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In Natura si distingue:
Vita saprofita: nell’ambiente a spese di materiale inanimato
Vita parassitaria: a carico di organismi
(Maggioranza dei batteri)
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Vita parassitaria: a carico di organismi superiori
Parassiti
Obbligati Facoltativi
(Minoranza)
1
Parassiti
Rapporti tra batteri e ospite:
Commensali (indifferenti)
Simbionti (utili)
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Opportunisti (talvolta possono dare malattia)
Patogeni (nocivi) (moltiplicazione in vivo e
tossigenicità)
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Popolazione microbica normale
Esistono due gruppi di PMN: residentetransito
1) Competizione con nutrienti (interferenza)2) Competizione con i recettori sulle cellule (tropismo)3) Produzione di batteriocine
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
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3) Produzione di batteriocine4) Produzione di acidi grassi o altri metaboliti
(anaerobi)5) Continua stimolazione del sistema immune
(macrofagi)6) Stimolazione di fattori immuni protettivi (Ig)
POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Microrganismi acquisiti dalla nascita subiscono modifiche in numero e specie lungo tutto il decorso della vita
Dipendono da
•fattori genetici
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
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•fattori genetici•abitudini alimentari e igieniche •situazioni di stress •fenomeni psicosomatici •età
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Residenti, o popolazione microbica normaleÈ dominata dai batteri anaerobi o anaerobi facoltativi, si calcola che il rapporto oscilli tra le 100 e le 1000 volte, circa 500-1000 specie diverse
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
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100 e le 1000 volte, circa 500-1000 specie diverse non del tutto identificate o coltivate nel solo apparato gastroenterico in circa 200 m2 vi sono almeno 10 14 microrganismiL‘unico sito anatomico privo di anaerobi è la faringe
POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Residenti, o popolazione microbica normalerappresentano circa l’1-3% del peso corporeo.10 volte il numero totale delle cellule somatiche Intestino: più di 500 (1000) specie diverse di
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Intestino: più di 500 (1000) specie diverse di batteri molte delle quali non coltivabili con le metodiche tradizionali Si stima che circa il 60% del materiale fecale sia costituito da batteri.
PMN
Cute
Cavità orale e prime vie aeree
Tratto intestinale
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Tratto intestinale
Uretra
Vagina
Occhio
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PMN Cute
PM transitoria
Pieghe cutanee
Secrezioni sebacee
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Sudorazione e lavaggi
Disinfezione
Medicazioni occlusive
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PMN cavità orale
Sterile alla nascita
4-12 ore dopo si stabiliscono i viridanti (madre)
Seguono stafilococchi, anaerobi, neisserie,
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Seguono stafilococchi, anaerobi, neisserie, moraxelle, difteroidi.
Eruzione dei denti: spirochete anaerobie, prevotelle, fusobatteri, capnocytophaga
Actinomyces tonsille e gengive degli adulti
Miceti: Candida10
PMN vie respiratorie
Faringe e trachea
simili
alla cavità orale
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alla cavità orale
Bronchi pochi batteri
Bronchioli e alveoli sterili
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PMN vie respiratorie
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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
La popolazione microbica dell’apparato gastro-enterico è stata definita come
"un insieme di microrganismi presenti nel lume intestinale i quali, se
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nel lume intestinale i quali, se convivono in un determinato equilibrio
contribuiscono allo stato di salute dell'ospite"
POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Nello stomaco vi è un alto grado di acidità e il numero dei
microrganismi non supera le mille unità, mentre nell'ileo la
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unità, mentre nell'ileo la concentrazione aumenta arrivando
nel colon a 1011-1012 batteri per g
PMN intestinale
Duodeno: 103-106/gr
Digiuno-ileo: 105-108/gr
Cieco-colon trasverso: 108-1010/gr
pHacido
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Cieco-colon trasverso: 108-1010/gr
Sigma-retto: 1011/gr
antibiotici basico
POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Anche il numero e il tipo di specie di microorganismi varia
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specie di microorganismi varia con il variare del sito anatomico
PMN intestinale
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G. Antonelli, M. Clementi, G. Pozzi, G.M. Rossolini Principi di Microbiologia medica, II ed. Copyright 2011 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana
POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Portano milioni di geni (5), un numero di gran lunga superiore ai 20.000 stimati del genoma umano. Una gran varietà di composti che possono essere metabolizzati (è un organo aggiunto, bioreattore)
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metabolizzati (è un organo aggiunto, bioreattore)Quando varia, si modifica anche l'assorbimento dei nutrienti Obesi e magri hanno profili batterici radicalmente diversi nei loro intestini
POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
La degradazione nell’intestino crasso, in particolar modo della lignina e della
cellulosa, è incompleta portando a particelle di fibre vegetali che
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particelle di fibre vegetali che persistono fino all’intestino distale
dove possono esercitare un ruolo che favorisce il processo di eliminazione
delle feci
POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
E’ importante il ruolo dei batteri intestinali nella sintesi e nell'utilizzo delle vitamine.B1, B2, B6, B12, PP, H, acido pantotenico e acido folico.
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folico.La vitamina K viene sintetizzata dall'Eucobacterium lentum che modifica degli steroidi a livello intestinaleI germi intestinali interagiscono con gli acidi biliari.
POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Gli acidi biliari derivano dal metabolismo del colesterolo nel fegato, coniugati con glicina ed eliminati con la bile.
Il metabolismo degli ormoni steroidei (androgeni, estrogeni e corticosteroidi) avviene nel lume intestinale attraverso varie reazioni chimiche
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attraverso varie reazioni chimiche Gli ormoni steroidei vengono modificati a livello del fegato ed escreti con la bile. Nell'intestino verranno deconiugati e sottoposti alle modificazioni enzimatiche per poi ritornare al fegato attraverso la vena porta.
POPOLAZIONE MICROBICA INTESTINALE
A questo livello vi è una barriera protettiva costituita da uno strato di muco denso che
contiene IgA secretorie, peptidi antimicrobici e anche complessi
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antimicrobici e anche complessi giunzionali che tengono unite le cellule
epiteliali adiacenti in modo da regolare la permeabilità del tessuto intestinale e impedire che i microrganismi lascino
questa sede
POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE
Gli enterociti esprimono recettori PAMP (pathogen-associated molecular pattern), comprese le proteine denominate TLR e NOD. Questi recettori captano la presenza di componenti batterici presenti e conservati in
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componenti batterici presenti e conservati in diverse specie microbiche e possono dare inizio ad una cascata pro infiammatoria per la difesa. I batteri possono presentare sulla superficie esterna delle strutture che sono individuate dalle cellule epiteliali e dalle cellule del sistema immunitario
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The commensal microbiota, intestinal epithelial cells, and intestinal immune cells engage in a complex crosstalk. Epithelial cells, M cells, and dendritic cells (DCs) can directly sense and sample the intestinal contents and communicate information about the microbiota to other subsets of immune cells. Toll-like receptors, expressed by epithelial cells, M cells and DCs, and NOD-like receptors, are classes of microbe-sensing molecules. Cytokines, chemokines, and host and microbial metabolites are key molecular mediators of intestinal homeostasis that influence responses of both host and microbe. l
PMN vagina
Alla nascita pH acido: lattobacilli
Dopo alcune settimane fino a pubertà pH neutro: PMN mista cocchi e bacilli
Pubertà pH acido: lattobacilli
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Pubertà pH acido: lattobacilli
Dopo la menopausa pH neutro: PMN mista cocchi e bacilli
IMPORTANTE IL LIVELLO DEGLI ESTROGENI
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Batteri a circolazione interumana:
Infezioni esogene ed endogene
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Portatore sano
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Possibili vie d’accesso per i microorganismi
Vie respiratorie
tratto gastro-enterico
Canali naturali
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tratto gastro-enterico
genito-urinario
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Possibili vie d’accesso per i microorganismi
Via Esempi
Ingestione Salmonella, Shigella, E. coli, V. cholerae, C. botulinum ecc..
Inalazione Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella Chlamydia ecc…
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Penetrazione diretta (aghi, ferite)
C. tetani, S. aureus ecc..
Punture d’artropodi
Rickettsia, Francisella, Y. Pestis ecc..
Sessuale N. gonorrhoeae, T. pallidum, C. trachomatis
transplacentare T. pallidum31
Possibili vie d’accesso per i microorganismi
Inserzioni di: cateteri (urinari, vascolari ecc.)
tubi per ventilazione
sondini di drenaggio
Somministrazione di farmaci che deprimono la
Canali occasionali
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Somministrazione di farmaci che deprimono la risposta immunitaria o che alterano il microambiente di alcuni distretti dell’organismo (es. antiacidi)
interruzioni dell’integrità della superficie della mucosa e della pelle
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Meccanismi di difesa naturale e barriere
L’ambiente in vivo è molto sfavorevole per i batteri: pH, T, O2, flusso dei liquidi organici, cellule ciliate, macrofagi,
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macrofagi,
integrità e composizione biochimica dei tessuti, infiammazione, febbre
Strato corneo della pelle
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Meccanismi di difesa naturale e barriere
Mucose: muco, lisozima, IgA, epiteli ciliati, movimento del contenuto del lume del
Colonizzazione della cute e delle mucose
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movimento del contenuto del lume del canale mucoso (intestino, uretra)…
PMN residente
Cellule di sfaldamento
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Meccanismi di difesa naturale
Fagocitosi
Funzioni dei fagociti: chemiotassi, ingestione e uccisione. I batteri elaborano sostanze che attraggono i fagociti, la fagocitosi è favorita dalle opsonine-anticorpi che rivestono la superficie battericaa) l’anticorpo agisce da opsoninab) l’anticorpo + antigene attiva il complemento
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b) l’anticorpo + antigene attiva il complementoc) opsonine possono essere prodotte da sistemi termolabili che attivano il complementoLa fagocitosi richiede consumo di energia. E’ posseduta dai granulociti e macrofagi, il meccanismo non è del tutto noto, è stato osservato un aumento della produzione di acqua ossigenata e liberazione di lisozima nei vacuoli (fagosoma, proteine antibatteriche, lisozima, pH, fosfatasi, lactoferrina, perossidasi)
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Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig)
Variazione antigenica (shift)
Inibizione della fusione lisosomiale
Elusione dei lisosomi e moltiplicazione nel citoplasma
Strategie batteriche
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
citoplasma
Produzione di catalasi che scinde lo ione superossido
Resistenza agli enzimi lisosomiali
Produzione di IgA proteasi
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Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig)
La resistenza ai macrofagi può aversi mediante:
1. produzione di leucocidine che uccidono i macrofagi
2. capsula che impedisce la fagocitosi
Strategie batteriche
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3. produzione di superossidismutasi che sequestra l’ossigeno che serve ai macrofagi per la produzione di ATP che è necessario per la fagocitosi
4. mimetismo antigenico
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Mimetismo antigene
È la presenza di componenti strutturali che presentano notevoli analogie di composizione con materiali presenti nei tessuti dell’organismo ospite che vengono
Strategie batteriche
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tessuti dell’organismo ospite che vengono quindi difficilmente individuati come non-self
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Mimetismo antigene
Esempi:
la capsula di S. pyogenes è formata da acido jaluronico, presente nel connettivo.
Alcuni enterobatteri possiedono nella
Strategie batteriche
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Alcuni enterobatteri possiedono nella porzione polisaccaridica del LPS determinanti antigeni simili a quelli presenti nelle emazie della specie normalmente parassitata.
40
Mimetismo antigene
S.pyogenes possiede diversi materiali antigenici (proteina M, antigeni di
membrana, carboidrati di gruppo) che presentano analogie molecolari ed
antigeniche con strutture molecolari presenti nel miocardio, cute, nell’encefalo
Strategie batteriche
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antigeniche con strutture molecolari presenti nel miocardio, cute, nell’encefalo
e nelle articolazioni e la risposta autoimmune che si mette in opera durante
l’infezione da S. pyogenes, potrebbe rappresentare un elemento di rilievo nella patogenesi della febbre reumatica a della
cardiomiopatia reumatica. 41
Mimetismo antigene
Le Chlamydie presentano negli involucri esterni alcune proteine
ricche in cisteina che hanno analogie antigenetiche con la catena pesante
dell’alfa-miosina specifica del muscolo
Strategie batteriche
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dell’alfa-miosina specifica del muscolo cardiaco ed è stata quindi ipotizzata una base autoimmune nella patologia cardiaca correlata alla infezione di
Chlamydia (C. pneumoniaesoprattutto).
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Gram-negative commensal of the human oropharynx, can causesepticaemia by crossing the mucosal barrier and entering thebloodstream or meningitis by crossing the blood–brain barrierinto the cerebrospinal fluid. In each case, N. meningitidis usesmolecular mimicry to survive exposure to the innate immunesystem. The ability of the immune system to distinguish foreigncells from self is mediated in part by sialic acid, which coats thesurface of human cells and acts as a ‘self signal’. N. meningitidis
Neisseria meningitidis
Strategie batteriche
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
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surface of human cells and acts as a ‘self signal’. N. meningitidisexploits this feature by decorating its outer surface with sialicacid residues, thus masking itself from human defences.Molecular mimicry is a key component of N. meningitidispathogenesis and mutants that are unable to sialylate their outersurface are highly attenuated. The in vivo nutritionalenvironment has an impact on N. meningitidis host cell mimicry.N. meningitidis can use lactate and glucose as carbon andenergy sources, and lactate and glucose are present innasopharyngeal tissue, serum and cerebrospinal fluid at 1–2 mMand 6–10 mM levels, respectively.
Molecular mimicry by Neisseriameningitidis.
a | Glucose catabolism in N. meningitidisproceeds by the Entner–Doudoroffpathway and lactate catabolism feedsdirectly into the sialic acid pathway. Notethe relative number of metabolic stepsfrom glucose to phosphoenolpyruvate
Strategie batteriche
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compared with that from lactate tophosphoenolpyruvate.b | Sialylated lipopolysaccharide (LPS)
on the N. meningitidis surface mimics thesurface of eukaryotic cells, preventingdeposition of the complement moleculeC3. Inactivation of the lactate permeasegene lctP results in C3-mediated celllysis.
Interestingly, although both of these carbon sources are presentin vivo, N. meningitidis catabolizes lactate at a faster rate thanit does glucose, and mutants that are deficient for lactatetransport are defective colonizers of nasopharyngeal tissue. Whymight a bacterium preferentially metabolize a more oxidizedsubstrate such as lactate over glucose? One likely explanation isthat intermediates of lactate consumption feed directly into the
Neisseria meningitidis
Strategie batteriche
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
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that intermediates of lactate consumption feed directly into thesialylation pathway, thus enhancing sialic acid biosynthesis. This,in turn, leads to increased sialylation of the N. meningitidis outermembrane.As expected, a N. meningitidis strain that is unable to transportlactate (DlctP) is highly deficient for sialic acid modification of theouter membrane and is more susceptible to complement-mediated killing. Thus, for N. meningitidis, catabolism of apreferred carbon source in vivo is coupled to a unique immune-evasion strategy.
Quando un microorganismo invade l’ospite
E’ in grado di superare le difese di un individuo sano
PATOGENO
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Sfrutta alcune situazioni di debolezza dell’ospite
OPPORTUNISTA
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Attributi dei microorganismi che causano malattia
Abilità di causare malattia o produrre lesioni progressive (Patogenicità)Grado di patogenicità, ovvero, malattia causataanche da batteri in numero piuttosto limitato(Virulenza).
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
(Virulenza).Queste proprietà possono essere suddivise intossicità: abilità nel produrre sostanze tossiche edinvasività: abilità nel penetrare i tessuti e didiffondere.Molti di questi caratteri sono controllati daplasmidi.
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Isole di patogenicità (PAI)
I geni per i fattori di patogenicità, soprattuttose localizzati a livello cromosomico, possonoessere (Gram-) riuniti in segmenti di DNA:PAI
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PAI
I PAI probabilmente sono segmenti di DNAacquisiti orizzontalmente che differenziano ibatteri che li posseggono dagli altri dellastessa specie
48
Infezione
L’infezione è il processo attraverso il
quale un microorganismo entra in
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quale un microorganismo entra in
relazione con l’ospite
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Infezioni
Monomicrobica: un singolo patogeno
Polimicrobica: da più patogeni aerobi o anaerobi
Mista: aerobi ed anaerobi insieme
Comunitaria: acquisita in ambiente non
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Comunitaria: acquisita in ambiente nonospedaliero
Nosocomiale: acquisita dopo 72 ore dal ricovero
50
Fasi di una proliferazione batterica
1) Adesione
2) Invasione
3) Produzione di metaboliti (crescita)
4) Produzione di tossine: enzimi degradativi
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
4) Produzione di tossine: enzimi degradativi
tossine tipo A-B
5) Endotossine
6) Induzione di infiammazione
7) Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig)
8) Resistenza agli antibiotici
51
Fattori che caratterizzano un microorganismo patogeno
Adesività mediata da strutture specializzate
ac. lipoteicoici nei gram-positivi
proteine nei gram-negativi (fimbrie, pili ecc.)
produzione di capsula (slime)
capacità biochimica di metabolizzare nelle condizioni
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
capacità biochimica di metabolizzare nelle condizioni
nutrizionali fornite dai tessuti dell’ospite
capacità di penetrare e moltiplicarsi in tessuti profondi (invasività)
capacità di contrastare i meccanismi difensivi dell’ospite
produzione di esotossine
52
Adesione
Uno dei principali eventi che promuovono l’infezione.
Il processo è mediato da strutture poste sulla superficie esterna dei batteri note come adesine, per esempio l’antigene K88 dell’Escherichia colienteropatogeno, gli acidi lipoteicoici
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
enteropatogeno, gli acidi lipoteicoici (streptococchi) e altre. Le cellule epiteliali hanno a loro volta, come già detto, strutture che legano le adesine ad esempio fibronectina disposta sulla superficie dell’epitelio orale.
(Batteri isogenici privi di adesine non danno infezione)
53
Perchè i batteri aderiscono?
• I batteri non adesi verrebbero eliminati
• Adesione: prima tappa della colonizzazione
3: Fase di adesione reversibile e irreversibile
• Adesione: prima tappa della colonizzazione e della formazione del biofilm
54
Evidenze sperimentalidel ruolo dell’adesione nella
colonizzazione• I batteri legano recettori isolati o analoghi
dei recettori• L’adesina purificata o un suo analogo lega il • L’adesina purificata o un suo analogo lega il
recettore • L’adesione è inibita da:
• Analoghi dei recettori e delle adesine• Enzimi che distruggono l’adesina o il recettore• Anticorpi specifici diretti contro l’adesina o il
recettore55
Cosa utilizzano i batteri per aderire? Adesine batteriche
• Proteine espresse sulla superficie• Fimbrie• Glicocalice, Lipopolisaccaride (G-), Acidi • Glicocalice, Lipopolisaccaride (G-), Acidi
teicoici (G+)• Enzimi
• Enzimi batterici ancorano la cellula al substrato
• Enzimi batterici possono esporre recettori criptici 56
Morfologia delle adesine
Type I fimbriaeAfimbrial adhesin
Type IV fimbriae (= bundle forming pilus) Curli
57
ADESINE BATTERICHEADESINE BATTERICHE
58
AdesivitàAdesione specifica e selettiva alle cellule epiteliali: adesine-recettore
)
Colonizzazione delle mucose
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G-: proteine in fimbrie o piliG+: glicolipidi (ac. Lipoteicoici, [LTA]) +
proteine (es. F di S.pyogenes) in fibrilleRecettore su cellule: porzione glicidica di
glicoproteine o glicolipidi o proteine di membrana
Materiale capsulare59
Adesività
Ogni specie batterica interagisce con recettori presenti su determinati epiteli: Esiste uno spettro
S. mitis tutta la mucosa buccale S. salivarius lingua e gengiveS. pyogenes faringe e tonsille
Colonizzazione delle mucose
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N. gonorrhoeae uretraV. cholerae intestino tenueE. coli ileo, colon,tratto urogenitale, ecc.
Tossine ciliostatiche
60
Fibronectina
Sulla superficie delle cellule epiteliali vi è una proteina, la fibronectina, con cui interagiscono le adesine dei batteri gram-positivi, prevenendo così l’adesione dei gram-negativi. La fibronectina è una glicoproteina prodotta dagli epatociti e distribuita in forma solubile in tutti i liquidi
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
epatociti e distribuita in forma solubile in tutti i liquidi organici, viene escreta nelle cavità naturali dell’organismo dove si deposita sulla superficie delle mucose ed è inoltre presente nei tessuti dove forma un reticolo fibrillare. La fibronectina è coinvolta in alcuni processi biologici tra cui la fagocitosi, la rigenerazione dei tessuti e nella differenziazione cellulare.
61
Acquisizione di patogeni potenziali:malattia di base
Durante il decorso di varie affezioni si determinano variazioni nelle cellule di rivestimento (cute e mucose) con colonizzazione da parte dei bacilli gram-negativi e riduzione della popolazione batterica gram-positiva
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Volontari o pazienti ricoverati in clinica psichiatrica non hanno dimostrato variazioni della popolazione batterica normale dell’orofaringeVariazioni con la durata della degenza (stesso reparto)
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FIBRONECTINA: ALTRI EFFETTI SULLA POPOLAZIONEBATTERICA RESIDENTE
La presenza di fibronectina in:ferite accidentali o causate da strumenti, sulla superficie di cateteri predispone all’invasività di cocchi gram-positivi (stafilococchi, streptococchi) che possiedono sulla loro superficie recettori per la fibronectina con la quale creano un legame molto stabile.
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fibronectina con la quale creano un legame molto stabile.
La colonizzazione dei cateteri avviene con batteri gram-positivi produttori di slime che li rende immuni da qualsiasi trattamento con farmaci e dall’azione dei macrofagi.
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Fibronectina: un modulatore della popolazione batterica residente
Pazienti affetti da malattie organiche o ustioni, traumi ecc. dimostrano un ridotto tasso di fibronectina nel plasma
Conseguenze
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ConseguenzeRiduzione di fibronectina dalla superficie cellulare scomparsa dei microorganismi (cocchi) gram-positivi colonizzazione da parte di bacilli gram-negativiProduzione di proteasi batterica e dell’ospite?Ulteriore riduzione del tasso di fibronectina nel sito di colonizzazione.
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Immunità naturale e Immunità acquisita:
Immunità naturale:dovuta non dal contatto con l’antigene ma dal genotipo.Es. malattie che colpiscono certe specie e non altre.Nell’uomo certe razze, certi gruppi etnici ecc.resistenza individuale diversa, nutrizione età, malattievarie.varie.Immunità acquisita:passiva dovuta alla somministrazione di anticorpispecifici che danno una copertura temporanea, ma puòconsentire una immediata ed elevata rispostaanticorpale. E’ passiva l’immunità acquisita dalla madreattraverso il flusso sanguigno ed il colostro.
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Immunità attiva e Immunità umorale
Immunità attivadovuta al contatto con un antigene, produzione di anticorpi richiedetempi di sviluppo anche lungo ma può dare protezione permanente
Immunità umoraleproduzione attiva di anticorpineutralizzano tossine e prodotti cellulari
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neutralizzano tossine e prodotti cellularieffetto battericida diretto o litico con il complementobloccano l’abilità infettiva dell’agenteagglutinano i batteri facilita la fagocitosiopsonizzazione, interagiscono con le componenti di superficie chepossono limitare la fagocitosi
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Sopravvivenza alla superficie delle mucose
Una volta ancorati alla superficie di un epitelio (ma questo anche nei tessuti profondi) i batteri si moltiplicano e interagiscono con le cellule superiori attraverso la produzione di sostanze variamente tossiche. Queste proteine vengono secrete da appositi sistemi secretori grazie al quale i batteri
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appositi sistemi secretori grazie al quale i batteri possono traslocare nel citosol della cellula eucariotica le proteine effettrici che interferiscono con il signalling eucariotico, compromettendo le funzioni cellulari e attivando il processo di apoptosi o alterano strutture particolari e causano necrosi
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Invasione
Produzione di enzimi extracellulari o attivi all’esterno dei batteri:collagenasi: distrugge il collagenocoagulasi: causa la coagulazione del plasma S.aureusialuronidasi: idrolizza l’acido ialuronico (tessuto connettivo)streptochinasi: (fibrinolisina) promuove la formazione di plasmina
dal plasminogeno, dissolve i coaguli
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dal plasminogeno, dissolve i coaguliemolisine: lisano i globuli rossiproteasi: idrolizzano le immunoglobuline o altre proteine
dell’ospite.La tossicità gioca un ruolo importante nell’invasività ma non è un
fattore diretto (capsula polisaccaridica o di acidi ialuronici, proteina M, polipeptidi di superficie, resistenza agli enzimi dei fagociti).
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Penetrazione nei tessuti profondi
Mucosa
Sottomucosa
Tessuti profondi
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Tessuti profondi
Via ematica/linfatica
Tutto l’organismo
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G. Antonelli, M. Clementi, G. Pozzi, G.M. Rossolini Principi di Microbiologia medica, II ed. Copyright 2011 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana
Penetrazione nei tessuti profondi
Il danneggiamento dell’epitelio mucoso è per molti batteri la strada per raggiungere la sottomucosa, altri quali Salmonelle e Shigelle utilizzano
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quali Salmonelle e Shigelle utilizzano peculiari meccanismi invasivi che
consentono di penetrare direttamente nelle cellule dell’epitelio
mucoso. 71
Sopravvivenza nella sottomucosa e nei tessuti profondi
Sfuggire alle difese immunitarie (capsula o resistenza al killing dei fagociti)
moltiplicazioneTempo di moltiplicazione in vivo (8-10h ?) (situazione simile a chemostato*, ma effetto del
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(situazione simile a chemostato*, ma effetto del s.i.)Siderofori ecc.Tropismo d’organo
* sangue e linfa portano nutrimenti e allontanano scorie
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Capsula
Contrasta gli effetti potenzialmentenocivi dell’interazione adesine-recettorefagocitaMaschera le adesine, varia la carica di superficie batterica
Colonizzazione delle mucose
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Maschera le adesine, varia la carica di superficie battericaOstacola la deposizione di C3b e l’ancoraggio di AbStrategia + comune nei G+Nei G- mancata produzione di fimbrie
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Sopravvivenza nella sottomucosa e nei tessuti profondi
Una volta all’interno di fagociti professionali,alcuni batteri patogeni sono in grado di evaderedal fagosoma (prima della fusione con i lisosomi),mentre altri sono in grado di moltiplicarsiall’interno del fagosoma alterando la membranaimpedendo la fusione con il lisosoma, oppure
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all’interno del fagosoma alterando la membranaimpedendo la fusione con il lisosoma, oppureproduzione di catalasi e SOD per contrastare imeccanismi di killing ossigeno-dipendenti,eliminado i derivati dell’ossigeno molecolareprovvisti di azione microbicida (perossido diidrogeno, anione superossido etc).
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Le shigelle non essendo in grado di accedere all’interno degli enterociti della mucosa del colon, attraverso la membrana apicale di tali cellule, guadagnano l’accesso alla sottomucosa attraverso le cellule M per transcitosi. I pochi batteri che arrivano alla sottomucosa vengono prontamente fagocitati dai macrofagi residenti nella sottomucosa.
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Produzione di metaboliti
Sono costituiti da prodotti originati dallacrescita batterica in seguito alla demolizionedi composti complessi, molti di questi, comel’acido lattico, alcoli, acetone o aldeidi o
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
l’acido lattico, alcoli, acetone o aldeidi ocomunque composti organici possonoesercitare un effetto tossico sulle cellule.
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Potere aggressivo dei batteri
Sostanze non tossiche:
capsula, coagulasi, catalasi (H2O2) SOD (O2
-), collagenasi, ialuronidasi ecc.
Sostanze tossiche:
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Sostanze tossiche:
Esotossine: esocitate, proteiche
Endotossine: legate al batterio LPS
Divisione non netta i.e. endotossine proteiche: V. cholerae
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Differenze tra esotossine ed endotossine
ESOTOSSINE
Escrete da cellule viventi e ritrovate ad elevate concentrazioni nei terreniPolipeptidi PM 10.000-900.000Relativamente instabili: tossicità spesso rapidamente distrutta col calore>60°
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distrutta col calore>60°Altamente antigeniche, stimolano la formazione di alti titoli di antitossina che neutralizza la tossinaConvertibile in antigene (anatossina) da formalina, acidi, calore ecc.Altamente tossiche, fatali per animali da laboratorio in mg o menoNon producono febbre nell’ospite
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Differenze tra esotossine ed endotossine
ENDOTOSSINE
Parte integrante della parete dei gram-negativiComplesso lipopolisaccaridico (LPS), il lipide A è la porzione responsabile della tossicitàStabile al calore>60° per ore senza perdere tossicitàNon stimola la formazione di antitossina
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Non stimola la formazione di antitossinaLa parte polisaccaridica (molto variabile) stimola la produzione di anticorpi (Antigene somatico O)Non è convertibile in anatossinaDebolmente tossico per animali anche a dosi di mgSpesso causa febbre
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Classificazione delle esotossine
TOSSINE CITOLITICHEAttive sulla membrana delle cellule
TOSSINE NEUROTROPEAttive sulle cellule del sistema nervoso
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TOSSINE ENTEROTOSSICHEAttive sulle cellule della mucosa intestinale
TOSSINE PANTROPEAttive su tutte le cellule, inibiscono la sintesi proteica
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Tossine emolitiche
Formazione di pori attraverso la membrana
Attività fosfolipasica che idrolizza la fosforilcolina della membrana
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Fig 7.3 LA placa
83
Esotossine che agiscono a livello delle strutture della superficie cellulare
Tossina esfoliativa →sindrome cute ustionata
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Tossine emolitiche (emolisine o citolisine)84
TOSSINE ENTEROTOSSICHE
Citotossiche che causano danni evidenti alle celluleCitotoniche danni non evidenti
Colerica è il prototipo (80.000 daltons)Subunità A 29.000 e 5-6 subunità B identiche 10.500Le sub. B si legano al recettore sulla membrana e facilitano l’ingresso della A
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ALa A induce una ADP-ribosilante NAD-dipendente sul GTP che attiva inmodo permanente l’adenilciclasiquesto provoca un perturbazione nel passaggio di acqua ed elettroliti(perdita di acqua attraverso il lume intestinale)
Con meccanismo simile si ritrova in E. coli, K. pneumoniae, S. typhimurium e S. enteritidis
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Tossina pertossica
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L’esotossina dissenterica è prodotta dalla Shigella dysenteriae di tipo 1.Neurotossica ed enterotossica. L’inibizione della sintesi proteica avviene con unmeccanismo non ancora noto. Si osserva un’inibizione del trasferimento degliamminoacidi sulla catena peptidica nascente.
Tossina della pertosse. Proteina (100.000 D) composta da 5 subunità.La produzione di cAMP è regolata da due proteine situate all’interno della
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
La produzione di cAMP è regolata da due proteine situate all’interno dellamembrana cellulare: Gs che ha funzione stimolante e Gi che svolgeattività inibente. La tossina colerica ha come bersaglio finale la Gsmantenendola in uno stato attivo permanente, mentre la tossina della pertosseinteragisce con Gi impedendo qualsiasi attività inibente.
88
TOSSINE PANTROPE
Tossina difterica (prototipo), catena polipeptidica di 62.000 D unita da 2 ponti S-S, la molecola è tagliata da proteasi in due frammenti A e B che restano uniti da S-S. Il frammento B riconosce il bersaglio cellulare, mediante la sua parte COOH terminale, sulla superficie della cellula. Si lega alla parte idrofoba della membrana e crea un canale attraverso il quale il frammento A penetra all’interno. Il glutatione (presente all’interno della cellula) libera il frammento
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Il glutatione (presente all’interno della cellula) libera il frammento A, enzimaticamente attivo (ADP-ribosilante). Agisce sul NAD staccando ADP-riboso che interagisce con il fattore EF2 bloccando la traslocazione sul ribosoma. Il complesso EF2-ADP potrebbe ancora reagire con il ribosoma e il GTP (che fornisce energia), tuttavia è bloccata l’idrolisi del GTP, non si ha quindi energia e la sintesi proteica è interrotta.
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Esotossine che inibiscono la sintesi proteica cellulare
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Esotossine citotossiche per azione sul citoscheletro
Sono tutte tossine binarie, formate cioè da due distinti componenti A e B che sono secreti separatamente e si riuniscono solo alla superficie della cellula bersaglio, possiedono tutte un attività catalitica ADP-ribosiltransferasica ed hanno come specifico bersaglio l’actina.C2 di C. botulinum, fattore citotossico necrotizzante prodotto da molti stipiti di E. coli uropatogeni nell’uomo
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C2 di C. botulinum, fattore citotossico necrotizzante prodotto da molti stipiti di E. coli uropatogeni nell’uomo e animali e la tossina dermonecrotica di Bordetella spp.Tossine sono denominate CDT (cytolethal distending toxins) dimostrate in in E.coli, Shigella e Salmonella. induce danni nel DNA che innescano i sistemi di riparo e il blocco del ciclo cellulare Le cellule bersaglio principali sono monociti- macrofagi.
91
TOSSINE NEUROTROPE
Tetanica e del carbonchio attive sulle cellule del SNCBotulinica attiva sulle cellule del sistema periferico
La botulinica blocca la liberazione di acetilcolina nella giunzione neuromuscolare si ha quindi paralisi flacida (meccanismo non noto)
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
(meccanismo non noto)
La tetanica blocca l’inibitore del riflesso si ha quindi contrazione, diffonde attraverso il midollo spinale e giunge ai centri nervosi, blocca i mediatori (glicina, acido gamma-aminobutirrico, nucleotidi ciclici) si fissa sui recettori gangliosidici della membrana dei motoneuroni a livello presinaptico (paralisi spastica)
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GABA
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Tossina botulinica
Sulla base del valore di LD50 di circa 1 ng/kg, poche centinaia di grammi di questa tossina potrebbero teoricamente uccidere ogni essere umano presente sulla Terra (a scopo comparativo, la
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sulla Terra (a scopo comparativo, la stricnina richiederebbe 400 tonnellate per uccidere ogni essere umano). Generalmente le dosi letali orali risultano comprese fra 0,5 e 5 mg/kg di alimento ingerito.
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Endotossina
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Glucosamina fosforilata ed esterificata con acidi grassi saturi
Ripetizione di unità diverse nelle diverse specie
Contribuisce alla tossicità del Lipide A influenzandone l’idrosolubilità e la struttura
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Endotossina
LPS si lega a proteina di memb. CD14 (recettore) dei macrofagiLe LBP prodotte dal fegato e presenti in circolo si combinano con LPS e catalizzano il suo trasferimento sul macrofago e il legame con
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si combinano con LPS e catalizzano il suo trasferimento sul macrofago e il legame con CD14Recettori Tlr presenti sui macrofagi in contatto con LPS legato a CD14, trasducono il segnale di membrana → rilascio citochine
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Endotossina
In passato si riteneva che LPS agisse direttamente sulle membrane biologiche
Oggi si sa che:
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stimola i macrofagi al rilascio di sostanze che sono le reali effettrici dell’attività tossica
Attiva la cascata del complemento
Attiva la cascata della coagulazione
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Effetti dell'endotossina
- febbre (attivazione di IL-l)
- neutropenia: adesivita' delle cellule ai vasi, granulocitosi- ipoglicemia: intensa attività metabolica cellulare glicolisi- ipotensione: vasodilatazione, permeabilità, stagnazione di
liquidi- anormale perfusione di organi essenziali
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- anormale perfusione di organi essenziali- attivazione del complemento
- disseminata coagulazione intravascolare- reazioni di Schwartzman (locale e generalizzata)
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Superantigene
Alcune tossine particolari liberate da alcunipatogeni attivano le cellule T senza richiesta diantigene, si legano al recettore di queste cellule siaa quello del complesso maggiore diistocompatibilità che può scatenare una risposta
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
istocompatibilità che può scatenare una rispostaimmune nei confronti delle stesse cellule, quindimolto rischioso. Esempi di queste tossine sonoquelle dello shock tossico di S.aureus e quelleeritrogeniche di S.pyogenes.
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superantigeni
Enterotossine stafilococcicheTSST (Tossina dello Shock Tossico)T. pirogeniche streptococcicheDevono parte della loro tossicità a:
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Devono parte della loro tossicità a:Specifica attività enzimatica (es. attivazione interleuchinaSono fortemente pirogene Interagiscono con i LT, attivazione e moltiplicazione in % amplificata (2-20% vs 0.0001-0.01% normale Ag)
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A. L’antigene convenzionale,internalizzato ed elaboratodalla cellula viene espostonel contesto del MHC II alriconoscimento del TCR conspecifica capacitàcombinatoria
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combinatoria
A. Il superantigene legadirettamente, senzaprecedente internaliz. edelaboraz., le proteine delMHC II e il TCR
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Infiammazione
Si ha in risposta di infezione batterica, ma inparticolare per i virus, si ha un eccesso dirisposta immune in proporzione al processo
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
risposta immune in proporzione al processoinfettivo. Chlamydia, Borrelia e sifilide, maanche streptococchi (febbre reumatica)
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
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IgA
Le IgA o immunoglobuline secretorie si trovano intutti gli epiteli in contatto con l’esterno. Siformano, attraverso la cattura, da parte dellecellule M (microfold) che sono localizzate neipressi delle placche del Peyer, di corpi estranei,virus, batteri, tossine, ecc. Queste cellule nonhanno attività fagocitaria, presentano quindi
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
virus, batteri, tossine, ecc. Queste cellule nonhanno attività fagocitaria, presentano quindil’antigene ai macrofagi sottostanti che lodigeriscono e lo presentano alle cellule T cheelaborano le IgA specifiche, in questo modol’organismo ha immunoglobuline per contrastarel’invasione dei microorganismi più frequentementepresenti.
109
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110
IgA
La mucosa intestinale secerne Ig, in particolare IgA. Si calcola che ne siano prodotte dai 40 ai 60 mg al giorno per ogni kg di peso corporeo. Nelle placche del Peyer vengono prodotte anche IgM. Le IgA sono considerate l’elemento primario per
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
111
Le IgA sono considerate l’elemento primario per la risposta immunitaria verso gli antigeni microbici. Le IgG fanno parte della risposta immunitaria innata della mucosa.
INTERAZIONI TRA BATTERI Infezioni polimicrobiche
Possono essere più gravi di quelle
causate da un singolo patogeno
quando le interazioni tra le singole
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
specie
trasformano un’infezione mista in
una
INFEZIONE SINERGICA
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INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico
E’ un fenomeno comune e
importante nella produzione di
infezioni miste di
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
infezioni miste di
aerobi ed anaerobi
specie in tessuti a lento ricambio o
drenaggio o dove l’eliminazione
dei patogeni è rallentato
113
INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico
E’ un fenomeno ben documentato
nelle infezioni sperimentali
intraddominali
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
intraddominali
tessuti molli
setticemie
dentali
ginecologiche
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INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico
E’ un fenomeno ben documentato
nelle infezioni sperimentali
Da peritoniti sono stati isolati i vari
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Da peritoniti sono stati isolati i vari
microorganismi in coltura pura:
Rinoculati in animali
Singola specie: innocua
Coltura mista: palese infezione
115
INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico (ipotesi)
Favorevoli modifiche dell’ambiente
Provvedere a nutrienti essenziali
Provvedere a fattori di virulenza
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Provvedere a fattori di virulenza
Modulare la risposta immunitaria
Protezione reciproca nei confronti degli agenti antibatterici
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INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Favorevoli modifiche all’ambiente
Il consumo di O2 da parte dei batteri aerobi nella popolazione mista produce condizioni favorevoli alla proliferazione degli anaerobi, i quali a loro volta proteggono i batteri
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
i quali a loro volta proteggono i batteri aerobi dalla fagocitosi
Il basso pH dovuto al metabolismo di molti aerobi e acidogeni crea situazioni favorevoli per lo sviluppo di anaerobi e acidofili
117
INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Favorevoli modifiche all’ambiente
Molte specie aerobie che producono capsula
(E.coli, K.pneumoniae, S.pneumoniae)
raramente producono ascessi se
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
raramente producono ascessi se
agiscono come unico patogeno
mentre il Bacteroides fragilis (anaerobio)
produce una capsula che è in grado di
promuovere la formazione di ascessi
118
INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Favorevoli modifiche all’ambiente
ASCESSO: UN AMBIENTE PROTETTO
La formazione sinergistica di un ascesso provvede:
una barriera alla diffusione degli agenti antibatterici
una barriera ai fattori dell’immunità dell’ospite
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
una barriera ai fattori dell’immunità dell’ospite
allo sviluppo di più specie batteriche che:
>elaborano enzimi inattivanti gli antibiotici (β-lattamasi, cinasi anti aminoglicosidi ecc.)
>causano strette condizioni di anaerobiosi che compromettono l’attività di di aminoglicosidi e chinoloni così come la fagocitosi
119
INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Provvedere a nutrienti essenziali(commensalismo)
Veillonelle e difteroidi sintetizzano vit. K (naftaquinone) che è richiesto da B.melaninogenicus per crescere e per esprimere la virulenza
S.mutans produce PAB utilizzato da S.sanguis
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
S.mutans produce PAB utilizzato da S.sanguis
I treponemi fanno uso di acidi grassi (butirrico e succinico) liberato da anaerobi (fusobatteri, batteroidi)
Le Veillonelle metabolizzano ac. lattico liberato dalla popolazione microbica normale (PMN)
Molti batteri della cavità orale usano ac. lattico liberato dagli altri commensali
120
INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Provvedere a fattori di virulenza
Fusobacterium necrophorum elabora una
leucocidina che protegge
Corynebacterium pyogenes dall’attività
battericida dei leucociti. (C. pyogenes produce un
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
battericida dei leucociti. (C. pyogenes produce un
fattore di crescita per F. necrophorum)
S. aureus produce ialuronidasi che esalta
l’attività necrotica degli streptococchi
anaerobi e conduce alla distruzione dei
tessuti
121
INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Modulazione della risposta immunitaria
Nelle infezioni miste gli anaerobi inibiscono la fagocitosi degli aerobi mediante disturbi o indebolimenti delle attività di:opsonizzazionechemiotassi dei neutrofiliproduzione di ossigeno
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
produzione di ossigenobatteriocidiaAttraverso il meccanismo di:diminuzione delle opsonine del sieroproduzione di acidi grassi volatili (butirrico e succinico) tossici per la fagocitosiproduzione di leucocidine
122
INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Protezione reciproca nei confronti degli agenti antimicrobici
B. fragilis e altre specie anaerobie producono β-lattamasi
Nelle infezioni miste questi enzimi proteggono le specie sensibili ai β-lattamici inattivando questi
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
specie sensibili ai β-lattamici inattivando questi antibiotici (patogenicità indiretta)
B. fragilis e vari Clostridi possono aminofenilare il cloramfenicolo rendendolo inefficace sulla restante popolazione batterica mista
123
INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico
Strategie terapeutiche
L’eliminazione selettiva di un componente della popolazione mista fa fallire il sinergismo batterico
Farmaci a spettro ristretto
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Farmaci a spettro ristretto
Eliminazione di tutti i patogeni in causa
Antibiotici ad ampio spettro
usualmente β-lattamici
in caso di allergie: macrolidi o altri agenti
124
Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite
Capsula: per mascherare le cellule opsonizzate ostacola lafagocitosi (S.pneumoniae, K.pneumoniae, H.influenzae)Coagulasi: il germe si annida nel coagulo per proteggersidalle difese in generale S.aureusFibrinasi, jaluronidasi, collagenasi: distruggerel’integrità dei tessuti con penetrazione all’interno (molti
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l’integrità dei tessuti con penetrazione all’interno (moltiopportunisti)Compromettere la funzionalità dei fagociti e dellecellule ciliate: BordetelleProduzione di enzimi citotossici: S.aureus,S.pyogenes, Pseudomonas spp.A livello di fagocitosi: blocco dei processi ossidativi(Salmonella, Legionella) impedire la fusione tra fagosoma elisozima (Gonococchi, Micobatteri)
125
Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite
Cattura del ferro (siderofori) in competizione con lattoferrina
Sfuggire alla risposta immunitaria: liberare la capsula(pneumococchi)
Variazioni di antigenicità (Borrelia e gonococchi) E.coli KI nella
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Variazioni di antigenicità (Borrelia e gonococchi) E.coli KI nellameningite infantile
Cattura di materiale dell’ospite e distribuirlo sulla superficieesterna per confondere la risposta immunitaria (Treponema pallidum)
Liberare la proteina A che si lega alla porzione Fc delle Ig cheprovoca l’inversione dell’anticorpo (S.aureus)
126
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite
Fase aerobia (aerobi, >>>ATP)
Fase anaerobia (aerobi, <<<ATP)
Fase planctonica
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Fase sessile
Ridotta tossicità di LPS P.aeruginosa, Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Morte cellulare programmata (PCD)
128
Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite
Biofilm: Ig, macrofagi, antibiotici, replicazione lentaFase intracellulare, per sfuggire ai macrofagi, Ig e a molti antibiotici, tasso di crescita
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
e a molti antibiotici, tasso di crescitaInduzione di forme filamentoseQuorum sensing, attivazione di alcune funzioni cellulari mediate da ferormoni (in funzione del numero)Attivazione di uno stato vitale ma non coltivabile
129
S. pneumoniae
S. pneumoniae is known for its ability to enter into a state ofgenetic competence under conditions of high celldensity in response to a secreted signaling peptide (QS).Only a fraction of the S. pneumoniae cells becomecompetent in response to the peptide autoinducer andelaborate a bacteriocin that causes the lysis of
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
130
elaborate a bacteriocin that causes the lysis ofnoncompetent cells.
The lysed cells release not only transforming DNA andnutrients but also pneumolysin and other factorsimportant for virulence.
S. pneumoniae sacrifices some its relatives for this purpose which facilitates invasion of its host.
Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
La vita dei microorganismi èprevalentemente sessile e solo unafrazione minima (<0,1 %) mantiene
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
frazione minima (<0,1 %) mantieneuno stato planctonico
131
Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
La semplice adesione ad una superficie,attiva nel microorganismol’espressione di molti geni checodificano sia per tutti i prodotti
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codificano sia per tutti i prodottideputati alla vita sessile sia quelli chesono coinvolti nei meccanismi dipatogenicità e virulenza
132
Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
Una volta che i batteri sono adesi, essi siorganizzano in microcolonie. Questofenomeno implica la presenza di unbiofilm, ove i microorganismi sono
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
biofilm, ove i microorganismi sonoimmersi, costituito da polisaccaridi eprodotti metabolici che, come già detto,mediano adesività tra i microorganismi egli epiteli e tra i batteri stessi.
133
Biofilm : una resistenza fenotipica
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm
Dunne WM Jr . Clin Microbiol Rev 2002;15:155-166 134
Fasi del biofilmBiofilm : una strategia batterica
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm
rilascioorganizzazioneadesioneSalvatorelli G. et al.Biofilms: stato dell’arte l’INTERNISTA, 10 (4), 2002Dunne WM Jr . Clin Microbiol Rev 2002;15:155-166 135
Biofilm : i riflessi negativi !..
• Protezione vs anticorpi• Ridotta attività PMN
nessuna fagocitosi • Rilascio di enzimi
inattivanti gli ATB• Rilascio di enzimi
inattivanti gli ATB
Solo gli elementi planctonici sono distrutti :• normali processi di difesa
• antibioticiLewis K et al : Antimicrob Agents Chemother 2001;45:999-1007136
Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
Il biofilm rappresenta un nido di microorganismi anche quando tutte le forme planctoniche sono state uccise.
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forme planctoniche sono state uccise. Questo spiega perché i cateteri colonizzati sono sorgenti di gravi infezioni con scarse possibilità di successo terapeutico.
137
Impianto su superfici mucoseImpianto su superfici mucose
Center for Disease Control and PreventionCenter for Disease Control and Prevention
stima chestima chela formazione di biofilmla formazione di biofilm
Biofilm in patologia umana
http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm
Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nature Rev. Drug Discov. 2: 114-122, 2003
Potera C. Forging a link between biofilms and disease.Science 283: 1837-1939, 1999
la formazione di biofilmla formazione di biofilmsia implicata almeno nel sia implicata almeno nel 6565--80%80%
di tutte le infezionidi tutte le infezionicroniche e/o recidivanti.croniche e/o recidivanti.
138
Biofilm batterici e Infezioni recidivanti
• Endocarditi: valvole naturali o artificiali • Quadri legati a inserzione di cateteri, protesi, lenti,tubi endotracheali• Otiti,sinusiti
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• Otiti,sinusiti • Prostatiti, uretriti ,cistiti • infezioni vie biliari•Fibrosi cistica
Riacutizzazioni di BPCO
Costerton JW e al :Science 1999;284 :1318-22139
“ Biofilm “ su superfici inerti
140
• Prevenire la formazione di biofilm
• Disgregare biofilm, già esistenti
Attacco al Biofilm
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Sethi et al. N Engl J Med 2002; 347: 465-471
• Disgregare biofilm, già esistenti
• Eradicare i microrganismi negli strati più profondi del biofilm
141
La strategia terapeutica deve tener conto che gli antibiotici attualmente in uso
sono stati sviluppati e studiati
Attacco al Biofilm
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Creson M. Focus: Bacterial Cities TimesDispatch.com 13 Gennaio 2003
sono stati sviluppati e studiati per agire contro batteri planctonici
e non organizzati in biofilm
142
Attacco al Biofilm
Eradicare le cellule planctoniche ! responsabili dell’episodio acuto,
per ritardare :
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per ritardare : colonizzazione,
potenziale produzione di biofilmrecidivare dell’infezione
Kobayashi H. Int J Antimicrob Agents 2001 ; 17:351-56 143
Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
Nel loro insieme queste osservazioniindicano che la fase planctonica è quellache favorisce la disseminazione della vita
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
che favorisce la disseminazione della vitamicrobica, mentre la fase sessileall’interno del biofilm è favorevole allasopravvivenza.
144
Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza
Lo sviluppo del biofilm è condizionato dalla presenza nell’ambiente di un fattore prodotto dagli stessi microorganismi autoinducente che a sua volta dipende dal
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
autoinducente che a sua volta dipende dal numero dei batteri, il fenomeno è noto come quorum sensing
145
Quorum Sensing
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Dinamica delle Popolazioni BattericheLaboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia
146
Espressione di un gene in funzione della densità dei batteri
Quorum sensing
E’ stato identificato nel 1970 su un batterio luminescente il Vibrio fischeri che colonizza un cefalopodo. Il microorganismo è presente in mare ad una concentrazione di circa 100
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
in mare ad una concentrazione di circa 100 cell/ml. Mentre sull’organo luminoso del pesce raggiunge 1010 cell/ml e diviene luminescente.
147
Espressione di un gene in funzione della densità dei batteri
Quorum sensing
I batteri elaborano un prodotto specie specifico (omoserinalattone) diffusibile nell’ambiente ove permane e si accumula.
Quando la concentrazione raggiunge un limite
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Quando la concentrazione raggiunge un limite condizionato dal numero dei batteri presenti si ha induzione del gene bersaglio.
148
Quorum sensing
Il sistema detto luxI~luxR è stato identificato in molte specie ed è tutto da valorizzare.
E’ un sistema molto economico per rivelare la
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
E’ un sistema molto economico per rivelare la propria presenza solo quando il numero è sufficientemente alto per avere tutti i vantaggi (nutrimenti, trasferimento di geni, fattori di patogenicità e virulenza, ecc.)
149
Quorum sensingApplicazioni
E’ stato dimostrato che se in P.aeruginosa si inattiva il gene las il microorganismo perde i suoi caratteri di patogenicità.
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Si possono rendere innocui i patogeni eliminando il loro sistema quorum sensing?
150
Quorum sensingApplicazioni
Trovare composti che funzionano come gli autoinduttori ma bloccano il gene
Furanone è stato trovato in un’alga
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
Furanone è stato trovato in un’alga
ha dimostrato di interferire con il quorum sensing di Serratia liquefaciens.
151
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
152I Gram-positivi causano effetti simili ma usano mediatori diversi
La scoperta dei sistemi quorum sensing neibatteri gram-negativi ha non soloapprofondito le nostre conoscenze sullapatogenesi delle infezioni causate da questi
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Dinamica delle Popolazioni Batteriche
patogenesi delle infezioni causate da questiorganismi ma potrebbe anche provvedere aimezzi per il trattamento di queste comuni edimportanti infezioni
Hartman and Wise 2001
153
E’ noto che in natura i batteri si presentano con caratterist ichemolto diverse da quelle che mostrano in coltura in laborator io
L’ambiente naturale può essere sfavorevole alla crescita e allasopravvivenza di molti batteri, specialmente di quelli adattati asopravvivenza di molti batteri, specialmente di quelli adattati amoltiplicarsi nell’uomo o negli animaliQuesti microorganismi hanno sviluppato risposte sofistic atealle variazioni ambientali
154
Quando le condizioni ambientali non sono idonee all a crescita, i batteri entrano in una fase programmata di
sviluppo che risulta in uno stato metabolico meno attivo e rende il batterio più resistente.
•Aumento della resistenza agli agenti antimicrobici
•Cambiamenti nell’idrofobicità di superficie e nelle capacità adesivecapacità adesive
•Cambiamenti a carico degli acidi grassi di membrana , degli aa della parete
•Cambiamento di forma
•Topologia del cromosoma
155
156
I BATTERI SI ADATTANO ALLE VARIAZIONI AMBIENTALI MEDIANTE
•Induzione della sintesi di sistemi di cattura dei nutrienti presenti in concentrazioni ridotte
•Modificazione della sintesi di alcuni enzimi allo s copo di utilizzare efficientemente i nutrienti presenti in
concentrazioni ridotte
•Modulazione del tasso di incorporazione dei nutrien ti •Modulazione del tasso di incorporazione dei nutrien ti presenti in eccesso
•Riorganizzazione di alcune vie metaboliche allo scopo di evitare possibili blocchi
Coordinamento dei tassi di sintesi per mantenere la crescita bilanciata
157
VBNCviable but non culturable
(Xu et al. 1982)
I batteri in stato VBNC sono metabolicamente attivi ma non sono in
grado di attuare i processi divisionali che grado di attuare i processi divisionali che portano alla formazione di colonia sui
terreni di coltura normalmente utilizzati per il loro rilevamento
158
FATTORI CHE INFLUENZANO
L’ATTIVAZIONE DELLO STATO
VBNC
Scarsità di nutrienti
Temperatura
LuceLuce
Salinità
Pressione idrostatica
Ossigeno
159
ELENCO DI ALCUNI BATTERI CHE
POSSONO ATTIVARE LO STATO
VBNC
Aeromonas
Agrobacterium
Alcaligenes
Pseudomonas
Rhizobium
Salmonella
Enterococcus
Escherichia
Helicobacter
Campylobacter
Enterobacter
Shigella
Vibrio
Yersinia
Klebsiella
Legionella
Micrococcus
160
SAGGI UTILIZZATI PER LA DIMOSTRAZIONE DELLA VITALITA’ BATTERICA
•Conta Vitale Diretta (DVC)
•Immunofluorescenza - Conta Vitale Diretta (DFA -DVC) •Ricerca di RNA Vitale Diretta (DFA -DVC)
•Colorazione con cloruro di tetrazolio (CTC)
•Colorazione con “Live/Dead bacLight Viability kit”
•Ricerca di RNA messaggero (RT-PCR)
•Ricerca di antigeni specifici dello stato VBNC
161
Le cellule non coltivabili (VBNC, stressate) possono rappresentare un problema
per la salute pubblica se per la salute pubblica se non rilevate con saggi
adeguati
162
163
164
165
166
167
Filamentation of bacteria in response to environmental cues.
a | Innate immune cues. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) reside intracellularly within bladderepithelial cells. A small number of intracellular bacteria respond to the activation of host immuneeffectors by filamentation. Epithelial-cell death accompanies bacterial growth, thereby resulting in theexposure of filamentous and bacillary organisms on the surface. The filamentous form is resistant toneutrophil phagocytosis. The recovery from filamentation results in the invasion of naive epithelial cellsto begin the process again.
168
Filamentation of bacteria in response to environmental cues.
b | Predator sensing cues. Marine bacterial populations are made up of multiple species,including the prototypical Flectobacillus spp. Protist grazing on all species stimulatesfilamentation in Flectobacillus spp. Filamentous forms cannot be grazed by marine protists.Recovery from filamentation results in an alteration in the diversity of bacteria in theenvironment and the depletion of non-Flectobacillus species
169
Filamentation of bacteria in response to environmental cues.
c | Quorum sensing cues. Proteus mirabilis grows as a bacillary form that can count the number ofsimilar species in the vicinity by quorum sensing. If a quorum of organisms is verified, the bacteriarespond by initiating the differential gene expression that leads to filamentation. Although amechanistic reason for filamentation in Proteus spp. Is under debate, the evidence suggests that thismorphology leads to enhanced invasion of the urothelium, thereby providing protection from thehost immune response. Dissemination into the tissue disperses the swarming filaments. Cell divisionis restored owing to low levels of quorumsensing molecules in the tissue.
170
Filamentation of bacteria in response to environmental cues.
d | Antimicrobial cues. Filamentation occurs if bacteria are exposed to certain β-lactam antibiotics invitro and in vivo. Filamentation allows for survival until the antibiotic is diluted or becomes inactive.The restoration of cell division occurs once the antibiotic activity is lost. In some cases, for example,Burkholderia pseudomallei, cell-division capacity is maintained even in the presence of antibiotics ofsimilar and dissimilar classes, which indicates that protection has been conferred to daughter cells. The
mechanisms and consequences of this response have not yet been explored.
171
172
INVASIONE CELLULARE da parte di batteri enteropatogeni
173
Cos‘è un batterio enteropatogeno invasivo?
• I batteri invasivi sono capaci di promuovere il loro ingresso in
cellule che non sono fagociti professionisti.
• I batteri enteroinvasivi raggiungono il lume intestinale,
aderiscono alle cellule dell’ospite e superano la b arriera naturale,
estremamente impermeabile, rappresentata dalle cell ule epiteliali
Esempi :
Yersinia enterocolitica e Yersinia pseudotuberculosis
Shigella spp.
Salmonella spp.
Listeria monocytogenes174
Barriere all‘infezione batterica nel tratto gastro-i ntestinale
175
La barriera dell‘epitelio intestinale
176
Cellule M: il punto debole, il tallone d‘Achille
Le placche del Peyer (formate da un centro germinativo di lin fociti B circondato dalinfociti T) si trovano nella sottomucosa dell’intestino t enue. L’epitelio sovrastante leplacche presenta cellule M, cellule epiteliali specializzate nel consentire il passa ggiodi particelle nel tessuto linfoide sottostante.La superficie basolaterale invaginata forma una superfici e dove migrano linfociti emacrofagi. Molecole e particelle vangono trasportate nell a tasca.
177
Fattori che determinano se il batterio sarà internalizzato o no:
• Natura del recettore sulla cellula ospite
• Forza dell’interazione
• Capacità del batterio di inviare segnali che • Capacità del batterio di inviare segnali che stimolano o antagonizzano l’internalizzazione
178
STUDI IN VITRO E IN VIVO
Colture cellulari
Diverse linee cellulari sono state usate per studiare l’inv asionebatterica: sistema eccellente, riproducibile e non compli cato, macon diverse limitazioni
Modelli animali
Dopo che i dettagli molecolari sono stati determinati in vit ro,possono essere poi verificati in modelli animali
179
Meccanismi di invasione cellulare
TriggerZipper
Yersinia, Listeria Salmonella, Shigella
180
Ingresso di Listeria monocytogenes in fagociti non professionisti in vitro
Sono coinvolte almeno due proteine di superficie: • Internalina (InlA): proteina di superficie che è an corata covalentemente alla parete
• InlB: proteina di superficie legata debolmente alla parete
181
in vivo
• I topi non sviluppano una malattia letale dopo infezione per os conListeria: scarsa traslocazione dei batteri attraverso l’intestino•Risultati simili con Listeria wt o mutanti inlA
• Cellule che esprimono E-cadherin di topo, al contra rio di cellule che esprimono E-cadherina umana, non permettono ingress o di Listeria via inlA
Listeria wt causa una malattia sistemica in topitransgenici che esprimono caderina E umana neglienterociti, mentre mutanti InlA sono incapaci diattraversare la barriera intestinale efficientemente
•la specie specificità è dovuta a differenze in un si ngolo aa
182
Model of invasion of the intestinal epithelium by Listeria
183
184
Motilità dipendente dalla polimerizzazione
di actina• Polimerizzazione dell’actina con
formazione di code• Si muove nel citoplasma• Invade le cellule adiacenti• Invade le cellule adiacenti• ActA: proteina di 90 kDa,
determina il reclutamento e l’assemblaggio dei filamenti Localizzata ad una estremità del batterio
Velocità: 1um/sec
185
• I batteri a contatto con la membrana plasmatica continuano a muoversi• Producono protusioni che si estendono nella
cellula adiacente: listeriopodi• Si forma una vescicola con due membrane e la
cellula si libera nel citoplasma
Ingresso nella cellula adiacente e fuoriuscita dal vacuolo secondario
Per la fuoriuscita dai vacuoli:
• Listeriolisina• PC- PLC: proteina extracellulare 28 kDa fosfolipasi
a largo spettro, idrolizza la fosfatidil colina (PC)• Metallo proteasi: trasforma il precursore di PC-
PLC (33 kDa) in forma attiva (28 kDa)• Le due fosfolipasi determinano la lisi di entrambe le
membrane cellulari. Non è noto se svolgano ruoli diversi nei due compartimenti che formano il vacuolo Pseudopodi: 40 um
Per la fuoriuscita dai vacuoli:
186
plcBhlyA
actA
hlyA plcA
inlA/B
actA
inlA: internalina; hly: listeriolisina; plcA: PI- PLC (una fosfolipasi);
actA: polimerizzazione actina; plcB: PC- PLC (una fosfolipasi) 187
188
The invasive phenotype of Shigella is dependent on a type III secretion system encoded by a 30 kb region of a 200 kb virule nce plasmid
VIRF: quando il batterio cresce a 37°C, la proteina plasmidica virF si lega al promotore di virB inducendo l’espressione della proteina virB, anch’essa plasmidicaVirB: attiva i promotori ipa, mxi, e spa.
Ipa B e C, si integrano nella membrana dell’ospite e promuovono la formazione degli pseudopodi
IpaA iniettata nel citoplasma dell’ospite favorisce la depolimerizzazione dell’actina accumulata intorno al sito d’ingresso del batterio. Le proteine IpaA servono anche per la lisi del vacuolo
IcsB lisa le membrane dei vacuoli; esposta sulla superficie o secreta
mxi membrane excretion of Ipa, and virulence vir genesspa surface presentation of invasion plasmid antigensspa e mxi operon: la loro espressione porta all’assemblaggio del complesso di traslocazione inattivo Mxi-Spa; l’attivazione avviene dopo il contatto con la cellula
IcsA ( VirG): una ATPasi localizzata sulla membrana esterna della cellula batterica, in posizione polare IcsA richiama sulla superficie della cellula batterica diverse proteine actino-associate, provocando la polimerizzazione dell’actina dell’ospite e lo spostamento della cellula batterica.
189
IPa (Invasion-Plasmid-Antigens)-ABCD
Ipa B e C, si integrano nella membrana
dell’ospite e promuovono la formazione degli
pseudopodi
FATTORI DI VIRULENZA plasmidici
IpaA iniettata nel citoplasma dell’ospite
favorisce la depolimerizzazione
IpaA (30 kDa) IpaB (62 kDa), IpaC (42 kDa), e
IpaD (35 kDa) in condizioni non secretorie sono accumulate nel
citoplasma legate ad una proteina di 18 kDa
(IpgC) che ne impedisce depolimerizzazione
dell’actina accumulata intorno al sito d’ingresso del
batterio. Le proteine IpaA
servono anche per la lisi del vacuolo
impedisce l’aggregazione e la
digestione
VIRF: quando il batterio cresce a 37°C, la proteina plasmidica virF si lega al promotore di virB inducendo l’espressione della proteina virB, anch’essa plasmidicaVirB: attiva i promotori ipa, mxi, e spa.
190
FATTORI DI VIRULENZA
spa surface presentation of invasion plasmid antigens
mxi membrane excretion of Ipa, and virulence vir genes.
spa e mxi operon: la loro espressione porta all’assemblaggio del complesso di traslocazione inattiva Mxi-Spa; l’attivazione avviene dopo il contatto con la cellula
IcsA ( VirG): una ATPasi localizzata sulla membrana esterna della cellula batterica, in posizione polare IcsA richiama sulla superficie della cellula
batterica diverse proteine actino-associate, provocando la polimerizzazione dell’actina dell’ospite e lo spostamento della cellula batterica.
IcsB lisa le membrane dei vacuoli; esposta sulla superficie o secreta
191
invasion plasmid antigens ipa, surface presentation of invasion plasmid antigens spa, membrane excretion of Ipa mxi, virulence vir genes.
Preinvasion step in the pathogenesis of Shigella spp. Ipa: invasion plasmid antigens; Mxi-Spa: membrane expression of Ipa proteins and surface presentation of antigens
A 37°C, VIRF e VIRB attivano operon spa, mxi e ipa
192
Early steps in the invasion of Shigella spp into M cells. Ipa: invasion plasmid antigen; Spa: surface presentation of antigens
193
194
195
Cytoskeletal rearrangements induced during Shigellainvasion of epithelial cells. Shigella secretes the effector proteins, such as IpaB, IpaC, IpaA and VirA, into host cells. IpaB and IpaC are integrated into the host membrane, and IpaC modulates Cdc42-dependent filopodial formation which, in turn, may cause activation of Rac1 and lamellipodial formation. IpaA binds vinculin, and the binds vinculin, and the resulting IpaA−vinculin complex promotes depolymerization of actin filaments, which is thought to be required for modulation of lamellipodial formation. VirA binds / -tubulin heterodimers and induces MT destabilization. VirA-induced MT destabilization would in turn lead to MT growth and stimulation of the Rac1 activity, and thus evoke the local membrane ruffling.
196
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