diacol Capiro de los departamentos de Cundinamarca,
Boyacá, Antioquia y Nariño; demostrando así que el cultivo de la papa es afectado
por una gran cantidad de patógenos, entre otros naturales.
6.1.1. BACTERIAS
Pierna negra. Erwinia carotovora var. atroseptica. Eca. (Van Hall) Dye.
Pudrición blanda. Erwinia carotovora var.carotovora. Ecc.
Erwinia chrysantemi. Echr.
80
Descripción macroscópica
Las bacterias crecieron en agar nutritivo a 22°C a las 24 horas. Las colonias eran
pequeñas, cremosas, color blanco crema, casi translúcidas.
Figura 12 . Colonias de Erwnia.
Observación microscópica
Al realizar la coloración de Gram (Anexo 10) se observaron bacilos Gram-
negativos rectos pequeños.
Figura 13. Coloración de Gram de Erwinia
81
Pruebas de patogenicidad
Se realizaron pruebas de patogenicidad en Eca y Ecc para confirmar
sintomatología y se obtuvieron resultados positivos en ambos casos. Luego se
procedió a realizar las respectivas pruebas bioquímicas.
Figura 14. Prueba de patogenicidad en rodajas de papa
Pruebas bioquímicas de las bacterias
Los siguientes son los resultados obtenidos de las respectivas pruebas
bioquímicas aplicadas a las bacterias Eca, Ecc, Echr:
Tabla 8. Resultados pruebas bioquímicas para bacterias
PRUEBA Eca Ecc Echr Catalasa + + + Oxidasa - - - O/F F F F Producción de Indol - - + Reducción de comp. a partir de sacarosa
+ - -
82
Sarna común. Streptomyces scabies. (Thaxter).
Al tomar las muestras en el cultivo de papa, por medio del reconocimiento visual,
se observaron los síntomas característicos de Streptomyces, pero al procesar las
mismas en el laboratorio no se obtuvo el aislamiento de este microorganismo.
Debido a que comúnmente los síntomas son confundidos con: fisuras causadas
por Rhizoctonia solani, o por problemas fisiológicos cuando en el cultivo se
presentan épocas de sequía y son seguidas por una lluvia intensa formando
agrietaduras; además de las lesiones similares causadas por nemátodos
(Asscheman, E. 1996). Por esta razón es importante e indispensable la realización
de análisis confirmatorios de los resultados, por medio de los aislamientos de los
microorganismos en el laboratorio.
6.1.2. HONGOS
Costra negra. Rhizoctonia solani. (Kühn).
Descripción macroscópica
Creció lentamente a los 6 días, formó un micelio poco algodonoso de color canela
a castaño oscuro, adherido al medio, de crecimiento radial. Se observaron
esclerocios pequeños de color café oscuro en medio del micelio.
83
Figura 15. Rhizoctonia solani en agar PDA
Observación microscópica
Es un hongo de micelio estéril por tener esporas ausentes las hifas eran gruesas,
septadas, fusionadas. Las principales características fueron: sus ramificaciones en
ángulo recto, constricciones en el punto de origen de la ramificación de la hifa,
formación de una septa en la rama cerca de su origen (Barnett, H.L. 1972).
Figura 16. Hifas de Rhizoctonia solani.
84
Roña polvosa. Spongospora subterranea.(Wallr).
Observación microscópica
Al hacer el raspado de las agallas de las raíces, se encontraron masas de esporas
llamadas quistosoros, eran ovoides, irregulares o alargados, constituidos por un
conglomerado de esporas (quistes) de descanso fuertemente aglutinadas entre si.
La espora individual es poliédrica, delgada, color castaño amarillenta.
Figura 17. Quistosoros de Spongospora subterranea.
Pudrición seca. Fusarium spp., F. oxysporum, F. avenaceum (Mart)
Descripción macroscópica
• Fusarium spp.: Comenzó a crecer rápidamente de 1 a 2 días. Con micelio aéreo
poco extenso y muy algodonoso, de color blanco totalmente, no produce
pigmento difusible alguno.
85
Figura 18 . Fusarium spp. En PDA.
• Fusarium oxysporum: Creció rápidamente de 2 a 3 días. Con micelio aéreo
extenso y algodonoso. La superficie del medio inicialmente era sólo de color
blanco (la mayor parte), pero conforme maduraba se observó color rosa pálido -
lila. En el reverso de la caja se observó el pigmento difusible púrpura oscuro.
Figura 19. Fusarium oxysporum en agar PDA.
• Fusarium avenaceum: Creció rápidamente de 2 a 3 días. El micelio aéreo es
denso y algodonoso. Inicialmente era solo de color blanco y a medida que va
creciendo toma color rojo carmín y/o café oscuro, producto del pigmento que se
86
difunde por debajo del medio; por encima de éste el color se observó más
tenue.
Figura 20. Fusarium avenaceum en PDA.
Observación microscópica
• Fusarium spp.: Produce esporas asexuales que se forman en esporodoquios,
incluye macro y microconidias levemente encorvadas y con extremos más o
menos puntiagudos.
Figura 21. Conidias de Fusarium spp.
87
• Fusarium oxysporum: Las microconidias son cortas, abundantes, generalmente
de una célula simple, ovaladas o en forma arriñonada, nacen en cabezas
falsas. Las macroconidias tienen generalmente 3 septas, son abundantes,
ligeramente curvas, de pared delgada y delicada, con una célula basal o apical
en forma de pezuña. Las monofiálides de donde salen las microconidias son
cortas, ramificadas y algunas no ramificadas. La principal característica es que
produce clamidosporas, son de pared gruesa y formadas por una o dos
células, son y se forman en la parte terminal del micelio más viejo.
Figura 22. Clamidosporas de Fusarium oxysporum.
• Fusarium avenaceum: Las microconidias son generalmente escasas. Las
macroconidias tienen de 3 a 5 septas, son muy largas, delgadas, con la pared
delgada, con una célula apical que se elonga y también pueden ser
encorvadas. La célula basal tiene forma de pezuña. Tiene monofiálides
ramificadas y no ramificadas. No produce clamidosporas.
88
Figura 23. Macroconidias de Fusarium avenaceum (Hooker, H.L. 1980).
La observación e identificación de las especies de Fusarium se realizaron con
base en los libros (Nelson, P.E. 1981), (Singleton, L.D. 1992).
Geotrichum spp. Pudrición gomosa.
Descripción macroscópica
Creció rápidamente de 2 a 3 días. Forma una colonia color blanco, grande
redondeada que crece de forma muy adherida sobre el medio, su consistencia es
polvosa y no filamentosa como los demás hongos.
Figura 24. Geotrichum spp. En Agar PDA.
89
Observación microscópica
El micelio es septado, conidióforos ausentes. Las colonias llamadas artrosporas
son hialinas, cortas, cilíndricas y con las terminaciones cerradas formadas por la
segmentación de las hifas (Barnett, H.L. 1972).
Figura 25. Geotrichum spp. Observación microscópica.
6.2. EVALUACIÓN DE ENFERMEDADES MEDIANTE LAS ESCALAS DE
SEVERIDAD
6.2.1. GRADOS DE SEVERIDAD DE LAS ESCALAS VISUALES SEGÚN LA
DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA
90
De las 23.400 muestras evaluadas tanto a nivel de campo como en condiciones de
almacenamiento, se encontraron 561 con Costra negra que equivale a un 23.9%
de incidencia, con los siguientes grados de severidad:
Tabla 9. Grado de severidad para la escala de Rhizoctonia solani:
DEPARTAMENTO GRADO 1
GRADO 2
GRADO 3
+ T.P. % + T.P. % + T.P. % Cundinamarca 21 9 0.9% 0 0 0 0 0 0 Boyacá 383 164 16.4
% 157 67 6.7% 0 0 0
Antioquia 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Nariño 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Según la tabla 9 se observa que el mayor porcentaje de severidad de Costra
negra fue en Boyacá del grado 1 con un 16.4% sobre el total de la incidencia
(Gráfica 1). El grado 1 es el máximo grado de tolerancia en el que puede
sembrarse los tubérculos con fin de semilla, aunque no es lo más óptimo, ya que
por pocos que sean la cantidad de esclerocios presentes en los tubérculos, esto
contribuye al establecimiento del patógeno; de todas formas el grado de severidad
fue bajo ya que la mayoría de las muestras presentaron grado 1.
De las 23.400 muestras evaluadas tanto a nivel de campo como en condiciones de
almacenamiento, se encontraron 11 muestras con Roña polvosa que equivale al
0.5% de incidencia, con los siguientes grados de severidad:
T
91
abla 10. Grado de severidad para la escala de Spongospora subterranea. DEPARTAMENTO GRADO
1 GRADO
2 GRADO
3
+ T.P. % + T.P. % + T.P. % Cundinamarca 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Boyacá 0 0 0 9 4 0.4% 0 0 0 Antioquia 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Nariño 2 0.8 0.08% 0 0 0 0 0 0 En la tabla 10 se encontró que en Boyacá el grado 2 fue el que mostró mayor
porcentaje de severidad de la Roña polvosa con un 0.4% (Gráfica 2), lo cual es
debido seguramente a que los cultivos muestreados se encontraban próximos a
época de cosecha, y las agallas maduras de las raíces ya se habían desintegrado
fácilmente, liberando los quistosoros del patógeno en el suelo y por ende se
evidenció fuertemente la aparición de las verrugas en los tubérculos.
6.2.2. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES SEGÚN LA DISTRIBUCIÓN
GEOGRÁFICA
EN CAMPO
El total de muestras evaluadas fue de 5.400, distribuidas así:
CUNDINAMARCA: 2.700 muestras.
Tabla 11. Incidencia de las enfermedades en campo en Cundinamarca ENFERMEDAD CASOS
POSITIVOS TASA
PREVALENCIA PORCENTAJE
Pata negra 1 0.4 0.04% Pudrición blanda 0 0 0% Pudrición seca 3 1 0.1% Costra negra 21 8 0.8% Roña polvosa 0 0 0% Pudrición gomosa 0 0 0%
92
BOYACÁ: 1.800 muestras. Tabla 12. Incidencia de las enfermedades en campo en Boyacá
ENFERMEDAD CASOS POSITIVOS
TASA PREVALENCIA
PORCENTAJE
Pata negra 0 0 0% Pudrición blanda 0 0 0% Pudrición seca 0 0 0% Costra negra 33 18 1.8% Roña polvosa 9 5 0.5% Pudrición gomosa 0 0 0% NARIÑO: 900 muestras. Tabla 13. Incidencia de las enfermedades en campo en Nariño
ENFERMEDAD CASOS POSITIVOS
TASA PREVALENCIA
PORCENTAJE
Pata negra 27 3 0.3% Pudrición blanda 0 0 0% Pudrición seca 0 0 0% Costra negra 0 0 0% Roña polvosa 2 0.2 0.02% Pudrición gomosa 0 0 0% En este trabajo se hace mayor énfasis en los resultados obtenidos a nivel de
campo, puesto que la semilla es el principal material de propagación del cultivo y
por ende, es necesario conocer las condiciones en que ésta se produce, para
evitar la transmisión y diseminación de enfermedades. Sin embargo es importante
tener en cuenta la incidencia de las enfermedades en las bodegas de semilla, ya
que en el almacenamiento se pueden presentar patógenos que posteriormente
ocasionan problemas en los suelos cuando se siembra la semilla en estas
condiciones.
El microorganismo que presentó mayor incidencia en los tubérculos-semilla
analizados a nivel de campo fue Rhizoctonia solani, debido a que esta variedad
93
de papa presenta susceptibilidad hacia este hongo fitopatógeno. De acuerdo al
análisis de incidencia de Costra negra, se encontró que el mayor porcentaje se
presentó en Boyacá con un 1.8% (Gráfica 4). Este microorganismo puede estar
presente en el suelo dado que es un habitante natural de allí. Los resultados
indican que este agente causal se estableció con mayor incidencia en este
departamento, probablemente debido a que en los suelos de esta zona, el hongo
pudo haber permanecido en el suelo en forma de esclerocios, los cuales al
sembrar en el cultivo, germinan e invaden a través de las heridas; luego se
desarrollan nuevos esclerocios en los tubérculos formados y este hongo se ve
favorecido por siembras sucesivas de papa con el uso de semilla contaminada,
con lo cual se incrementa significativamente el inóculo en el suelo (Alvarado, L.F.
1998). Es importante señalar que esta enfermedad es un problema en Colombia
por el tipo de suelo y su incremento puede afectar la brotación de los tubérculos.
Entre los factores que afectan el crecimiento y desarrollo de los tubérculos están:
la temperatura, humedad y el tipo de suelo; estas condiciones fueron tomadas en
cuenta al momento de tomar las muestras en los cultivos. La incidencia de Pata
negra (Eca) sólo se presentó en condiciones de campo y obtuvo el mayor
porcentaje en Nariño con un 0.3% (Gráfica 5). Este cultivo presentaba un suelo
arcilloso, el cual posee mayor capacidad de retención de humedad, además no
presentaba un buen drenaje; esto confirma por qué cuando en un suelo hay
exceso de agua, las lenticelas de los tubérculos se abren exageradamente y dan
94
origen a la entrada de agentes patógenos, especialmente de bacterias (López,
C.A. 1993). Los mejores suelos empleados para cultivar son los francos, franco-
arenosos, bien drenados y con alto contenido de materia orgánica.
A nivel de campo no se presentó Pudrición blanda (Ecc - Echr), debido a que
Ecc difiere principalmente de Eca porque esta última principalmente se evidencia
con más frecuencia en los cultivos y la primera en condiciones de
almacenamiento; un deficiente almacenamiento de la semilla, como la falta de
maduración de los tubérculos, presencia de heridas, condiciones de alta humedad,
falta de luz indirecta y de oxígeno, favorecen la incidencia de esta enfermedad en
los tubérculos (Guerrero, O. 1997).
La mayor incidencia de Roña polvosa causada por Spongospora subterranea
en condiciones de campo se encontró en Boyacá con un 0.5% (Gráfica 4). La
incidencia varía entre los cultivos debido probablemente a las condiciones de
temperatura y precipitación durante el desarrollo de los cultivos de papa, que
determinan el período de susceptibilildad de las plantas a la roña y las condiciones
del suelo favorables para el desarrollo de la enfermedad (Guerrero, O. 1997).
Según un estudio en campo realizado por Guerrero, O. (2000), se observó que los
mejores estados para analizar y evaluar la presencia de la roña en el cultivo son
floración, posfloración y maduración, ya que en estas épocas se obtuvieron los
95
mayores porcentajes de infección del hongo en las raíces de las plantas. Las
muestras de raíces con Roña evaluadas en uno de los cultivos de Boyacá, fueron
tomadas en época de maduración del cultivo, (aproximadamente a las 18
semanas) esto permitió observar la presencia de agallas. El hecho de que la
planta infectada no presente síntomas en el follaje, hace que este patógeno se
esté diseminando en forma no perceptible a nuevos campos productores, adicional
a ello el problema de que este patógeno es un parásito obligado y necesita de
condiciones in vivo (especialmente el suelo), para sobrevivir.
En el departamento de Nariño sólo se encontraron las enfermedades Pata negra y
Roña polvosa con un porcentaje de incidencia de 0.3% y 0.02% respectivamente
(Gráfica 5), lo cual indica que tal vez por la ubicación del cultivo, la altitud, la
temperatura, entre otros aspectos, otras etiologías no presentan índices de
enfermedad como en algunos lugares muestreados.
EN BODEGAS DE SEMILLA
El total de muestras evaluadas fue de 18.000, distribuidas así:
BOYACÁ: 12.000 muestras.
Tabla 14. Incidencia de las enfermedades en bodega en Boyacá ENFERMEDAD CASOS
POSITIVOS TASA
PREVALENCIA PORCENTAJE
Pata negra 0 0 0% Pudrición blanda 42 35 3.5% Pudrición seca 217 181 18.1% Costra negra 507 422 42.2%
96
Roña polvosa 9 7 0.7% Pudrición gomosa 0 0 0%
ANTIOQUIA: 6.000 muestras.
Tabla 15. Incidencia de las enfermedades en bodega en Antioquia ENFERMEDAD CASOS
POSITIVOS TASA
PREVALENCIA PORCENTAJE
Pata negra 0 0 0% Pudrición blanda 35 6 0.6% Pudrición seca 137 23 2.3% Costra negra 0 0 0% Roña polvosa 0 0 0% Pudrición gomosa 7 1 0.1% Según los resultados obtenidos de las muestras tomadas en bodega, se observó
que Fusarium spp. fue el patógeno más frecuente en condiciones de
almacenamiento, aunque ello también depende de las condiciones climáticas. Este
hongo es el principal patógeno que afecta los tubérculos en condiciones de
almacenamiento (Asscheman, 1996). La mayor incidencia se encontró en Boyacá
con un 18.1% (Gráfica 6).
Según Beukema, H.P.(1979), bajo condiciones de clima de páramo, los tubérculos
de algunas variedades provenientes de Solanum tuberosum se deterioran más
fácilmente en el almacenamiento. Las pérdidas que sufre la semilla durante el
almacenamiento se relacionan con la pérdidad de peso y la calidad de la misma,
entre la cosecha y el momento en que los brotes alcanzan su estado óptimo para
la siembra; los tubérculos se infectan durante el almacenamiento a través de
heridas causadas por daños mecánicos o por golpes, por esta razón es importante
97
separar los tubérculos que estén cortados y no emplearlos con fines de semilla. La
pudrición seca es uno de los principales problemas que afecta los tubérculos en
el almacenamiento, por eso es indispensable aislar los tubérculos infectados de
los sanos, ya que al igual que en el caso de la pudrición gomosa, también
participan otros patógenos como Erwinia que aumentan la severidad del daño.
El porcentaje de incidencia más alto de todo el estudio fue de Costra negra, se
presentó en condiciones de almacenamiento en Boyacá con un 42.2% (Gráfica 6).
El período de almacenamiento generalmente es mayor al del tubérculo a nivel de
campo, quedando de esta forma más tiempo expuesto a la acción del patógeno y
permitiéndose el desarrollo de otros microorganismos en estas condiciones
(Zapata, J.L. 1999).
La Pudrición blanda (Ecc) se presentó únicamente en condiciones de bodega y
su mayor nivel de incidencia se observó en el Departamento de Boyacá con un
3.5% (Gráfica 6). A pesar de ello sus principales síntomas se ven expresados en
condiciones de almacenamiento y bajo estas circunstancias generalmente los
niveles de daño son superiores allí que los de campo, debido a que en las
bodegas la bacteria encuentra condiciones más favorables para su multiplicación y
no está expuesta a factores naturales en el cultivo que limitan su crecimiento
(López, C. 1993).
98
El departamento de Boyacá arrojó la mayor incidencia de Roña polvosa con un
0.7% (Gráfica 6), según los muestreos realizados a lo largo del estudio se logró
observar que esta zona es de las que actualmente presenta los más altos niveles
de incidencia de esta enfermedad probablemente debido a la presencia latente de
este microorganismo en los suelos de determinados cultivos.
La mayoría de los patógenos que afectaron los tubérculos, se hallan naturalmente
en el suelo donde quiera que se cultive papa. Según Alvarado, L.F.(1998) la
contaminación de los suelos con microorganismos patógenos se vuelve un
problema endémico con el hecho de sembrar en el mismo lote cultivos sucesivos,
contribuyendo así al establecimiento de enfermedades hasta convertirlos en
habitantes naturales de una finca o región. Este es el caso principalmente de
Geotrichum spp., él es microorganismo común del suelo y es un patógeno débil
secundario que en condiciones de almacenamiento puede interactuar tanto con
Fusarium como con Erwinia y producir problemas de pudriciones mayores; lo cual
explica por qué este hongo se obtuvo únicamente en las muestras tomadas en
bodegas en Antioquia con una incidencia del 0.1% (Gráfica 7).
6.2.3. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES SEGÚN LA CATEGORÍA DE LA
SEMILLA
99
EN CAMPO
El total de muestras evaluadas fue de 5.400, distribuidas así:
CUNDINAMARCA: 2.700 muestras.
Tabla 16. Incidencia de las enfermedades en campo en Cundinamarca. Municipio Categoría Pata
negra P. blanda
P. seca Costra negra
Roña polvosa
P. gomosa
Calera Certificada 0.04% 0 0.1% 0 0 0 Chocontá Certificada 0 0 0 0.8% 0 0 Chocontá Registrada 0 0 0 0 0 0 BOYACÁ: 1.800 muestras. Tabla 17. Incidencia de las enfermedades en campo en Boyacá. Municipio Categoría Pata
negra P. blanda
P. seca
Costra negra
Roña polvosa
P. gomosa
Ventaquemada Básica 0 0 0 1% 0 0 Ventaquemada Registrada 0 0 0 0.8% 0.5% 0 NARIÑO: 900 muestras. Tabla 18. Incidencia de las enfermedades en campo en Nariño. Municipio Categoría Pata
negra P. blanda
P. seca
Costra negra
Roña polvosa
P. gomosa
Pasto Certificada 0.3% 0 0 0 0.02% 0
EN BODEGAS DE SEMILLA
El total de muestras evaluadas fue de 18.000, distribuidas así:
BOYACÁ: 12.000 muestras.
Tabla 19. Incidencia de las enfermedades en bodega en Boyacá. Municipio Categoría Pata
negra P. blanda
P. seca
Costra negra
Roña polvosa
P. gomosa
Ventaquemada Mejorada 0 0.2% 8.4% 8.2% 0 0 Umbita Certificada 0 3.3% 0 4.9% 0 0 Paipa Mejorada 0 0 6% 18.4% 0 0 Tunja Mejorada 0 0 3.7% 10.7% 0.7% 0
100
ANTIOQUIA: 6.000 muestras.
Tabla 20. Incidencia de las enfermedades en bodega en Antioquia. Municipio Categoría Pata
negra P. blanda
P. seca Costra negra
Roña polvosa
P. gomosa
Jordan Básica 0 0.6% 2.3% 0 0 0.1%
Aún cuando la evaluación de la incidencia por categorías de semilla no fue un
objetivo de este estudio, observaciones realizadas reflejan que la categoría
Mejorada en el departamento de Boyacá, fue la que presentó mayor
susceptibilidad a la mayoría de las enfermedades; principalmente para Costra
negra demostrando el mayor porcentaje con un 18.4%. Los lotes sembrados con
semilla mejorada no se encuentran inscritos o bajo vigilancia del ICA, sin embargo
pueden venderse entre agricultores, pero no en puntos de venta, donde solo se
debe vender semilla Certificada, esto no quiere decir que este tipo de semilla no
sea en muchos casos de buena calidad.
Boyacá demostró ser el departamento más afectado por la mayoría de las
enfermedades, probablemente debido al bajo uso de semilla Certificada; esto se
atribuye a que muchas zonas productoras particularmente Nariño y Boyacá,
presentan condiciones ideales para la auto producción de semillas aparentemente
buenas, pues buena parte de los cultivos están ubicados por encima de los 3000
msnm lo cual les permite obtener semilla de características relativamente buenas
debido al clima. Sin embargo en este estudió se demostró que la semilla
sembrada con fines de Certificada, también presenta problemas patológicos que
101
seguramente fueron adquiridos en los suelos cultivados. El departamento de
Boyacá es uno de los más grandes productores de papa en Colombia, esto es
importante tenerlo en cuenta ya que de esta región se evaluó el mayor número de
muestras y por ende los porcentajes de incidencia son más altos.
Para la categoría Básica, el mayor porcentaje de incidencia lo obtuvo la
enfermedad Pudrición seca en Antioquia con el 2.3%, este departamento es el
mayor productor de semilla Básica del país y como esta categoría proviene de la
pre-básica, es probable que las enfermedades presentes provengan de la semilla.
6.3. EVALUACIÓN DE Ralstonia solanacearum
HOT BOX
De las 120 muestras de minitubérculos evaluados, se observó que después de 5
días a 30°C no presentaron cambio alguno. No se encontró ninguno positivo.
ELISA (NCM)
De las 408 muestras sometidas a esta prueba, todas arrojaron resultados
negativos para Marchitez bacteriana.
Los resultados negativos obtenidos en las dos pruebas realizadas para el
diagnóstico de esta bacteria (Hot Box y ELISA), demuestran que el nive l de
102
incidencia en de esta enfermedad es nulo en los cultivos evaluados; prueba de ello
se confirma en que este patógeno tampoco fue aislado en el laboratorio. Es
importante tener en cuenta que la Marchitez bacteriana es una de las principales
enfermedades reportadas en Colombia y es por esta razón que deben aplicarse
pruebas adicionales comparado con los demás patógenos, sin embargo en este
estudio no se encontró esta enfermedad.
6.4. APORTES DE LA TESIS A McCAIN ANDINA
VISITA DE SUPERVISIÓN A NARIÑO
Gracias al trabajo que se venía realizando en la empresa, como un aporte técnico,
surgió la necesidad de realizar una visita de supervisión a los cultivos de semilla
principalmente y a los cultivos comerciales ubicados en el departamento de Nariño
en las zonas de Río Bobo, El encanto, Pupiales. El principal motivo de este aporte
fue informar sobre el estado fitosanitario en el que se encuentraba un cultivo de
semilla Certificada, localizado en Pasto (Río Bobo); el cual presentaba una gran
incidencia de Pata negra causada por Erwinia carotovora var. atroseptica. Por tal
razón se tomaron muestras de tubérculos de las plantas afectadas para realizar el
posterior análisis de laboratorio.
Allí mismo se realizó una entrevista con el Dr. Omar Guerrero en ICA Pasto con el
objetivo de suministrarme asesoría sobre el tema de la Roña polvosa causada por
Spongospora subterranea. Se conoció la metodología empleada en el laboratorio
103
de Sanidad Vegetal de ICA Pasto para el diagnóstico de las muestras con roña
polvosa y así mismo se determinó que dicho organismo es difícil ser aislado de
tubérculos de papa, por ello la forma mas empleada para hacerlo es de las agallas
de las raíces; tal procedimiento ya fue establecido en las evaluaciones de plantas
infectadas.
104
7. CONCLUSIONES
• Con la realización de este estudio se reportó en la variedad Diacol capiro, la
presencia de las siguientes enfermedades: Pata negra causada por Erwinia
carotovora var. atroseptica, pudrición blanda por E. carotovora var. carotovora y
E. chrysantemi, Costra negra por Rhizoctonia solani, Roña polvosa por
Spongospora subterranea, Pudrición seca por Fusarium spp., F.oxysporum y
F.avenaceum y Pudrción gomosa por Geotrichum spp.
• Mediante las escalas se determinó la severidad de Rhizoctonia solani y
Spongospora subterránea. El primero presentó el mayor porcentaje en el
departamento de Boyacá del grado 1 con un 16.4% (Gráfica 1) y el segundo en
Boyacá del Grado 2 con un 0.4% (Gráfica 2).
• El microorganismo que presentó los mayores porcentajes de incidencia del
estudio, fué Rhizoctonia solani, principalmente en las 12.000 muestras tomadas
105
en bodega provenientes del Departamento de Boyacá se observó un 42.2% de
incidencia (Gráfica 6).
• El porcentaje de incidencia más alto en condiciones de campo fue de Costra
negra en Boyacá con un 1.8% (Gráfica 4) y en condiciones de bodega fue de
Costra negra en Boyacá con un 42.2%. (Gráfica 6).
• La categoría Mejorada en el departamento de Boyacá, fue la que presentó
mayor susceptibilidad a la mayoría de las enfermedades, en condiciones de
almacenamiento; principalmente para Costra negra demostrando el mayor
porcentaje con un 18.4% sobre 12.000 muestras tomadas en este
departamento.
• Con la evaluación de las muestras tomadas en las bodegas se concluyó que al
igual que Rhizoctonia solani, Fusarium spp. fue el microorganismo más
frecuente en ellas, puesto que este hongo es el principal patógeno que afecta
los tubérculos en condiciones de almacenamiento.
• No se reconoció la presencia de la enfermedad Marchitez bacteriana o
Dormidera en los cultivos seleccionados ni en la semilla almacenada en las
bodegas.
106
• Finalmente con este proyecto se inició la aplicación de un sistema de control de
calidad en la producción de semilla de papa, ya que este aporte beneficia de
gran manera la economía de la industria papera.
107
8. RECOMENDACIONES
• Es indispensable organizar un historial de la semilla sembrada en cada uno de
los cultivos, que permita conocer la procedencia de la misma, las condiciones
en las cuales se produjo y el estado fitosanitario del cultivo. Esto con el fin de
detectar el origen del problema patológico y poder concluir si la enfermedad se
transmitió de un cultivo al otro por la semilla o se encontraba allí como habitante
del suelo en forma de estructuras reproductivas.
• Diseñar e implementar el uso de claves para facilitar la identificación de las
enfermedades bacterianas, fungosas y virosas en el campo, observando la
sintomatología de las plantas y los tubérculos en el cultivo.
• En el análisis de muestras con Spongospora subterranea se debe aplicar un
diagnóstico microbiológico del suelo, adicional a ello surge la necesidad de
realizar pruebas de patogenicidad y bioensayos inoculando el suelo de las
108
plantas para confirmar la observación de los síntomas causados por este
hongo.
• Implementar y aplicar el uso de la escala de severidad de Spongospora
subterranea diseñada en este trabajo como un medio de soporte para la
evaluación de la Roña polvosa.
• Como Rhizoctonia solani fue el hongo que demostró mayor prevalencia en este
estudio, sería importante llevar cabo la aplicación en campo de un tratamiento
biocontrolador por medio de cepas antagónicas de Trichoderma. Con ello se
obtienen elevados porcentajes de brotes de papa libres de Rhizoctonia y
porcentajes bajos de tubérculos afectados por este patógeno cuando el suelo
se trata con dicho hongo (Avila, C.1994).
• Para la metodología de la Prueba de ELISA en la detección de Ralstonia
solanacearum, se recomienda realizar el aislamiento y evaluación del patógeno
a partir de muestras de suelo naturalmente infestadas, ya que esta bacteria
puede permanecer allí latente. La prueba de ELISA tipo sandwich usando
anticuerpos dobles (ELISA - DAS) con un proceso de post-enriquecimiento,
demuestra ser una técnica de detección apropiada para ello (Priou, S. 1999).
109
• Se recomienda diseñar un modelo de manejo integrado que incluya el control
cultural, genético (razas resistentes), biológico y químico, el cual esté basado
en un perfecto entendimiento del ecosistema de los patógenos del suelo, con el
objetivo de crear las bases de un programa de manejo de las enfermedades.
110
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Rionegro; 1999: 27p.
115
ANEXO 1. CICLO DE VIDA DE Erwinia
(Agrios, G. 1996).
116
ANEXO 2. CICLO DE VIDA DE Rhizoctonia solani
(Agrios, G. 1996).
117
ANEXO 3. CICLO DE DE VIDA DE Spongospora subterranea
(Hooker, W.J. 1980).
118
ANEXO 4. CICLO DE VIDA Fusarium oxysporum
(Agrios, G. 1996).
119
ANEXO 5. MAPA DE ZONAS PRODUCTORAS DE PAPA EN COLOMBIA
FEDEPAPA, 2000.
120
ANEXO 6. ESCALA DE SEVERIDAD PARA Rhizoctonia solani
Grado 1 Grado 2 Grado 3
121
ANEXO 7. ESCALA DE SEVERIDAD DESpongospora subterranea
Grado 1
Grado 2
Grado 3
122
ANEXO 8. AGAR PDA
COMPOSICIÓN gr/ml
Papa picada 25 gr
Agar - Agar 2.0 gr
Glucosa 2.0 gr
Agua destilada 100 ml
PREPARACIÓN:
Se cocina la papa en agua destilada hasta la liberación total del almidón, luego se
filtra para eliminar los residuos de papa, se lleva a 100 ml de agua y se adiciona
agar - agar y la glucosa; se calienta para homogenizar los componentes, y se
autoclava a 15 libras durante 2 horas.
Para obtener un mejor crecimiento de los hongos y evitar la contaminación de
bacterias se agrega una gota de ácido láctico a la preparación.
123
ANEXO 9. AGAR NUTRITIVO
COMPOSICIÓN:
Peptona de carne 5gr
Extracto de carne 3gr
Agar-agar 12gr
PREPARACIÓN:
Disolver 20 gr/L y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121 ºC. Las placas con
medio de cultivo preparado son claras e incoloras hasta con una tonalidad
amarillenta.
124
ANEXO 10. COLORACIÓN DE GRAM
COMPOSICIÓN:
SOLUCIÓN DE OXALATO DE AMONIO - CRISTAL VIOLETA
Solución A:
Cristal violeta 2 gr
Alcohol etílico (95%) 20 ml
Solución B:
Oxalato de amonio 0.8 gr
Agua destilada 80 ml
Mezclar las soluciones A y B. Almacenar durante 24 horas antes de su uso. Filtrar
la solución con papel filtro.
SOLUCIÓN DE LUGOL
Iodo 1 gr
Yoduro de potasio 2 gr
Agua destilada 300 ml
Permitir que la solución de iodo se disuelva durante la noche en un lugar oscuro.
A la vez macerar en un mortero el iodo y el yoduro de potasio, secos y adicionar
125
poca agua. Continuar macerando con la solución de iodo y enjuagar con agua en
un frasco ámbar.
DECOLORANTE
Alcohol etílico al 95% (agente más lento)
CONTRASTANTES
Solución Stock:
Safranina O 2.5 gr
Alcohol etílico 100 ml
Solución de trabajo:
Solución Stock 10 ml
Agua destilada 90 ml
Mezclar las dos soluciones y guardar en frasco ámbar.
PROCEDIMIENTO:
Agregar a la lámina unas gotas de cristal violeta y dejar por 1 minuto. Lavar.
Agregar unas gotas de lugol por 1 minuto. Lavar.
Agregar dos gotas de alcohol al 95% por 30 segundos. Lavar.
Agregar unas gotas de safranina por 1 minuto. Lavar.
126
ANEXO 11. PRUEBA OXIDO FERMENTACIÓN (O/F)
COMPOSICIÓN:
Peptona de caseina 2 gr
Extracto de levadura 1 gr
Cloruro de sodio 5 gr
Hidrógenofosfato dipotásico 0.2 gr
Azul de bromotinol 0.08 gr
Agar-agar 2.5 gr
Carbohidrato 10 gr
Agua destilada 1 Litro
PREPARACIÓN:
Se debe disolver 11 g/L y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
Dejar enfriar aproximadamente a 50 °C e incorporar 100 ml/L de cada solución al
10% de glucosa, lactosa, sacarosa y maltosa. Las soluciones de azúcares se
esterilizan por filtración con membrana millipore de 0.45µ Ajustar el pH a 7.0.
Distribuir por cada azúcar en tubos con 5 ml de la solución. Dejar enfriar.
127
ANEXO 12. CALDO PARA PRODUCCIÓN DE INDOL
COMPOSICIÓN:
Peptona de carne 8.6 gr
Cloruro de sodio 6.4 gr
Agua destilada 1 Litro
PREPARACIÓN:
Mezclar todos los ingredientes calentando suavemente para disolución completa.
Ajustar el pH a 7.0. Dispensar en tubos en cantidad de 4-5 ml. Autoclavar a 121°C
por 15 minutos.
REACTIVO DE KOVAC`S
COMPOSICIÓN:
Alcohol isoamílico 150 ml
Para-dimetil-amino-benzaldehído 10 gr
Ácido hidroclorhídrico concentrado 50 ml
PREPARACIÓN:
Disolver el aldehído en el alcohol y agregar lentamente el ácido. El reactivo de
Kovac`s debe conservarse en refrigeración aproximadamente por 2 meses en
frasco ámbar.
128
ANEXO 13. PRUEBA REDUCCIÓN DE COMPUESTOS DE SACAROSA
COMPOSICIÓN:
Peptona 10 gr
Sacarosa 40 gr
Agua destilada 1 Litro
PREPARACIÓN:
Mezclar todos los ingredientes calentando suavemente para disolución completa.
Ajustar el pH a 7.0. Dispensar en tubos en cantidad de 4-5 ml. Autoclavar a
121°C por 15 minutos.
REACTIVO DE BENEDICT
COMPOSICIÓN:
Citrato de sodio 17.3 gr
Carbonato de sodio 10 gr
Sulfato de cobre 5 H2O 1.73 gr
Agua destilada 100 ml
PREPARACIÓN:
Homogenizar los ingredientes y guardar en frasco ámbar en un lugar fresco.
129
ANEXO 14. SOLUCIONES EMPLEADAS EN LA PRUEBA ELISA (NCM)
1. SOLUCIÓN TAMPÓN DE EXTRACCIÓN: SOLUCIÓN TAMPÓN CITRATO pH
5.6
COMPOSICIÓN:
Paquete A: Ácido cítrico 0.1M (1.995g)
Paquete B: Citrato de sodio 0.1M (11.907g).
PREPARACIÓN:
Disolver el paquete A en 1 litro de agua destilada y luego añadir lentamente el
contenido del paquete B agitando. Ajustar pH a 5.6. Esterilizar por 20 minutos a
120ºC.
2. CALDO DE ENRIQUECIMIENTO SMSA
COMPOSICIÓN:
Medio basal:
Bacto peptona 10 g
Glicerol 5 ml
Ácido casamino 1 g
Esterilizar en autoclave y enfriar a 50ºC y añadir las siguientes soluciones de
antibióticos esterilizadas con filtro. (por litro):
130
Soluciones de antibióticos:
Sulfato de polimixina al 1% 10ml
Cicloheximida al 1% 10ml
Bacitracina al 1% 2.5ml
Penicilina G al 0.1% 500µl
Cloranfenicol al 1% 500µl
Cristal violeta al 1% 500µl
Cloruro tetrazolio trifenil 2,3,5 al1% 5ml
PREPARACIÓN:
Diluir 20 ml de caldo de enriquecimiento SMSA 10X añadiendo 180ml de agua
destilada estéril y verter 500µl de SMSA 1X a tubos eppendorf estériles de 1.5ml.
3. SOLUCIÓN TAMPÓN TBS pH 7.5
COMPOSICIÓN:
Paquete 1:
Tris 0.02M 2.42g
NaCl 0.5M 29.22g
NaN3 0.01% 0.10g
HCl 18.5% 6ml
131
PREPARACIÓN:
Disolver el contenido del paquete 1 en 995 ml de agua destilada. Mezclar
completamente. Añadir HCl hasta alcanzar el pH 7.5. Completar a 1 litro con agua
destilada.
4. SOLUCIÓN DE BLOQUEO
COMPOSICIÓN:
Leche en polvo sin grasa 0.43g
PREPARACIÓN:
Disolver esto en 30 ml de solución tampón TBS.
5. TAMPÓN DE ANTICUERPOS
COMPOSICIÓN:
Leche en polvo sin grasa 0.43g
PREPARACIÓN:
Disolver esto en 30 ml de solución tampón TBS.
6. SOLUCIÓN DE ANTICUERPOS DE Rs
COMPOSICIÓN:
IgG de conejo específico de Rs 0.6 ml
132
PREPARACIÓN:
Al tampón de anticuerpos añadir, agitando simultáneamente 100µl de la IgG de
conejo.
7. SOLUCIÓN TAMPÓN DE LAVADO T-TBS
COMPOSICIÓN:
Tween 20 250µl
Solución TBS 500ml
PREPARACIÓN:
Homogenizar muy bien los ingredientes.
8. TAMPÓN DEL CONJUGADO
COMPOSICIÓN:
Leche en polvo sin grasa 0.43g
PREPARACIÓN:
Disolver esto en 30 ml de solución tampón TBS.
9. SOLUCIÓN DEL CONJUGADO
COMPOSICIÓN:
133
Anticuerpos de cabra anti-conejo 0.6ml
(45 µl diluidos en 555 µl de solución tampón 0.5X PBS).
PREPARACIÓN:
Al tampón del conjugado añadir, agitando simultáneamente 100µl de los
anticuerpos de cabra anti-conejo. La concentración final será de 1:4000.
10. SOLUCIÓN TAMPÓN SUSTRATO pH 9.6
COMPOSICIÓN:
Tris 0.1M 1.21g
NaCl 0.1M 0.58g
MgCl2 6H2O 5mM 0.10g
PREPARACIÓN:
Disolver en 100ml de agua destilada. Mezclar completamente y ajustar pH con
unas gotas de HCl.
11. SOLUCIONES NBT/BCIP
NBT: Nitroblue Tetrazolio.
BCIP: Sal de Toluidina de 5-bromo, 4-cloro, 3-indolil.
DMF/NBT: 70% Dimetilformamida en agua.
DMF/BCIP: 100% Dimetilformamida.
134
COMPOSICIÓN:
Sustratos:
1.NBT 30mg
2.BCIP 15mg
Disolventes:
1.DMF/NBT (70% DMF en agua) 1ml
2.DMF/BCIP (100% DMF) 1ml
PREPARACIÓN:
NBT: Al sustrato 1 agregar 800µl del disolvente 1. Disolver con agitador.
BCIP: Al sustrato 2 agregar 800µl del disolvente 2. Disolver con agitador.
12. SOLUCIÓN SUSTRATO NBT/BCIP
PREPARACIÓN:
Tomar 100µl de la solución NBT y añadirla gota a gota con agitación en un frasco
oscuro que contenga 25 ml de la solución tampón sustrato.
1
Cun
dina
mar
ca
Boy
acá
Ant
ioqu
ia
Nar
iño
GRADO 1
GRADO 2
GRAD0 3
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18P
OR
CE
NTA
JES
DEPARTAMENTOS
GRÁFICA 1. GRADOS DE SEVERIDAD PARA LA ESCALA DE Rhizoctonia solani
1
Cun
dina
mar
ca
Bo
yacá
Ant
ioqu
ia
Nar
iño
GRADO 1
GRADO 2
GRADO 3
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
DEPARTAMENTOS
GRÁFICA 2. GRADOS DE SEVERIDAD PARA LA ESCALA DE Spongospora subterranea
1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8P
OR
CE
NTA
JES
Pata negra Pudriciónblanda
Pudrición seca Costra negra Roña polvosa Pudricióngomosa
ENFERMEDADES
GRÁFICA 3. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES EN CAMPO EN CUNDINAMARCA
2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8P
OR
CE
NTA
JES
Pata negra Pudriciónblanda
Pudriciónseca
Costra negra Roña polvosa Pudricióngomosa
ENFERMEDADES
GRÁFICA 4. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES EN CAMPO EN BOYACÁ
3
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3P
OR
CE
NTA
JES
Pata negra Pudriciónblanda
Pudrición seca Costra negra Roña polvosa Pudricióngomosa
ENFERMEDADES
GRÁFICA 5. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES EN CAMPO EN NARIÑO
4
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45P
OR
CE
NTA
JES
Pata negra Pudriciónblanda
Pudriciónseca
Costra negra Roña polvosa Pudricióngomosa
ENFERMEDADES
GRÁFICA 6. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES EN BODEGA EN BOYACÁ
5
0
0,5
1
1,5
2
2,5P
OR
CE
NTA
JES
Pata negra Pudriciónblanda
Pudriciónseca
Costra negra Roña polvosa Pudricióngomosa
ENFERMEDADES
GRÁFICA 7. INCIDENCIA DE LAS ENFERMEDADES EN BODEGA EN ANTIOQUIA
6
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