View
220
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
1/250
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CC. BIOLGICASDepartamento de Ecologa
INCIDENCIA DE LOS CONTAMINATES AMBIENTALESGENOTXICOS EN CLULAS DE TRUCHA ARCOIRIS
(ONCORHYNCHUS MYKISS)
MEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL GRADO DEDOCTOR POR Concepcin Becerril Moral
Bajo la direccin de la Doctora:Argelia Castao Calvo
Madrid, 2002
ISBN: 84-669-1679-2
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
2/250
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
IINNCCIIDDEENNCCIIAADDEELLOOSSCCOONNTTAAMMIINNAANNTTEESS
AAMMBBIIEENNTTAALLEESSGGEENNOOTTXXIICCOOSSEENN
CCLLUULLAASSDDEETTRRUUCCHHAAAARRCCOOIIRRIISS
((OOnnccoorrhhyynncchhuussmmyykkiissss))
Concepcin Becerril Moral.
Marzo, 2002
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
3/250
Este trabajo ha sido realizado en
el Servicio de Toxicologa del
Centro Nacional de Alimentacin
perteneciente al Instituto de
Salud Carlos III y financiado
CYCIT (proyectos AMB1994-0655-
CO2 y AMB1997-0431-CO2).
V B
Fdo.: Argelia Castao Calvo
Tesis dirigida por la Dra. Argelia
Castao Calvo y presentada por
Concepcin Becerril Moral para optar
al grado de Doctor en Ciencias
Biolgicas por la Universidad
Complutense de Madrid.
Fdo.: Concepcin Becerril Moral
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
4/250
A mis padres
A Antonio, Elena y Miguel
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
5/250
AGRADECIMIENTOS
Quisiera expresar mi mas sincero agradecimiento a todas aquellas
personas que de una manera u otra me ayudaron en la realizacin de este
trabajo:
En primer lugar y de forma muy especial a mi directora de tesis Dra.
Argelia Castao por darme su amistad a lo largo de tantos aos. Su
constante animo, ayuda y dedicacin ha hecho posible lo que en
muchos momentos considere imposible: la finalizacin de esta tesis.
Al Dr. Flix Sanz, Jefe de Servicio de Toxicologa Alimentara por las
facilidades que me ha concedido a lo largo de estos aos y que hanpermitido la realizacin de este trabajo.
Al Dr. Francisco Daz Pineda por su confianza al aceptar la ponencia
de esta tesis.
A Mar Ferrero que en todo momento ha estado a mi lado
ofrecindome su desinteresada ayuda y colaboracin. Esta tambin es
su tesis.
A Helda Acevedo que en este tiempo ha conseguido contagiarme de
su constancia y sentido practico. Adems, su colaboracin ha
permitido la finalizacin de esta tesis, de la que nunca dud.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
6/250
A mis compaeras, Irene, Mercedes, ngela, Thea, y Olga que gracias
a los buenos ratos compartidos han hecho que todo me pareciese ms
sencillo.
A M Luz por el cario e inters que mostr en la traduccin de
algunos de estos trabajos.
A Angelita del Pino por sus frases y refranes tan oportunos y por su
buen hacer en las tareas administrativas del servicio.
A Vicente Caldern y Henny Hooghuis que siempre han estado
dispuestos a ayudarme desinteresadamente cuando por una causa u
otra les he necesitado.
A Maria Bravo que siempre con palabras amables a mostrado su
inters y buena disposicin a colaborar.
A Carmen Rodrguez por su buen hacer en el mantenimiento de las
clulas y todos mis compaeros del Servicio porque de una forma u
otra han colaborado.
Por ltimo quiero agradecer a mi madre, a Antonio, Elena y Miguel por
haber estado siempre a mi lado mostrndome su constante
colaboracin, cario y apoyo.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
7/250
ndice i
INDICE
I. MEMORIA
1. INTRODUCCIN 1
1.1. Conceptos generales de la valoracin del riesgo
medioambiental 2
1.2. Medio Acutico: valoracin de efectos en poblaciones 10
1.3. Antecedentes metodolgicos de la tcnica de RAPD 23
2. JUSTIFICACIN Y OBJETIVOS 30
3. PLANTEAMIENTO Y RESULTADOS 33
3.1. Optimizacin de la Tcnica 33
3.1.1. Integridad del ADN 34
3.1.2. Ajuste de los parmetros de la reaccin 36
3.2. Capacidad para la Deteccin de Dao al ADN 38
3.2.1. Patrn de bandas especfico y reproducible 38
3.2.2. Condiciones ptimas de deteccin de dao al ADN 39
3.2.3. Sistema de anlisis para la deteccin de
alteraciones en el patrn de bandas42
3.3. Capacidad de Predecir el Dao in vivo 44
3.3.1. Similitud gentica entre los sistemas in vivo e in
vitro 45
3.3.2. Similitud de los efectos in vivo e in vitro 46
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
8/250
ndice ii
4. DISCUSIN 48
5. CONCLUSIONES 62
6. BIBLIOGRAFA 67
II. ANEXOS.
ANEXO 1. PROTOCOLO DEL ENSAYO 89
ANEXO 2. PUBLICACIONES
ANEXO 2.1. Characterization of RTG-2 Fish Cell
Line by Random Amplified Polymorphic DNA. (1998)
Ecotoxicology and Environmental Safety Vol. 40, pp
56-64 108
ANEXO 2.2. Detection of Mitomycin C-Induced
Genetic Damage in Fish Cells by use of RAPD. (1999).
Mutagenesis Vol. 14, n 5 pp. 449-456 120
ANEXO 2.3. DNA Fingerprint Comparison of Rainbow
Trout and RTG-2 cell line using Random Amplified
Polymorphic DNA. (2001). Ecotoxicology, Vol. 10 n 2
pp. 115-125 131
ANEXO 2.4. Detection by RAPD of Genetic
Alterations in vitro Amplification and conservation
conditions of DNA Extract. (2002) Toxicology Methods.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
9/250
ndice iii
Vol. 12, n 1 (en prensa) 144
ANEXO 3. PUBLICACIONES (en proceso de aceptacin)
ANEXO 3.1. In Vitro Assessment of DNA Damage
after Chronic Exposure to B(a)P using RAPD and
RTG-2 Fish Cell Line.ATLA. 169
ANEXO 3.2. In vitro Detection of Alterations in the
DNA after Acute Exposure to B(a)P Using the RAPDTechnique. Chemosphere. 198
ANEXO 4. PUBLICACIONES (en preparacin)
ANEXO 4.1. Deteccin de Alteraciones Genticas
en Truchas Arcoiris Expuestas a Benzo(a)Pireno. 230
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
10/250
I. MEMORIA
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
11/250
Introduccin 1
1. INTRODUCCIN
El desarrollo econmico producido en el ultimo siglo ha estado
ntimamente ligado a la utilizacin de una gran cantidad de productos qumicos
en todos los campos de la actividad humana. La liberacin continuada de los
mismos, o sus derivados, al ambiente ha generado problemas de
contaminacin a escala mundial que afectan tanto a la salud humana como al
mantenimiento de los ecosistemas.
El alcance global del deterioro ambiental fue puesto en evidencia ya en
los aos sesenta. Poco a poco se fue tomando conciencia de que los recursos
del planeta son limitados, y que era necesario controlar la actividad industrial
mundial y aunar esfuerzos para minimizar los efectos adversos de la
contaminacin. Estos dos objetivos se plantearon como retos sin precedentes
asumiendo que en cualquier actividad humana no existe el riesgo cero.
Consecuencia de ello fue la creacin de una estrategia mundial para la
conservacin de la naturaleza como pieza clave en la consecucin de un
desarrollo sostenible establecindose de forma explicita, por primera vez, la
existencia de una interrelacin dinmica entre economa y medioambiente.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
12/250
Introduccin 2
La respuesta institucional a esta nueva concepcin se recogi en el
Convenio sobre la Diversidad Biolgica firmado en la Conferencia de las
Naciones Unidas de Medio Ambiente y Desarrollo, celebrada en Ro de Janeiro
en 1992. Despus de la cumbre de Ro quedaron establecidos los principios
que deben regir las actuaciones medioambientales en materia de
contaminacin, y que pueden resumirse en: el Principio de precaucin, el
Principio de quien contamina paga, y el compromiso de todos los Estados de
aplicar las mejores tcnicas disponibles y las mejores prcticas
medioambientales, tomando las medidas necesarias para conseguir un
ambiente saludable en el marco de un desarrollo sostenible.
La gestin y conservacin de los sistemas naturales se ha incorporado a
las polticas de los diferentes pases de la OCDE (Organizacin para la
Cooperacin y Desarrollo Econmico), establecindose el desarrollo conjunto
de programas de investigacin y la elaboracin de normativas de gestin
medioambiental.
1.1 CONCEPTOS GENERALES DE LA VALORACIN DE RIESGO
MEDIOAMBIENTAL.
El concepto de riesgo medioambiental se puede definir como la
probabilidad de que el uso de una sustancia qumica o actividad humana pueda
producir efectos adversos sobre la estructura y funcin de los ecosistemas,
entendiendo stos como unidades discretas formadas por un conjunto de
factores abiticos y biticos que interactan para formar un sistema estable.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
13/250
Introduccin 3
(Smrchek and Zimamm 1998).
Los procedimientos de valoracin de riesgo se realizan mediante la
identificacin y cuantificacin de estos efectos adversos, y constituyen una
poderosa herramienta para la toma de decisiones en el proceso de gestin
medioambiental. Dichos procedimientos se encuentran en evolucin constante,
incorporando herramientas o metodologas cada vez mas precisas.
Bsicamente se realizan siguiendo las siguientes fases:
Evaluacin de la exposicin,
Identificacin del peligro,
Caracterizacin del riesgo,
Gestin del riesgo.
Las tres primeras estn basadas en la aplicacin de herramientas
cientfico-tcnicas, mientras que la ltima, la gestin del riesgo, implica una
toma de decisiones considerando factores socio-econmicos. En este contexto,
la ecotoxicologa, - rama de la toxicologa que trata de entender los efectos
txicos que los agentes fsicos y qumicos ejercen sobre el medio -, se ha
convertido en una herramienta muy valiosa en el binomio desarrollo econmico
/ medioambiente
La evaluacin de la exposicin consiste en determinar la
concentracin que previsiblemente puede alcanzar un xenobitico en un
determinado medio receptor.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
14/250
Introduccin 4
Cuando un xenobitico llega a un compartimento medioambiental, en
funcin de sus caractersticas y de las del medio receptor, puede ser
incorporado o absorbido por los organismos, puede formar complejos con la
materia orgnica o inorgnica del medio, o puede movilizarse rpidamente a
otros compartimentos (suelo - agua subterrnea, etc.) Todo ello determina la
concentracin final que alcanzar dicho contaminante y por tanto, la magnitud
de la exposicin.
La evaluacin de la exposicin, se calcula con modelos matemticos
mas o menos complejos, considerando las caractersticas fisicoqumicas del
compuesto -punto de fusin, solubilidad en agua, productos de degradacin,
persistencia, bioacumulacin etc-, su uso -frecuencia y duracin de la
exposicin, vas de exposicin, compartimentos afectados, etc- y las
caractersticas del medio receptor dureza, temperatura, pH, etc-.
El resultado se conoce como Concentracin Medioambiental Prevista
(PEC - Predicted Environmental Concentration) y es un valor numrico que
representa los niveles de exposicin a los que estn sometidos los organismos
que viven en el compartimento estudiado.
La identificacin del peligro se realiza mediante estudios de
ecotoxicidad, encaminados a identificar la naturaleza de los efectos producidos
por el contaminante y a establecer la relacin dosis (concentracin) - respuesta
(efecto).
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
15/250
Introduccin 5
El objetivo de esta fase es estimar la concentracin por debajo de la
cual una sustancia no es capaz de producir efectos adversos. Para ello se
determinan los efectos del contaminante sobre las especies representativas del
compartimento estudiado, a travs de todas las posibles rutas de acceso,
mediante estudios de ecotoxicidad. El resultado se expresa mediante un valor
numrico llamado Concentracin que Previsiblemente No producir Efectos
(PNEC - Predicted No Effect Concentration)
Los ensayos de toxicidad que se requieren para la identificacin del
peligro con fines de clasificacin en la Unin Europea o en la OCDE, son
siempre mtodos estandarizados por organismos de normalizacin nacionales
o internacionales. Metodolgicamente, los procedimientos bsicos utilizados en
la evaluacin de la toxicidad para sustancias industriales, existentes y de nueva
sntesis, biocidas etc., estn recogidos en el anexo V de la directiva
67/548/EEC de clasificacin, embalado y etiquetado y sus posteriores
adaptaciones al progreso tcnico.
En la fase de identificacin del peligro, cuando se trata de muestras
complejas, como vertidos o mezclas de contaminantes, o cuando se realiza una
valoracin de riesgo de un proceso industrial o cualquier otro procedimiento no
enmarcado en la normativa anteriormente citada, la gama de herramientas para
la valoracin de efectos ecotoxicolgicos se ampla considerablemente,
utilizando bioensayos o test de ecotoxicidad mucho ms verstiles y
sensibles.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
16/250
Introduccin 6
Un ensayo o test de toxicidad, en definitiva, no es mas que un
procedimiento que utiliza un sistema vivo (uno o varios organismos o clulas)
en presencia de la sustancia, compuesto o mezcla a estudiar y sobre el que se
valora el efecto que produce en unas condiciones previamente fijadas. Estos
resultados obtenidos en el laboratorio, deben ser capaces de predecir los
efectos de la sustancia estudiada en situaciones reales. La valoracin de
efectos se realiza mediante un sistema escalonado. En las primeras etapas se
utilizan modelos sencillos, como parmetros agudos de mortalidad (CL50) o de
efecto (CE50). Posteriormente, y en funcin de estos resultados iniciales, se
valoran efectos fisiolgicos crnicos o ms especficos (alteraciones en la
reproduccin, teratognesis, carcingenesis etc).
Los ensayos de ecotoxicidad pueden realizarse a cualquier nivel de
organizacin biolgica, desde molculas hasta ecosistemas completos. No
obstante, y en mayor medida que en la toxicologa humana, los ensayos de
laboratorio en ecotoxicologa conllevan un alto grado de incertidumbre, debido
a las complejas relaciones entre materia y seres vivos que existen en un
ecosistema.
La eleccin del organismo biolgico de ensayo determinar,
obviamente, el valor predictivo del mismo. De esta forma, y teniendo en cuenta
que existe una relacin directa entre el grado de representatividad y la
complejidad del sistema elegido, los estudios de campo seran los sistemas de
valoracin que ms se asemejan a la realidad, y por tanto, con mayor valor
predictivo. Sin embargo, su coste y la gran cantidad de variables a considerar,
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
17/250
Introduccin 7
los convierten en inapropiados, sobre todo en las primeras fases de
identificacin del peligro. Por esta razn solo se utilizan en ensayos
confirmatorios, en casos de diagnstico, o en aquellos casos donde el
resultado de la valoracin de riesgo necesite una confirmacin in situ,
considerando factores climticos y especies autctonas, como es el caso de
algunos productos fitosanitarios.
En la prctica, el procedimiento que ms se utiliza en ecotoxicologa,
consiste en la aplicacin de una batera de ensayos agudos o subagudos
utilizando especies representativas de distintos niveles trficos para un mismo
compartimento; normalmente, productores primarios, consumidores primarios y
secundarios y descomponedores.
Los ensayos con especies de pequeo tamao, (bacterias, algas o
microcrustceos) son relativamente baratos y no requieren grandes
instalaciones de laboratorio. Por el contrario, la aplicacin de ensayos sobre
vertebrados, como los bioensayos de peces, incluso en sus estados ms
tempranos requiere de instalaciones y personal cualificado en el mantenimiento
de las especies, adems de un gran volumen de muestra y del sacrificio de un
alto nmero de animales, lo que plantea problemas ticos.
Los ensayos in vitro que utilizan rganos aislados, cultivos primarios
de tejidos o clulas derivadas de vertebrados, permiten obtener informacin
acerca de la toxicidad de un compuesto qumico o de cualquier tipo de muestra
ambiental, evitando el sacrificio masivo de animales y reduciendo los
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
18/250
Introduccin 8
problemas tcnicos y econmicos. Es ms, desde un punto vista mecanicista,
los ensayos in vitro resultan idneos, pues permiten abarcar un amplio
numero de respuestas (mortalidad, efectos sobre el sistema inmune,
teratognicidad, mutagenicidad etc) eliminando las interferencias debidas a los
efectos sistmicos.
No obstante, la aplicacin de sistemas in vitro requiere un importante
esfuerzo en el desarrollo del ensayo para conseguir que sus resultados
adquieran precisin, sensibilidad, y lo que es ms importante, que demuestren
una buena correlacin con el ensayo in vivo que pretenden sustituir. Todo ello
es determinante para que el grado de prediccin sea aceptable desde un punto
de vista cientfico.
La caracterizacin del riesgo se lleva a cabo mediante la relacin de
los parmetros mencionados anteriormente, es decir, el nivel de exposicin de
un txico, y el efecto que produce sobre las especies seleccionadas como
representativas.
La caracterizacin del riesgo es el resultado, por tanto, de la relacin
entre la PEC y la PNEC para la especie que resulte ms sensible en cada
compartimento ambiental estudiado.
Si el cociente PEC/PNEC es menor o igual que la unidad, se considerar
que el riesgo es bajo y, por tanto, que no se requiere una mayor informacin
toxicolgica, es decir, ms ensayos. Si el cociente es mayor que uno, la
probabilidad de que se produzca un dao sobre el compartimiento considerado
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
19/250
Introduccin 9
ser grande, y, por tanto, se asumir que el compuesto tiene un alto riesgo
ambiental. En ese caso se decidir si son necesarios ms ensayos, y de que
tipo, o si se ha de reducir el riesgo adoptando medidas de mitigacin.
La caracterizacin del riesgo no es una tarea fcil, ya que la
vulnerabilidad de los sistemas biolgicos frente a la polucin por sustancias
qumicas depende de mltiples y complejos factores. La cuantificacin de los
parmetros analizados mediante ensayos ecotoxicolgicos adecuados, es la
nica manera de realizar de forma objetiva la caracterizacin del riesgo. Por
todo ello, es necesario incorporar metodologas cada vez ms especficas y
sensibles, que permitan reducir los niveles de incertidumbre que toda
estimacin de riesgo lleva asociada.
Por ltimo, la gestin del riesgo implica una toma de decisiones tras
realizar un balance coste / beneficio, considerando factores tales como la
posibilidad real de control, la preocupacin pblica, razones polticas, ticas,
intereses de los sectores de produccin, mantenimiento o mejora de la calidad
de vida, etc. De esta forma, la gestin del riesgo adquiere una gran importancia
y sus repercusiones afectan al conjunto de la sociedad.
Un eficaz sistema de gestin medioambiental debe disponer de los
conocimientos cientfico-tcnicos necesarios para predecir el riesgo que implica
la liberacin de contaminantes fsicos y qumicos, y su valoracin ltima debe
realizarse considerando el medio ambiente como un todo.
En la actualidad, este concepto globalizador ya ha sido recogido en
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
20/250
Introduccin 10
algunas normativas. As la Directiva Europea del Control y Prevencin
Integrado de la Contaminacin (96/61/CE) (IPPC- Integrated Prevention and
Control), que acaba de entrar en vigor en nuestro pas, exige a los organismos
responsables de la gestin medioambiental una valoracin integrada de los
riesgos inherentes a una determinada actividad industrial, y aunque por motivos
metodolgicos los anlisis de riesgo se aborden por compartimentos (acutico,
areo y terrestre), la valoracin final siempre debe ser realizada conjuntamente.
1.2 MEDIO ACUTICO: VALORACIN DE EFECTOS EN POBLACIONES
Actualmente la contaminacin se extiende a una buena parte de las redes
hidrogrficas, lagos y costas. Las causas de ello se deben en gran medida al
incremento del nmero de industrias que vierten sus residuos, en muchas
ocasiones sin depurar, al medio acutico, bien sean ros o zonas costeras.
Aunque tradicionalmente se ha tenido la tendencia a considerar que el medio
acutico, por un principio de simple dilucin y autodepuracin, era capaz de
asimilar cantidades ilimitadas de residuos; la deteccin de concentraciones
crecientes de diferentes contaminantes qumicos, metales pesados,
organoclorados etc., en organismos acuticos, ha puesto de manifiesto la poca
proteccin que supone el principio basado en la dilucin.
El compartimento acutico es sin duda el ms estudiado, tanto en lo que
se refiere al destino y comportamiento de los contaminantes, como en el
desarrollo de metodologas para la valoracin de los efectos en poblaciones
acuticas. Todo ello facilita los procedimientos de valoracin de riesgo, que en
ste compartimento ambiental estn muy bien definidos. De hecho, el inters
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
21/250
Introduccin 11
cientfico en la actualidad se ha desplazado desde la valoracin de los efectos
agudos, a considerar los efectos transgeneracionales que ejercen ciertos
compuestos qumicos sobre las poblaciones naturales. (Colborn et al., 1996;
Anderson et al., 1994).
Estos efectos pueden manifestarse de forma indirecta dando lugar a un
decrecimiento de la supervivencia, de la tasa de reproduccin, edad de
maduracin etc., de los individuos pertenecientes a las poblaciones afectadas. De
esta manera se provoca un proceso de seleccin o cuello de botella dirigido por la
accin del txico (Theodorakis et al., 2001) En consecuencia, la diversidad
gentica puede verse disminuida, e incidir negativamente sobre la capacidad de
adaptacin, viabilidad y persistencia de la poblacin expuesta. (Bickham and
Smolen, 1994; Bickham et al., 2000) (Figura 1)
Tambin los efectos transgeneracionales pueden manifestarse de manera
directa por la accin de los denominados agentes genotxicos, contaminantes
capaces de interaccionar y modificar la molcula de ADN. La alteracin del ADN
de las clulas somticas incrementa la incidencia de determinados tipos de
tumores, mientras que la alteracin del ADN de las clulas germinales de los
individuos expuestos se transmite a la descendencia. De esta forma, las
alteraciones a escala celular pueden modificar, finalmente, y tras periodos ms o
menos largos de tiempo, la estructura gentica de estas poblaciones (Bickham et
al., 2000) (Figura 2)
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
22/250
Introduccin 12
Las especies pisccolas estn directamente afectadas por ambos
procesos, pero los estudios a escala poblacional plantean graves problemas
prcticos, como disponer de poblaciones control, e incluso de metodologas
sensibles y especficas que permitan predecir de manera inequvoca, si un
contaminante es capaz de producir alteraciones en la dotacin gentica en una
poblacin. Sin embargo son numerosos los trabajos que asocian la presencia de
neoplasias en una gran variedad de especies pisccolas, con la presencia en el
agua de xenobiticos. (Harshbarger and Clark, 1990; Leblanc and Bain., 1997;
Malins et al., 1996; Dawe, 1969; Al-Sabti and Metcalfe, 1995) Por tanto, y
aunque en ecotoxicologa el centro de inters se establece a escala poblacional
mas que individual, la posibilidad de detectar a priori alteraciones genticas en
clulas somticas adquiere una gran importancia, permitiendo identificar
compuestos de relevancia ambiental (Shugart, 2000; Weinstein, 1988).
Tiempo
Diversidad
Gentica
Tamao de la Poblacin
Tamaode
laPoblacin
Diversidad Gentica
Figura 1. Relacin entre diversidad gentica y tamao de la poblacin.
( Bickham et al., 2000)
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
23/250
Introduccin 13
Mutgenos Ambientales
Mutaciones en Lnea GerminalMutaciones Somticas
Sustancias ToxicasMedioambientales
no mutagnicos
Dao en Clulas
Somticas y TejidosAlteraciones en
el Desarrollo
Disminucin de la
Diversidad Gentica de
la Poblacin
Alteracin de la Viabilidad
o Salud de los Individuos
Alteracin de los ProcesosReproductivos de los Individuos
Efectos Demogrficos:Declive de la Poblacin,
Cuellos de botella
Seleccin de Loci crticospara la Supervivencia en
un Medio Especficamente Contaminado Reduccin de la media de los parmetros de adapta
Adaptacin a un Medio Ambiente Contaminado: Perdida del Potencial deAdaptacin, Frecuencia alelica alterada .
Extincin o Extirpacinde poblaciones
Figura 2. Relacin entre los distintos efectos causados por la contaminacin
ambiental (compuestos mutagnicos o no mutagnicos) y la prdida de diversidad
biolgica. (Bickham et al., 2000)
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
24/250
Introduccin 14
En este sentido, y al igual que en los estudios de genotoxicidad en
mamferos, resultan de gran utilidad los ensayos in vitro. La utilizacin de
lneas celulares derivadas de especies pisccolas representativas constituye
una alternativa real a los bioensayos de peces, y presenta grandes ventajas
tcnicas como, por ejemplo, la capacidad de abordar un gran numero de
muestras con instalaciones de laboratorio poco sofisticadas, lo que se traduce
en una reduccin de los costes. En el mbito metodolgico, la homogeneidad
gentica de las clulas y su ciclo celular, permite simular estudios
transgeneracionales en periodos relativamente cortos de tiempo y con
volmenes de muestra reducidos (Tabla I) (Rachlin and Perlmuter 1968, Babich
and Borenfreund 1991; Castao et al., 1994; 1996; 2000; Segner, 1998, Fent
2001).
Concretamente, la lnea celular RTG-2 derivada de tejido gonadal de
trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss), es una de las mejor caracterizadas
(Figura 3) Se estableci a principios de los aos sesenta por Wolf y Kimby y
est incluida en la coleccin de cultivos celulares americana (ATCC) y europea
(ETCC). Es una lnea de morfologa fibroblstica, con una dotacin
cromosmica de 2n = 60, que retiene capacidad para metabolizar xenobiticos
(Clark, and Diamond, 1970; Thornton, et al., 1982) y que es viable en un
amplio rango de temperaturas (4 a 23 C), lo que permite investigar mltiples
variables cinticas, y adems resulta extremadamente til en la prctica diaria
de laboratorio.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
25/250
Introduccin 15
ENSAYO COMPUESTO LNEA ESTABLECIDA CULTIVO PRIMARIO BIBLIOGRAFAB(a)P, DMBA BF-2, RTG-2, BB Smolarek et al, 1987, 1988
Aflatoxina B1Hepatocitos de trucha
arcoirisBailey et al, 1982Aductos de
ADN
B(a)PHepatocitos de trucha
arcoirisMasfaraud et al, 1992
Alkaline
Unwinding
Assay
MND, PQ BB Hasspieler et al, 1996
MNNG, H2O2 R1, RTG-2 Braunbeck and Neumller, 1996Extractos orgnicos de sedimentos
marinosEPC Kamman et al, 2000; 2001
Cadmio Hepatocitos de trucha Risso-de Faverney et al, 2001
B(a)P, 4NQO RTG-2, RTL-W1 Nehls and Segner, 1998Muestras ambientales RTG-2, RTL-W1 Nehls and Segner, 2001Muestras de agua Hepatocitos de pez cebra Schnurstein and Braunbeck,
2001
Muestras de aguaPez cebra clulas
branquiales
Schnurstein and Braunbeck,2001
H2O2, B(a)PHepatocitos de trucha
arcoirisDevaux et al, 1997
H2O2, furanona, B(a)P, 1-
nitropirenoHepatocitos/sangre trucha Mitchelmore et al, 1998
H2O2 Clulas rojas Pleuronectes Nacci et al, 1996
Metil mercurio Linfocitos de T. Truncatus Betti et al, 1996
Ensayo
Cometa
Ciclofosfamida Eritrocitos carpa Pandrangi et al, 1995
Tabla 1: Estudios de genotoxicidad in vitro con clulas de peces. BB: Tejido de tronco posteriorde Brown Bullhead (Ameiurus nebulosus); BF-2: tronco caudal de Bluegill fry (Lepomismacrochirus); EPC: Epitelio de Carpa comn (Cyprinus carpio); R1: Hgado de trucha arco iris;RTG-2: Tejido gonadal de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss); RTL-W1: Hgado de truchaarco iris; Ul-h: Corazn de Umbra limi;; ULF-23HU: Aleta de Umbra limi.AA: Aminoacridina; BA: 1,2-benzoantraceno; B(a)P: Benzo(a)pireno; BP: 3,4-Benzopireno; BS:1,4-butanosultona; DBA: 1,2,5,6- dibenzoantraceno; DMBA: Dimetilbenzo(a)ntraceno; DP:dicromato potsico; EMS: etilmetilsulfonato; 3-MC: 3-metilcolantreno; MNNG: N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidiana; MMC: Mitomicina-C; MMS: metilmetanosulfonato; MND: menadodiona;4NQO: 1-oxido- 4-nitroquinolina; PQ: 9,10- fenantrenoquinona; PY: pireno; VS: sulfato devincristina.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
26/250
Introduccin 16
COMPUESTO LNEA ESTABLECIDA CULTIVO PRIMARIO BIBLIOGRAFA
Kocan et al, 1982, 1985B(a)P, MNNG, MMC, AA, 3-MC RTG-2
Kocan and Powell, 1985
Kocan et al, 1985
Landolt and Kocan, 1984Sedimentos marinos RTG-2Ahne and Schweitzer, 1993
Atrazina, meturxoron,4-ClA, HCH,PCP,alacloro,carbofurano
R1 Ahne and Schweitzer, 1993
N-nitroso-N-methylurea ULF-23 Park et al, 1989
Aberraciones
Cromosmicas
(AC)
3,4-BP, 1,2,5,6-DBA, 1,2-BA,
pyrene (PY).Ul-h Walton et al, 1988
MMC, MNNG, MMS Lnea celular A. splendens Barker and Rackham, 1979
MNNG ULF-23 Suyamah and Etoh, 1988
N-nitroso-N-methylurea ULF-23 Park et al, 1989
Leucocitos en cultivo Ellingham et al, 1986
Leucocitos en cultivo Zakour et al, 1984
ntercambio de
Cromatidas
Hermanas
(SCE
EMS, MMS Leucocitos Maddock and Kelly, 1980
Fenil-, etil-, metil-
organomercuriados BG/F Babich et al, 1990
MNNG, 4NQO Ul-h Walton et al, 1984
B(a)P, DP, EMS RTG-2 Kolpoth et al, 1999MMC, B(a)P, VS RTG-2 Sanchez et al, 2000
Induccin de
Microncleos
Mezclas complejas RTG-2 Castao et al, 2000MNNG, 4NQO, aflatoxin B1 RTG-2 Walton et al, 1983MNNG, 4NQO Ul-h Walton et al, 1984
B(a)P, Aflatoxina B1 RTG-2 + S9 Walton et al, 1987Sedimentos BB Ali et al, 1993
Hepatocitos de peces Klaunig, 1984
Hepatocitos de peces Kelly and Maddock, 1985
Hepatocitos de peces Miller et al, 1989
Irradiacin UV CAF-MM1 Mano et al, 1980
Mitani et al, 1982
Sntesis no
programada
de ADN (UDS)
Irradiacin Gamma CAF-MM1 Mitani and Egami, 1982
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
27/250
Introduccin 17
Esta lnea celular se ha utilizado para la valoracin de la toxicidad aguda
de compuestos representativos de casi la totalidad de los grupos de
contaminantes ambientales, mostrando una muy buena correlacin con los
resultados obtenidos in vivo (Babich and Borenfreund, 1991; Segner 1998;
Castao et al., 1996; 2000), en estudios citogenticos (Kohlpott, et al., 1997;
Snchez et al., 2000) as como, ms recientemente, para la deteccin de
compuestos que modifican el comportamiento hormonal o disruptores
endocrinos (Fent, 2001)
Figura 3. Lnea celular RTG-2 derivada de tejido gonadal de trucha arcoiris(Oncorhynchus mykiss),
En los estudios de genotoxicidad, los sistemas in vitro constituyen el
primer paso para la identificacin de efectos. Una vez que el mutgeno
interacciona con la molcula de ADN, se producen en ella, tras cortos periodos
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
28/250
Introduccin 18
de tiempo (minutos e incluso segundos), daos estructurales cuya naturaleza
est en funcin de las caractersticas fsico-qumicas del compuesto (Tabla II)
Existe un importante grupo de sustancias con capacidad genotxica
(algunas de ellas tras ser metabolizadas), que forman enlaces covalentes con
la molcula de ADN, dando lugar a los llamados aductos (Figura 4). En los
ltimos aos se han desarrollado diferentes metodologas capaces de
cuantificarlos, aplicando tcnicas inmunolgicas con anticuerpos especficos
(Poirier, 1984; Santella, 1988), HPLC combinado con espectroscopia
fluorescente (Dunn, 1991; Krahn et al., 1993), cromatografa de gases acoplada
a espectrometra de masas (Krahn et al., 1993) o marcaje con 32P tambin
llamado 32P-postlabeling.
PAH-N7 aducto
Sntesis de ADN
Lu ar abasico
Sntesis de ADN
Mutante
Figura 4. Formacin de mutaciones a partir del aducto formado entre unhidrocarburo policclico aromtico (PAH) y el N - 7 de la adenina.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
29/250
Introduccin 19
Esta ltima, es quizs la ms utilizada debido a su gran especificidad y
sensibilidad ya que es capaz de detectar un aducto entre 1010 nucletidos
normales. (Gupta et al., 1982; 1985; 1988; Liu et al., 1988; Halbrook et al.,
1992; Lloyd-Jones, 1995; Jones and Parry, 1992; Pfau 1997; Qu et al., 1997)
La formacin de aductos, est considerada como un elemento clave en
la iniciacin de procesos carcinognicos, ya que pueden desestabilizar las
uniones glucosdicas y dar lugar a lugares apurnicos con posterior rotura de la
cadena de ADN, o pueden dar lugar a la insercin de bases incorrectas, que
tras el proceso de replicacin pueden comprometer la fidelidad de la copia.
(Weinstein, 1978; Wogan and Goreling, 1985).
Los daos sobre el ADN, adems de por la formacin de aductos,
pueden producirse por otros procesos diferentes, como son la generacin de
especies de oxgeno altamente reactivas, (Kuchino et al., 1987; White et al.,
1996; Park et al., 1996; Sugg et al., 1996) o dando lugar a mutaciones por
formacin de dmeros de pirimidina, desaminacin de bases, o interfiriendo con
los procesos de replicacin, metilacin o reparacin (Shugart, 2000). La
hipometilacin, consecuencia, por ejemplo, de la oxidacin de las bases por
radicales libres, puede medirse mediante la hidrlisis enzimtica del ADN
(Rosiello et al., 1994; Count and Goodman ,1995) o mediante la sntesis no
programada de ADN (Selden et al., 1994).
En cuanto a la deteccin de capacidad mutagnica la, los ensayos
bacterianos tradicionales de mutagenicidad, como el test de Ames (Ames et
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
30/250
Introduccin 20
al., 1975; Stepanova et al., 1999), estn siendo sustituidos por ensayos de
activacin de oncogenes (Deveraux, 1994; Abshire et al., 1996), o la utilizacin
de modelos con animales transgnicos (Jowett et al., 1991; Murti et al., 1994;
Ryskova et al., 1997)
La deteccin de roturas en las cadenas de ADN puede realizarse
mediante los ensayos de desnaturalizacin en medio alcalino, (Shugart, 1988;
1998; 1996b; Meyers-Schone et al., 1993; Everaart et al., 1998), electroforesis
en geles alcalinos o neutros (Theodorakis et al., 1994) o el ensayo Comet
(Ostling and Johanson 1984; Michelmore and Chipman 1998; Singh et al.,
1988; Olive et al., 1992; Fairbairn et al., 1995), todos ellos basados en la
desnaturalizacin in vitro de la doble hlice a determinado pH. La proporcin
de ADN de cadena sencilla detectada se considera que est relacionada con el
nmero de roturas.
Los daos estructurales son reparados la mayor parte de las veces por
los mecanismos celulares, pero cuando no es as y persisten o son reparados
errneamente, pueden interferir en la fidelidad de la replicacin y producir
cambios irreversibles en el genoma. Estos efectos tardos e irreversibles, tales
como el intercambio de cromtidas, las aberraciones cromosmicas o el
incremento en la frecuencia de microncleos, se denominan efectos
citogenticos y para la deteccin de los mismos se han incorporado
recientemente tcnicas de anlisis automtico de imagen y de citometra de
flujo. (Gordon et al., 1989;Custer et al., 1994; 1997;Lamb et al., 1995;Grawe
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
31/250
Introduccin 21
et al., 1997; Bikham et al., 1998; Carrano et al., 1978; Kohlpoth et al., 1999;
Snchez et al., 2000)
En funcin de la magnitud del dao producido al ADN, sus efectos
pueden no ser fcilmente observables, siendo necesarios meses o aos para
hacerse patentes, a veces incluso, despus de que la fuente de contaminacin
haya sido eliminada. Son precisamente estos eventos tardos, los que a escala
poblacional adquieren mayor importancia (Saava, 1998; Anderson et al., 1994)
(Tabla II) Por tanto, el desarrollo de metodologas capaces de detectar el dao
al ADN en estados tempranos adquiere una gran importancia.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
32/250
Introduccin 22
Tabla II. Secuencia de efectos de la exposicin a genotxicos.
Efectos biolgicos al nivel de indiv iduoEfectos a escala
poblacionalTemprano
Temprano-Medio-Tarde
Medio /Tarde Tarde
3.ADN anormal 4. Condicionespatolgicas
5.Efectos genticos1.Detoxificacin
Induccin delsistemaenzimtico P450
Aberracionescromosmicas.
Microncleos
Neoplasias
Tumores
Alteracin de ladiversidadgenotpica
Variaciones en la
frecuencia allica2.Alteracionesestructurales
Agentes fsicos Dmeros de
Timidina Rotura de cadena
Agentes qumicos Aductos
Alteraciones debases
Rotura decadenas
Modificacin debases
Hipometilacin
Interferencias conla reparacin yreplicacin delADN
Mutaciones
Aneuploidas
Apoptosis
Disfuncinde protenas
Declive dela fertilidad
Letalidad
6. Efectos fenotpicos
Rasgos fenotpicosalterados.
Modificaciones en laestructura de lasclases de edad.
Decrecimiento de laabundancia ydistribucin de lapoblacin
Extincin de lapoblacin
El tiempo de aparicin de estos efectos depender de las especies y tipo degenotxico. (Temprano: horas o das. Medio: das, semanas o meses. Tarde:
semanas, meses o aos.) Modificada a partir de Thomson et al., 1999
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
33/250
Introduccin 23
1.3 ANTECEDENTES METODOLGICOS DE LA TCNICA DE RAPD
En la ltima dcada, los avances en biologa molecular han permitido el
desarrollo de tcnicas tales como el anlisis de polimorfismos obtenidos
mediante enzimas de restriccin(RFLP), y la amplificacin de genes mediante
la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), abriendo nuevas posibilidades
en la deteccin del dao al ADN. (Botstein et al., 1980; Saiki et al., 1988; Nirmal
et al., 1999)
La tcnica de PCR, fue desarrollada por Mullis a finales de los aos
ochenta y con ella se consigue la amplificacin enzimtica de un fragmento de
ADN o ARN hasta millones de veces, de un modo rpido y fiable. Su gran
sensibilidad, sencillez y eficacia para amplificar especficamente determinados
segmentos de cidos nucleicos, ha permitido afrontar problemas
experimentales que antes eran irresolubles. En ella se imita, bajo condiciones
controladas de laboratorio, el proceso de replicacin del ADN que tiene lugar
en los organismos vivos (Figura 6)
La complejidad del ciclo biolgico, se simplifica in vitro utilizando una
ADN polimerasa y ciclos de temperatura para desnaturalizar e hibridar
alternativamente, la parte de ADN que se desee obtener. El resultado es la
amplificacin exponencial de determinados fragmentos de ADN seleccionados
mediante cebadores o primers diseados por el analista. El principal
inconveniente de la PCR, es que requiere el conocimiento previo de las
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
34/250
Introduccin 24
ADN moldeee
Nuevo ADN
Cebador
ADN +
Cebador +dNTPs +ADN polimerasa +Bufer
1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4 Ciclo
Figura 6. Esquema de la tcnica de PCR. Despus de 30 ciclos se obtienen
1 billn de copias idnticas de un fragmento determinado de ADN.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
35/250
Introduccin 25
secuencias que flanquean el fragmento a amplificar, cosa que no siempre es
posible.
Para solventar este problema se desarrollaron una serie de variantes
conocidas con el nombre de MAAP (Multiple Arbitrary Amplificon Profiling o
Tcnicas de Obtencin de Perfiles Mltiples y Arbitrarios de Amplificacin), que
utilizan cebadores de secuencia arbitraria y generan una huella gentica del
ADN molde estudiado. Este grupo est formado por la tcnica de RAPD
(Random Amplified Polimorphic ADN o ADN Polimrfico Amplificado al Azar)
(Williams et al., 1990), AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR o Reaccin en Cadena
de la Polimerasa Usando Cebadores al Azar) (Welsh and McClelland 1990) y
DAF (ADN Amplification Fingerprinting o Huella Gentica Mediante
Amplificacin del ADN) (Caetano-Anolles et al., 1991) Las diferencias entre
ellas, consisten en la longitud del cebador utilizado y en la forma de visualizar
los fragmentos amplificados (Tabla III)
La tcnica de RAPD, desarrollada por Williams y col., en 1990 utiliza
cebadores cortos (entre 9-14 bases) de secuencia arbitraria, y la reaccin de
amplificacin se realiza a una temperatura de hibridacin o anillamiento poco
selectiva, alrededor de 36C. Con estas condiciones la especificidad del
cebador disminuye, aumentando la probabilidad de hibridacin, aunque en
muchos casos de forma imperfecta. Las diferencias entre PCR y RAPD
aparecen en la tabla IV.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
36/250
Introduccin 26
Tabla III. Principales diferencias entre las Tcnicas de Obtencin de
Perfiles Mltiples y Arbitrarios de Amplificacin.
RAPD AP-PCR DAF
Cebadores 10-12 pb 20 pb 5 pb
Ciclo detemperaturas
Baja t dehibridacin entodos sus ciclos(30-39C)
Baja t dehibridacin en losprimeros 2-5ciclos alta en elresto (45-50C)
Baja t dehibridacin entodos sus ciclos(30C)
N de ciclos 40-45 40-45 30-35
Visualizacinde losproductos
Electroforesis engeles de agarosa +bromuro de etdio
Incorporacin de32P-dATP en losprimeros ciclos.Electroforesis engeles depoliacrilamida +autoradiografa
Electroforesis enpoliacrilamida +tincin con plata
Tamao de losproductos
Entre 300 y 2000pb
Por encima de500 pb
Por encima de500 pb
(pb = pares de bases) Datos tomados de Menier y Grimont (1993)
Tabla IV. Diferencias bsicas entre la tcnica de PCR y RAPD.
PCR RAPD
Secuencia del cebadorcomplementaria al DNAmolde conocido.
Secuencia del cebador al azar, norequiere del conocimiento del ADNmolde.
En ausencia de la secuenciano se produce amplificacin.
Por lo general, se encuentransecuencias complementarias.
No exige integridad al ADNmolde.
Es fundamental la integridad delADN molde
Ciclo de temperaturas (t dehibridacin: 50 - 55C)
Ciclo de temperaturas (t dehibridacin : 30 - 39C)
N de ciclos: 30 N de ciclos: 45
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
37/250
Introduccin 27
Durante los primeros ciclos el proceso es competitivo, es decir,
inicialmente un numero elevado de fragmentos son co-amplificados, pero solo
aquellos que presentan una mayor estabilidad cebador-ADN molde sern los
productos finales de la reaccin.
El resultado, es un amplio espectro de fragmentos amplificados que
conforman un patrn de bandas o huella gentica caracterstica del ADN molde
utilizado. Los fragmentos o bandas, generalmente entre 300 y 2000 pares de
bases, son separados electroforeticamente en geles de agarosa y visualizados
mediante una tincin con bromuro de etdio. La tcnica presenta grandes
ventajas ya que:
No necesita conocimiento previo de la secuencia a amplificar.
Utiliza pequeas cantidades de ADN molde (entre 5-50 ng)
Utiliza los mismos cebadores para distintos sistemas biolgicos.
Puede analizar un nmero elevado de muestras en poco tiempo.
No necesita marcaje radiactivo ni grandes equipos de laboratorio.
Todas ellas, han hecho que esta tcnica se aplique con xito en una
gran variedad de campos: en epidemiologa molecularpara la identificacin de
cepas patgenas causantes de infecciones bacterianas (Allerberger et al.,
1997; De Vos et al., 1997), en el sector alimentario permitiendo la deteccin de
brotes de intoxicacin (Loudon, et al., 1996) o el seguimiento de las vas de
diseminacin de patgenos durante el procesamiento de alimentos
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
38/250
Introduccin 28
(Niederhauser, et al., 1994); en estudios taxonmicos estableciendo relaciones
de proximidad evolutiva en especies animales y vegetales (Rothmanier, et al.,
1997; Rout et al. 1998; Hoey et al., 1996); en la elaboracin de mapas
genticos (Williams, et al., 1993), etc.
Tambin, aunque ms tmidamente, se ha utilizado en estudios de
genotoxicidad humana y animal. Peinado y colaboradores la aplicaron para la
deteccin de mutaciones en clulas tumorales de colon, tras comparar sus
patrones de bandas con los de las clulas sanas (Peinado et al., 1992). En
ecotoxicologa, Kubota y colaboradores irradiaron machos del pez medaka
(Oryzias latipes), con el objetivo de detectar alteraciones en el ADN de los
individuos irradiados y en su progenie. Los resultados confirmaron la alteracin
del patrn mediante la perdida y ganancia de bandas, as como diferencias en
la intensidad de amplificacin. Verificaron el carcter hereditario de alguna de
las bandas de nueva aparicin, sin que ello afectara a la viabilidad de la
progenie (Kubota et al., 1995). Adems, demostraron una relacin directa entre
las alteraciones en el patrn y la intensidad de irradiacin (Kubota et al., 1992).
No obstante, esta tcnica ha sido criticada por la aparicin de bandaserrticas de difcil interpretacin y, en general, por la falta de reproducibilidad
de sus resultados, aspectos muy estudiados aunque no bien entendidos.
La naturaleza e intensidad de las bandas, est en funcin de mltiples
parmetros, tales como la integridad del ADN molde utilizado y/o de cada una
de las condiciones que intervienen en la reaccin, desde la eleccin de la ADN
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
39/250
Introduccin 29
polimerasa hasta el ciclo de temperaturas establecido. (Davin-Regli et al., 1995;
Abed et al., 1995; Bassam et al., 1992; Ellsmorth et al., 1993; Meunir and
Grimont 1993; Park and Kohel, 1994; Penner et al., 1993; Williams et al., 1990).
A su vez, la integridad del ADN molde est en funcin de las
condiciones iniciales de la muestra, del mtodo de extraccin utilizado, as
como de la conservacin posterior del extracto genmico obtenido. (Black,
1993; Cheng et al., 1995). En cuanto a la unin cebadorADN molde, es
directamente dependiente de la temperatura de hibridacin y pequeas
variaciones en ella pueden modificar los lugares de anillamiento y, por tanto,
los productos finalmente amplificados.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
40/250
Justificacin y Objetivos 30
2. JUSTIFICACIN Y OBJETIVOS
La presencia continuada de sustancias qumicas de naturaleza
genotxica, provoca daos estructurales en el material hereditario de las
poblaciones pisccolas expuestas. La posibilidad de evaluarlo tempranamente,
representa un avance metodolgico en los procedimientos de valoracin de
riesgo.
En los ltimos aos, y gracias al incipiente auge de la genmica, se han
desarrollado tcnicas sensibles y especficas que abren nuevas posibilidades
en disciplinas cientficas muy dispares.
An as, la aplicacin de dichas metodologas en estudios poblacionales
de peces, plantea dificultades tcnicas, econmicas y ticas, debido al alto
nmero de animales, a las instalaciones de laboratorio que requieren y a la
larga duracin de los estudios. Estas dificultades pueden en parte solventarse
mediante la utilizacin de sistemas in vitro, particularmente en las primeras
fases de valoracin de riesgo.
Nuestros estudios han ido dirigidos a conseguir un modelo sencillo y
suficientemente representativo del medio acutico, que permita detectar una
amplia gama de alteraciones en la molcula de ADN, asociadas a la accin de
sustancias genotxicas medioambientalmente relevantes.
El sistema biolgico elegido ha sido la lnea celular RTG-2, derivada de
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
41/250
Justificacin y Objetivos 31
trucha arcoiris, y, que como se ha mencionado anteriormente, ha presentado
una buena correlacin en multitud de estudios de citotoxicidad con el sistema
in vivo del que procede.
La tcnica de RAPD, de reciente desarrollo, ha sido elegida para la
deteccin de efectos sobre dicho sistema. Teniendo en cuenta su fundamento
terico, es posible detectar alteraciones inespecficas en el ADN procedente de
clulas que posean una dotacin gentica idntica, como es el caso de las
lneas celulares establecidas, mediante la comparacin del patrn de bandas
de las clulas expuestas a la accin de genotxicos y el patrn de bandas de
clulas no expuestas o controles. El hecho de no requerir informacin de la
secuencia genmica representa una gran ventaja en estudios ecotoxicolgicos,
donde el conocimiento de la gentica de las especies silvestres es muy
reducido, y donde el inters se centra en la deteccin del dao, y sus posibles
consecuencias, ms que en la naturaleza del dao en s mismo, objeto de otras
disciplinas como la gentica molecular o la bioqumica.
Adems de lo anterior, la tcnica de RAPD es simple y no necesita
marcaje radiactivo, lo que permite que pueda realizarse prcticamente en
cualquier laboratorio. Por lo tanto, considerando la gran cantidad de ventajas
que presenta tericamente esta tcnica en estudios de ecotoxicologa gentica,
y aunque ha sido criticada por la falta de reproducibilidad de sus resultados,
nos hemos planteado esta tesis marcndonos dos objetivos concretos:
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
42/250
Justificacin y Objetivos 32
1. Conseguir resultados fiables y reproducibles, optimizando todos y
cada uno de los diferentes parmetros que intervienen en la
reaccin RAPD.
2. Desarrollar un sistema in vitro sensible y verstil, que permita
valorar a priori el carcter genotxico de compuestos qumicos y
muestras ambientales.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
43/250
Planteamiento y resultados. 33
3. PLANTEAMIENTO Y RESULTADOS
El desarrollo metodolgico ha ido dirigido a conseguir un sistema
sensible y cuyos resultados in vitro sean capaces de predecir los resultados
in vivo. Como las variaciones, incluso muy pequeas, en el patrn de bandas
de clulas control y clulas expuestas son asumidas como resultado de la
accin del txico sobre el ADN, es imprescindible que dicho patrn sea
especfico y altamente reproducible.
Por tanto, este trabajo se ha estructurado de la siguiente manera:
1. OPTIMIZACIN DE LA TCNICA (Reproducibi lidad y
Especificidad)2. CAPACIDAD PARA LA DETECCIN DE DAO AL ADN
(Sensibilidad)
3. CAPACIDAD PARA PREDECIR EL DAO IN VIVO
3.1 OPTIMIZACIN DE LA TCNICA. (Reproducibi lidad y Especificidad)
(Anexos 2.1 y 2.4)
Como ya se ha mencionado, uno de los aspectos mas criticados a la
tcnica de RAPD, ha sido la falta de reproducibilidad de sus resultados, dando
lugar a patrones de bandas variables. Los factores que intervienen en esta falta
de reproducibilidad se pueden agrupar en:
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
44/250
Planteamiento y resultados. 34
1. Integridad del ADN.
2. Ajus te de los Parmetros de la Reaccin.
3.1.1. La Integridad del ADN,a su vez, est determinada por el mtodo
de extraccin seleccionado y por el estado de conservacin de los
extractos.
Para seleccionar el mtodo de extraccin mas adecuado, se
ensayaron tres tcnicas diferentes: (Anexo 2.1)
Precipitacin de protenas en un medio con alto contenido
en sales (Salting out) (Miller et al., 1988; Cheng et al., 1995). Ebullicin en presencia de Chelex como resina quelante
de metales divalentes. (Walsh et al., 1991).
Extraccin con Fenol-cloroformo basado en la extraccin
diferencial, de la molcula de ADN (Sambrook et al., 1988).
La idoneidad del mtodo de extraccin se valor analizando la
concentracin, pureza e integridad de cada uno de los extractos
geonmicos.
La concentracin se determin midiendo la absorbancia que presenta a
260 nm; y la pureza, mediante la relacin de absorbancias a 260/280 nm.
Adicionalmente se introdujo una medida a 320 nm para sustraer el fondo
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
45/250
Planteamiento y resultados. 35
inespecfico, tras comprobar la distorsin que ste produca en un estudio
realizado con 18 extractos genmicos.
La integridad se determin realizando una electroforesis en gel de
agarosa (al 0,8%) de una alcuota del extracto. La presencia en el gel de una
sola banda de aproximadamente 23.000 Kb indica el buen estado del ADN
extrado. En caso contrario, se observa la presencia de varias bandas de pesos
moleculares significativamente mas bajos, o bien una fluorescencia difusa a lo
largo de toda la calle.
Los resultados mostraron que el mtodo ms adecuado para la tcnica
de RAPD era la extraccin con Fenol-Cloroformo.
La conservacin de los extractos de ADN (anexo 2.4) es determinante
para mantener el tamao y el nmero de fragmentos en el patrn de
amplificacin.
Generalmente, bien por conveniencia o por el propio diseo del ensayo,
el proceso de extraccin del ADN se realiza simultneamente en un nmero
elevado de muestras, almacenando los extractos hasta el momento de su
anlisis, en algunos casos despus de semanas o meses. En muchas
ocasiones, el almacenamiento conlleva un deterioro del extracto y, por tanto es
fundamental determinar los mrgenes dentro de los cuales se puede realizar un
ensayo en condiciones de seguridad.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
46/250
Planteamiento y resultados. 36
Se valoraron, a intervalos regulares de 3, 6, 9, 15 y 21 meses, la
integridad y concentracin del ADN de 18 extractos genmicos almacenados a
4 C durante un periodo de casi 2 aos.
Los resultados mostraron que los extractos pueden ser utilizados
durante un periodo mximo de 9 meses. Pasado este tiempo, y aunque la
concentracin de ADN permanece prcticamente constante, su integridad se ve
alterada significativamente.
3.1.2. Ajus te de los parmetros de la reaccin. (Anexo 2.1)
Con respecto a la enzima el Fragmento Stoffel de la Taq polimerasa,
existe acuerdo unnime en que esta enzima, obtenida a partir de la Taq
polimerasa por modificacin gentica, mejora la reproducibilidad en la reaccin,
y, aunque no se conoce la causa concreta, se apunta a una mayor estabilidad
trmica, menor velocidad de procesamiento (10 veces menor que la Taq
polimerasa) y / o el amplio rango de iones magnesio (2 -10 mM) en el cual
trabaja. (Lawyer et al., 1988; 1993). El resto de los componentes de la
reaccin, aunque se estudiaron diferentes concentraciones de Mg y dNTPs, se
fijaron finalmente dentro de los rangos recomendados: 4 mM de Mg y 0,2 mM
de cada dNTPs y 2 U del enzima.
En relacin a las concentraciones optimas de ADN y primerutilizadas
en la reaccin, existen opiniones contradictorias. Nosotros hemos estudiado un
amplio rango de concentraciones, desde 1 a 100 ng/25 ul de ADN y desde 1 a
8,5 pM de primer. Los resultados nos indujeron a elegir, inicialmente, 15 ng/25
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
47/250
Planteamiento y resultados. 37
ul y 5 pM de ADN y primer respectivamente, como las proporciones mas
adecuadas. Se observ que cada cebador, en funcin del nmero de bandas
que amplifica, presenta sus propias concentraciones ptimas, lo que nos
llevara a ajustar las concentraciones en futuros trabajos.
La unin cebadorADN molde es directamente dependiente de la
temperatura de hibridacin, y pequeas variaciones en ella pueden modificar
los lugares de unin y, por tanto, los productos finales amplificados. (Penner et
al., 1993; Roehrdanz et al., 1993). En ste sentido se estudiaron, un rango de
temperaturas de hibridacin (entre 34 a 39 C), tiempos y numero de ciclos.
Los resultados obtenidos permitieron establecer la temperatura idnea en 36
C durante 75 seg. y 50 ciclos.
En lo referente a la visualizacin de los fragmentos amplificados, sta
se realiza mediante electroforesis en geles de agarosa y tincin con bromuro
de etdio. Tras estudiar diferentes voltajes, tiempos (de 1 a 4h) y
concentraciones, se determin una tensin de 115 V durante 4 h y 2.1% de
agarosa como condiciones ptimas para conseguir una buena separacin entre
los fragmentos o bandas. La incorporacin del bromuro de etdio (0,5 g/ml) se
realiza durante la preparacin del gel, antes de que se solidifique, lo que
permite la comparacin fluorimtrica de las bandas, a la vez que se minimiza el
manejo de este compuesto.
Para evitar la subjetividad en la interpretacin de los resultados por parte
del operador, la imagen del gel es capturada y analizada por densitometra
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
48/250
Planteamiento y resultados. 38
mediante soporte informtico.
3.2. CAPACIDAD PARA LADETECCIN DE DAO AL ADN (Sensibil idad)
(Anexos 2.1, 2.2, 2.4, 3.1, 3.2)
La deteccin de alteraciones en el ADN de las clulas expuestas es
tericamente sencilla, ya que las variaciones observadas en los patrones de
bandas de clulas controles y expuestas son interpretadas como resultado de
la accin del compuesto genotxico sobre el ADN. Por ello es importante
obtener:
1. Un Patrn de Bandas Especfico y Reproducib le.
2. Unas Condiciones ptimas para Deteccin de Dao al ADN.
3. Un Sistema de Anlis is suficientemente sensible para detectar
alteraciones en el patrn de bandas.
3.2.1 Patrn de Bandas Especfico y Reproducib le. (Anexo 2.1, 2.2)
Una vez fijadas las condiciones de la reaccin, dicho patrn de bandas
se consigui mediante una adecuada seleccin de primers.
Se probaron 26 primers. Algunos no generaron bandas, otros
proporcionaron productos de amplificacin difusa o bandas poco definidas y en
otros casos, aunque se obtuvieron bandas definidas, no presentaban
reproducibilidad intra y/o inter extractos, por lo que se seleccionaron solo
aquellos que presentaban bandas claras y altamente reproducibles. Tambin
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
49/250
Planteamiento y resultados. 39
se estudiaron combinaciones binarias de cebadores, ninguna de las cuales
present resultados satisfactorios, bien por fallos en la amplificacin, bien por
prdida de reproducibilidad intergenmica, o bien por la aparicin de bandas
con iguales pesos moleculares que los utilizados individualmente, por lo que la
combinacin de primers no aportaba ninguna ventaja.
Finalmente, la huella gentica de las clulas pertenecientes a la lnea
celular RTG-2 qued establecida con 8 cebadores que generaban un total de
56 bandas, con una reproducibilidad superior al 80% en todas las
amplificaciones y dentro de un amplio rango de pesos moleculares
(aproximadamente entre 2000 y 300 pares de bases)
La reproducibilidad de los patrones se comprob amplificando
extractos procedentes de diferentes pases celulares (entre el pase 100 y el
135).
La especificidad de la huella obtenida se constat comparando los
patrones de bandas de otras lneas celulares derivadas de carpa (EPC) y de
hmster (CHO-K1)
3.2.2 Condiciones ptimas para la Deteccin de Dao al ADN.
(Anexos 2.2, 2.4, 3.1 y 3.2)
Despus de obtener un patrn constante y especfico, se procedi a
comprobar la capacidad de esta tcnica para detectar dao en el ADN tras
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
50/250
Planteamiento y resultados. 40
exposiciones agudas y crnicas. En este proceso hubo que optimizar las
concentraciones de ADN molde y cebador mas adecuadas para incrementar la
sensibilidad del ensayo y evitar la presencia de falsos positivos.
Se utilizaron dos compuestos genotxicos de referencia, la Mitomicina C
(MMC) como mutgeno directo, (Anexo 2.2 y 2.4) y el Benzo(a)Pireno (BaP)
como mutgeno indirecto (Anexos 3.1 y 3.2).
MMC es un mutgeno de accin directa, ampliamente conocido por su
accin mutagnica y clastognica. En funcin de la dosis y del periodo de
exposicin, ste compuesto provoca, tanto in vivo como in vitro, sustitucin
de bases, incremento en el intercambio de cromtidas hermanas, aberraciones
cromosmicas y formacin de microncleos. (IARC)
Los estudios de exposiciones agudas realizadas con MMC, (1 y 0,5 g/ml
durante 4 y 4, 6 y 8 h respectivamente) nos condujeron a ajustar tanto las
concentraciones de ADN molde, (de 15 a 5 ng / 25 l) como las de cebador (de
5 a 4 pM). Las condiciones finalmente fijadas resultaron ptimas en la
deteccin de mutaciones, incluso para primers que generan un nmero muy
diferente de productos finales (de una a seis bandas).
El BaP, se seleccion como compuesto de referencia, en estudios
agudos y en exposiciones prolongadas. La eleccin de dicho compuesto,
adems de por su relevancia ambiental, se bas en que es un mutgeno de
accin indirecta, es decir, los productos activos son sus metabolitos.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
51/250
Planteamiento y resultados. 41
El BaP pertenece al grupo de los hidrocarburos aromticos policclicos
(PAHs) que se producen a partir de la ignicin de combustibles fsiles. Est
clasificado por la EPA como polucionante prioritario debido a su persistencia,
carcinogenicidad y alta capacidad de acumulacin a lo largo de la cadena
trfica (Kanaly et al., 2001).Este compuesto, despus de ser metabolizado se
transforma y da lugar a formas altamente reactivas, capaces de formar enlaces
covalentes con el ADN. En este tipo de estudios, donde los productos activos
son los metabolitos, la lnea celular RTG-2 presenta la ventaja de retener cierta
capacidad metablica, lo que le permite transformar el BaP en sus
intermediarios activos (Thornton et al.,1982).
El BaP se utiliz para establecer la sensibilidad de la tcnica en las
condiciones anteriormente fijadas, comparndola con la induccin de
microncleos, utilizando para ello la misma lnea celular, y las mismas
concentraciones y periodos de exposicin. Los resultados, adems de
confirmar que sus efectos son dependientes del tiempo y de la dosis, mostraron
que la tcnica de RAPD presentaba una mayor sensibilidad. La concentracin
mnima de compuesto genotxico necesario para la induccin de microncleos,
era prcticamente el doble de la requerida para detectar alteraciones en el
patrn de bandas previamente establecido. No obstante, la sensibilidad estaba
en funcin del primer utilizado.
Las variaciones observadas en el patrn de bandas del ADN de las
clulas expuestas, tanto a MMC como a BaP, respecto a clulas control,
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
52/250
Planteamiento y resultados. 42
consistieron en diferencias en la intensidad y / o en la ausencia y / o presencia
de nuevas bandas.
La valoracin de estas diferencias requiri el desarrollo de una
metodologa de anlisis precisa y objetiva, para minimizar la variabilidad del
mtodo y facilitar la interpretacin de resultados.
3.2.3. Sistema de Anlisis para la Deteccin de Alteraciones en el Patrn
de Bandas. (Anexo 2.2)
Como prctica habitual, y para evitar errores a lo largo del proceso, en
cada gel se corrieron conjuntamente controles y expuestos (cada uno de ellos
al menos por triplicado), un patrn de pesos moleculares y un blanco
consistente en todos los reactivos excepto ADN molde. Adems, para cada
ensayo, los geles se realizan, al menos, por duplicado y en diferentes das. El
anlisis de las diferencias entre controles y expuestos se objetiv mediante un
proceso de captacin de imagen computerizado.
En el anlisis del perfil fluorimtrico de cada gel, se estudiaron las
diferencias cualitativas y cuantitativas. Las primeras, desaparicin de bandas o
la aparicin de otras nuevas, se expresaron como porcentajes respecto al
nmero de repeticiones realizadas.
Los anlisis cuantitativos se llevaron a cabo mediante un software
especfico, considerando inicialmente tres parmetros: altura, volumen y
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
53/250
Planteamiento y resultados. 43
porcentaje de amplificacin de cada una de las bandas. Las diferencias entre
controles y expuestos de cada uno de estos parmetros, se establecieron
mediante el anlisis de la t-Student, confirmando los resultados mediante el
test de U-Mann-Whitney. Todos los parmetros analizados mostraron
diferencias estadsticamente significativas (p
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
54/250
Planteamiento y resultados. 44
gran ayuda en los estudios en donde las observaciones de los efectos sobre la
dotacin gentica deben realizarse tras varias generaciones.
Se expusieron clulas RTG-2 a una baja concentracin de BaP (0,05
g/ml) y tras 3, 15 y 30 das de exposicin, se extrajo y analiz el ADN. Los
resultados, al igual que los obtenidos en la exposicin aguda realizada con este
mismo compuesto, presentaron una relacin tiempo y dosis dependiente,
confirmndose tambin la sensibilidad selectiva de los primers utilizados.
Particularmente interesante fue la observacin de la aparicin de nuevas
bandas altamente repetitivas, tanto en el 100% de las amplificaciones como en
la totalidad de los extractos analizados, tras el mayor periodo de exposicin.
3.3. CAPACIDAD PARA PREDECIR EL DAO IN VIVO .
(Anexos 2.3 y 4.1)
Los sistemas in vitro presentan grandes ventajas cientficas tcnicas,
econmicas y ticas, pero deben ser capaces de predecir los efectos que se
observaran en la especie in vivo. Por lo tanto, la capacidad de extrapolacin
de los resultados es requisito fundamental, por razones obvias, para su
aplicacin.
En el caso concreto de la deteccin de alteraciones en el ADN mediante
la tcnica de RAPD, la capacidad predictiva del ensayo vendra determinada
por:
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
55/250
Planteamiento y resultados. 45
1. La Simili tud Gentica entre los Sistemas in vivo e in vitro,
que se manifiesta en el grado de semejanza de sus respectivos
patrones de bandas y
2. La Simil itud de los Efectos in vivo e in vitro producidos por
un mismo agente txico.
3.3.1. Simili tud Gentica entre los Sistemas in vivo e in vitro .(Anexo 2.3)
Se compar el patrn de bandas de la lnea RTG-2 con el de los
individuos de trucha arcoiris, especie de la que procede. Para ello, se utilizaron
33 individuos procedentes de 3 piscifactoras distintas. El ADN se extrajo a
partir de clulas de sangre perifrica, y las amplificaciones se realizaron
mediante los cebadores inicialmente seleccionados para la caracterizacin de
la lnea celular RTG-2. Para comparar el patrn de bandas de cada uno de los
individuos con la lnea celular, se amplificaron los resultados conjuntamente y
por duplicado en un mismo gel.
Finalizado este proceso, se constat que los extractos genmicos de
todos los individuos generaban un total de 73 fragmentos frente a los 56
obtenidos en la lnea celular. Este menor nmero de bandas est relacionado
con el carcter homocigtico de la lnea celular. El anlisis comparativo de los
patrones mostr una gran concordancia, ya que casi un 75% de las bandas se
encontraron en ambos sistemas. Las restantes se debieron a la presencia de
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
56/250
Planteamiento y resultados. 46
polimorfismos.
Las amplificaciones de todos los cebadores mostraron in vivo bandas
polimrficas, consecuencia de su diversidad gentica, pero su nmero estuvo
en funcin del cebador utilizado. La similitud observada en los patrones de
bandas es una consecuencia de la homogeneidad que presentan ambos
sistemas. As, el ndice de similaridad inter-poblacional in vivo / in vitro
obtenido (0,931) est muy prximo al valor mximo 1.
Igualmente, en el dendrograma de distancias genticas construido entre
todos los individuos analizados y la lnea RTG-2, se observaron dos brazos
indistintamente formados por individuos pertenecientes a todas las poblaciones
y la lnea celular RTG-2. Como conclusin de este trabajo y para estudios
posteriores, se seleccionaron de entre los primers inicialmente ensayados,
aquellos cuyo patrn de bandas presentaba una mayor concordancia in vivo
e in vitro.
3.3.2. Simi litud de Efectos in vivo e in vitro. (Anexo 4.1)
Una vez constatada la similitud gentica de ambos sistemas, se realiz un
ensayo in vivo con el mismo agente (BaP), que permitiera comprobar si los
efectos observados in vitro se confirmaban in vivo.
Se realiz una exposicin subletal, mediante una inyeccin
intraperitoneal, y se valoraron sus efectos a diferentes tiempos (1 - 4 meses),
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
57/250
Planteamiento y resultados. 47
comparando el patrn de bandas obtenido a partir del ADN de clulas de
sangre perifrica.
Los anlisis cualitativos y cuantitativos confirmaron los resultados in
vitro, mostrando la aparicin de nuevas bandas y alteraciones en su
intensidad. No obstante, la presencia de bandas polimrficas dificult el anlisis
entre los grupos de individuos tratados y no tratados, de manera que las
comparaciones solamente se pudieron realizar en un mismo individuo antes y
despus del tratamiento. Esta es la mayor limitacin que presenta la tcnica de
RAPD en los estudios in vivo. El sistema de agrupacin de bandas se mostr
especialmente adecuado para evidenciar los efectos del contaminante. No
obstante, y debido al pequeo nmero de individuos analizados en este
estudio, no es posible extraer conclusiones determinantes, ya que la propia
susceptibilidad individual requiere el anlisis de muestras de gran tamao. De
cualquier manera los resultados obtenidos son, sin duda, la manifestacin de
las alteraciones producidas por este compuesto en el material gentico, tanto
in vivo como in vitro, demostrando claramente la capacidad de la lnea
celular RTG-2, tanto para metabolizar este conocido promutgeno, como para
predecir los efectos genotxicos que se observaran en los individuos
expuestos.
Con este trabajo, slo hemos pretendido apuntar la capacidad
metodolgica del sistema desarrollado y, es evidente que para poder llegar a
conclusiones ms fiables que permitan transferir dichos resultados in vitro a
los sistemas in vivo, son necesarios estudios ms completos y ambiciosos
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
58/250
Planteamiento y resultados. 48
que exceden de los objetivos de este trabajo.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
59/250
Discusin. 49
4. DISCUSIN
Uno de los objetivos de la ecotoxicologa, es proporcionar metodologas
sensibles y realistas que permitan acometer las valoraciones de riesgo con
mayor grado de seguridad. Actualmente, en los foros de consenso internacional
sobre seguridad de sustancias qumicas para el medio acutico (Convenio
OSPAR, Convenio de Londres y de Barcelona) , se est planteando la poltica
de eliminacin de la contaminacin en su origen, recomendando la adopcin
del concepto de sustitucin de las sustancias qumicas ms peligrosas, o bien
reduciendo sus niveles de emisin a cero. Esta poltica, que acarrear una gran
controversia en particular por parte de la industria, se debe en gran medida a la
ausencia de metodologas prcticas capaces de predecir efectos a largo plazo
sobre las poblaciones expuestas. El desarrollo de nuevos mtodos, que
contribuyan a la monitorizacin de los efectos que producen los compuestos
qumicos de relevancia medioambiental sobre los organismos y poblaciones
expuestas, es hoy en da, por tanto, una prioridad en ecotoxicologa.
Las tcnicas moleculares que permiten la obtencin de la huella gentica
o patrn de bandas especfico del sistema biolgico utilizado, pueden aportar
nuevas herramientas en la deteccin de efectos genotxicos sobre los
individuos y poblaciones expuestas.
La aparicin a principios de los noventa de este tipo de tcnicas, que no
requeran el conocimiento de la secuencia de ADN, supuso una autnticarevolucin en el campo de la ecotoxicologa gentica, pues permiten obtener
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
60/250
Discusin. 50
huellas genticas especieespecficas, poblacinespecficas e incluso
individuoespecficas. Esta es una de las razones por las cuales la literatura
cientfica que se puede encontrar sobre el tema, sea prcticamente coincidente
en el tiempo y se deba en su mayora a los trabajos de tres o cuatro equipos de
investigacin en todo el mundo que hemos trabajado simultneamente.
La obtencin de un patrn de bandas especifico de un determinado ADN
permite detectar cambios en dicha molcula tras ser expuesta a diferentes
factores de estrs, como son los contaminantes fsicos o qumicos (Kubota et
al., 1992,1995). Con estas tcnicas, la huella gentica se obtiene mediante una
PCR que utiliza primers cortos y de secuencia arbitraria. Se han desarrollado
tres protocolos diferentes, de los cuales el de AP-PCR y particularmente el de
RAPD han sido los que se han aplicado de forma mayoritaria.
Los primeros trabajos aplicaron la tcnica de AP-PCR. Su protocolo
utiliza altas temperaturas de hibridacin, permitiendo aumentar la especificidad
cebador-molde y obtener un nmero reducido de fragmentos finales. Por el
contrario, la tcnica de RAPD, debido a las bajas temperaturas que utiliza (34-
39 C), permite multiplicar los lugares de unin cebadorADN molde y por tanto
aumentar el nmero de bandas o productos finales. Sin embargo, la falta de
especificidad de muchas de estas uniones, hace que ligeras variaciones en
algunos de los parmetros que intervienen en la reaccin, alteren la intensidad
e incluso el nmero de los productos amplificados. Todo ello ha contribuido a
cuestionar la reproducibilidad de sus resultados y en definitiva, la idoneidad de
esta tcnica (Abed et al., 1995; Bassam et al., 1992; Ellsmorth et al., 1993;
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
61/250
Discusin. 51
Meunir and Grimont 1993; Park and Kohel, 1994; Penner et al., 1993; Regli et
al., 1995).
Nuestra hiptesis inicial parti de la base de que si los diferentes
parmetros que intervienen en la reaccin eran minuciosamente
estandarizados, los resultados llegaran a ser altamente repetitivos y por tanto
la tcnica podra ser aplicada satisfactoriamente en ecotoxicologa. Ello ha
supuesto que el trabajo realizado en esta tesis haya sido eminentemente
metodolgico.
Uno de los factores a controlar es la integridad del ADN utilizado como
molde. Durante la fase de hibridacin, el cebador busca o explora a lo largo de
todo el genoma, secuencias complementarias a las que unirse. Slo si existen
lugares de unin en ambas cadenas del ADN y a distancias adecuadas, el
fragmento comprendido entre ambos ser amplificado. Si el ADN ha sufrido
roturas durante el proceso de extraccin o conservacin, algunos de los
lugares de unin pueden verse daados y por tanto, afectar a la
reproducibilidad de los resultados finales. De la gran cantidad de mtodos de
extraccin, incluyendo kits comerciales, de que se dispone en la actualidad,
slo pueden utilizarse aquellos que no rompan la molcula de ADN (Black,
1993; Cheng et al., 1995). Segn nuestros resultados, la extraccin con fenol
cloroformo proporciona un ADN de alta eficiencia que puede ser almacenado
durante varios meses a 4 C sin alterarse, lo que le convierte en un mtodo
ptimo.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
62/250
Discusin. 52
Adems, en la reaccin de amplificacin propiamente dicha, intervienen
un gran nmero de variables que cada equipo de investigacin ha
protocolizado a su eleccin. Algunas de ellas estn condicionadas por el tipo de
polimerasa y el ciclo de temperaturas elegido (Roehrdanz y col., 1993; Penner
y col., 1993; Meunier and Grimont 1993). La Taq polimerasa fue empleada por
Williams y colaboradores en 1990 en el desarrollo del mtodo, pero en la
actualidad el fragmento Stoffel de la Taq polimerasa esta siendo
preferentemente utilizado, pues a bajas temperaturas de hibridacin
proporciona resultados ms reproducibles y presenta una actividad ptima
dentro de un rango ms amplio de concentraciones de iones magnesio (Nicol et
al., 1998; Schiliro et al., 2001; Aljanabi et al., 1999; Lawyer et al., 1993).
Algo semejante ha sucedido con el ciclo de temperaturas. La unin
cebadorADN molde es directamente dependiente de la temperatura de
hibridacin y pequeas variaciones en ella pueden modificar los lugares de
unin y, por tanto, los productos finalmente amplificados. Penner y col., (1993)
en un estudio comparativo, comprobaron que la diferencia en los resultados
finales entre distintos laboratorios, era debida a las diferencias de temperaturas
conseguidas por los termocicladores en el interior de los tubos de amplificacin,
a pesar de estar igualmente programados. Williams, y col., (1990) al desarrollar
el mtodo sugirieron la imposibilidad de utilizar temperaturas superiores a 40
cuando se trabajaba con primers cortos de 10 pares de bases. Posteriormente,
sin embargo, se han desarrollado protocolos para la deteccin de mutaciones
en el intervalo de temperaturas que va desde 35C (Conte et al., 1998) a 50C
(Atienzar et al., 2000b). En nuestro caso la temperatura ptima se ha fijado en
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
63/250
Discusin. 53
36 C.
La concentracin de ADN molde y primer son factores que afectan en la
obtencin de un patrn de bandas constante. Aunque existen diferentes
opiniones sobre su influencia (Van Belkum 1994; Welsk and McClelland 1990,
Muralidharan and Wekeland 1993; Davin-Regli et al., 1995), en nuestros
estudios han resultado ser de gran importancia para la obtencin de resultados
repetitivos y para eliminar la presencia de bandas errticas. No obstante,
hemos podido comprobar que cada cebador, en funcin del nmero de bandas
que amplifica, presenta concentraciones ptimas de trabajo, lo que
posiblemente sea la causa de las diferentes opiniones al respecto. Adems, la
concentracin de ADN molde fue decisiva para la deteccin de diferencias en el
ADN de clulas control y expuestas a compuestos genotxicos, y su
optimizacin ha permitido aumentar la sensibilidad, eliminando la presencia
falsos positivos. El ADN de las clulas expuestas, en funcin de las
concentraciones y tiempos de exposicin utilizados, permanece intacto en un
cierto nmero de copias. Cuando se utilizan concentraciones de ADN altas (20
ng / 25 l), el nmero de copias inalteradas es suficiente para que el primer (4
pM) pueda encontrar secuencias donde hibridar y dar lugar, finalmente, a
patrones de bandas no alterados. Sin embargo, cuando la concentracin de
ADN es menor, (5 ng / 25 ul) y a pesar de que en trminos relativos la
proporcin de copias intactas sea la misma, el numero absoluto es mas bajo e
insuficiente, incrementando as la probabilidad de mostrar secuencias
alteradas.
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
64/250
Discusin. 54
El ajuste de la concentracin de ADN a cantidades tan bajas, requiere
una gran precisin para la cuantificacin de los extractos, en este sentido, una
lectura adicional a 320 nm permite eliminar las interferencias debidas a otros
componentes presentes en el medio, evitando la sobrevaloracin de la medida.
Adems de las variables consideradas, la obtencin de un patrn de
bandas especfico y adecuado para la deteccin de genotoxicidad requiere una
meticulosa seleccin de los primers. Del total de los mismos y sus
combinaciones binarias inicialmente probadas, slo se seleccionaron 8,
siguiendo como criterio que las bandas amplificadas sean constantes y bien
definidas, y que se encuentren dentro de un amplio rango de pesos
moleculares. La necesidad de una buena reproducibilidad del patrn resulta
obvia, y la obtencin de bandas de diferentes pesos moleculares, incrementa la
sensibilidad en la deteccin de dao al ADN. (Atienzar, et al., 2001)
Por lo que respecta a la aplicacin de la tcnica de RAPD para el estudio
de alteraciones genticas in vivo, existen ciertas complicaciones. Los
individuos pertenecientes a una misma especie, presentan diferencias
individuales que se manifiestan como bandas polimrficas. Este hecho, que es
de gran inters para estudios de diversidad, es un grave inconveniente cuando
se aplica a la deteccin de genotoxicidad, pues la presencia o ausencia de
bandas entre los individuos expuestos y no expuestos, puede ser debida tanto
a la presencia de polimorfismos propios de la especie, como a la accin de
sustancias genotxicas, lo que implica, para evitar incertidumbre, la utilizacin
de muestras de gran tamao, encareciendo y complicando el estudio
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
65/250
Discusin. 55
(Theodorakis, et al., 1997; 1998; Krane et al., 1998; Bickham et al., 2000). La
utilizacin de individuos genticamente homogneos, tales como clones de
Daphnia magna (Atienzar et al., 1999; 2001) o clulas pertenecientes a una
misma lnea celular, permite detectar fcilmente tales cambios, tras comparar
los patrones de bandas de individuos controles y expuestos.
La utilizacin de cultivos celulares en la deteccin de efectos
genotxicos simplifica muchos de los problemas asociados al uso de sistemas
in vivo, y pueden resultar de gran utilidad en los procedimientos de prediccin
/ valoracin de riesgo, siempre y cuando se haya constatado el grado de
similitud entre ambos sistemas. Hay que tener en cuenta que las lneas
celulares establecidas pueden poseer caractersticas genticas diferentes de
las clulas originales y, adems, muchas especies de peces presentan una
gran variabilidad en su dotacin gentica. Por ejemplo, en trucha arcoiris se
han descrito individuos con dotaciones diplides, tetraplides e incluso
aneuplides. (Al-Sabty, 1991). Por ello es imprescindible comparar ambos
patrones de bandas (in vivo/in vitro) y establecer su grado de similaridad,
mediante la deteccin de bandas comunes y / o exclusivas de cada uno de los
sistemas, con objeto de acotar mejor la extrapolacin de resultados.
La comparacin de los patrones de bandas de diferentes individuos de
trucha arcoiris y de la lnea celular RTG-2 utilizando los 8 primers
seleccionados, revel una gran concordancia, pues el 73% de las bandas que
componen el patrn de la lnea celular RTG-2 estn presentes en todos los
individuos de trucha arcoiris estudiados. La lnea celular presenta un numero
7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas
66/250
Discusin. 56
menor de bandas que el sistema in vivo, como consecuencia de su carcter
homocigtico (Theodorakis, et al., 1997). Debido a que el numero de loci que
pueden ser analizados por esta tcnica es tericamente ilimitado (Lynch and
Milligan, 1994), aproximadamente el 50% de las bandas obtenidas in vivo
resultaron ser polimrficas, mostrando la variabilidad gentica de las
poblaciones estudiadas.
A pesar de que la tcnica de RAPD es relativamente nueva y hay una
informacin limitada de valores de referencia, el ndice de similaridad
interpoblacional in vivo/in vitro obtenido (0,931) es considerablemente mayor
al mostrado por otros autores entre poblaciones pisccolas dentro de una
Recommended