View
4
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
1
UNIVERSITATEA DE ŞTIIN ŢE AGRICOLE ŞI MEDICIN Ă VETERINAR Ă
CLUJ-NAPOCA
ŞCOALA DOCTORAL Ă
FACULTATEA DE HORTICULTUR Ă
Ing. Valentina FLORAN
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Analize genetice spaţiale în populaţii naturale de
pin silvestru (Pinus sylvestris L.)
Conducător ştiin ţific:
Prof. univ. dr. Radu SESTRAȘ
Cluj-Napoca
2011
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
2
CUPRINS
INTRODUCERE ……………………………………………………………………………….. 3
CAPITOLUL I CONSIDERAŢII GENERALE PRIVIND PINUL SILVESTRU ……………………………
5
1.1 Distribuţia pinului silvestru........................................................................................... 6
1.2. Importanţa pinului silvestru........................................................................................... 6
CAPITOLUL II STADIUL ACTUAL AL CUNOA ŞTERII PRIVIND DISTRIBU ŢIA POSTGLACIAL Ă A SPECIEI PINUS SYLVESTRIS..............................................................
8
2.1. Consecinţe genetice ale schimbărilor climatice din timpul cuaternarului...................... 8
2.2. Scopul şi obiectivele cercetării …….............................................................................. 9
2.1.2. Obiectivele cercetării.......................................................................................... 10
CAPITOLUL III MATERIALUL ŞI METODELE DE CERCETARE ...............................................................
11
3.1. Materialul de cercetare ….............................................................................................. 11
3.2. Metodele de analiză utilizate în laborator …………………………………………… 12
CAPITOLUL IV REZULTATE OB ŢINUTE ……………………………………………………………...............
13
4.1. Diversitatea genetică a pinului silvestru din românia, ungaria şi suedia la nivelul ADN-ului mitochondrial.......................................................................................................
13
4.2. Diversitatea genetică a pinului silvestru din românia, ungaria şi suedia la nivelul ADN-ului cloroplastic...........................................................................................................
16
4.3. Structura genetică spaţială în populaţii naturale de pin silvestru................................... 25
4.3.1. Interpolarea genetică a populaţiilor de pin silvestru din România, Ungaria şi Suedia...........................................................................................................................
25
4.3.1.1. Interpolarea genetică pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial pentru populaţiile din România şi Ungaria…………………………………….
25
4.3.1.2. Interpolarea genetică pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial a populaţiilor din Suedia………….……………………………………...............
26
CAPITOLUL V DISCUŢII ŞI CONCLUZII PRIVIND EVOLU ŢIA POSTGLACIARA A PINULUI SILVESTRU ŞI TENDIN ŢELE ACTUALE DE MIGRARE…………………
31
5.1.Contribuţii personale................................................................................................. 34
Rezumatul în limba engleză............................................................................................................. 35
Bibliografie selectivă……………………………………………………………………………... 45
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
3
INTRODUCERE
Gestionarea durabilă a pădurilor trebuie să aibă în vedere atât măsurile silviculturale
specifice, în acord cu cerințele ecologice ale speciilor, cât și considerentele de ordin genetic legate
de cunoașterea și gestionarea diversității genetice existente în arboretele naturale și cele artificiale.
Faptul că pădurile naturale dispun de o diversitate genetică mare, face ca acestea să se preteze
foarte bine programelor de ameliorare şi conservare a germoplasmei, în comparaţie cu arboretele
artificiale, acestea din urmă prezentând adesea un nivel mai redus al diversităţii genetice.
Schimbările climatice survenite în timpul Cuaternarului şi-au lăsat amprenta puternic
asupra structurii neutre a diversităţii genetice în cadrul populaţiilor aparţinând diferitelor specii de
arbori. În Europa şi America de Nord, repetatele cicluri glaciare şi interglaciare au forţat speciile
din zonele temperate să se retragă în refugii, de-a lungul perioadelor de creştere a gheţii şi
permafrostului fiind posibilă apoi migrarea lor în perioadele de încălzire interglaciare spre regiuni
unde condiţiile climatice le-au permis să supravieţuiască (IBRAHIM şi colab., 1996; TABERLET
şi colab., 1998; HUNTLEY, 1983; BENNETT şi colab., 1991; CHEDDADI şi colab., 2005).
Istoria recolonizării arborilor forestieri ajută la înţelegerea condiţiilor climatice şi de habitat
ale acestora în diferite regiuni din Eurasia în perioada Erei Glaciale. Deşi cele mai multe dintre
specii au avut ca refugiu aceeaşi regiune, dinamica şi căile de recolonizare diferă de la o specie la
alta, astfel încât speciile cu o toleranţă mare la temperaturi scăzute, cum sunt Picea, Pinus, Betula,
sunt considerate a fi originare din zone vestice şi nordice (LAGERCRANTZ şi RYMAN, 1990;
PALME şi colab., 2003).
Pinul silvestru sau pinul de pădure (Pinus sylvestris) este considerat a fi un relict glaciar,
datând din Terţiar (MIROV, 1967) şi având o istorie foarte complexă din punct de vedere al
posibilelor zone de refugiu răspândite pe întreg teritoriul Europei (BIRKS, 1989; TANTĂU şi
colab., 2006; WILLIS şi van ANDEL, 2004). Studiul polenului, macro-şi mega-fosilelor, a
profilelor sedimentare, precum şi datele istorice dovedesc că distribuţia pinului silvestru în sudul
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
4
Europei a început cu aproximativ 16000 de ani în urmă, ajungând în nordul Scandinaviei cu
aproximativ 7800 de ani în urmă (TANTĂU şi colab., 2006; WILLIS, 1998; CRITCHFIELD şi
LITTLE, 1966; GODWIN, 1956). Odată cu schimbările climatice survenite acum 500 de ani,
limita nordică a distribuţiei pinului s-a retras spre sud (WILLIS şi colab., 1998). Istoria acestor
specii, refugiile glaciare, rata de supravieţuire, precum şi distribuţia lor după era glaciară, poate fi
urmărită atât prin analiza fosilelor, cât şi cu ajutorul markerilor moleculari (ECKERT 2006,
WILLYARD şi colab., 2007). Astfel, WILLYARD şi colab. (2007) au putut evidenţia fosile de P.
belgica vechi de aproximativ 130 de milioane de ani.
Studiile filogeografice ale dinamicii populaţiilor în timp şi spaţiu, precum şi ale structurii
speciilor la nivel molecular folosind markerii organelari, au arătat că cele mai mari refugii de pin
silvestru au fost localizate în Munţii Balcani, Munţii Alpi şi Peninsula Iberică (BENNETT şi
colab., 1991; HUNTLEY şi BIRKS, 1983). Analiza polenului fosil indică faptul că abundenţa
genului Pinus în Europa a fluctuat de-a lungul sutelor de ani, în funcţie de ciclurile climatice care
au avut loc (CHEDDADI şi colab., 2005; MUELLER şi colab., 2003). În perioada apogeului erei
glaciare (37000 - 16000 de ani în urmă), Fennoscandia (Norvegia, Suedia, Finlanda, Peninsula
Kola şi Karelia) , precum şi părţile vestice din nordul Rusiei au fost acoperite cu gheaţă, însă odată
cu retragerea acesteia, pe parcursul ultimilor 10000 de ani, regiunea a fost colonizată de P.
sylvestris. Pe baza evidenţelor paleoecologice şi genetice au fost făcute numeroase sugestii despre
istoria filogeografică a pinului silvestru în timpul şi după Era Glaciară.
În cadrul cercetărilor aferente acestei teze de doctorat s-a urmărit analiza genetică a pinului
silvestru cu ajutorul markerilor moleculari (ADN mitocondrial şi cloroplastic), cu scopul de a
identifica zonele în care acesta a supravieţuit perioadei glaciare şi de a reconstitui căile de
recolonizare în areale cum ar fi România, Ungaria şi Suedia, urmărind bineînţeles şi diversitatea
genetică din cadrul acestor populații considerate resurse genetice în domeniul forestier.
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
5
CAPITOLUL I
CONSIDERAŢII GENERALE PRIVIND PINUL SILVESTRU
1.1.DISTRIBUŢIA PINULUI SILVESTRU
Pădurea de conifere reprezintă cel mai întins habitat terestru din lume, în emisfera nordică
ea ocupând o fâşie lată de aproximativ 1300 km.
La nivel global, din suprafaţa totală ocupată cu păduri, un procent de 37% este reprezentat
de pădurile de pin, în timp ce în emisfera nordică acestea ocupă 70% (MIROV, 1967). Dintre
toate speciile de pin, pinul silvestru sau pinul de pădure (P. sylvestris L.) are cea mai largă
distribuţie geografică, care se întinde din nordul Scandinaviei până în sudul Spaniei, şi din vestul
Scoţiei până în Estul Siberiei, la Marea Okhotsk. În cadrul acestui areal, populaţiile de pin
silvestru pot fi întânite la diferite altitudini, în nord fiind prezent de la nivelul mării până la 1000
m, în timp ce limita cea mai sudică este cuprinsă între 1200-2600m altitudine (Sierra Nevada,
Spania).
Pinul silvestru este cel mai răspândit conifer de pe Glob, ocupând circa 143 milioane ha
(37% din suprafaţa împădurită a globului). În România este pinul silvestru puţin răspândit în
comparaţie cu alte ţări, vegetând spontan, în masiv, la altitudini cuprinse între 310m, Dofteana-
Baciu, şi 1600 m, în Munţii Retezat, insular, în lungul Carpaţilor şi în Munţii Apuseni, pe stâncării
aride, turbării etc. Astăzi, bazinul râului Trotuş reprezintă cea mai mare zonă în care pinul este
menţinut sub formă de pădure pură sau în amestec cu molid, brad, stejar. Standuri naturale, unele
fiind de mare productivitate, se găsesc în iazuri ca: Buzău, Râmnic, Putna, Oituz. În general,
limitele sale de răspândire sunt cuprinse între 300 m altitudine în Subcarpaţii Moldovei şi Valea
Oltului şi aproximativ 1900 m în Retezat, izolat în bazinul Gemenele. Distribuţia generală a
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
6
vegetaţiei forestiere de pe teritoriul României este, pe de o parte, rezultatul evoluţiei generale a
vegetaţiei din Europa, după perioada Postglaciarului, fiind determinată climatic, iar pe de altă
parte, a intervenţiei antropice manifestată atât prin reducerea suprafeţelor deţinute de pădure, cât şi
prin transferul de seminţe şi puieţi.
Fig. 1.1. Arealul pinului silvestru (după DUCUSSO A., Euforgen 2009) Fig. 1.1. Scots pine distribution range (DUCUSSO, A., Euforgen 2009)
1.2. IMPORTANŢA PINULUI SILVESTRU
Pinul silvestru este o specie foarte importantă din punct de vedere comercial. Lemnul
cu duramen roşcat, cu proprietăţi mecanice bune este uşor de prelucrat fiind folosit în
diferite industrii (lemn de cherestea, lemn de construcţii, lemn de celuloză, lemn de mină
etc.). Cheresteaua este numită în limbaj industrial „afacere roşie”(lemn cu duramen roşu),
fiind clasificată drept "lemn moale" şi utilizată pentru o gamă largă de produse, de la
construcţii de case şi bărci, la traverse de cale ferată, mobilier, jucării. Multe hectare de
pădure de pin sunt plantate în fiecare an pentru a furniza industriei lemnul necesar
(PRAVDIN, 1969).
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
7
Calităţile tehnologice ale lemnului depind în mare măsură de bonitatea staţiunii.
Rusticitatea remarcabilă de care dă dovadă pinul silvestru l-a impus ca specie de primă
importanţă în culturile forestiere din staţiuni de bonitate inferioară, în scopul fixării solului,
asigurând totodată şi o producţie apreciabilă de masă lemnoasă.
După anul 1960, pinul silvestru a fost utilizat frecvent pentru substituirea arboretelor
slab productive de fag, gorun, gârniţă, cer etc., cultivându-se anual pe circa 6000 - 7000 de
hectare (TURNOCK, 2002).
Duşmanii pinului sunt nematodele care provoacă ofilirea, cel mai des întâlnită la
puieţii tineri, de până la 10 ani, provocând moartea acestora în doar câteva săptămâni
(LOWE, 2011).
Cu un conţinut de răşină foarte mare, pinul silvestru se pretează la rezinaj, fiind
derulate programe de selecţie a fenotipurilor valoroase, preconizându-se instalarea de culturi
cu o astfel de destinaţie. Pinul silvestru este de asemenea utilizat cu mult succes şi la
împădurirea terenurilor degradate, mai ales în Transilvania.
În Finlanda şi ţările scandinave, pinul a fost utilizat pentru producerea gudronului în
epoca pre-industrială. Şi acum mai există producători activi de gudron, dar ca şi industrie
aceasta a încetat să mai existe.
Din punct de vedere medicinal, produsele din pin sunt utilizate ca diuretice şi iritante,
fiind şi un remediu valoros în tratarea problemelor de rinichi, boli reumatice şi infecţii ale
mucoasei respiratorii. Din ace, crengi şi scoarţă, care conţin o răşină lipicioasă cu miros
plăcut, sunt extrase substanţe cum ar fi: colofoniu, terebentină şi uleiuri esenţiale.
Terebentina nu este altceva decât esenţa distilată a răşinii brute de pin. Uleiul de terebentină
este folosit pentru uz extern ca stimulent pentru umflături reumatice, pentru entorse,
echimoze şi împotriva paraziţilor. Gudronul este folosit în medicină, în special în practica
veterinară, ca şi stimulent antiseptic, cu acţiune diuretică şi diaforetic.
Colofoniul a fost folosit pentru acoperirea plăcilor de zinc sau cupru, în tipărirea
imaginilor gravate şi pentru arcurile de vioară. Uleiul esenţial de pin nu se distilează direct
din răşină brută, ci cu abur, din ramurile şi acele proaspete, la fel ca şi terebentina.
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
8
CAPITOLUL II
STADIUL ACTUAL AL CUNOA ŞTERII PRIVIND DISTRIBU ŢIA
POSTGLACIAL Ă A SPECIEI PINUS SYLVESTRIS
2.1. CONSECINŢE GENETICE ALE SCHIMBĂRILOR CLIMATICE DIN
TIMPUL CUATERNARULUI
Efectele schimbărilor climatice asupra speciilor de plante sunt cel mai bine cunoscute în
urma analizelor polenului fosil găsit în decursul ultimilor 20000 de ani în Europa şi America de
Nord (HUNTLEY şi BIRKS, 1983; HUNTLEY şi WEBB, 1988; HUNTLEY, 1990).
Studiul polenului, macro-şi mega-fosilelor, a profilelor sedimentare, precum şi datele
istorice dovedesc că distribuţia pinului silvestru în sudul Europei a început cu aproximativ
16000 de ani în urmă, ajungând în nordul Scandinaviei cu aproximativ 7800 de ani în urmă
(TANTĂU şi colab., 2006; WILLIS, 1998; CRITCHFIELD şi LITTLE, 1966; GODWIN,
1956). Istoria acestor specii, refugiile glaciare, rata de supravieţuire şi distribuţia lor după
era glaciară, poate fi urmărită prin analiza fosilelor şi cu ajutorul markerilor moleculari.
Răspândirea postglaciară a speciilor a fost influenţată şi de topografia fiecărei regiuni.
Studiile filogeografice ale dinamicii populaţiilor în timp şi spaţiu, ale structurii speciilor
la nivel molecular folosind markerii organelari, au arătat că cele mai mari refugii de pin silvestru
au fost localizate în Munţii Balcani, Munţii Alpi şi Peninsula Iberică (BENNETT şi colab.,
1991; HUNTLEY şi BIRKS, 1983). Analiza polenului fosil a indicat faptul că, abundenţa
genului Pinus în Europa a fluctuat de-a lungul sutelor de ani în funcţie de ciclurile climatice. În
perioada apogeului erei glaciare (37000 - 16000 de ani în urmă), Fennoscandia (Norvegia,
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
9
Suedia, Finlanda, Peninsula Kola şi Karelia), precum şi părţile vestice din nordul Rusiei au fost
acoperite cu gheaţă, însă odată cu topirea acesteia, pe parcursul ultimilor 10000 de ani, regiunea
a fost colonizată de P. sylvestris.
Numeroase studii pe aloenzime şi un număr tot mai mare de analize de ADN din
organite celulare (ADNcp şi ADNmt) demonstrează că populaţiile de plante care au fost
izolate în anumite areale prezintă o diversitate genetică mai ridicată decât celor dezvoltate
ulterior şi provenite din acestea.
Reducerea diversităţii genetice, în rândul populaţiilor, odată cu creşterea distanţei faţă
de refugiu prin expansiunea postglacială, în general înspre nord, este un fenomen general
datorat constrângerilor genetice repetate. Populaţiile considerate refugii glaciare (cum sunt
cele din sudul Europei) este posibil să fi menţinut o mare parte a variaţiei genetice existente
şi, prin urmare, este indicat a fi folosite cu precădere în programele de conservare genetică.
2.2. SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII
Scopul principal al temei de cercetare este studiul structurii genetice spaţiale a pinului
silvestru (Pinus sylvestris L.), de un interes major în procesul de adaptabilitate climatică,
producţie şi conservare a resurselor genetice forestiere a acestei specii. Acest studiu a
urmărit, de asemenea, cuantificarea diversităţii genetice intra şi interpopulaționale a speciei,
în populaţii provenite din trei ţări diferite altitudinal şi latitudinal: Suedia, România şi
Ungaria, în vederea caracterizării structurii lor genetice şi a modului lor de adaptare, precum
şi cu scopul identificării posibilelor rute ale colonizării în perioada postglacială. Datele
obținute vor fi folosite pentru a face recomandări privind modul de adaptare al pinului
silvestru la viitoarele schimbări climatice produse de încălzirea globală; la alegerea şi
utilizarea haplotipurilor valoroase ca material de reproducere în diferite zone geografice.
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
10
2.2.1. Obiectivele cercetării
Pentru atingerea scopului cercetărilor s-au stabilit următoarele obiective de cercetare:
- evaluarea diversităţii intra- şi interpopulaţionale a unor populaţii naturale de pin
silvestru din România, Ungaria şi Suedia;
- evidenţierea haplotipurilor existente la nivelul ADN-ului mitocondrial şi ADN-ului
cloroplastic atât prin tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction), cât şi prin metoda
electroforezei capilare (Capilary electrophoresis -Sequencing Analysis);
- identificarea refugiilor glaciare din care provin populaţiile de pin silvestru din
România, prin verificarea ipotezei conform căreia Ungaria este zonă de refugiu a pinului
silvestru în perioada glaciară (revizuit de WILLIS şi van ANDEL 2004), precum şi căile de
recolonizare postglaciară pe teritoriul ţării;
- evaluarea diversităţii genetice şi identificarea căilor de recolonizare a populaţiilor de
pin silvestru pe teritoriul Suediei, în zona de nord a distribuţiei acestuia;
- elaborarea de concluzii privind influenţa schimbărilor climatice asupra diversităţii
genetice, evoluţiei şi migraţiei populaţiilor de pin silvestru;
- formularea de recomandări privind alegerea haplotipurilor cu capacitate mare de
adaptare viitoarelor schimbări climatice (de exemplu încălzirea globală preconizată) în
funcţie de zona de interes.
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
11
CAPITOLUL III
MATERIAL ŞI METODE DE CERCETARE
3.1. MATERIALUL DE CERCETARE
În cercetările aferente prezentei teze de doctorat s-au analizat 13 populaţii naturale de
pin silvestru din România, 2 populaţii din Ungaria şi 53 populaţii din Suedia. Recoltarea
materialului vegetal, respectiv muguri (România, Ungaria şi Suedia) şi ace (Suedia) s-a
desfăşurat în două perioade diferite ale anului II de studiu 2010, respectiv anul III 2011.
Pentru a putea lua în studiu întreaga distribuţie a pinului silvestru de pe teritoriul
României, au fost recoltate populaţiile din zona centrală, respectiv interiorul lanţului Munţilor
Carpaţi (etapa I a recoltării), dar şi partea nord-estică, respectiv, exteriorul lanţului Carpatic
(etapa II a recoltării). Alegerea populaţiilor a fost făcută pe baza Catalogului Rezervaţiilor de
Seminţe, catalog întocmit la nivelul Regiei Naţionale a Pădurilor şi care cuprinde întreaga
suprafaţă a ţării.
Populaţiile din Suedia luate în studiu au provenit din două loturi de experimente cu
provenienţă diferită. Prima serie de provenienţe se află în Sävar, lângă Umeå, la 63˚53'N
20˚32'E, iar materialul a fost furnizat de către Institutul de Cercetări Silvice, Skogforsk. A
doua serie a fost în Remmingstorp, lângă Skövde, la 58˚27'N 13˚40'E şi au fost furnizate de
către Skogssällskapet AB.
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
12
3.2. METODE DE ANALIZĂ UTILIZATE ÎN LABORATOR
Procesul de izolare al ADN-ului la toate variantele de studiu din România s-a realizat
utilizând protocolul de extracţie ADN creat de LODHI (1994) şi îmbunătăţit de către POP
(2003). În cadrul populaţiilor din Suedia, extracţia ADN s-a ralizat după protocolul CTAB
(DOLYE & DOLYE 1987). Cantităţile de ADN obţinute au variat între 1000 ng/µl şi 6500
ng/µl. Toate probele au avut puritate destul de ridicată, raportul celor două citiri (A260-
A280) s-a încadrat între valori de 1,7 şi 1,9
Primerii folosiţi pentru amplificarea ADN-ului mitocondrial au fost aleşi pe baza
studiilor similare (PYHÄJÄRVI şi colab., 2008; NAYDENOV şi colab., 2007; CHEDDADI
şi colab., 2006); astfel, au fost folosite 2 seturi de primeri, şi anume nad1 intron B/C creat de
SORANZO şi colab. (2000) şi nad7 intron1 creat de JARAMILLO-CORREA (2003).
Nivelul variaţiei genetice intra şi interpopulaţionale a fost urmărit la nivelul
secvenţelor microsatelit din cloroplaste în toate cele 68 populaţii naturale de pin silvestru.
Pentru amplificarea ADN-ului cloroplastic s-au folosit 18 primeri microsateliţi (cpSSR).
Aceştia au fost concepuţi şi testaţi pentru prima dată pe 6 specii diferite de pin printre care şi
P. thunbergii, de către POWELL şi colab. (1995); VENDRAMIN şi colab. (1996). În urma
optimizării condiţiilor PCR de amplificare, pentru a continua analizele au fost aleşi 14
primeri (PCP26106, PCP30277, PCP36567, PCP41131, PCP45071, PCP1289, PCP48256,
PCP63771, PCP71987, PCP87314, după PROVAN şi colab. (1998), Pt87268, Pt1254,
Pt71936, Pt15169 după VENDRAMIN şi colab. (1996).
În vederea evidențierii diversității genetice la nivelul markerilor mitocondriali şi
cloroplastici, datele rezultate în urma interpretării gelurilor de agaroză (cazul primerilor
mitocondriali) şi a cromatrogramelor (cazul primerilor cloroplastici) au fost prelucrate cu
ajutorul diferitelor programe de analiză genetică: CONTRIB, FSTAT, ARLEQUIN, BAPS
şi AIS, fiind determinați diferiţi parametrii.
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
13
CAPITOLUL IV
REZULTATE OB ŢINUTE
4.1. DIVERSITATEA GENETICĂ A PINULUI SILVESTRU DIN ROMÂNIA, UNGARIA
Şi SUEDIA LA NIVELUL ADN-ULUI MITOCONDRIAL
Din punct de vedere al diversităţii genetice a pinului silvestru au fost identificate două
haplotipuri distincte de ADNmt, din care cel mai reprezentativ este haplotipul AA, întâlnit în
toate cele 15 populaţii analizate, urmat de haplotipul AB comun în partea centrală a ţării şi în
proporţie redusă în cele 2 populaţii din Ungaria.
O importanţă deosebită este atribuită acestui studiu datorită faptului că nici un alt
studiu anterior cu privire la rutele de colonizare a pinului silvestru în Europa nu au cuprins şi
populaţii din România, cu excepţia lui NAYDENOV şi colab. (2007), care au studiat o
singură populaţie din Cugir (rezervaţie de seminţe), observând prezenţa unui singur hapotip,
haplotipul AA.
Prezenţa haplotipului BA într-o singură populaţie din România este corelată cu
prezenţa aceluiaşi haplotip în Peninsula Iberică şi Munţii Balcani (NAYDENOV şi colab.,
2007), fiind posibilă migrarea acestuia de-a lungul timpului spre România, datorită
topografiei şi poziţiei izolate a Peninsulei Iberice. Probabilitatea unei deplasări ale
seminţelor pe distanţe aşa lungi ar fi mai mare în cazul populaţiilor mai nordice şi estice ale
distribuţiei pinului silvestru datorită lipsei barierelor majore (munţi). O altă explicaţie
plauzibilă pentru prezenţa atât de rară a acestui haplotip (datorită alelei B a locusului nad1)
în populaţia din România şi în câteva populaţii din Balcani, ar fi aceea conform căreia alela
B este o alelă veche care a fost prezentă în era glaciară în mai multe refugii din zona de sud a
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
14
Europei. Frecvenţa ridicată sau scăzută a acestei alele este datorată variaţiei stochastice, în
special în cazul în care refugiile din sud au trecut prin puternice fenomene de bottleneck, sau
datorită intervenţiilor umane.
Prezenţa alelei B a locusului nad7 în proporţie de aproximativ 50% în majoritatea
populaţiilor din România nu poate fi explicată ca fiind o mutaţie din timpul Holocenului,
deoarece ea este foarte răspândită în populaţii din nord - estul Europei (NAYDENOV şi
colab., 2007), făcând de asemenea parte din populaţii nordice considerate zone de refugiu
(SINCLAIR şi colab., 1999).
Rezultatele obţinute sunt în concordanţă cu ipoteza conform căreia Ungaria şi Cehia
sunt considerate refugii ale pinului silvestru în era glaciară, după cum arată studii ale
polenului fosil (revizuit de WILLIS şi van ANDEL 2004). Se pot urmări două căi de migrare
din refugiu şi colonizare a României, astfel, prima rută de colonizare cel mai probabil s-a
realizat din populaţia Fenyőfő din partea de sud-vest a Ungariei, populaţie considerată relict,
urmând fluviul Dunărea ce străbate Ungaria şi Romania, fiind astfel posibil transportul
seminţelor pe această cale spre populaţiile din exteriorul arcului Carpatic: Vâlcea, Vrancea şi
Suceava. Cea de-a doua rută de colonizare s-a realizat prin transportul seminţelor cu ajutorul
vântului sau a apei din partea de nord - vest a Ungariei, respectiv din populaţia Velemer
considerată de asemenea relict, prin partea central - nordică a României, colonizând zonele
din interiorul Munţilor Carpaţi. De asemenea, pentru Picea abies, conifer foarte comun în
Europa şi rezistent la temperaturi scăzute, Munţii Carpaţi au fost consideraţi zonă de refugiu
în timpul glaciaţiunii (GUGERLI şi colab., 2001).
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
15
Fig. 4.6. Distribuţia haplotipurilor mitocondriale în popula ţiile analizate
din România şi Ungaria Fig. 4.6. Distribution of mitochondrial haplotypes in populations from Romania and Hungary
Populaţiile din Suedia au evidenţiat prezenţa haplotipului AA la 80% dintre indivizii
analizaţi, iar a haplotipul AB întâlnit la doar 20% dintre indivizi. De asemenea haplotipul
BA a fost nesemnificativ reprezentat datorită prezenţei într-o sigură populaţie din cele 54
populaţii analizate. Din analizele realizate în cadrul acestei teze de doctorat se poate
concluziona, de asemenea, faptul că pinul silvestru a colonizat Suedia urmând două rute
principale care se întâlnesc în centrul ţării, ipoteză susţinută şi de TABERLET şi colab.
(1998), SINCLAIR şi colab. (1999). O rută a colonizării porneşte din partea de nord-est a
Europei şi iar cea de-a doua, din sudul Europei, întâlnindu-se în centrul Suediei, fapt ce
poate fi observat din figurile prezente în teză (Figura 4.6., Figura 4.7.).
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
16
Fig. 4.7. Distribuţia haplotipurilor mitocondriale în popula ţiile analizate din Suedia Fig. 4.7. Mitochondrial haplotypes distribution in populations from Sweden
4.2. DIVERSITATEA GENETICĂ A PINULUI SILVESTRU DIN ROMÂNIA, UNGARIA
Şi SUEDIA LA NIVELUL ADN-ULUI CLOROPLASTIC
În analizele ADN-ului cloroplastic fiecare locus analizat a fost polimorf, prezentând
în medie 2 până la 6 alele. Pe baza acestei frecvenţe a alelelor se observă o distribuţie
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
17
unimodală la nivelul fiecărui locus, cu alele ce se diferenţiază prin una sau două perechi de
baze. Aceasta sugerează faptul că cea mai mare parte a variaţiei observate poate fi explicată
datorită erorilor care apar în timpul replicării ADN-ului prezent în markerii microsatelit
(VALDES şi colab., 1993; DIRIENZO şi colab., 1994, FREIMER şi SLATKIN 1996).
Datorită faptului că genomul cloroplastic nu este supus procesului de recombinare,
variabilitatea observată la nivel de ADN nu poate fi explicată prin crossing-over. În urma
analizei frecvenţelor microsatelit din ADN-ul cloroplastic, obţinute prin amplificarea cu 14
primeri, s-a evidenţiat un nivel foarte ridicat al variaţiei. Astfel, în 288 de indivizi analizaţi,
din România şi Ungaria, s-au identificat 235 de haplotipuri diferite, din care 182 (77%) sunt
haplotipuri unice, ele aparţinând câte unui singur individ. Aceasta înseamnă că 63% (182 din
288) din indivizii analizaţi au avut un profil unic la nivelul locilor microsatelit analizaţi; la
nivelul întregului studiu 82% dintre indivizii analizaţi au prezentat haplotip caracteristic.
În vederea grupării populaţiilor pe baza relaţiilor genetice s-a folosit programul
BAPS. Utilizând opţiunea de grupare a populaţiilor (clustering of populations) s-a presupus
un număr K=15 sau K=3 de populaţii, rezultând o grupare a populaţiilor în 2 mari clustere
reprezentate în figura de mai jos.
Considerând modul de transmitere a ADN-ului cloroplastic pe cale paternă prin
polen, fluxul de gene este mult mai mare, răspândirea polenului fiind posibilă pe distanţe
foarte mari de zeci şi chiar sute de kilometri. Astfel se poate observa o diversitate ridicată în
cadrul populaţiilor analizate. Cele 15 populaţii au fost astfel grupate în două clutere cu o
proporţie de 50:50 în fiecare cluster reprezentate pe hartă prin culoarea galben şi maro.
Populaţiile din ambele ţării au fost analizate împreună pentru a evidenţia legătura genetică
dintre acestea, fapt ce poate susţine ipoteza lui WILLIS van ANDEL 2004, Ungaria fiind
considerată refugiu glaciar pentru această specie.
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
18
Fig. 4.11. Distribuţia clusterelor cloroplastice rezultate în urma analizei bayesiene Fig. 4.11. Distribution of the chloroplast clusters given by BAPS program
Prin analiza ADN-ului cloroplastic al celor 54 de populaţii, cu ajutorul celor 14
primeri microsatelit, s-a evidenţiat un număr de 230 haplotiuri unice fiecărui individ din
totalul de 317 indivizi analizaţi (Figura 4.13.). Un nivel ridicat al diversităţii intra şi
interpopulaţionale poate fi observat şi comparativ cu analizele ADN-ului mitocondrial,
datorită modului de transmitere a ADN-ului cloroplastic, şi anume pe cale paternă cu
ajutorul polenului, caz în care fluxul de gene este mult mai mare.
Astfel, utilizând varianta de calcul “clustering individuals” sau populaţii “ clustering
groups of populations” s-a observat o grupare a populaţiilor în 4 clustere. Aceste clustere
prezintă o distribuţie aproximativ egală de-a lungul întregii ţării, subliniind astfel gradul
ridicat de diversitate la nivelul populaţiilor analizate.
Diferenţierea genetică între populaţiile din România şi cele din Ungaria, la nivelul
ADN-ului cloroplastic, a înregistrat o valoare de Gst= 0,0549 ceea ce indică o diferenţiere
destul de ridicată a populaţiilor comparativ cu valorile înregistrate în cazul ADN-ului
mitocondrial. Nivelul diversităţii genetice totale (HTCP) se situează în jurul valorii de 52%.
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
19
Valoarea cea mai ridicată a diversităţii genetice a fost găsită în populaţia Caraş Severin
(HSCP= 0,496) (Tabelul 4.23.), urmată de populaţia Gurghiu (HSCP =0.491), iar valoarea cea
mai scăzută a fost înregistrată în populaţia Timişoara (HSCP =0.4256) şi Reghin (HSCP =
0.4348).
Fig. 4.13. Reprezentarea geografică a clusterelor ADN-ului cloroplastic rezultate în urma analizei bayesiene
Fig. 4.13. Geographical distribution of the chloroplast clusters resulted from BAPS analy
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
20
Tabelul 4.23. Table 4.23.
Parametrii diversitt ăţii genetice intrapopulaţionale pentru populaţiile de pin silvestru analizate în România şi Ungaria; N-mărimea eşantionului, H SMT/SCP-diversitatea genetică medie în ADN-uli mitochondrial,cloroplastic ASMT/SCP-diversitatea alelelor mitocondriale, cloroplastice, Gst, Nst- diferenţierea genetică interpopulaţională
Genetic diversity parameters for scots pine analyzed population from Romania and Hungary; N-sample size, HSMT/SCP-mitochondria/chloroplast mean genetic diversity, ASMT/SCP- mitochondrial/chloroplast allelich richness, Gst, Nst- genetic
differentiation within populations
Ţara Judeţul Locaţia Longitudine Latitudine Marimea eşantionului
HSMT ASMT BAPS
HSCP ASCP G-W
Country County Location Longitude Latitude Sample size Mitocondria Cloroplast
Romania Alba Baia de Aries 23°20’00” 46°24’33” 20 0.218 0.433 2,3 0.465 0.996 1.038 Romania Alba Sebes 23°30’09” 45°53’32” 20 0.505 0.505 2 0.448 0.996 1.196 Romania Mures Gurghiu 24°51’16” 46°46’28” 20 0.478 0.456 2 0.491 0.995 0.914 Romania Mures Reghin 24°31’42” 46°53’02 20 0.442 0.456 2 0.434 0.996 0.989 Romania Sibiu Agnita 24°45’47” 46°00’53” 20 0.514 0.515 2 0.477 0.995 1.043 Romania Harghita Toplita 25°20’35” 46°54’40” 20 0.505 0.505 2 0.449 0.996 0.988 Romania Brasov Zarnesti 25°19’31” 45°33’59” 17 0.400 0.382 2 0.486 1.000 1.027 Romania Caras Anina 21°51’41” 45°05’60” 20 0.521 0.521 2 0.496 0.993 1.009 Romania Hunedoara Pui 23°06’05” 45°31’24” 19 0.514 0.503 2 0.470 1.000 1.076 Romania Suceava Candreni 21°51’12” 47°20’59” 20 0.000 0.000 1 0.483 0.991 0.982 Romania Timisoara Nadragu 21°11’00” 45°39’00” 19 0.424 0.456 2 0.425 0.990 1.003 Romania Valcea Voineasa 23°52’01” 45°28’12” 16 0.000 0.000 1 0.465 0.183 1.061 Romania Vrancea Tulnici 26°38’57” 45°55’18” 20 0.000 0.000 1 0.450 0.996 0.950
Ungaria Győr Moson Sopron
Fenyőfő 17°45’47” 47°5’20” 20 0.100 0.100 1 0.458 0.994 0.832
Ungaria Vas Velemer 16°22’35” 46°44’04” 18 0.522 0.523 2 0.489 1.000 0.964 Total Gst= 0.184
Nst =0.184
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
21
Tabelul 4.24. Table 4.24.
Parametrii diversitt ăţii genetice intrapopulaţionale pentru populaţiile de pin silvestru analizate în Suedia N-mărimea eşantionului, HSMT/SCP-diversitatea genetică medie în ADN-uli mitochondrial,cloroplastic ASMT/SCP-
diversitatea alelelor mitocondriale, cloroplastice, Gst, Nst- diferenţierea genetică interpopulaţională Genentic diversity parameters for scots pine analyzed population from Sweden N-sample size, HSMT/SCP-
mitochondria/chloroplast mean genetic diversity, ASMT/SCP- mitochondrial/chloroplast allelich richness, Gst, Nst- genetic differentiation within populations
Ţara Judeţul Locaţia Id.Tag
Latitudine Longitude Marimea eşantionului HSMT ASMT HSCP ASCP G-W BAP
S Country County Location Latitude Longitudine Sample size Mitocondria Cloroplast Sweden Sävar Rönnbäck AC 493 63°55’ 20°03’ 7 0.400 0.333 0.414 1.000 1.154 1 Sweden Sävar Hjoggböle AC 494 64°30’ 21°00’ 6 0.333 0.333 0.442 1.000 1.230 2 Sweden Sävar Krångfors AC 495 64°46’ 20°29’ 6 0.000 0.000 0.400 1.000 1.580 5 Sweden Sävar Tallsjö AC 496 64°10’ 17°56’ 7 0.000 0.476 0.377 1.000 1.431 1 Sweden Sävar Segersjökullen AC 497 64°03’ 18°33’ 6 0.000 0.000 0.533 1.000 1.211 1
Sweden Sävar Fjällbränna,
Ormsjö AC 498 64°30’ 16°03’ 5 0.000 0.000 0.471 1.000 1.295 1
Sweden Sävar Innanbäck AC 499 65°00’ 21°03’ 5 0.000 0.000 0.242 1.000 3.200 1 Sweden Sävar Tallunda AC 501 65°18’ 18°49’ 6 0.000 0.000 0.392 1.000 1.407 1
Sweden Sävar Plantage 18+20,
Brån AC 560 63°52’ 19°52’ 7 0.285 0.286 0.458 1.000 1.230 1
Sweden Sävar Lindviken 2/68 BD401 65°50’ 20°53’ 5 0.000 0.000 0.540 1.000 1.333 1 Sweden Sävar Ö. Nykåtatjärn BD403 65°50’ 18°53’ 7 0.285 0.286 0.522 1.000 1.003 1 Sweden Sävar Pasainen BD 405 66°30’ 23°03’ 6 0.000 0.000 0.328 0.933 1.600 1 Sweden Sävar Korro BD 406 66°31’ 19°53’ 7 0.400 0.333 0.473 1.000 1.251 1 Sweden Sävar Abtaur BD 407 66°00’ 18°53’ 7 0.285 0.286 0.328 0.964 1.501 1 Sweden Sävar Krp. Ö. Uddjaur BD 408 66°01’ 18°03’ 6 0.333 0.333 0.328 1.000 1.401 1 Sweden Sävar Suopikåive BD 409 66°20’ 20°00’ 7 0.000 0.000 0.560 1.000 1.119 1 Sweden Sävar Suopikåive BD 410 66°20’ 20°00’ 4 0.000 0.000 0.559 1.000 1.148 1 Sweden Sävar Uijatievat BD 411 67°48’ 21°53’ 7 0.571 0.333 0.386 0.964 1.347 1 Sweden Sävar Äijänrova BD 412 67°38’ 21°22’ 6 0.400 0.333 0.538 1.000 1.230 1
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
22
Ţara Judeţul Locaţia Id.Tag
Latitudine Longitude Marimea eşantionului HSMT ASMT HSCP ASCP G-W BAP
S Country County Location Latitude Longitudine Sample size Mitocondria Cloroplast Sweden Sävar Selsberget BD 424 66°00’ 21°03’ 6 0.533 0.333 0.419 1.000 1.260 2 Sweden Sävar Selsberget BD 425 66°00’ 21°03’ 8 0.000 0.000 0.685 1.000 1.095 1 Sweden Sävar Krp. Flinsberget Bg 419 60°00’ 16°00’ 6 0.000 0.000 0.516 1.000 1.541 1 Sweden Sävar Stempen, Särna Bg 420 61°30’ 13°03’ 6 0.533 0.000 0.466 1.000 1.251 2 Sweden Sävar Granåsen Bg 422 61°40’ 13°00’ 4 0.333 0.500 0.504 1.000 1.250 2 Sweden Sävar Nora, Nyland Y 824 62°52’ 17°55’ 4 0.000 0.000 0.500 1.000 1.375 4 Sweden Sävar Nordanede Y 825 62°35’ 16°18’ 7 0.000 0.000 0.580 1.000 0.917 3 Sweden Sävar Finnbäcken Y 826 62°20’ 16°28’ 7 0.000 0.000 0.421 0.952 1.238 3 Sweden Sävar Dalstjärn Y 827 63°30’ 19°03’ 6 0.000 0.000 0.492 1.000 1.057 1 Sweden Sävar Viken Y 828 63°30’ 16°31’ 5 0.000 0.000 0.454 1.000 1.371 1 Sweden Sävar Bergetjärn Y 829 64°10’ 16°03’ 5 0.000 0.000 0.509 1.000 1.138 4 Sweden Sävar Fudan Z 423 62°40’ 14°33’ 5 0.000 0.000 0.521 1.000 1.242 4 Sweden Sävar Bodbacksbränn Z 424 62°30’ 14°33’ 6 0.000 0.000 0.430 1.000 1.500 4 Sweden Sävar Vävelsberget Z 425 62°40’ 13°03’ 7 0.476 0.476 0.521 1.000 1.076 4
Sweden Sävar Kittelsjön, Lillhärdal
Z 426 62°00’ 13°33’ 6 0.000 0.000 0.421 0.933 1.219 4
Sweden Sävar Medskogen Z 427 62°26’ 13°02’ 7 0.333 0.476 0.525 1.000 0.976 4 Sweden Sävar Kvitsle, Mattmar Z 428 63°17’ 13°49’ 6 0.000 0.000 0.488 1.000 1.118 4 Sweden Sävar Borön, Lockne Z 429 63°15’ 14°53’ 6 0.000 0.000 0.490 1.000 0.968 4 Sweden Sävar Gransjölandet Z 430 63°03’ 15°38’ 7 0.000 0.000 0.447 1.000 1.272 5 Sweden Sävar Krp. Golhammar Z 431 63°00’ 14°00’ 5 0.000 0.000 0.534 1.000 1.032 5 Sweden Sävar Brämön, Sanna 40S 62°12’ 17°42’ 2 0.000 0.000 0.428 1.000 2.122 5
Sweden Sävar Kilafors,
Hemstanäs 48H 61°08’ 16°31’ 6 0.333 0.333 0.500 1.000 1.076 5
Sweden Remmingstorp
Orsa, Högståsen 49H 61°05’ 14°58’ 10 0.000 0.000 0.543 0.978 0.922 5
Sweden Remmingstorp
Sandhamn 61S 59°17’ 18°55’ 2 0.000 0.000 0.428 1.000 2.277 5
Sweden Remmi Varnhem,Billing 69B 58°22’ 13°41’ 9 0.000 0.476 0.472 0.972 1.129 5
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
23
ngstorp en
Ţara Judeţul Locaţia Id.Tag
Latitudine Longitude Marimea eşantionului HSMT ASMT HSCP ASCP G-W BAP
S Country County Location Latitude Longitudine Sample size Mitocondria Cloroplast
Sweden Remmingstorp
Västervik 70V 57°46’ 16°39’ 2 0.000 0.000 0.500 1.000 2.000 5
Sweden Remmingstorp
Eckersholm 74E 57°36’ 14°13’ 2 1.000 1.000 0.571 1.000 1.708 5
Sweden Remmingstorp
Färingtofta 80F 56°03’ 13°23’ 9 0.200 0.429 0.524 0.978 0.932 5
Sweden Remmingstorp
Granna G 58°01’ 14°28’ 4 0.000 0.000 0.404 1.000 1.614 1
Sweden Remmingstorp
Hornso H 57°00’ 16°12’ 7 0.476 0.476 0.512 1.000 1.125 1
Sweden Remmingstorp
Kohult K7V 57°48’ 13°47’ 5 0.600 0.000 0.452 1.000 1.380 4
Sweden Remmingstorp
Timmer Nabben TN 56°41’ 12°55’ 8 0.600 0.667 0.414 1.000 1.400 4
Sweden Remmingstorp
Torup&Halland TH 56°54’ 12°29’ 5 0.000 0.600 0.433 1.000 1.166 1
Total GST= 0.194,
NST= 0.197
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
24
În ceea ce priveşte situaţia populaţiilor din Suedia, diversitatea genetică totală (HTCP)
la nivelul ADN-ului cloroplastic se situează în jurul valorii de 99%. Valoarea cea mai mică a
diversităţii genetice medii la nivelul fiecărei populaţii a fost înregistrată în populaţia din
Innanbäck, notată în tabel prescurtat AC 499 (HSCP =0,24286), urmată de populaţiile
Pasainen (BD 405), Abtaur (BD407), Uddjaur (BD408), care au înregistrat o valoare egală
(HSCP =0,32857). Valoarea cea mai ridicată a diversităţii genetice s-a observat în populaţia
Selsberget (BD 425) (HSCP =0,68537), populaţii situată printre cele mai nordice analizate.
Din punct de vedere latitudinal populaţiile cele mai nordice au prezentat o diversitate
genetică mai pronunţată la nivelul locuşilor analizaţi, comparativ cu populaţiile aflate la
latitudini mai joase, înspre sud.
Pentru a testa dacă populaţiile au suferit o constrângere (fenomenul de bottleneck) de-
a lungul anilor, dar şi în timpul procesului de recolonizare, indicele Garza - Williamson a
fost calculat cu valori cuprinse între 0,832 în populaţia Fenyőfő Ungaria şi 1,196 în
populaţia Sebeş, Romania. Se constată astfel că populaţia Fenyőfő a suferit mici modificări
datorită fenomenului de bottleneck, în timp ce restul populaţiilor au avut o valoare a
indicelui G-W≥1, ce indică o stabilitate/staţionare a mărimii populaţiei efective. Această
situaţie se poate explica prin faptul că s-au analizat exemplare bătrâne de pin silvestru, care
reprezintă rezultatul unor încrucişări realizate cu mult timp în urmă. În populaţiile din
Suedia indicele G-W a avut valori cuprinse între 0,922 în populaţia Orsa, Högståsen, cu
urme uşoare de constrângere a mărimii populaţiei efective, şi 3,22 în populaţia Innanbäck,
urmată de restul de 52 de populaţii toate înregistrând valori mai mari sau egale cu 1 ceea ce
indică faptul că nu au fost detectate efecte ale derivei genetice de tip bottleneck.
Analize spaţiale au fost realizat cu programele BAPS şi AIS. În urma analizei
bayesiene a ADN-ului mitocondrial, populaţiile au fost grupate în două clustere principale şi
unul secundar.
1. Primul cluster cuprinde populaţiile din exteriorul arcului Carpatic, respectiv
Suceava, Vrancea şi Vâlcea, de pe teritoriul României şi populaţia din sud - vestul Ungariei,
Fenyőfő.
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
25
2.Cel de-al doilea cluster cuprinde restul populaţiilor de pe teritoriul României situate
în interiorul arcului Carpatic şi cea de-a doua populaţie din nord - vestul Ungariei, Velemer.
Considerând modul de transmitere a ADN-ului cloroplastic pe cale paternă prin
polen, fluxul de gene este mult mai mare, răspândirea polenului fiind astfel posibilă pe
distanţe foarte mari, de zeci şi chiar sute de kilometri. Astfel, se poate observa existenţa unei
diversităţi ridicate în cadrul populaţiilor analizate. Astfel, cele 15 populaţii au fost grupate în
două clustere, în proporţie de 50:50 în fiecare cluster, fiind reprezentate pe hartă prin
culoarea galben şi maro. Populaţiile din ambele ţări au fost analizate împreună pentru a
evidenţia legătura genetică dintre acestea, fapt ce poate susţine ipoteza lui WILLIS van
ANDEL (2004), Ungaria fiind considerată refugiu glaciar pentru această specie.
4.3. STRUCTURA GENETICĂ SPAŢIALĂ ÎN POPULAŢII NATURALE
DE PIN SILVESTRU
4.3.1. Interpolarea genetică a populaţiilor de pin silvestru din România, Ungaria
şi Suedia
4..3.1.1 Interpolarea genetică pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial pentru
populaţiile din România şi Ungaria
Metoda interpolării a fost folosită pentru vizualizarea modelelor diversităţii genetice
în conformitate cu terenul/relieful zonei analizate.
Interpolarea realizată prin metoda Delanuay Triagulation sau teselaţia (WATSON
PHILIPS, 1985; WATSON, 1992) a fost utilizată pentru a deduce distanţele genetice între
locaţii pe o grilă suprapusă uniform pe întreaga zonă recoltată (Figura 4.14.). Urmărind
procedeul interpolarii, a fost generată o figură 3D reprezentând distanţele genetice
interpolate, unde X şi Y corespund coordonatelor geografice ale populaţiilor analizate, iar Z
-distanţele genetice.
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
26
Cu alte cuvinte, s-a utilizat această metodă pentru a “întării”/confirma rezultatele
obţinute cu ajutorul programului BAPS, ambele metode fiind bazate pe acelaşi principiu, şi
anume de a grupa indivizii în funcţie de distanţa genetică dintre ei, dar şi de distanţa
geografică. Metoda de interpolare folosită în acest program a fost metoda teselaţiei, luând la
întâmplare indivizi ce se aseamănă din punct de vedere genetic şi poartă aproximativ
aceleaşi alele, urmând ca ulterior sa fie grupaţi în clustere.
Poate fi observată o grupare a populaţiilor aflate în exteriorul arcului Carpatic
(Suceava, Vrancea, Vâlcea) cu populaţia din partea de sud - vest a Ungariei, Fenyőfő. De
asemenea, populaţiile situate în interiorul arcului Carpatic au fost grupate cu populaţia din
nord - vestul Ungariei, Velemer. Culoarea vârfurilor indică cât de asemănători respectiv cât
de diferiţi sunt indivizii/populaţiile între ele (exemplu, populaţiile în culoarea albastru închis
sunt asemănătoare din punct de vedere genetic, au alele comune; populaţiile în gri se
aseamănă între ele însă sunt diferite de cele în albastru la nivelul alelelor) (Figura 4.14.).
4.3.1.2. Interpolarea genetică pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial a populaţiilor din
Suedia
În mod aşteptat, rezultatele interpolării populaţiilor din Suedia după datele ADN-ului
mitochondrial sunt în perfectă concordanţă cu rezultatele obţinute în programul BAPS,
evidenţiind astfel faptul că populaţiile din nordul şi sudul ţării prezintă o diversitate mult mai
ridicată şi o frecvenţă a alelelor mult mai mare în comparaţie cu populaţiile situate în partea
centrală a ţării acestea fiind mult mai “sărace” din punct de vedere al diversităţii genetice şi
frecvenţei alelice; rezultă o evidenţă clară a colonizării pinului silvestru în Suedia urmând
două rute principale: una din refugii situate în partea de nord a Europei (cel mai probabil
Rusia, PYHAJARVI şi colab., 2008, NAYDENOV şi colab.,2007) şi cea de-a doua rută
colonizând partea de sud a ţării din refugii sud-estice cum ar fi: Balcani, Peninsula Italică,
Ungaria, Cehia (CHEDDADI şi colab., 2006, ROBLEDO-ARNUNCIO şi colab., 2005).
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
27
Fig. 4.14. Interpolarea genetică a 15 populaţii de Pinus sylvestris din Romania şi Ungaria calculate pe baza variaţiei genetice la nivelul ADN-ului mitocondrial. Axele X şi Y reprezintă locaţia geografică a populaţiilor în interiorul re ţelei de triangulaţie
Delaunay (WATSON, 1992, BROUNS şi colab., 2003), iar “înălţimile” suprafeţei (axele Z) reprezintă media distanţelor genetice dintre indivizi.
Fig. 4.14. Genetic Landscape Shape Interpolation analysis for 15 scots pine populations based on mitochondrial DNA variation. The X and Y axes show the geographic locations within a
Delaunay triangulation network constructed among the sampled stands. Surface plots heights reflect average between interindividual genetic distances.
Atât populaţiile din partea de nord a distribuţiei sunt corelate cu distanţa geografică,
cât şi cele din partea de sud (Figura 4.15.), rezultând în vârfuri proeminente şi de aceeaşi
culoare, în timp ce pentru populaţiile din zona centrală a ţării se observă o mai slabă
interpolare prin lipsa diversităţii genetice.
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
28
Fig. 4.15. Interpolarea genetică a 54 populaţii de Pinus sylvestris din Ungaria calculate pe baza variaţiei genetice la nivelul ADN-ului mitochondrial. Axele X şi Y reprezintă
locaţia geografică a populaţiilor în interiorul re ţelei de triangulaţie Delaunay (WATSON 1992, BROUNS şi colab., 2003) iar “înălţimile” suprafeţei (axele Z)
reprezintă media distanţelor genetice dintre indivizi.
Fig. 4.15. Genetic Landscape Shape Interpolation analysis for 54 scots pine populations from Sweden based on mitochondrial DNA variation. The X and Y axes show the geographic locations within a Delaunay triangulation network constructed among the sampled stands. Surface plots
heights reflect average between interindividual genetic distances.
Rezultatele analizei bayesiene (Figura 4.12. din teză) confirmă ipoteza celor două rute
de colonizare (tratate în Capitolul IV) din refugii situate în nord - estul Europei şi din refugii
din zona de sud a Europei, acestea întâlnindu-se în partea centrală a Suediei.
Rezultatele analizei bayesiene au fost susţinute şi de rezultatele analizei interpolării
genetice şi autocorelaţiei spaţiale.
Rezultatele testului Mantel indică o valoare negativă a coeficientului de corelaţie (r)
între distanţa genetică şi distanţa geografică de - 0,0286 nesemnificativ statistic (Figura
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
29
4.18.a din teză), cum de altfel se aştepta luând în calcul aşezarea geografică şi orografia
României. În mod asemănător, valoarea coeficientului de regresie (r) pentru datele ADN-
ului cloroplastic, este de 0,09813, ceea ce indică o corelaţie redusă, nesemnificativă din
punct de vedere statistic (Figura 4.18.b din teză). Se poate concluziona astfel faptul că
diferenţierea genetică a populaţiilor de pe teritoriul României nu se datorează distanţei
geografice dintre acestea, ci mai degrabă datorită orografiei - munţilor. În acest sens Carpaţii
României au funcţionat ca o barieră naturală în faţa diversităţii genetice a populaţiilor de pin
silvestru, respectiv în procesul de reproducere, (diseminare a seminţelor, polenului) şi a
schimbului de gene între populaţii.
Fig. 4.18.a. Corelaţia dintre distanţa genetică la nivelul ADNmt şi distanţa geografică (Testul Mantel) reprezentând populaţiile din România şi Ungaria
Fig. 4.18.a.Correlation of genetic and geographical distances (Mantel test) showing Romanian and Hungarian scots pine populations
Pentru populaţiile din Suedia, testul Mantel a prezentat un coeficient de corelaţie
pozitivă între distanţa genetică şi distanţa geografică, r =0,1078, şi o probabilitate de a
observa această corelaţie de P = 1,0000, în graficul de mai jos observându-se o uşoară
creştere a diversităţii genetice odată cu creşterea distanţei geografice. O posibilă explicaţie
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
30
pentru această corelaţie este suprafaţa mare (în lungime) de pe care populaţiile au fost
recoltate şi lipsa barierelor naturale, a munţilor, diversitatea genetică fiind astfel influenţată
de un model geografic şi nu orografic (cazul României şi Ungariei). Deasemenea, indivizii
aflaţi la o distanţă mai mare sunt mai diferiţi, (exemplu, indivizii din nord cu cei din sud)
prezintă o diversitate genetică mai mare datorită celor două rute de colonizare, provenind din
două refugii diferite, respectiv Nordul Europei (Rusia, Finlanda) şi una din sudul Europei
(partea central-vestică, Balcani, Peninsula Italică).
Fig. 4.19.a. Corelaţia dintre distanţa genetică, ADNmt, şi distanţa geografică
(Testul Mantel) reprezentând popuaţiile din Suedia Fig. 4.19.a. Correlation of genetic and geographical distances (Mantel test)showing Swedishscots
pine populations.
În cazul analizei datelor ADN-ului cloroplastic, testul Mantel a fost nesemnificativ
(Figura 4.19.b din teză), coeficientul de corelaţie înregistrând o valoare de r= ,0118. Acest
rezultat a fost estimat datorită transmiterii paternale a cloroplastelor printr-un flux mare de
gene, respectiv de polen.
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
31
CAPITOLUL V
DISCUŢII ŞI CONCLUZII PRIVIND EVOLU ŢIA POSTGLACIARA A PINULUI
SILVESTRU ŞI TENDIN ŢELE ACTUALE DE MIGRARE
După cum indică rezultatele obţinute, structura genetică a populaţiilor analizate nu a
fost afectată de translocările masive de materiale forestiere de reproducere de origine
necunoscută de la începutul secolului al XIX-lea. Spre deosebire de arboretele regenerate
artificial, arboretele naturale prezintă o structură genetică uniformă, formată din unul,
maxim două haplotipuri (populaţii naturale posibile sunt considerate populaţiile Suceava,
Vrancea şi Vâlcea). Apariţia a două haplotipuri este rezultatul migraţiei postglaciare a
pinului în procesul de recolonizare, acestea întâlnindu-se de regulă în zonele de contact
dintre două regiuni/subregiuni.
Analiza distribuţiei haplotipurilor la nivel naţional se observă o structurare bine
definită a populaţiilor, atât în ceea ce priveşte diversitatea genetică intrapopulaţională, cât şi
specificitatea haplotipurilor din zonele geografice analizate. Valorile coeficientului de
diferenţiere GST, fiind egale cu valorile coeficientului NST şi mai mari decât 0, evidenţiază
de asemenea faptul că există o structură a populaţiilor analizate, însă fără influenţe
filogeografice; este vorba aici mai mult de un model orografic care a dus la o structurare a
populaţiilor de astăzi. Studierea evoluţiei postglaciare a pinului silvestru şi modalităţile de
migrare a acestuia au evidenţiat originea diferită a populaţiilor din Bazinul Carpatic faţă de
cea a populaţiilor din zona extracarpatică.
Pe baza analizelor ADN-ului mitocondrial, care au arătat o origine filogenetică
diferită pentru arboretele situate în diferite areale (exteriorul şi interiorul arcului Carpatic),
se poate recomanda acţiunea de conservare “in situ”, care trebuie să includă cel puţin o
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
32
populaţie pentru fiecare haplotip de ADN mitocondrial. Astfel, unităţile de conservare “in
situ” nu trebuie să lipsească din următoarele populaţii: Suceava, care pe lângă haplotip
prezintă şi condiţii speciale de adaptare-supravieţuire, creştere şi dezvoltare (pe sol tip
turbă), urmată de populaţiile Vrancea şi Baia de Arieş (pe sol tip calcaros), şi populaţiile din
interiorul arcului Carpatic spre exemplu: Topliţa, Hunedoara, Agnita, Caraş ce poartă
ambele haplotipuri evidenţiate la nivelul ADN-ului mitocondrial.
Metodele de genetică moleculară pot constitui un instrument de control al transferului
de material genetic în practica silvică, acestea fiind utilizate cu succes pentru speciile de
răşinoase în ţările vest europene; astfel, prin analize la nivelul ADN-ului mitocondrial se
poate identifica dacă seminţele au fost într-adevăr recoltate din populaţiile Suceava, Vrancea
sau Vâlcea, deoarece acestea trebuie să prezinte un singur haplotip, AA. Nu se poate afirma
cu tărie că problema transferului de material genetic este direct corelată cu instabilitatea
ecologică şi că exemplarele care prezintă haplotipurile străine prezintă şi o vitalitate redusă,
este importantă însă menţinerea diversităţii naturale prin regenerarea naturală sau transfer de
puieţi din populaţiile analizate în acest studiu. De asemenea faptul că nu au fost detectate
efecte ale derivei genetice de tip bottleneck constituie un bun argument pentru alegerea unor
entităţi de conservare “in situ” în care se găsesc câteva mii de exemplare din specia în cauză,
pentru a diminua riscul pierderii unor variante genetice valoroase sub aspectul capacităţilor
de adaptare şi supravieţuire.
Aceste rezultate nu au putut fi comparate cu alte studii datorită faptului că până în
prezent, în România, nici un alt studiu nu a fost condus pe această temă în populaţii de pin
silvestru.
În Suedia, situaţia se prezintă în felul următor: distribuţia haplotipului AA a fost
aproximativ uniformă pe toată suprafaţa analizată, ceea ce indică faptul ca ar fi fost prima
alelă care a colonizat Suedia (alela părinte). Pe de altă parte, distribuţia alelei AB a fost
observată în cele mai multe exemplare din populaţiile din sudul Suediei şi mai puţin întâlnită
sau chiar lipsind din partea de nord a ţării. Se poate astfel afirma că, în Suedia, colonizarea
pinului silvestru a urmat două rute: una fiind partea de sud a Europei, a doua rută de
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
33
colonizare ar fi partea de nord - est a Europei, fapt evidenţiat şi de PYHAJARVI şi colab.
(2007) în analizele efectuate. Astfel poate fi explicat amestecul de gene, respectiv
haplotipuri în zona centrală a Suediei. Pentru a întări cele două ipoteze, în special ruta de
colonizare din nord-estul Europei, pe viitor mai multe populaţii din această zonă trebuie
analizate.
În aceste populaţii valorile coeficientului de diferenţiere Gst sunt mai mici decât
valorile coeficientului Nst, diferenţe înregistrate gradient pe toată suprafaţa recoltată
(acoperind toate zonele Suediei), ceea ce înseamnă că există o structurare filogeografică în
cadrul zonei.
Cercetările efectuate în cadrul tezei de doctorat au avut ca principal obiectiv studiul
genomului mitocondrial, a cărui ereditate este exclusiv maternală, având o structură genetică
bine conservată datorită ratei reduse a mutaţiilor genetice şi care indică modul de evoluţie al
speciilor în perioada de după ultima glaciaţiune (circa 15000 ani în urmă), permiţând astfel
evaluarea refugiilor glaciare a diverselor provenienţe, a căilor de migrare şi tendinţele
actuale de evoluţie. În acest sens, studiile aferente acestei teze de doctorat au relevat o
variabilitate redusă a populaţiilor de pin silvestru din România, precum şi o structurare în
două subregiuni, care sunt caracterizate prin haplotipuri distincte, atât ca variabilitate, cât şi
ca provenienţă postglacială.
Gestionarea durabilă a pădurilor pentru amplificarea multiplelor funcţii ale acestora
necesită punerea în aplicare a unui complex de măsuri, printre care se numără stabilirea şi
delimitarea regiunilor de provenienţă pentru producerea, comercializarea şi utilizarea
materialelor forestiere de reproducere, acţiune importantă, menită să fundamenteze cadrul
normativ şi de reglementare la nivel naţional, în acest domeniu, armonizat cu cerinţele
Uniunii Europene şi în concordanţă cu prevederile Schemei Organizaţiei pentru Cooperare şi
Dezvoltare Economică
În prezent, regiunile de provenienţă sunt delimitate pe baza unităţilor de zonare şi
regionare a pădurilor, care au fost stabilite prin metoda indicatorilor ecologici sintetici,
folosind în acest scop răspândirea fitocenozelor şi plantelor forestiere indicatoare de climat.
Ing. Valentina FLORAN Rezumatul tezei de doctorat
34
Cunoscând mărimea mică a genomului mitocondrial şi cloroplastic, dar și a faptului că
majoritatea genelor specializate în adaptare sunt localizate în genomul nuclear şi după
distribuția geografică a haplotipurilor identificate în prezentul studiu, nu se pot face
recomandări în privința circulației de material forestier de reproducere.
Mutarea informaţiei genetice şi înfiin ţarea plantaţiei în condiţii de mediu diferite,
duce la schimbări adaptive ale structurilor genetice. Pe viitor, prin analize genetice (expresie
genică) se vor putea determina genele cu rol în adaptabilitate. Pe de altă parte, dacă populații
apropiate geografic au haplotipuri diferite, în scopul evitării scăderii gradului de puritate a
populațiilor din zona respectivă, nu se recomandă transferul de material genetic cu un alt
haplotip.
5.1. CONTRIBUȚII PERSONALE
Printre cele mai importante contribuții personale se pot menţiona următoarele:
1. Pentru prima dată s-a efectuat un studiu genetic prin analiza ADNmt şi ADNcp, pe
baza căruia au fost identificate rutele de recolonizare a ţărilor luate în studiu, cu specia Pinus
sylvestris;
2. În această teză de doctorat este prezentat cel mai amplu studiu genetic efectuat în
ţara noastră asupra acestei speci de arbori, prin utilizarea a două seturi de markeri genetici;
3. Prin cercetările efectuate, respectiv rezultatele obţinute, studiul de față a adus
contribuții la îndesirea hărților mitocondriale şi cloroplastice existente, în vederea stabilirii
cu precizie a rutelor de recolonizare postglaciară;
4. Prin analizele de ADN mitocondrial au fost identificate trei haplotipuri dintre care
doua comune si unul rar, întâlnit la doar un individ într-o populaţie;
Recommended