View
80
Download
2
Category
Preview:
DESCRIPTION
inginerie metabolica curs 1, politehnica bucuresti
Citation preview
Universitatea Politehnica din București
Catedra de Inginerie Chimică și Biochimică
Profesor dr. ing. Gheorghe MARIA
Elemente de Inginerie Metabolică Celulară
• Flux celular = viteze de reacție enzimatice celulare în condiții de creștere staționară (homeostază);
= efectul modificării genomului asupra fluxurilor celulare și producției de metaboliți (vaccinuri, biosinteză industrială, noi enzime modificate, etc.);
2
• Inginerie Metabolică = studiul fluxurilor celulare;
• Scop = modificarea fluxurilor celulare (prin acțiunea asupra enzimelor celulare) pentru obținerea de metaboliți doriți în cantități mai mari;
• Microorganisme celulare:
Celule procariote (mai simple; bacterii, alge);
eucariote (mai complexe; animale, vegetale).
• Procariote perete celular (proteine + oligozaharide);
spațiu periplasmatic (proteine);
citosol apos (RNA, enzime, ioni …..);
membrană plasmatică (proteine + lipide) mezozomi (replicare DNA, sinteză ATP);
nucleu fără membrană (DNA, cromozomi);
filament;
Celule
DNARNAProteineSubstrat (C, N, O, P, microelemente)
DNARNAProteine
3
4
• Eucariote
RER (reticul endoplasmatic rugos) = membrane + vezicule (sinteză proteine, fosfolipide);
nucleu cu membrană (DNA, cromozomi, rRNA, proteine);
corp Golgi = sortare și împachetare proteine cu membrană;
membrană plasmatică(acizi grași, proteine,
carbohidrați);
endocitoză;
exocitoză;
mitocondria cu membrană = sinteză ATP, ciclul Krebs, degradare acizi grași, metabolism Fe/S, etc.;
cloroplaste = conțin clorofilă (fixare CO2, producere ATP, sinteză anumite proteine);
lizozomi = pH acid pentru procese degradative (catabolism) ale proteinelor, lipidelor, fosfolipidelor, DNA, RNA;peroxizomi = degradare acizi grași și aminoacizi;
citosol apos + rețea citoschelet.
; mD dtdV
mc D
ln2 t
• { Proteine + Gene } = Pereche geno conține informația structurii proteinei și participă la sinteza ei. Sinteza P și G se catalizează reciproc pe parcursul ciclului celular;
• Scop ciclu celular dublarea conținutului celular urmată de diviziunea celulară (multiplicare celule):
unde: tc = ciclu celular;
V0 = volum celular inițial;
V0 2 V0 = volum final;
Dm diluția celulară = viteza medie logaritmică de creștere celulară.5
Componenți metabolici celulari:
• Nutrienți, apă, ioni, aminoacizi (AA), proteine, enzime (proteine), proteine ne-enzimatice, fragmente proteice, anticorpi, membrane, DNA, RNA, carbohidrați, lipide (grăsimi), metaboliți secundari (care apar în cursul sintezelor), etc.;
ct
0m
2V
V
dtD dV0
0
; tD V2V
ln cm0
0 ;
6
• Aminoacizi (în număr de 20) = ”cărămizile” proteinelor (lanțuri de aminoacizi) (α-amino + α-carboxil);
• Proteine:primară = secvența liniară de aminoacizi;
cutatprin legături de hidrogen;
elicoidalsecundară = modul regulat de pliere a segmentelor
de lanț
terțiară = structura 3D a lanțului (legături de H+, covalent, electrostatic);
Structură
cuaternară = aranjarea mai multor lanțuri 3D (legături covalente);
7
• Enzimele = proteine care catalizează reacțiile de sinteză / degradare celulară
Activitate
”induced-fit” E și S cuplate perfect doar la apropiere. E își schimbă forma:
”lock-and-key” (cheie-lacăt) E și S au forme complementare, rigide, cuplate perfect (geometrie indusă):
8
9
• Mecanismul catalizei:
– oxidoreducere;– transferaze (transfer grupe funcționale);– hidrolaze (scindări hidrolitice);
• Tipuri de enzime 6 grupe (după tipologia reacțiilor catalizate):
– liaze (leagă apa, amoniu sau CO2 la duble legături);
– izomeraze (izomerizări);
– ligaze (două grupe chimice sunt unite cu energia cedată de ATP);
10
- Mase moleculare mari ~ 104 – 105 Da;
- Enzimemonomere (lanț peptidic);
oligomere (mai multe lanțuri peptidice);
- Enzima are un ”centru activ” care ocupă o mică porțiune din structura enzimei;
• Caracteristici enzime:
- Specificitate de substrat;
- Specificitate de reacție;
- Specificitate stereochimică (ex. hidroliza acidului D-fumaric sau a acidului L-fumaric);
- Unitate enzimatică (1U);
[1U = cantitatea de enzimă ce produce 1 µmol produs / min în condiții optime de reacție specificate]
[Da = Dalton ≈ masa H]
11
- Codificare enzime: EC + 3 grupe de cifre;
- Dependența activității enzimatice:
- Influența temperaturii asupra activității enzimatice:
E + S (ES) Pk1
k-1
k2
(Mecanism reacție enzimatică)
12
- Influența substratului asupra vitezei de reacție:
2maxV
Vmax
S Km
Viteza de
reactie
- Influența pH-lui asupra vitezei de reacție:
[S] mK[S] ]t[t ck
- dtdS v
(cinetica de reacție Michaelis-Menten)
t[E] ck Vmax
kc = turnover - number
13
• Membrana celulară:
– implicate în procese de transfer dinspre/către mediul exterior celular;
– sunt permeabile selectiv;
– permeația se face cu ajutorul unei proteine (permează);
– compusă din proteine, lipide și carbohidrați;
– straturile de lipide pot culisa lateral dar nu și transversal;
– vâscozitatea și flexibilitatea ei depind de temperatură, compușii de fluidificare (ex. colesterol);
apa, gazele, ureea = trec direct;
zaharurile, AA, ionii, etc. = necesită permeaze membranare.
– permeația
14
• Transport membranar:
– pasiv (fără consum de energie):- prin difuzie;- asistat de permeaze;- influențat de pH, temperatură și inhibitori;
– activ (cu consum de ATP):- ex. migrația ionilor (ex. Na+, K+, Ca2+, H+) prin
gradientul dat de hidroliza ATP;- ex. glucoză prin atașare la un ion (ex. Na+, H+);
– molecule mari (bacterii, fragmente celulare):- endocitoză (exterior celulă)
• fagocitoză• pinocitoză• endocitoză mediată
scade dimensiune fragment
- exocitoză (celulă exterior);• mediată de receptori membranari;• selectivă.
15
• Hormonii:
– implicați în procese de semnalare celulară și comunicare inter-celulară;
– distanța de semnalaremare;mică;în interiorul celulei semnalizatoare;
– hormoniirămân cuplați de receptorii membranari:
- prostaglandine;- insulină;
ex.
- epinefrină (adrenalină);- histamină;
difuzează în celulă și interacționează în citosol și nucleu:
- steroizi;- tiroxină;
ex.
- vitamina D.
16
• DNA:
– părți constituente ale genelor;– au patru baze posibile:
A = adenină;C = citozină;G = guonină;T = timină;Pi = acid fosforic.
Elicea dublă a unui lanț DNA
Lanț DNArăsucit
Lanț dublu DNA dispus circular
Legături de hidrogen
Bază
Asocierea DNA cu o proteină structurală într-o bacterie
Proteină structurală
Lanț
17
Bază + Deoxiribază + Pi
(monozaharid)
Secvență nucleotide(legături 3’-5’-fosfo-diesterice)
2 lanțuri DNA cuplate prin legături de hidrogen
Cromozomi legați în fibre (perioadă de împerechere – pereche) + Proteină centrală
Operoni = secvență de gene responsabile cu controlul unei anumite expresii genetice
Nucleotid(dNTP)
Lanț DNA
Elice dublăDNA
Nucleozomi(Gene)
Cromozom
Elice dublă DNA + Proteine (5 tipuri)
Histone HP
Nehistone NHP
Operoni
18
Expresie genetică = secvența de reacții catalizate de o genă, implicată în sinteza unei proteine (proteina pereche a genei)
RNA:
= rol în sinteza proteinelor (decodifică informația genetică din DNA);
= structură asemănătoare DNA, doar că în loc de:
• timină uracil (U);
• deoxiriboză riboză (R);
• nucleotide NTP.
19
Ciclul celular:
• Proces de dublare a conținutului celular pe o durată determinată (tc) urmată de diviziunea celulară:
cD dtdV
V0 2 V0 în tc
Dc = viteza medie de creștere celulară (diluție celulară)
20
• Fazele ciclului celular:
G0 Fază inactivă, când nu s-au întrunit condițiile propice de creștere celulară (replicare conținut);
G1 Fază preliminară (”gap”) de ”analiză” a condițiilor de mediu. La sfârșitul fazei G1 există faza G1/S;
S Faza de replicare genom + proteine;
Cei 2 cromozomi care apar (mamă + fiică) = pereche de cromozomi = cromatide (X);
Cromatidele sunt ținute lipite (cei 2 cromozomi identici) de către o proteină (coesină);
G2 Fază de definire și replicare a genomului;
G1/S Momentul în care se ia decizia ireversibilă de replicare a genomului și a conținutului celular. Condiția de decizie este dată de o anumită
raport suprafață exterioară/ volum celular;
masă celulară critică;
21
M Fază de mitoză. Cromozomii sunt aliniați pe o axă și se verifică dacă sunt toți și corect replicați. Cromatidele identice se găsesc la polii opuși axei;
M/F Momentul în care se ia decizia de finish (terminare), adică M = anafază. Coesinele se desprind și sunt distruse. Cromatidele pereche se separă și migrează în sens opus;
F/G0, G1 Celula se divide. Apare iar faza G0 (condiții externe nefavorabile) și apoi, eventual, G1 (condiții externe favorabile);
Controlul ciclului celular este complex și se realizează prin intermediul unor proteine specifice (cicline) care se sintetizează / descompun în funcție de condițiile de mediu.
22
• Sinteza DNA:
dNTP = deoxinucleotide:
dGTP; G = guanină;dTTP; T = timină;dCTP; C = citozină.
dATP; A = adenină;
PPi = acid piro-fosforic;
n (fragmente DNA) + dNTP (n+1)(fragmente DNA) + PPi
5’ 3’ enzimă
(DNA polimerază),Mg2+
- lanț DNA parental = lanț matrice (“template”)
principal (conducător);
secundar;
Celule procariote:
23
- fragmentele DNA parentale sunt citite bucată cu bucată în direcția 3’ 5’ duc la formarea în paralel a:
lanț principal (fiu 5’ 3’); lanț secundar (fiu) din fragmente Okazaki.
- lanț DNA sintetizat începând cu o origine ”ori” (bulă sau ochi de replicare) a cormozomului;
- debutul = polimeraza (”primer”) se leagă la o bucată din lanțul DNA ”ori” (de mărime 250 bp bogată în baze A-T);
24
Replicarea cromozomilor circulari într-o celulă procariotă
(a) Replicarea pornește de la origina “ori” și se propagă bidirecțional de-a lungul cromozomului.
(b) Linia subțire reprezintă cele două lanțuri DNA originare (matrice sau “template”) iar linia groasă lanțurile DNA sintetizate.
(c) Sinteza DNA în furca de replicare. Lanțul principal (conducăto” sau ”leading”) este sintetizat continuu (linie groasă) iar cel secundar (”lagging”) este sintetizat din fragmente Okazaki.
(c)
25
Celule eucariote:
- din cauza complexității și mărimii mai mari a lanțului DNA, replicarea se face:
de la mai multe ”ori” pentru a se asigura replicarea pe durata ciclului celular;
dintr-un ”ori” replicări unități de repliconi (20 – 80 ”ori”) care apoi sunt asamblați;
replicarea este bi-direcțională; distanța dintre ”ori” este de 3 – 3000 kbp;
- suma de cromozomi (gene) = genom.
Sinteza la procariote a genomului este secvențială:
Proteine(Met G) I1 InI2
G1 G2 Gn Gn-1G1
Met G Met G Met G
26
• Sinteza RNA (ribozom):
- codul genetic trebuie citit;înregistrat (mRNA);transcris (tRNA);tradus (translație);folosit în sinteza proteinelor (expresie genetică);
n (fragmente RNA) + NTP (n+1)(fragmente RNA) + PPi
5’ 3’
enzimă
- RNA este de trei tipuri:
rRNA = ribozomial = ”matrice” pentru ribozomi;
mRNA = mesager = ”matrice” de informație pentru gene;
tRNA = de transfer = ”adaptor” al scrierii informației la expresia genetică
- inițiată de o enzimă (primer) legată la capătul genei;
27
inițiere (cu RNA polimerază);
terminare.
- transcrierea informației genetice:
elongație (copiere mRNA a DNA în direcția 5’ 3’);
Cod genetic:
= modul în care secvența de nucleotide genetice este transcrisă în mRNA;= ea este ”tradusă” sub forma secvenței de aminoacizi ce formează proteina;
= informația se transmite sub formă de ”codoni” (tripleți de aminoacizi);
= o ”mutație” genetică schimbă doar o nucleotidă din lanțul DNA (”punct de mutație”);
= de multe ori o mutație în lanțul mRNA transcris nu are efect, deoarece la traducere (translație) secvența trebuie recunoscută (validată) și de către un anti-codon (aflat în tRNA). Deci informația genetică este dublată și în ribozom;
= codul genetic nu este universal dar este similar în majoritatea organismelor.
28
Sinteza proteinelor:
mRNAcodon
transcriere
proteină
mărire lanț proteic
rRNA+ enzimă
citește verifică
anti-codon(t-RNA)
t-RNA
29
- mRNA este tradus (translație) de către ribozomi (uzina de proteine);
- citirea este activă (pentru sinteză proteine, 5’ 3’);
controlată (finalizată prin control);
Sinteza proteinelor:
- necesită energie celulară (ATP) pentru legarea fiecărui aminoacid:
amoniacid + ATP + tRNA aminoacil-tRNA + AMP + PPi
- fiecare aminoacil-tRNA = anti-codon;
- Ribozomul (rRNA + proteine)
citește codonul;
cuplează anti-codonulprin legături de H;
sintetizează o peptidă;
astfel se adaugă codon-după-codon de-a lungul mRNA.
de n-ori
30
Sinteza proteinelor:
- traducerea informației genetice se face cuinițiere;
elongație;
terminare (stop);
- la eucariote procesul este asemănător dar sunt implicate mai multe componente:
• inițiere;• control;
• terminare;
- proteinele astfel sintetizate suntîmpachetate;
transportate la locul țintă (difuziune controlată);
31
Sinteză anticorpi (vezi și notele de curs):
- asamblarea mai multor gene (recombinare somatică) care duce la sinteza de fragmente poli-peptidice și cuplarea lor;
- unii există din momentul nașterii;
- alții sunt sintetizați în momentul îmbolnăvirii.
Tehnici de modificare genetică
a) Enzime de restricție:
permit secționarea DNA în anumite zone;
apoi capetele fragmentelor sunt blocate în vederea legării ulterioare în DNA recombinat;
fragmentele DNA sunt separate prin electroforeză de gel (plasmide DNA) și formează harta de restricție, care este o hartă a zonelor de secționare.
32
b) Hibridizare nucleică: două lanțuri DNA desperechiate (sub influența temperaturii)
sunt recombinate (hibridizate) în scopul formării unui nou lanț DNA dublu (stabil) și eventual modificat;
metoda permite analiza DNA.
c) Clonarea genelor:
gena nou obținută se poate replica autonom (fragmentele DNA inițiale nu se puteau auto-replica);
legarea mai multor lanțuri (fragmente DNA) printr-o tehnică de legare cu ajutorul unor vectori de clonare viruși;
plasmide DNA (fragmente);
DNA recombinat se introduce într-o celulă gazdă și rezultă o celulă (bacterie) de interes care este separată, purificată și multiplicată;
se pot obține bănci de DNA recombinat (pentru sinteza anumitor proteine, gene rezistente la antibiotic, etc.) sau bacterii cu calități dorite.
33
d) Virușii:
sunt frecvent folosiți în modificări genetice;
particule mici mic ”genom” DNA (sau RNA);
înveliș protector (capsidă);
se replică doar prin ”infecția” unei celule gazdă;
după replicare virușii părăsesc gazda (fără să o distrugă);
interferă cu genomul gazdă modificându-l (bacteriofagi);
pot rămâne în celula gazdă: dezvoltări necontrolate (cancer); moartea celulei;
Exemple: - dezvoltări necontrolate sunt date de ”virusul DNA tumoral”;
- modificări DNA ”retrovirus” (ex. HIV).
34
e) Secvența DNA (diverse metode de determinare)
f) Tehnica PCR (”Polymerase Chain Reaction”):
metodă de amplificare DNA sau a unei secvențe DNA;
este folosită pentru clonarea DNA, obținerea de mutații, determinarea secvenței DNA, diagnosticarea medicală, etc.
Metabolismul celular
Metabolism = transformarea nutrienților și energiei în organismul viu;
Metabolism Catabolism (distructiv)
Intermediari, molecule mici, oligomeri + Energie + (ATP) + CO2
Anabolism (constructiv)
Moleculele mici sunt asamblate după regulile organismului gazdă, cu consum de energie
Componente celulare
35
Nutriția Autotrofă(self-
susținută)
= în plante, alge verzi, bacterii:
Macromolecule
CO2 + H2OMolecule
organice mici
energie
(lumină)
= se asimilează materia și energia produsă de autotrofe
Hetrotrofă(celelalte
organisme)
- ingestie alimente;- digestie = hidrolize enzimatice;- absorbție nutrienți;- transport nutrienți (C, N, ….) la celule;- absorbție celulară.
Metabolismul uman
Etapele metabolismului uman:
36
Alimentele conținProteine Aminoacizi
Polizaharide Mono- + Oligo-zaharide
Grăsimi Acizi grași + Glicerină
Ingestia + Digestia + Absorbția + Transportul:
Dezmembrare în molecule mici de 2-4 atomi de C și subproduși
Absorbția celulară:
(ex. molecule mici: acetil-CoA, acid piruvic, aminoacizi)
(ex. subproduși: reziduuri, NH3, acid uric, etc.)
GlucozaGlicoliză
Acid piruvic Acetil-CoA
NADH
Ciclu Krebs ATP, CO2
37
Ciclu Krebs
NADH, H2O
CO2
Energie (ATP) (fosforilare oxidativă)+ O2
Acizi grași + Glicerină Acetil-CoA Ciclu Krebs
38
Metabolismul zaharidelor GlicolizaGlicogenezaMetabolism glicogen
39
+ NADH
Glicoliza
metabolism anaerob al glucozei; are loc în citosol;
rezultă multă energie (ATP) și agent reducător NADH.
CO2 + H2O(mitocondrie, ciclu Krebs)
GLC PYR+ CoA+ NAD+
Acizi grași
Acetil-CoA
Etanol(drojdii)
+ CO2 + NAD+
Acid lactic(mușchi)
+ NAD+
40
Glucogeneza
sinteza glucozei din precursori ne-carbohidrați;
reacția consumă multă energie (ATP), ( ADP) (anabolism) și GTP ( GDP);
are loc în celulele hepatice (citosol) în condiții de scădere a GLC în sânge:
Acid piruvic Glucoză
Metabolism glicogen (polimerizarea glucozei în vederea stocării ei în ficat)
glicogen = material de stocare energie la animale;
n Glucoză + Pi + ATP Glicogen
enzimă
41
Metabolismul grăsimilor (acizi grași/trigliceride și colesterol)
sunt componente membranare care modifică proprietățile proteinelor;
sunt rezerve energetice;
acizii grași sunt codificați în funcție de numărul de atomi de C și numărul de legături duble;
ex.: acid palmitic (C16:0)acid oleic (C18:1)
suntmesageri celulari secundari.
hormoni;
la dezagregarea glicogenului se degajă energie (ATP);
controlul este dublu
alostericlegare enzimă ES1, …. de către S = ATP
hormonal
adrenalină (glicoliză) (degradare glicogen)
insulină (sinteză glicogen)
42
Degradarea acizilor grași (-oxidare)
când este nevoie să se producă energie (ATP)
are loc în citosol (procariote);
mitocondrie (eucariote);
Acetil-CoA Ciclul Krebsintră în
Acizi grași
Energie(ATP)
Acetil-CoA + Acil-CoA (acid gras cu 2 atomi de C mai puțin)
NADH
lipază
-oxidare
Exemplu: 1 mol (16:0) (35 + 96) ATP
direct ciclu Krebs
43
Sinteza acizilor grași (din Acetil-CoA)
condensarea succesivă a Acetil-CoA;
necesită consum de energie (anabolism) ATP, cât și agent NADPH;
are loc în citosol (cu Acetil-CoA din mitocondrie);
(C16:0) + 14 NADP+ + 8 CoA + 6 H2O + 7 ADP + 7 Pi
8 (Acetil-CoA) + 7 ATP + 14 NADPH + H+
controlul este dublu
alosteric(E+nS, S = ATP/palmitol-CoA/acid citric);
hormonal adrenalină
44
Metabolismul grăsimilor (trigliceridelor)
+ Energie,
ATP, NADH
Acizi grași+
Glicerină
Acetil-CoA+
Acil-CoA
Grăsime
Degradare
(-oxidare)Acizi grași
GlicerinăGlicoliză
Metabolismul colesterolului
steroid cu 27 atomi de C;
componentă a membranei celulară;
Acetil-CoA Colesterol
reglare nivel colesterol prin acțiunea asupra uneia dintre enzimele de sinteză.
45
Colesterolul
Acizi biliari
Vitamina D
Hormoni steroizi
Acizi biliari
produși în ficat;
”detergenți” ai intestinelor, ajută digestia;
preiau lipidele din alimente.
Vitamina Dnecesită radiație UV (lumină) pentru a fi sintetizată;
rol în dezvoltarea scheletului osos.
Hormoni steroizi rol în reglări procese celulare, semnalare.
46
Respirația celulară (ciclul Krebs + fotosinteza)
procesul de transformare a glucozei în energie (ATP) via acid piruvic;
GLC(Glucoza)
PYR(CH3CO-COOH)
CO2 + H2O + Energie(ATP, NADH)
CH3COOH
are loc încitosol (procariote);
mitocondrie (eucariote);
punctul de pornire și de terminare al ciclului Krebs este Acetil-CoA (2 atomi de C);
47
GLC
PYR
Alanină
Proteine
CH3COOH + 2 H2O
Acetil-CoA CoA + 2 CO2 + 8 H+ +
+ 12 ATPKrebs
CH3COOH + 2 H2O 2 CO2 + 8 H+ + Energie
8 stagii: oxidări, izomerizări, hidratări, hidrogenări, dehidrogenări;
produse din: Acetil-CoA + H2O
SH-CoA
CO2
3 NADH + H+
FADH2
ATP
per global: 1 mol GLC 38 ATP glicoliză
ciclul Krebs
48
glicoliza = trecerea glucozei în acid piruvic;
controlul ciclului Krebs
feedback (-) enzime, produși: ATP, acid citric, NADH, SH-CoA;
feedback (+) prin substrat: NAD+, Acetil-CoA, ADP, acid piruvic.
Fosforilarea oxidativăîn mitocondrie (eucariote)
în membrana plasmatică (procariote)
înmagazinarea energiei produse în ciclul Krebs și reoxidarea NADH și FADH2:
ADP + Pi+ H+ ATP + H2O
NADH + H+ + ½ O2 NAD+ + H2O
FADH2 + H+ + O2 FAD+ + H2O
49
Respirația celulară
respirația celulară = oxidarea nutrienților la CO2 și H2O cu eliberare de energie (ATP);
la eucariote se petrece în citosol (glicoliză) sau mitocondrie (oxidare acid piruvic);
se consumă agent reducător NADH, FADH2 care este regenerat la glicoliză.
implică două procese
glicoliză:
oxidare:
GLC PYR + NADH + FADH2
+ NAD+
PYR+ NADH
ATP + CO2 + H2O + NAD+
50
Fotosinteza
fotosinteza = proces de sinteză a hidraților de carbon din CO2 și H2O sub acțiunea luminii (fixare carbon);
ADP, NADP+ ATP, NADPH (la lumină)
H2O + CO2 (CH2O) + O2 ( la întuneric)energie
(ATP)(NADPH)
Fructoză
stocare energie (plante)
Amidon + Sucroză
51
are loc în cloroplastele celulelor vegetale și în membrana unor bacterii;
pigmenții (clorofila, carotenoide, etc.) optimizează procesul realizând un fotosistem;
fotosistemul
complex ”antenă” (absorbant de lumină și generator de electroni);
centru de reacție de fotosinteză;
reglare multiplă
transmitere energie;
temperatură;
etc.
procesul are loc în două etape:
a) reacții la lumină, cu producere de ATP și NADPH;
b) reacții la întuneric (ciclul Calvin) ce convertesc CO2 la carbohidrați, cu consum de ATP și NADPH;
reacția globală: CO2 (aer) + ATP CO2 (celular) + AMP + 2 Pi
52
Metabolismul aminoacizilor (ciclul acidului uric)
ciclul N în natură;
fixare:
(nitrificare)
(anabolică)
NO3- (precipitații)
N2 (aer) NH3 asimilare
biosinteză (bacterii)
Nucleotide
Porfirine
Amoniacizi
DNA, RNA
Polizaharide
Proteine
Fosfolipide
Biosinteză
degradare: procese inverse
(denitrificare)
(catabolică)
53
fixarea N2 din atmosferă se face de către bacteriile din sol, cu consum energetic:
N2 + 8 e- + 16 ATP + 16 H2O 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi + 8 H+
dintre cei 20 de aminoacizi prezenți în proteine, nu pot fi sintetizați toți în același organism;
aminoaciziiesențiali (trebuie ingerați din alimente);
ne-esențiali (pot fi produși în organism);
în funcție de procesele metabolice la care participă, cei 20 de aminoacizi se grupează în 6 grupe:
• glutamat;
• aspartam;
• serină;
• acid piruvic;
• aromatici;
• histidină;
degradarea aminoacizilor este reglată alosteric
(GTP, ATP inhibitori)
54
excesul de N (aminoacizi) nu poate fi stocat;
eliminarea se face direct (microorganisme, NH3) sau indirect (ciclul acidului uric) cu consum energetic:
(uree)
NH4+ + HCO3
- + H2O + 3 ATP + Acid aspartic
Acid uric + 2 ADP + AMP + 2 Pi + PPi + Acid fumaric
legat în ciclul Krebs
excesul de NH3 și acidul uric în sânge boală (gută)
55
Formalizare reacții biochimice
asemănătoare celor chimice;
viteza de reacție:
(specia j)dt
dn
V1
v j
jR
dt
dn
V11
v
v j
ijij
j
i
RR
(specia i)
ij = coeficient stoichiometric al speciei j în reacția i
matricea stoichiometrică:
......
........................
......
......
RS2R1R
S22221
S11211
SR
R = linii reacții
S = coloane specii
56
Determinarea coeficienților stoichiometrici în regim de creștere celulară staționară
Substraturi Produși metabolici
Biomasă Intermediari de reacție
0 Xg X P SK
1 ii ,metji
Q
1 ii ,macroji
M
1 iiji
N
1 iiji
(pentru reacția
celulară j)
Scrisă în formă matricială rezultă:
0 X GX P B S A metmacro
unde sunt matrici stoichiometrice ce conțin coeficienți stoi- chiometrici, în j reacții pentru substraturi, produși metabolici, constituenți de biomasă și intermediari de proces. În aceste matrici rândurile reprezintă reacțiile iar coloanele reprezintă metaboliții.
G , ,B ,A
Numărul de măsurători experimentale face ca sistemul de ecuații să fie sub-determinat (există mai multe necunoscute decât ecuații).
57
Număr de reacții = O (105 – 106)
Număr de compuși = O (104) dintre care doar o mică parte sunt măsurabili
Studiu de caz: Glicoliza în Escherichia coli
5
6
43
21
78
58
ProdusMol per 100 moli glucoză
fermentată
Formate 2.4
Acetate 36.5
Lactate 79.5
Succinate 10.7
Ethanol 49.8
CO2 88.0
H2 75.0
Măsurători experimentale (cultură de Escherichia coli)
Reacții specifice:
1 – ½ GLC + PEP + NADH = 0
(coeficienți stoichiometrici reactanți 0)
(PEP = fosfoenolpyruvate)
2 – PEP – CO2 – 2 NADH + Succinate = 0
3 – PEP + PYR + ATP = 0 (PYR = acid piruvic = pyruvate)
4 – PYR – NADH + Lactate = 0
59
5 – PYR + Acetyl-CoA + Formate = 0
6 – Formate + CO2 + H2 = 0
7 – Acetyl-CoA + Acetate + ATP = 0
8 – Acetyl-CoA – 2 NADH + Ethanol = 0
0 X G P B S A met
A B P G Xmet 0
0
0
0
0
0
0
0
0
X
X
X
X
X
20100
01100
00000
00110
10010
01011
20001
10001
P
P
P
P
P
P
P
1000000
0100000
0011010
0001000
0000100
0000000
0000011
0000000
S
0
0
0
0
0
0
021
NADH
ATP
AcCoA
PYR
PEP
Et
Ac
2H
For
Lac
2CO
Succ
GLC
cunoscute determinateexperimental
necunoscute(rezultă)
60
Determinarea vitezelor de reacție (fluxuri metabolice) în regim staționar
0 Xg X P SK
1 ii ,metji
Q
1 ii ,macroji
M
1 iiji
N
1 iiji
aplicare operator derivată pentru reacția j:
t
0 t
Xg
t
X
t
P
t
S K
1 i
i ,metji
Q
1 i
i ,macroji
M
1 i
iji
N
1 i
iji
0 vg v v vK
1 ijji
Q
1 ijji
M
1 ijji
N
1 ijji
= vitezele reacțiilor j (j = 1, ……, J; J = numărul total al reacțiilor din schemă)
jv
cazuri în care specia i nu este implicată în reacția j
0 g 0, 0, 0, jijijiji
matricea se scrie sub forma: ]r ,r ,r ,r[ v metmacroPS
61
0 v G v v B v A metT
macroT
PT
ST
v calculul necunoscute se face prin mai multe metode (sistem liniarsub-determinat):
0
v2vv2v
vv
vvv
vvv
vvv
v
2-0001-02-1
01000100
1-1-010000
0001-1-100
000001-1-1
v
v
v
v
v
8421
73
875
543
321
NADH
ATP
AcCoA
PYR
PEP
se determină acele fluxuri necunoscute.
Exemple: 1GLC v2
1 v
262CO vv v
pentru a crește gradul de informație se folosește și bilanțul atomic elementar
62
Exemplu: Cultivarea aerobă a drojdiei Saccharomyces cerevisiae pe glucoză (sursă de carbon) și sare de amoniu (sursă de azot)
Biomasa (X) = CH1.83O0.56N0.17
1 + Yxe + Yxc – Yxs – Yxo – YxN = 0
1X + YxeCH3O0.5 + YxcCO2 + YxwH2O – YxsCH2O – YxoO2 – YxNNH3 = 0 (etanol brut) (GLC, glucoză)
X EtOH CO2 H2O GLC O2 NH3
(C)
(H)
(O)
(N)
1000000.17
021120.50.56
3022031.83
0010111
E
Bilanțul atomic sau matricea compoziției elementare ( ):E
în acest fel crește numărul de ecuații și se reduce incertitudinea la calculul v ( r ) și concentrațiilor celulare (X)
0 Y E se determină (Y) necunoscuți;
63
Bioreactoare cu culturi celulare
– concentrație substrat (sursă de C și energie) exprimată în g/L;
– concentrație celulară () exprimată în g/L (determinată prin metoda densității optice sau altele, ex. turbidimetre, numărare celule, etc.);
– bioreactor continuu = chemostat;
– determinarea fluxurilor metabolice se face în regim staționar;
– MCA = metabolic control analysis = determină coeficienții de senzitivitate ai stărilor staționare (concentrații, fluxuri) în raport cu variabilele sau parametrii din mediul extern.
64
Exemple de stoichiometrie în reacții metabolice(în Saccharomyces cerevisiae )
1,000 1,0001,000
• Blueprint encoding sequence of proteins
• Catalysis of metabolic reaction• Players in bio-reaction
• Uptake of nutrients from Env.• Catabolism• Production of Energy (ATP, NADH, NADPH)• Synthesis of Building Blocks (amino acids, nucleic acids, lipids, carbohydrates)• Bioreactions
DNA Array 1,000 D-electrophoresis 100 MFA 10
Physiological Data 10-100
65
Molecular composition of Bacterium
66
Elementar Composition of Microorganisms
Microorganisms % C % H % O % ash% N
Yeast (Lab. strain) 38 6 35 9 12
(Brew. strain) 46 7 33 10 4.3
C. glutamicum 48 7 26 11 6
Elementar Composition Balance of the Cell
α CHlOm + NH3 + O2 CHaObNc + CHpOqNr + H2O + CO2
CHlOm: elemental composition of carbon source (l, m: constants)
CHaObNc : elemental composition of the cell (a, b, c: constants)
CHpOqNr : elemental composition of the extracellular product (p, q, r: constants) Quiz 1: Make elemental composition balance
α, , , , , : time variant parameters
67
Answer 1: 1 C:
H: 2pa 3 l
O: 2qb 2 m
N: rc
Quiz 2: Change above equations to matrix and vector form
α CHlOm + NH3 + O2 CHaObNc + CHpOqNr + H2O + CO2
Answer 2:
c
b
a
1
00r010
21q20m
02p03l
101001
C
H
ON
68
Quiz 3: How to determine all the reaction rates?
α CHlOm + NH3 + O2 CHaObNc + CHpOqNr + H2O + CO2
(S)
Answer 3:
mc r r A
m-1
c rA r
C
H
ONMoli Substrat
Moli NH3
3NH
S
R
R
c
b
a
1
000010
000001
00r010
21q20m
02p03l
101001
A rc rm
69
Elementar Composition Balance of the Cell
α CHlOm + NH3 + O2 CHaObNc + CHpOqNr + H2O + CO2
C - source Cell Product
RS RNH3 RO RCell RP RH RC
Reaction rate (mol/h):
RS: substrate consumption (uptake) rate
RNH3: ammonia consumption (uptake) rate
RO: oxygen consumption (uptake) rate
Rcell: cell growth rate
RP: product formation rate
RC: CO2 production rate
Stoichiometric Relation:
Ex.: cellS R:R 1:
2O
2COQ R
R R
RQ = respiratory quotient
α, , …, : six unknown reactionrate
How to know all the reaction rate?
(1) Measure some reaction rate.
(2) Determine other reaction rate with Linear Constraints.
70
1 C:
H: 2pa 3 l
O: 2qb 2 m
N: rc
Two more reaction rates are necessary!
Rcell , RNH3: for example should be measured.
Metabolic Coupling
ATP and NAD+
ATP: energy currency metabolite in the cell
NADH: electron transport
NADPH: electron transport
71
Metabolic Coupling
72
Metabolic Coupling
73
Metabolic Coupling
74
Energy Generation (1)
Direct formation of ATP from substrate level
ATP + Pi ATP + H2O
Ex.: Pyruvate kinase
PEP + ADP PYR + ATP
Energy Generation (2)
Oxidative phosphorylation:
2 NADH + O2 NAD + 2 H2O(2 electrons, 4 protons)
2(P/O)(ADP + Pi + H+) 2(P/O)(ATP + H2O)
P/O: Oxidative phosphorylation ratio
Ideally (P/O): 3 (Actually 1-2)
Electron Transport Chain and Oxidative Phosphorylation in
Eukaryotes
75
ATP Consumption in Biosynthesis
α CHlOm + NH3 + O2 CHaObNc + CHpOqNr + H2O + CO2
C - source Cell Product
(S) (O) (X) (P)
1/YATP (ATP) 1/YATP (ADP)
YATP : gram cell produced per mole ATP consumed
mATP : consumption of ATP for cell maintenance
Many yields:
1
ConsumedSubstrate
Produced Cell YX/S
1
Consumed O
Produced Cell Y
2X/O
ConsumedSubstrate
Produced Product YP/S
76
Metabolic Map of Saccharomyces cerevisiae
77
Figure - A metabolic pathway of glycolysis
[GLC]
[G6P]
[F6P]
[F1,6BP]
[G3P]
[1,3PG]
[3PG]
[PEP]
[PYR]
Question 1:
Figure shows a metabolic pathway of glycolysis. Make one stoichiometric equation, summarizing up from glucose to pyruvate. Answer number of correct equation:
1. GLC + 2ADP + 2NAD = 2PYR +2ATP + 2NADH
2. GLC + ADP + NAD = 2PYR +ATP + NADH
3. GLC + NAD = 2PYR + NADH
Stoichiometric equation of each metabolic reaction:
GLC + ATP = G6P + ADP
G6P = F6P
F6P + ATP = F1,6BP + ADP
F1,6BP = 2(G3P)
(G3P) + NAD = (1,3PG) + NADH
(1,3PG) + ADP = (3PG) + ATP
(3PG) = PEP
PEP + ADP = PYR + ATP
78
Answer question 1:
1. GLC + 2ADP + 2NAD = 2PYR +2ATP + 2NADH
GLC + ATP = G6P + ADP
G6P = F6P
F6P + ATP = F1,6BP + ADP
F1,6BP = 2(G3P)
2(G3P) + 2NAD = 2(1,3PG) + 2NADH
2(1,3PG) + 2ADP = 2(3PG) + 2ATP
2(3PG) = 2PEP
2PEP + 2ADP = 2PYR + 2ATP
GLC + (4-2)ADP + 2NAD = 2PYR +2ATP + (4-2)NADH
Correct answer: (1)
79
Metabolic Reactions in Saccharomyces cerevisiae
Glycolysis:
R1: GLC_ext GLCt
R2: GLC + ATP G6P
R3: G6P F6P
R4: F6P + ATP F1,6P
R5: F1,6P DHAP + GA3P
R6: GA3P DHAP
R7: GA3P PEP + ATP + NADH
R8: PEP PYR + ATP
Penotose phosphate pathway:
R9: G6P 2/3F6P + 1/3GAP + + CO2 + 2NADPH
TCA cycle:
R10: PYR AcCoA + CO2 + NADH
R11: AcCoA + OXA CIT
R12: CIT IZOCIT
R13: CIT KG + CO2 + NADH
R14: KG SUC + ATP + CO2 + NADH
R15: SUC FUMARATE + FADH
R16: FUMARATE MALATE
R17: MALATE OXA + NADH
Ethanol Synthesis:
R18: PYR ACALD + CO2
80
Metabolic Reactions in Saccharomyces cerevisiae
Acetate Synthesis:
R21: ACALD ACETATE
R22: ACETATE ACETATE_ext
Glycerol Synthesis:
R23: DHAP + NADH GLYCEROL3P
R24: GLYCEROL3P GLYCEROL
R25: GLYCEROL GLYCEROL_ext
R26: 2G6P TREHALOSE
R20: ETOH ETOH_ext
R19: ACALD + NADH ETOH
Ethanol Synthesis (continued):
Oxidative Phosphorelation:
R27: NADH 3 ATP
R28: FADH 2 ATP (Excess ATP)
R29: ATP excess(Cell growth)
R30:
Cell
(1/6)GK + NH3 + (MW/YATP) ATP
81
Macroscopic Stoichiometry (over all reaction)
Glycolysis (R1-R8): GLC_ext 2PYR + 2ATP + 2NADH
TCA cycle (R10-R17): PYR 3CO2 + FADH + 4NADH
Glycolisis (R1-R8) + TCA cycle (R10-R17) + Oxidative phosphorylation (R27-R28):
GLC_ext 6CO2 + 38ATP (1)
(2)GLC_ext 2CO2 + 2ETOH_ext + 2ATP
Ethanol synthesis (R1-R8) + (R18-R20):
GLC_ext 2CO2 + 2ACETATE_ext + 10ATP (3)
Acetate synthesis (R1-R8) + (R18, R21, R2):
GLC_ext + 2ATP + 2NADH 2GLYCEROL_ext (4)
Glycerol synthesis (R1-R6, R23-R25):
(5)2GLC_ext + 2ATP TREHALOSE Trehalose synthesis:
82
2ATP excess Maintenance: (6)
(7)(1/6)GLC + NH3 + (MW/YATP)ATP Cell Cell growth:
Fluxurile metabolice (FBA):
fenotip al GMO (organism modificat genetic);
condițiile de mediu (sunt variabile).
variază în funcție de
[ Rcell , RET , ….., RCO2 ]
[ a, b, c, d, e, f, g ]
Linear combination of Eqs. (1) – (7):
mATP2COTREGLYACEETcellGLC grfReRdRcRbRaR r
Global Substrate (Glucose) Consumption
83
Modele cinetice ale proceselor enzimatice
= procesele metabolice sunt extrem de complexe O (104) componenți și Oº(105-106) reacții;
= procesele care au loc sunt de: – sinteză;
– degradare (apoptoză);
– întreținere;
– liză;
– mobilitate;
– etc.;
= procesele enzimatice sunt catalizate de o enzimă și pot avea un activator (A) și un inhibitor (I) al activității acesteia;
= controlul lor este deci complex;
= enzimele au un situs (centru) activ iar legăturile cu substratul sunt de tip Van der Waals, de hidrogen, electrostatice;
= reacția E + S trece printr-un complex activat;
84
= reacția este foarte specifică: P ES ES S E *activat
Substrat (S) Produs (P)Enzimă
(E)
= enzimele acționeazăin-vivo (în celula vie) ducând la modificări fiziologice (reglabile);
in-vitro (cu enzime imobilizate pe un suport);
= ca orice catalizator, enzimele măresc viteza de reacție, scad energia de activare dar nu deplasează (modifică) echilibrul biochimic;
= reacțiile biochimice pot în acest fel să aibă loc la temperatura și pH-ul dorite, strict controlate (de către organismul viu);
= enzimele acționează cu o mare specificitate, de regulă pentru o singură reacție;
= enzimele acționează prin ”recunoașterea” fiecărui substrat pe care îl leagă formând un complex activat;
= procesele cu enzime imobilizate ridică probleme suplimentare de transfer/transport de masă (cu influență asupra cineticii aparente) deși enzima este mai stabilă;
85
= procesele enzimaticefără inhibiție;
cu inhibițieprin substrat (S);
prin produs (P);
printr-o substanță străină (I);
complexă.
= procesele enzimaticecu co-enzimă (co-reactant);
cu promotor/activator;
fără co-enzimă;
= activitatea enzimei este foarte sensibilă la temperatură;
pH;
inhibitor;
= fiecare enzimă prezintă un domeniu optim de temperatură și pH la care activitatea sa este maximă.
86
În cazul conversiei unui substrat S într-un produs P, forma generală a curbei va fi dată de:
Pentru a determina viteza de reacție trebuie generată o curbă ce ilustrează variația concentrației substratului sau a produsului în funcție de timp.
ktminS0SminSS e C-C C-C
-kt0PmaxP0PP e-1 C- C C-C
• descreșterea exponențială de ordin I a concentrației de substrat:
• sau de creșterea exponențială de ordin I a concentrației de produs:
Modele cinetice enzimatice
CS0= concentrația inițială a substratului (S);
Csmin= concentrația minimă de substrat la timpul t → ;
CS = concentrația de substrat la timpul t;CP0
= concentrația inițială de produs la timpul t = 0;Cpmax
= concentrația minimă de substrat la timpul t → ;CP = concentrația de produs la timpul t.
În care:
Variația concentrațiilor substratului și produsului în timp
87
Viteza reacției este dată de panta corespunzătoare curbei obținute, și anume:
kdt
dP
dt
dS- v
Viteza de reacție scade în timp datorită următoarelor cauze:
• enzima devine instabilă pe parcursul desfășurării reacției;
• gradul de inhibiție al enzimei descrește cu descreșterea substratului;
• reacția reversibilă devine determinantă pe măsură ce se acumulează produsul;
• produsul reacției inhibă enzima;
• orice combinație a factorilor enumerați mai sus.
Curba obținută pentru reacțiile enzimatice nu poate fi comparată cu modelele standard ale reacțiilor chimice omogene. Prin urmare a fost necesară o altă abordare, a fost introdus ca termen de măsurare a vitezei de reacție viteza inițială.
88
La începutul unei reacții enzimatice:
C C0StS
0 CtP
P S • gradul de conversie este destul de mic și astfel concentrația substratului poate fi considerată constantă și egală cu cea inițială:
• cantitatea de produs acumulată este foarte mică:
• se poate considera că reacția inversă este neglijabilă;
• posibilele efecte inhibitoare ale produsului sau cele determinate de activitatea enzimatică sunt nesemnificative;
• se poate consideră că enzima rămâne stabilă în stadiile incipiente ale reacției;
Pentru a obține vitezele inițiale se trasează o tangentă la curba obținută anterior care să fie cât mai aproape de origine (vezi figura următoare). Panta acestei drepte trasate (adică viteza inițială) se obține prin regresie liniară:
89
De cele mai multe ori, forma curbei variază în funcție de: pH, temperatură, tărie ionică, polaritate, tipul substratului, concentrațiile enzimei și a coenzimei, etc.
Pentru a determina viteza unei reacții, cercetătorii se bazează de prea multe ori pe măsurătorile obținute, măsurători care nu caracterizează întotdeauna procesul pentru toate condițiile studiate. Din acest motiv, pentru a obține o analiză cinetică corectă, este esențial ca vitezele de reacție să fie determinate din regiunea inițială a curbei.
În caz contrar există riscul ca, prin alegerea unui moment de timp nepotrivit pentru derivare, să nu se obțină o relație liniară între viteză și concentrația enzimei (aceasta fiind o cerință necesară în analiza cinetică enzimatică).
Determinarea vitezei inițiale a unei reacții enzimatice
90
Pentru ca reacția să fie cinetic controlată de către enzimă, viteza reacției trebuie să fie direct proporțională cu concentrația acesteia:
Dependența vitezei inițiale a reacției de concentrația enzimei din amestecul
de reacție
În concluzie, pentru a colecta date valide din punct de vedere cinetic, trebuie să se țină cont de următoarele aspecte:
• enzima trebuie să fie stabilă pe durata măsurătorilor utilizate în calculul vitezelor inițiale;
• vitezele inițiale sunt utilizate ca viteze de reacție;
• viteza de reacție trebuie să fie proporțională cu concentrația enzimei.
91
Cinetică enzimatică cu inhibiție de substrat (modelul Michaelis-Menten)
Cea mai simplă și mai veche descriere cantitativă cinetică a procesului enzimatic este modelul Michaelis-Menten (M-M):
(S = substrat, E = enzima, P = produs, ES = complex activat)
S + E (ES) P + Ek1
k-1
k2
Pentru a deduce expresia cinetică M-M a reacției enzimatice se aplică teoria stării staţionare care consideră că, în orice moment, vitezele de formare şi de scindare ale complexului ES sunt egale, astfel încât:
• pentru o perioadă scurtă de timp, concentraţia complexului poate fi
considerată ca fiind constantă: ;0dt
d(ES)
92
0dt
d(ES)
• pentru perioade mai mari de timp, concentraţia complexului ES se modifică deoarece reacţia progresează şi concentraţia substratului scade, dar viteza modificării concentrației ES va fi întotdeauna mult mai mică decât viteza reacţiei enzimatice;
• în acest fel, postulându-se că specia ES se află la cvasi-staționaritate,
, și obținerea produsului (P) este etapa determinantă de viteză
se obține: )ES(EEE t0
)ES(kESkdt
dS11
)ES()kk(ESk0dt
d(ES)211
21
1
kk
ESk(ES)
0t 0SS
0)ES( 0
(ES)
P
So
Eo
0 Timp
93
)ES(kESkdt
dS11
21
12010
21
100 kk
ESkkEkE
kk
ESkE)ES(EE
ESkkEkEkEkE 1201021
Skkk
kkEE
121
210
Substituind în ipoteza de cvasi-staționaritate rezultă:dt
dS
)ES(k)ES(kESkdt
dS211
Skkk
kkE
kk
Skk
kk
SEkk)ES(k
dt
dS
121
210
21
21
21
212
Sk
kkESk
Sk)kk(
ESkk
dt
dS
1
21
02
121
021
94
SK
SV
dt
dSr
M
maxS
unde:
1
21M k
kkK
; (KM = constanta Michaelis-Menten,1913)
02max EkV ; (k2 = turnover-number, specific fiecărei enzime)
Alte forme ale ecuației Michaelis-Menten
01
21pS ES
k
kkrr
021
21pS ES
kk
kkrr
0
1
1
2pS ES
Skk
krr
95
Cazurile limită ale ecuației M-M:
MK S M
maxS K
SVr
MK S constant maxS Vr
MM K 10 S K 1.0 Sr ecuația M-M cu abatere de maxim 10%
Semnificația fizică a KM:
(echilibru prima reacție)ES
)ES(K
k
keq
1
1
ES
)ES(
kk
k
K
1
21
1
M
12 k k (echilibru rapid)
liberă enzimă
legată enzimă
MK
S
E
)ES(
96
Dacă: SKM ½ E este legată și ½ E este liberă
SKM toată enzima este legatăDacă:
MK toată enzima este liberăDacă:
Valori tipice pentru KM :
Enzimă Substrat KM (mol/L)
maltază maltoză 0.1
sucrază sucroză 0.01
fosfatază glicerol-fosfat 0.001
dehidrogenază acid piruvic 0.0001
complex BOD-organic 100 (g/m3)
complex NH4+ 0.55 (g/m3)
complex NO2- 1.4 (g/m3)
complex NO3- 0.1 (g/m3)
97
Determinarea parametrilor cinetici ai ecuației Michaelis-Menten din date experimentale
(curbe cinetice S(t))
a) Metode aproximative
a1) Diagrama Lineweaver-Burk
0S
1
Sr
1
MK
1
maxV
1
SK
SVr
M
maxS
maxmax
M
max
M
S V
1
S
1
V
K
SV
SK
r
1
98
a2) Diagrama Eadie
00
S
ES
r
0
S
E
r
M
2
K
k
2k
0
SM2
0
S
ES
rKk
E
r
SE k S V )SK(r 02maxMS
SE k SrKr 02SMS
Kr SE k Sr MS 02S 0E S
Valori tipice ale constantelor M-M:
k1 = 105 – 109 L/mol · s
k-1 = 10 – 104 1/s
k2 = 1 – 106 1/s
KM = 10-6 – 10-1 mol/L
99
Alte metode grafice de evaluare a constantelor M-M:
• metoda Eisenthal;
• metoda Cornish-Bowden;
• metoda Dixon;
• etc.
b) Metoda exactă - Regresia neliniară
2n
1 u
P S,
1 imodel ,u ,iexp u, i,Mmax CC Min arg K̂ ,V̂
100
Mecanismele inhibiției enzimatice
Reacție fără inhibiție Reacție cu inhibitor competitiv
Reacție cu inhibitor incompetitiv Reacție cu inhibitor necompetitiv
101
Modele cinetice enzimatice cu inhibiție
Inhibiție competitivă
S + E (ES) P + Ek1
k-1
k2
I + E (EI)Ki
1
i
i k
k
K
1
1
21S k
kkK
I = I0 (concentrație inhibitor)
)ES(kdt
dPr 2P
EIESE E0
02max Ek V S
KI
1K
SVr
IS
maxP
; ;
Inhibiție ne-competitivă (non-competitive)
E + S (ES) E + Pk1
k-1
k2
+ Ik3 k-3 + Ik4 k-4
EI (ESI)k5
k-5
• inhibitorul se leagă la un situs distinct de cel al substratului, numit situs de legare;
• are loc la concentrații foarte mici ale S ;
• Vmax nu este atins niciodată, nici chiar la concentrații foarte mari ale substratului;
0Pmax Ek V
SKKI
1
SVr
SI
maxP
• inhibitorul reduce rp prin blocarea centrilor activi; 102
103
• cinetica M-M cu dublu substrat:)SK()SK(
SSVrr
22M11M
21maxPS
Inhibiție incompetitivă (un-competitive)
E + S (ES) P + Ek1
k-1
k2
+ Iki k-i
(ESI)
IS
maxP
KI
1SK
SVr
• asemănătoare catalizei chimice (A* + B*) cu reacție pe suprafață.
• are loc la concentrații foarte mari ale substratului (S);
104
Inhibiție alosterică
nS + E (ESn) nP + Ek1
k-1
kcat
nnS
nmax
PSSK
SVrr
0catmax Ek V
Activare alosterică
Inhibiție alosterică
105
Influența temperaturii și pH-ului asupra vitezei de reacție și activității enzimatice
a) Dezactivarea enzimei
• enzima se dezactivează în timp datorită schimbărilor structurale conformaționale după ecuația:
dk dt
dE tdk
0 e E E
SK
SeEk
SK
ESkr
M
tdk02
M
2S
b) Sterilizarea enzimei
• sterilizarea este similară dezactivării naturale dar are ca efect încetarea viabilității organismului sau a celulei;
• sterilizarea se face sub influența căldurii, radiației sau a compușilor chimici;
106
• sterilizarea este un proces stocastic, aproximat printr-o cinetică de ordin unu:
X k r dd
(X = concentrația de biomasă activă)
)tk ( exp XX d0
• timpul necesar reducerii populației de celule cu un factor de 10 este:
dd
0d k
10ln
k
XXlnt
)tk( exp1.0 X
Xd
0
dd tk1.0 nl dd tk01 nl
dd k
10lnt
Demo:
107
Concentrațiile metaboliților la nivel celular:
]G[0 ,cytA VN
Număr de molecule (copy number) G/celulă
NA = 6,023 x 1023 = numărul lui Avogadro
Vcyt, 0 = volumul celulei (citosol)
Exemplu: în Escherichia coli : Vcyt, 0 = 1,66 x 10-1 L și există un
copy-number genă G:
)L/mol(10 nM 11066,110023,6
1]G[ 9-
1523
Recommended