Instrumentalne analize

Radne

Pomoćne

Referente

Redoks

Gasne

Metalne

Membranske

red

oks

a

alog

nF

10lnRTEE

E – standardni redoks potencijal (V); E=f(T)

(Ako potencijal elektrode zavisi od pH rastvora umesto E u izrazu se koristi E - formalni redoks potencijal)

n - razmenjenih elektrona aoks i ared – aktivitet oksidovanog i redukovanog oblika supstance

R – univerzalna gasna konstnta R = 8,314 (JK-1mol-1)

T – temperatura (K)

F – Faradejeva konstanta F = 96485 (Cmol-1)

Ako je temperatura t = 25oC, ln 10 = 0,059 (V)

F

RT

pH

10lnRT

FE2rH IND

rH – veličina koja takođe definiše redoks potencijal sistema

(0< rH < 41,8) EIND– potencijal indiferentne indikatorske elektrode (V)

zz M

θ

/MMloga

zF

RTln10EE

M/MzE

zMa

- standardni redoks potencijal sistema Mz+/M - aktivitet metalnoh jona

Konstantnost potencijala

Nepolarizovanost

Stabilnost

Reproduktivnost

Kapacitet

Difuzioni potencijal

Temperaturni koeficijent

Električna otpornost

Oblik

A

MA

z

M

red

ox

a

P

nF

RTFEE

anF

RTFEE

a

a

nF

RTFEE

log10ln

log10ln

log10ln

Srebrna:

Kalomelova elektroda:

Zasićena:

2

Cl

ClHg

Hg2/Hg a

Plog

F2

10lnRTEE 22

22

2222

log059,0

2/ ClHgHgHgP

zEE

KClCl

AgCl

AgAg C

P

zF

RTEE

)(log10ln

/

(V) 0E ; pHnF

RTln10E θ

/H2H 2

2/1

H

H

)p(

alog

F

10lnRTEE

2

Hinhidronova:

Staklena:

pHF

10lnRTEE VCE o

hidrhin 699,0)25(/

maref,ust EEEE

)pHpH(F

10lnRTE mum

)pHpH(F

10lnRTEEE muaref,ust

mkst pHF

10lnRTEE

mkst pHF

10lnRTSEE

teorijsko

novarst

)dpHdE(

)dpHdE(S

F

10lnRT)dpHdE( teorijsko

Jon-selektivne elektrode:

Staklena

Elektrode zasnovane na neorganskim solima

Elektrode zasnovane na organskim izmenjivačima

jona i neutralnim nosačima

Gas-osetljive elektrode

Ostale: enzimske, na bazi PAM, na bazi FET-a

Jon-selektivne elektrode:

Anjonske

Katjonske:

)akalog(Fz

10lnRTEE IK zz

IKIK

K

K

)akalog(Fz

10lnRTEE IA zz

IAIA

A

A

A

A

A

K

K

K

aFz

RTEE

aFz

RTEE

log10ln

log10ln

pMFz

10lnRTEE

K

K

pAFz

10lnRTEE

A

A

Indikatorska elektroda (kombinovana)

Referentna elektroda

Elektrolitička veza

)pHpH(F

10lnSRTEEE muaref,ust

Nedostaci:

Asimetrični potencijal (izobestična tačka)

Gubitak osetljivosti – starenje

Mala mehanička otpornost

Velika električna otpornost

Tendencija adsorpcije

Rastvor se podvrgava kratkotrajnoj

elektrolizi pri promenljivoj razlici

potencijala

Kvalitativna karakteristika: Er, E1/2

Kvantitativna karakteristika: id

)/log((

10ln2/1 iiid

nF

RTEE

log(id-d)/i

E

E1/2

2,303RT/nF

Cd2+ + 2e Cd(Hg)

2Hg – 2e Hg2Cl2

Ilkovičeva jednačina:

id = KCm2/3t1/6D1/2

E = f(di/dE)

E = f(d2i/dE2)

Analize više depolarizatora pri zajedničkim

uslovima (osetljivost, kompenzacija

difuzione struje, itd.)

50 mV razlika polutalasnih potencijala

(klasična 100 mV)

Odnos koncentracije 1000:1 (klasična 50:1)

iF = id + im

ig = iF + ic + ir + io

Migraciona: visoka koncentracija pomoćnog

elektrolita

Kapacitetna: eliminacija električnim putem

do 10-6 mol/l; pulsne tehnike

• Mala površina elektrode (d = 0,02 – 0,08 mm)

– reproduktivnost saopštavanja potencijala

• Mogućnost ponavljanja analize

• Visok nadnapon izdvajanja vodonika

• Obnavljanje elektrodne površine –

reproduktivnost procesa

• Momentalno uspostavljanje potencijala

• Ograničenost anodnog potencijala (+0,4 V)

• Diskontinualan rad

Rezervoar žive

Kapilara

Mikrometarski zavrtanja

Tipovi:

Viseća

Sedeća

Kiseonični maksimumi:

Polarografski maksimumi: I (adsorpcija), II

vrste (konvektivni prenos mase unutar

elektrode)

Primarna kulonometrija:

F

Qm

m – masa supstance na generatorskoj elektrodi

Q – protekla količina struje (C = As)

q – masa ekvivalenta izdvojene supstance koja reaguje sa jednim molom elektrona (gmol-1)

elt

tdtiQ0

it = iel = const: Q = iel tel

E = const it = i0e-kt

el el

el

t

0

t

0

kt0kt

0t e1k

idteidtiQ

D

V

Ak

r

Generatorska katoda:

G + ne T

Generatorska anoda:

G T + ne

Pomoćna anoda:

T G + ne 4OH- O2 + 2H2O + 4e

Pomoćna katoda:

T + ne G 2H+ + 2e H2

Titracija ireversnog sistema reversnim:

i

t ET ZTT

Titracija reversnog sistema ireversnim:

i

t

2 S2O32¯ + J2 S4O6

2¯ + 2 J¯

2 S2O32¯ + J3

¯ S4O62¯ + 3 J¯

2J- J2 + 2e

3J- J3- + 2e

J2 + C6H8O6 2J- + 2H+ + C6H6O6

J3- + C6H8O6 2J- + 2H+ + C6H6O6

2

M

F

Qm

)J(J 32

F2

Qx

F

Q

F2

Q2x

• 2 S2O32¯ + J2 S4O6

2¯ + 2 J¯

• 2 S2O32¯ + J3

¯ S4O62¯ + 3 J¯

Promene smera struje se dešavaju sporije od fenomena

relaksacije

500 Hz, 1000 Hz

Detektor - osciloskop

100 MHz

Eliminacija elektrolize

Visoka osetljivost

Mogućnost multielementarne analize

Visoka selektivnost

Selektivnost prema različitim fizičko-hemijskim oblicima i valentnim stanjima analita

Mogućnost direktne analize

Mogućnost automatizacije i kontinualnog monitoringa

Mobilnost – in situ analize

Prihvatljiva cena

Mala potrošnja energije

Fe2+/Fe3+

Tl+/Tl3+

Sn2+/Sn4+

Sb3+/Sb5+

As3+/As5+

Se4+/Se6+

Mn2+/Mn4+

Sile koje ubrzavaju: F1

Solvodinamičke (hromatografske)

Elektrostatiske (razdvajanje u elektricnom

polju)

Elektrolineticke

Gravitacione (sedimentacione metode)

Sile koje usporavaju: F2

Sila trenja

Elektrostatičke

Dipol-dipol interakcija

Adsorpcione

Osmotske

Efekti molekulskih sita

Difuzione

Adsorpciona

1,3`

21

1`

```

``

xCkCs

Cmk

CmkCs

Wm

Ws

Cm

Cs

Wm

WsKiki

Am

As

Cm

Cs

Vm

AsKiki

x

m

Proteini A i G – antitela

Antitela – proteini

Boje – adsorpcija proteina, enzima

Ligandi, supstrati, kofaktori – enzimi

Lektini – glukozinolati

Metalni joni – proteini bogati His, fosforilovani proteini

Borna kiselina – planarne cis diolne grupe ugljenih hidrata i komponenata nukleinskih kiselina

Sekvenca nukleotida – complementarna RNK

Afinitetna

Afinitetna - elucija

Promena pH (snizavanje)

Dodatak visoke koncentracije soli (NaCl – 1

mol/l)

Agensima koji ometaju hidrofobne interakcije

i vodonične veze (urea, tiourea, Na-tiocijanat,

guanidine hidrohlorid)

Na molekulskim sitima

Vi

VmVeK

KVVV ime

Molekulska sita

Kserogeli – umreženi dekstran, umrezeni

poliakrilamid

Aerogeli – porozno staklo

Kombinovani – Agaroza, Sefaroza, S/DVB

Slabi katjonski:

- karboksilna, fenolna, amidoacetatna

- sulfonatna

Jaki katjonski:

Jaki anjonski:

- kvaternerne amonijum grupe

- dimetil amino, trimetilamino, amino

Slabi anjonski:

H

LN

LH

2

4/

4

w

w

354,2

2/1b

22

164

/

w

t

w

trHLN r

2

2/1

545.5

b

tN r

2222

)4/()4/()/( trwLLwLLLL

H

n = L/H

H = L(w/tr)2

H = H1+H2+H3

n – broj ekvivalentnih teorijskih podova

H – visina ekvivalenta teorijskih podova

pdA 2

mDB 2

m

p

D

dCm

2

s

f

D

dkfCs

2

`)(

- faktor pakovanja

dp - precnik cestica

- lavirint faktor, manji, 1 Dm – koeficijent difuzije u mobilnoj fazi

CsCmC

- konstanta zavisna od

kapacitetnog faktora i nacina

pakovanja

f(k`) – konstanta zavisna od kapacitetnog faktora

Ds – koeficijent difuzije u stacionarnoj fazi

Hawkes

Knox

Cuu

BAH

uCCu

BH ms )(

Cuu

BAuH 3/1

Van Deemter

Metode kvantifikacije u TLC

Kalibraciona kriva

Denzitometrija

Merenje intenziteta radioaktivnog zracenja

Eluiranje: spektrofotometrija, IR, MS,

elektroanalitika, NMR

HPTLC

Piezoelektrični uredjaji za nanošenje

2D

Smanjena nesigurnost polozaja i površine mrlje

Niza cena analize

Kraće vreme analize

Niska cena održavanja

Jednostavna priprema uzoraka

Mala potrošnja rastvarača

Mogucnost vizuelne detekcije

HPTLC TLC

Debljina sloja 100 um 250 um

Efikasnost Visoka Umerena

Razdvajanje 3-5 cm 10-15 cm

Trajanje analize Znatno krace Duze

Sorbent Silika gel, C8, C18 Silika gel, Aluminium oksid,

Kieselguhr

Razvijanje Uz znatno manji utrosak

mobilne faze

Dosta mobilne faze

Nanosenje uzorka Autosampler Manuelno

Detekcija UV/VIS fluorescentni skener

uz denzitometar I automatsku

kvalitativnu I kvantitativnu

analizu

Ručna

Eluciona

Frontalna

C C

A+B+C A+B+C

B+C B+C

A+B+C

Metoda istiskivanja

D

A

B

D

D

A

B

Asimetrija pika:

Loša rezolucija

Pogrešna procena broja ekvivalentnih teorijskih

podova

Netačna kvantifikacija

Gubitak manjih pikova

Loša reproduktivnost

min

maxln

41

V

VNnc

jedinjenja 86ml 1

ml 30ln

4

000,101 cn

Vmax i Vmin – maksimalna i minimalna zapremina mobilne faze

u kojoj se analit moze eluirati i detektovati

Kapacitet kolone

Injektovanje uzorka

Gasna slavina

Split injektor

Spiltless injektor

Direktno na kolonu

Programmed Temperature Vaporizing Injection

(PTV)

Sa koncentrovanjem isparljivih analita (Purge and

Trap)

mt

ldkQ

2

Detektori

Detektor termičke provodljivosti (TCD)

Vodonikov plameno-jonizacioni detektor (FID)

Elektron-apsorbujući detektor (ECD)

NP detektor

Maseni spektrometar (MS)

Termičke provodljivosti

Plameno-jonizacioni

Elektron-apsorbujući

NP detektor

MS detektor

GC MS interfejs

Analiti se ne smeju kondenzovati niti raspadati

Interfejs se mora nalaziti na temperaturi iznad

tačke ključanja supstanci

Složeniji kod instrumenata sa punjenim

kolonama

More complicated in instruments with packed

columns

Headspace tehnika

1950. god. uvedena

Tehnika pripreme uzoraka za odredjivanje

isparljivih supstanci u cvrstim i tecnim

uzorcima

Jednostavna

“Čista”

Kriogeno koncentrovanje

Kriogeno koncentrovanje - konstantna T

Kriofokusiranje – temperaturni gradijent

1. Vece zapremine gasa nosača koji sadrži komponentu se prevodi preko hladnog sorbera

2. Brzim zagrevanjem sorbera akumulirani analiti se oslobadjaju

Kriogeno koncentrovanje

1. Kada je potrebno u GC uvesti veće zapremine gasne faze (niže koncentracije, mali K)

2. Kada je unosenje uzorka suviše dugo trajalo

3. Kada je desorpcija u dinamičkoj head space dugo trajala

Kriogeno koncentrovanje

1. Kada je potrebno u GC uvesti veće zapremine gasne faze (niže koncentracije, mali K)

2. Kada je unošenje uzorka suviše dugo trajalo

3. Kada je desorpcija u dinamičkoj head space dugo trajala

Sistemi kriogenog fokusiranja

1. Mala predkolona (3 cm) koja se hladi tečnim azotom (40x)

2. Cela kolona se hladi tečnim azotom

3. Dinamičko hladjenje

Problemi

1. TT likvidnih faza – zamrzavanje i zadrzavanje analita nedefinisanim mehanizmom (adsorpcija, zamrzavanje)

2. Voda iz uzorka – sušenje LiCl na Chromosorb-u

3. Kriogene kolone – aktivne!!!

HPLC

Mobilna faza – tečnost u kojoj su analiti rastvorni

Značajna uloga mobilne faze u retenciji analita

Stacionarna faza – čvrsta, tečna ili gel

Pritisci – 400 bar

Kolone i detektori moraju biti otporni na visoke pritiske

Značajna uloga pufera – kontrola jonizacije

Filtri, guard kolone

Zaštita analitičkih kolona

Filtri 10 -30 m

Pojedine pumpe takodje poseduju filtre

Velik broj filtera – nepoželjno zbog otpora protoku i formiranja mehurova

Saturacione kolone – pre analitičke, štite od degradacije uzrokovane puferima visoke pH

Delovi od nerdjajućeg čelika

Vodovi, “liner”-i se pasiviziraju

Sprečavanje korozije uzrokovane visokom (do 200 mmol/l) koncentracijom halida

Predkolonu i kolonu je potrebno ukloniti

Pasivizacija – provodjenjem 20% azotne kiseline i ispiranje vodom

Uklanjanje iskristalisanih pufera i nataloženih organskih materijala

Za veće koncentracije halida preporučuje se primena delova od titanijuma i primena pumpi sa polimernim glavama (PEEK)

Pumpe

Moraju obezbediti stabilan protok od 10 l/min – 2 ml/min

Kod HPLC MS protok zavisi od

primenjenog interfejsa

Elektronski-kontrolisane pumpe

Najčešće su klipne pumpe

- sa jednosmernim kretanjem klipa

- sa naizmeničnim kretanjem klipa

- sa klipovima smaknutim u fazi

HPLC

Podeona – 80% svih aplikacija

Na izmenjivačima jona – 15%

Drugo – 5%

Izokratski

Jednostavnije

Brže

Niža cena

Jedna pumpa

Mešač nije potreban

Neophodna reekvilibracija sistema izmedju analiza

Ograničena selektivnost

Gradijentno

Pri razdvajanju supstanci različitih polarnosti

U hromatografiji na obrnutim fazama – brža elucija kasnih pikova

Razdvajanje preklopljenih pikova

Sporije razdvajanje

Veća fleksibilnost

Više pumpi - viša cena

HPLC Kolone

Kolone

Nerdjajući čelik ispolirane unutrašnje površine (kompleksiranje od strane gvoždja, hroma i nikla)

Nerdjajući čelik prevučen staklom

Staklo

Stopljena silika

Polimeri

Meki spoljašnji polimeri

Porozne frite – 0.5 m; 2 m

Stacionarne faze

Hemijski vezane faze – na bazi silika gela

Hemijska modifikacija odredjuje polarnost

Polimerizacija na nosaču

Za razliku od GC stacionarna faza ne daje

pozadinski šum u detektoru osim ako

neadekvatan pH ne izaziva njenu degradaciju

Porozne mikrosfere

Najčešće primenjivane

Dostupne, efikasne, dugotrajne, praktične

Različitih prečnika, veličina pora, specifične

površine

Čvrste

Dostupne različitih prečnika 1,5 – 2,5 m

Ograničen kapacitet

Oštri pikovi

Perfuzione

Velike pore: 4000 – 8000 A

Manje pore: 300 - 1000 A

Preparativno izolovanje makromolekula

(proteini)

Poroshell

1,7 m čvrsto jezgro od silike sa 0,5 m

poroznim spoljašnjim slojem

Uniformna raspodela veličina – gusto pakovanje –

veća efikasnost

Poroshell

Proizvodnja slaganjem slojeva

Usavršena proizvodnja - koacervacija

Usavršena rezolucija

2 m frita, otporne na zapušenje

80-90% bolja efikasnost razdvajanja uz manje

otpore

Mogućnost transfera na UHPLC

Čestice od silike

Najviše korišćene

Dostupne različite poroznosti (7, 30, 100 nm)

Dostupne različitih veličina (3, 5, 10 m)

Dostupne pravilnog sfernog i nepravilnog oblika

Čestice od silike

Ne menjaju zapreminu u kontaktu sa rastvaračem

Ne smeju se koristiti na pH>8

Nedostatak – kiseli karakter

Otporne

Dug vek trajanja

Modifikovane - kompatibilne sa vodenim i organskim rastvorima

Porozni polimeri

Nesubstituisani – pogodni za razdvajanje na obrnutim fazama

PS – DVB

Substituisani metakrilat

Polivinil alkohol

Širok raspon pH: 1-13

Porozne mikrosfere i čvrste

Širokih pora – preparativna, za uklanjanje proteina

Porozni polimeri

Jaka hidrofobna retencija

N = ½ N (silika)

Bubrenje – izraženije kod gradijentnog režima

Modifikovani: - C18

-NH2

-CN

-COOH

-SO3H

-NR3+

Grafitisani ugljenik

Za razdvajanje na obrnutim fazama

Porozne mikrosfere različitih veličina

Geometrijski izomeri

U širokom opsegu pH i temperature

Izuzetno jaka adsorpcija nečistoća

Kolone malih dužina i skupe

Aluminijum-oksid

Različitih veličina pora

Za razdvajanje na normalnim fazama umereno polarnih analita

Za razdvajanje na obrnutim fazama – prevlačenje polimernom fazom (polibutadien)

Do pH 12

Ne sme se koristiti za uzorke koji sadrže karboksilne kiseline

Ne pokazuje izrazite prednosti u odnosu na siliku

Na bazi cirkonijuma

Porozne mikrosfere i neporozne ultramikrosfere

Komercijalno – polimerom prevučene cirkonijum mikrosfere

pH: 1 – 14

Za razdvajanje izrazito baznih jedinjenja

T: do 100C

Ugljen-dioksid, F, fosfati, Luisove kiseline, karboksilne i sulfonske kiseline moraju u potpunosti biti uklonjen iz uzorka

Karakteristike kolone

Broj teorijskih podova (N)

Faktor asimetričnosti pikova

Selektivnost

Pad pritiska

Reproduktivnost retencionih faktora

Koncentracija vezane faze

N raste kod:

Dobro pakovanih kolona

Dužih kolona

Manjih protoka

Manjih čestica

Mobilnih faza manjeg viskoziteta

Manjih molekula analita

Gubitak performansi kolone:

Blokiranje friti ili punjenja kolone

Apsorpcija/adsorpcija nečistoća

Mehaničko ili termijsko oštećenje

Hemijsko oštećenje

HPLC Detektori:

UV/VIS (varijabilni UV)

DAD detektor (Diode Array Detector)

Fluorescentni

Refraktometrijski

Elektrohemijski

Konduktometrijski

ELSD detektor (ELSD)

Viskozimetrijski

MS

Zahtevi detektora

Minimalna disperzija pika

Osetljivost

Linearnost

Selektivnost

Više redno vezanih detektora

2

det

222 colinjtot

det,i

outi

dc

dUS

i

outi

d

dUS

UV/VIS

•Signal elektronski linearizovan

•Za velike A – nelinearnost usled nejednakosti apsorpcionog

koeficijenta

•Velika A – veliki šum i pozadinska apsorpcija

•Kod rastvarača koji intenzivno apsorbuju - smanjuje

se odnos S/N

bcII 100

Varijabilni UV

Optičke ćelije od kvarca (190 – 650 nm)

8 l za punjene kolone

1 l za kapilarne kolone

Detektori koji prate signal na jednoj talasnoj

duzini – živina lampa na 254 nm

Varijabilni – volframova i D lampa

Difrakcione rešetke: 2-5 nm

Promena talasnih dužina omogućava da se za

svaki pik nadju uslovi najveće osetljivosti

Varijabilni UV

DAD

•Rotirajuća ili vibrirajuća difrakciona rešetka ispred

ćelije (1 s)

•Polihromatska svetlost prolazi kroz ćeliju

•DAD – polihromator se nalazi iza ćelije

•Dispergovana svetlost pada na 200-500 dioda

•Svaka dioda odgovara odredjenoj talasnoj dužini i

deo je strujnog kola

• Ciklus merenja <1 ms

•U prvom pristupu - više LOD zbog kratkog vremena

uzorkovanja signala

Primena DAD

•Utvrdjivanje čistoće pika

•Odredjivanje površine nedovoljno razdvojenih pikova

(deconvolution)

•Identifikacija pikova – biblioteke spektra pomažu

u identifikaciji

•Identifikacija pikova pri promeni redosleda elucije

Fluorescencija:

Omogućava jedan od najselektivnijih načina

detekcije posto je redak fenomen

Molekuli nakon ekscitacije UV zracima emituju

fotone

U ekscitovanom stanju : 1-100 ns

Emitovan spektar dosta složen

Emitovano zračenje je uvek veće talasne dužine

•Фf – efikasnost fluorescencije

•kf – konstanta brzine fluorescentnog

procese

•ki – konstanta brzine alternativnih procesa

•Idet – intenzitet emitovanog zračenja

•q – efikasnost instrumenta u prikupljanju

fluorescentnog zračenja

if

f

fkk

k

f

bclIqI )10(0det

Fluorescentni •Fluorescentni signal je priblizno linearan pri malim koncentracijama

•Nelinearnost može biti uzrokovana i apsorpcijom emitovanog zračenja

prisutnim molekulima

•Izvor – živina ili pulsna ksenonova lampa; laser u minijaturizovanim HPLC

•Overtoni se izbegavaju filtriranjem zračenja

•Pozadinski signal potiče od rasipanja zračenja na zidovima, fluorescentnih nečistoća,

Rejlijevog i Ramanovog rasejanja

Predkolonska derivatizacija:

Pre hromatografskog razdvajanja

Uvodi se kovalentnim vezivanjem grupa koja

fluorescira

Visok prinos fluorescencije

Derivatizacija treba da se odvija selektivno, sa

jednim tipom funkcionalnih grupa

Reakcija derivatizacije treba da proizvodi jedan,

stabilan produkt

Višak reagensa ne sme fluorescirati i treba da se

jednostavno uklanja od analita

Postkolonska derivatizacija:

Ako jedan analit proizvodi više proizvoda

dobija se jedan pik

Visoka reproduktivnost čak i za nestabilne

proizvode i za nepotpuno iskorišćenje reakcije

usled reproduktivnog reakcionog vremena

Reagens ne sme biti fluorescentan

Reakcioni uslovi moraju biti kompatibilni sa

uslovima razdvajanja

Refraktometrijski:

Univerzalni, jedinjenja koja ne poseduju

hromofore, u gel hromatografiji

Jedan od prvih razvijenih detektora

Meri se razlika indeksa refrakcije mobilne faze i

eluirane supstance

Temperature moraju biti iste!!

Zavisnost je nelinearna

Pri nižim koncentracijama se može aproksimirati

linearnom

Izvor zračenja emituje vidljivu svetlost

Refraktometrijski

Za niže koncentracije analita

-n0 – index refrakcije mobilne faze

- ni - index refrakcije analita

ii Cnnknn )( 00

Elektrohemijski detektor

•Potenciometrijski – relativno neosetljiv

•Amperometrijski – signal pogodan za merenje,

mobilna faza mora biti elektroprovodna (obrnute faze)

Ox + ne Red

Elektrohemijski

Transport molekula analita konvekcijom do

površine elektrode

Transfer elektrona izmedju elektrode i analita

Transfer produkata reakcije od elektrode

Faze transfera mase (prvi i treći korak)

ograničavajuće, odredjeni geometrijom ćelije

Brzina transfera elektrona – odredjena primenjenim

potencijalom

Selektivnost odredjena potencijalom

Opseg potenijala odredjen raspadom rastvarača

Elektrohemijski

Elektrode – najčešće od staklastog ugljenika

Redukciona tehnika – tankoslojna živina elektroda

2 tipa ćelija – tankoslojne i sa poroznom

elektrodom

03/2

3/13/23/2

47,1 Cb

qADnFi el

•C0 – koncentracija u celiji

•Ael – povrsina elektrode

•b – debljina kanala

•q - protok

•D – koeficijent difuzije

Elektrohemijski

Na poroznim elektrodama – potpuna konverzija

Kalibracija bespotrebna - Faradejev zakon

Povećanja osetljivosti – dve elektrode

Druga elektroda služi da redukuje oksidovane produkte ili

obrnuto

Drugi pristup: Prva elektroda je na nižem potencijalu i

sluzi da oksiduje nečistoće, hromatogram je “prečišćen”

Treći pristup: Primena elektroda od specijalnih materijala,

hemijski-modifikovanih

Amperometrijski

PAD – pulsni amperometrijski

Šećeri se teško oksiduju

Na platinskim i zlatnim elektrodama i visokim pH

vrednostima je moguća njihova oksidacija

Da ne bi doslo do deaktivacije elektroda primenjuju

se pulsevi potencijala:

1. Adsorpcija čećera

2. Oksidacija na umerenom potencijalu

3. Primena još pozitivnijeg potencijakla radi

čišćenja elektroda

Konduktometrijski detektor

U jonskoj gromatografiji elucija jona izaziva promenu električne

provodljivosti

Struja se prati izmedju radne platinske i referentne elektrode od

nerdjajućeg čelika

Primenjuje se promenljivi potencijal sa amplitudom od nekoliko volti

Sinusni, pravougaoni impulsi potencijala

Za minimiziranje pozadinskog šuma – elektroliti niske koncentracije ili

kompenzacija elektronskim putem (dve serije para elektroda)

Hemijski način minimiziranja šuma – nakon razdvajanja zamena jona

pufera neutralnim molekulima:

H+ + HCO3- CO2 + H2O

Konduktometrijski detektor

ii C 0

)/1( elras

ACAC

fCR

Ei

• – provodljivost rastvora

•i – provodljivost jona

•Eac –potencijal

•Rras – otpornost rastvora

•Cel – kapacitet kondenzatora,

tj. električnog dvojnog sloja na

elektrodama

•f – frekvencija sinusnog signala

Za jako velike frekvencije, 1kHz,

pošto je otpornost obrnuto proporcionalna provodljivosti, :

KiAC

K – konstanta proporcionalnosti zavisna od amplitude,

naponskog impulsa, dimenzija elektroda i geometrije ćelije

Evaporativni detektor na bazi praćenja

rasipanja svetlosti (ELSD)

4

22

2

2

02

1

NV

n

nkII sc

•Alternativa refraktometrijskom

•Pneumatsko raspršivanja eluenta

•Formirane kapljice se unose strujom azota ili vazduha

i zagrevanu (100 – 250C) zonu

•Nakon otparavanja rastvarača čvrste naisparljive čestice se

prenose do optičke jedinice

•Prati se rasipanje svetlosti dovedene iz lasera ili polihromatske lampe

•I0 – intenzitet upadne svetlosti

•n – indeks refrakcije čvrstih čestica

•N – broj cestica po jedinici zapremine

•V – zapremina čestica

•k – konstanta proporcionalnosti

• - talasna dužina svetlosti

ELSD

•Nelinearan odziv

•Efikasnost transporta kapljica do komore za otparavanje zavisi od njihove veličine

•Univerzalni detektor za polimere

•LOD – 10-100 ng

•Odsustvo šuma usled potpunog otparavanja rastvarača

Viskozimetrijski detektor

Najveća primena u tehnologiji polimera

Prati se pad pritiska kroz kapilaru

Pad pritiska je proporcionalan viskozitetu

rastvora

Diferencijani način merenja se primenjuje za

eliminisanje uticaja pulsiranja pumpe i

temperature

Druga kapilara se postavlja nakon rezervoara sa

eluatom

Ostali detektori

IR – zahteva malu zapreminu ćelije zbog apsorpcije od strane rastvarača

Polarimetrijski – za optički-aktivne, hiralne supstance. Prati se obrtanje

ravni polarizovane svetlosti

Merenje radioaktivnosti – visokoselektivan; teško se povezuje sa HPLC

posto merenje zahteva vreme

Najznačajniji radioizotopi - 3H, 14C, 35S i 32P

Radioaktivno zračenje se apsorbuje tečnim ili čvrstim scintilatorima

Energija se prevodi u fotone (350 – 600 nm)

Tečni scintilatori – organski rastvarač, fluorofor i PAM

Čvrsti scintilatori – granularni antracen, staklo i plastika dopirana

fluroforom

Povezivanje HPLC i GC detektora – pod ispitivanjem

UHPLC

1,7 um čestice

Veci rizik od zapušenja, neophodni finiji filteri

3-5- puta veći protok

P = 600-1200 bar

Skraćivanje vremena analize

Manji utrošak rastvarača

Redizajniranje ostalih delova (pumpe, injektori,

spojevi)!!!

Relativne metode kvantifikacije

Metoda normalizacije – metoda 100%

Metoda kalibracione krive

Metoda standarda

Metoda untrašnjeg standarda

Metoda standardnog dodatka

Metoda normalizacije

iii wKA

i

ii

C

AK

%100(%)

1

n

i

i

ii

A

Aw

Modifikovana metoda normalizacije

i

s

s

isi

C

C

A

Aff

fi – odziv detektora za supstancu i

fs – odziv detektora za standardnu supstancu

Ai – površina pika komponente i

As – površina pika standardne komponente

Ci – koncentracija analita i

Cs – koncentracija standardne komponente

%100(%)

1

n

i

ii

iii

fA

fAw

Metoda kalibracione krive

Površina pika

Koncentracija

Metoda standarda

i

ii

C

AK

i

ii

K

AC

Metoda unutrašnjeg standarda

i

s

s

i

s

ii

C

C

A

A

K

Kf fi – odziv prema analitu i

Ai – površina pika komponente i

As – površina pika unutrašnjeg standarda

Ci – koncentracija analita i u standardnoj smeši

Cs – koncentracija unutrašnjeg standarda

s

ss

C

AK

sii KfK i

ii

K

AC

Metoda dodatka standarda

si

i

si

i

siisi

iii

C

C

A

A

CKA

CKA

Pošto je: Ci+s = Ci + Cs:

si

i

si

i

CC

C

A

A

isi

isi

AA

ACC

Metoda viseštrukog dodatka

standarda

EI

source: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Schematic_diagram_of_an_EI_ion_source.jpg

FAB

MALDI

Source:http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_maldi.html

Maseni analizator

Razdvajanje jona različitog m/z

Rezolucija (R):

Analizatori male rezolucije R < 1000

Sa duplim fokusiranjem

Kvadrupolni

source: http://murr.missouri.edu/ps_analytical_ICP_quadrupole.php

Ion trap

TOF

source: http://www.fi.tartu.ee/labs/ltl/tof-ms.html

Linearni

Sa reflektronom

MS MS

Primenjuje se kod svih tipova jonizacije

Praćenje produkt jona - Product ion scan

Praćenje prekursor jona - Precursor ion scan

Praćenje neutralnog gubitka - Neutral loss

monitoring

SDM (Selected Decomposition Monitoring)

QQQ

QTOF

Spektrometrija

Emisija ili apsorpcija elektromagnetnog zračenja od strane molekula, atoma ili jona

Omogućava kvalitativnu i kvantitativnu analizu

Kvantitativne karakteristike – intenzitet apsorbovanog ili emitovanog elektromagnetnog zračenja

Kvalitativne karakteristike – talasna dužina apsorbovanog ili emitovanog zračenja

Spektrofotometrija

A=lC

Greške

Hemijske prirode:

Solvatacija

Disocijacija

Stvaranje kompleksa

Fizičke prirode:

Temperatura

Elektrolit

Greška talasne dužine, nekalibrisanog spektrofotometra

Jednozračni spektrofotometar

I0 =Ia + It + Ir + IR

Dvozračni spektrofotometar

Plamena fotometrija

Emisiona spektralna metoda

Kvantitativno odredjivanje alkalnih i zemnoalkalnih metala (3-5 eV)

Cu, Ni, Pb, Fe, In, Mn, Cr, Co, Tl, B, Al – plamena spektrometrija

Plamena fotometrija

Uvodjenje uzorka:

Posredno rasspršivanje

Neposredno raspršivanje

Atomska apsorpciona

spektrofotometrija

MX

M

M

M

M

Atomizcija

Isparavanje

Desolvtacija

Jonizacija

+ +

*

-h

-h

*

Šuplja katodna lampa

AAS sa kontinualnim izvorom

• Monohromatori visoke rezolucije – predmonohromator i

monohromatori dobijeni fotolitografskim tehnologijama

• Intenzitet zračenja za red veličine veći nego kod klasične

AAS

• Visokonaponska ksenonova lampa električnog luka

• CCD (Charge Coupled Device) detektor (200 pixel-a)

Smetnje

• Spektralne

• Hemijske

• Fizičke

• Jonizacione

• Usled apsorpcije pozadine

Oblik materije sa značajnim udelom elektrona

(>1%), pozitivnih jona, radikala, neutralnih

atoma i molekula

Električno provodna

Podložna dejstvu magnetnog polja

Plazma

Multielementarna analiza

Širok dinamički linearni opseg

Smanjen uticaj interferencija matriksa

Poboljšana granica detekcije za elemente sa

visokom temperaturom isparavanja

ICP-OES

Visoka osetljivost (ppt)

Jednostavni maseni spektri

Brza kvalitativna analiza

Interferencije od strane molekulskih jona

ICP MS